專(zhuān)利名稱(chēng)：光學(xué)控制第二信使的細(xì)胞系、系統(tǒng)和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及響應(yīng)光學(xué)刺激產(chǎn)生第二信使的系統(tǒng)和方法，更具體涉及各與響應(yīng) 光產(chǎn)生第二信使有關(guān)的細(xì)胞系、核苷酸序列、嵌合蛋白以及它們的應(yīng)用。背景鳥(niǎo)嘌呤核苷酸-結(jié)合蛋白(G蛋白)被認(rèn)為能在無(wú)活性的鳥(niǎo)苷二磷酸(GDP)狀態(tài) 和有活性的鳥(niǎo)苷三磷酸(GTP)結(jié)合狀態(tài)之間發(fā)生改變。這兩種狀態(tài)與細(xì)胞內(nèi)第二信使的釋 放相關(guān)聯(lián)。釋放的第二信使能夠調(diào)節(jié)下游細(xì)胞過(guò)程。第二信使包括迅速產(chǎn)生/釋放的信號(hào)傳導(dǎo)分子。這些分子通過(guò)激活細(xì)胞內(nèi)的效應(yīng) 蛋白產(chǎn)生細(xì)胞反應(yīng)。細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)的例子包括磷酸肌醇體系、環(huán)腺苷酸(cAMP)體系和 花生四烯酸體系。稱(chēng)為G蛋白-偶聯(lián)受體(GPCR)、G蛋白-連接受體(GPLR)、七跨膜結(jié)構(gòu)域受體(7TM 受體)或七螺旋受體的蛋白質(zhì)可觸發(fā)G蛋白不同狀態(tài)之間的變化。該蛋白質(zhì)家族包括各種 跨膜受體。這些受體通過(guò)激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑而響應(yīng)外部刺激(例如，光、神經(jīng)遞 質(zhì)、氣味或激素)。具體地說(shuō)，配體結(jié)合并激活轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑從而造成G蛋白改變狀態(tài)。GPCR-相 關(guān)活性與許多疾病有關(guān)，因此GPCR是許多藥物和治療的靶點(diǎn)。據(jù)信，市場(chǎng)上超過(guò)30%的藥物尋靶G-蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)，因此其中的大多數(shù)涉 及第二信使cAMP的產(chǎn)生或抑制。有許多病理過(guò)程直接涉及cAMP，包括神經(jīng)生理學(xué)疾病、內(nèi) 分泌學(xué)疾病、心臟疾病、代謝疾病和免疫疾病。在研究哺乳動(dòng)物復(fù)雜行為時(shí)，技術(shù)局限性導(dǎo) 致不能在時(shí)空上精確控制胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程。調(diào)節(jié)第二信使水平，如cAMP水平的現(xiàn)有化學(xué) 方法起效較慢，導(dǎo)致不能在第一時(shí)間研究與某些組織如如神經(jīng)或心臟組織有關(guān)的機(jī)體的活 性。這些化學(xué)方法通常缺乏探測(cè)這些快速時(shí)間量程(例如，在篩選新療法時(shí))的速度。概述本發(fā)明涉及克服上述挑戰(zhàn)，還涉及第二信使的產(chǎn)生以及有關(guān)成像裝置和它們的應(yīng) 用。本發(fā)明有許多實(shí)例和應(yīng)用，其中一些概述在下文中。與本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式一致，一種方法用于在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生第二信使。用一個(gè)或 多個(gè)異源受體亞單位{例如，腎上腺素能受體(al，0 }修飾表達(dá)光反應(yīng)性嵌合膜蛋白 (例如，視紫質(zhì))的核苷酸序列。光反應(yīng)性膜蛋白在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)以便響應(yīng)光產(chǎn)生第二信使。
與本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式一致，一種方法用于評(píng)價(jià)涉及胞內(nèi)信使相關(guān)的假定治療 方案(例如，藥物或電刺激或經(jīng)由這些第二信使發(fā)揮作用的任何其他物質(zhì))的效果。用一 個(gè)或多個(gè)異源受體亞單位{例如，腎上腺素能受體(α 1，0 }修飾表達(dá)光反應(yīng)性嵌合膜蛋 白(例如，視紫質(zhì))的核苷酸序列。光反應(yīng)性膜蛋白在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)以便響應(yīng)光產(chǎn)生第二信 使。將所述蛋白暴露于光。評(píng)價(jià)治療效果。本發(fā)明的實(shí)施方式涉及表達(dá)具有一個(gè)或多個(gè)異源受體亞單位{例如，腎上腺素能 受體(α 1，β 2)}的光反應(yīng)性嵌合膜蛋白(視紫質(zhì))的細(xì)胞。本發(fā)明的實(shí)施方式涉及表達(dá)具有一個(gè)或多個(gè)異源受體亞單位{例如，腎上腺素能 受體(α ，β2)}的光反應(yīng)性嵌合膜蛋白(視紫質(zhì))的核苷酸序列。上述本發(fā)明的概述不是要描述本發(fā)明的每個(gè)示例性實(shí)施方式或每個(gè)應(yīng)用。下面的 附圖和詳細(xì)描述更具體闡述了這些實(shí)施方式。附圖簡(jiǎn)述結(jié)合附圖，通過(guò)本發(fā)明各個(gè)實(shí)施方式的詳細(xì)描述可以更全面地理解本發(fā)明，圖 中圖IA是與本發(fā)明的示例性實(shí)施方式一致的optc^s和optoGq的示意圖；圖IB是與本發(fā)明的示例性實(shí)施方式一致的未被轉(zhuǎn)染或者用optc^s或optoGq轉(zhuǎn) 染的細(xì)胞的cAMP、cGMP和IP1的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)示意圖；圖IC是與本發(fā)明的示例性實(shí)施方式一致的被opto(is和optoGq的mCherry融合 蛋白轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的Ca-成像示意圖；圖2是與本發(fā)明的示例性實(shí)施方式一致的被optc^s和optoGq的mCherry融合蛋 白轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的Ca-成像示意圖；圖3A是與本發(fā)明的示例性實(shí)施方式一致的表達(dá)各種構(gòu)建物的HEK細(xì)胞的cAMP、 IP1和IP3水平的示意圖；圖;3B是與本發(fā)明的示例性實(shí)施方式一致的慢病毒表達(dá)載體，opto-α AR-表達(dá) 細(xì)胞的GAD免疫染色，以及光刺激10分鐘后在optoXR-表達(dá)細(xì)胞(mCherry+)中觀察到的 PCREB活化；圖4A是與本發(fā)明的示例性實(shí)施方式一致的轉(zhuǎn)導(dǎo)的伏核(accumbens)的光電極 (optrode)尋靶，波峰波形以及所示構(gòu)建物的基線代謝率；圖4B是與本發(fā)明的示例性實(shí)施方式一致的用光刺激記錄的體內(nèi)光電極示意圖；圖4C是與本發(fā)明的示例性實(shí)施方式一致的波峰頻率與光和基線的變化情況的示 意圖；圖4D是與本發(fā)明的示例性實(shí)施方式一致的代謝率變化(firing rate change)動(dòng) 力學(xué)的示意圖；圖5A是與本發(fā)明的示例性實(shí)施方式一致的轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)的立體定向?qū)ぐ?(stereotactic targeting)，植入了光學(xué)纖維的自由移動(dòng)小鼠，位置偏好裝置和試驗(yàn)的示 意圖以及自由移動(dòng)小鼠的軌跡；圖5B是與本發(fā)明的示例性實(shí)施方式一致的對(duì)照和opto-α AR的偏好的示意圖； 和圖5C是與本發(fā)明的示例性實(shí)施方式一致的各種曠場(chǎng)試驗(yàn)的總距離結(jié)果的示意圖。盡管本發(fā)明可包括各種修飾和改變形式，但其具體形式已在附圖中通過(guò)舉例形式 列出，并將在下文中詳細(xì)描述。然而，應(yīng)理解，這并不是要將本發(fā)明限于所述具體實(shí)施方式
。 相反，本發(fā)明包括落入本發(fā)明精神和范圍內(nèi)的所有修飾、等價(jià)形式和改變。發(fā)明詳述本發(fā)明被認(rèn)為可用于各種光學(xué)系統(tǒng)和方法的實(shí)際應(yīng)用，并且發(fā)現(xiàn)本發(fā)明特別適用 于對(duì)細(xì)胞內(nèi)第二信使的水平進(jìn)行光學(xué)控制的系統(tǒng)和方法。由于本發(fā)明不必局限于這些應(yīng) 用，因此通過(guò)對(duì)本文中各種實(shí)施例的討論可以了解本發(fā)明的各個(gè)方面。本發(fā)明的實(shí)施方式涉及通過(guò)在細(xì)胞內(nèi)釋放第二信使而響應(yīng)光學(xué)刺激的嵌合膜蛋 白。在具體例子中，所述嵌合蛋白是異源受體亞單位與通過(guò)光異構(gòu)化與光起反應(yīng)而經(jīng)歷構(gòu) 象(變化)并因此被光激活的蛋白的組合。視紫質(zhì)或亞視黃基(retinylidene)蛋白是可 被修飾以包含異源受體亞單位的光反應(yīng)性蛋白的例子。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式，對(duì)據(jù)信含有七跨膜α-螺旋結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾 以包含與第二信使相關(guān)的異源受體亞單位。當(dāng)在細(xì)胞膜內(nèi)表達(dá)時(shí)，所述蛋白質(zhì)通過(guò)共形 (conformal)改變與光發(fā)生反應(yīng)。共形改變引發(fā)第二信使的釋放/產(chǎn)生。本發(fā)明的實(shí)施方式涉及通過(guò)在細(xì)胞內(nèi)釋放第二信使而響應(yīng)光學(xué)刺激的嵌合膜蛋 白的編碼核苷酸序列。本發(fā)明的實(shí)施方式涉及表達(dá)異源嵌合膜蛋白的細(xì)胞。所述嵌合膜蛋白通過(guò)引發(fā)第 二信使在細(xì)胞內(nèi)的釋放而響應(yīng)光學(xué)刺激。在某些實(shí)施方式中，嵌合膜蛋白的表達(dá)在體內(nèi)發(fā) 生。在其他實(shí)施方式中，嵌合膜蛋白的表達(dá)在體外發(fā)生。本發(fā)明的實(shí)施方式可用于通過(guò)修飾鳥(niǎo)嘌呤核苷酸-結(jié)合蛋白偶聯(lián)的受體蛋白 (GPCR)以包含合適的受體亞單位而產(chǎn)生任何合適的第二信使。本發(fā)明的實(shí)施方式可使用響應(yīng)各種波長(zhǎng)和強(qiáng)度的光的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的實(shí)施方式涉及使用本文所述的嵌合GPCR蛋白來(lái)確定感興趣的第二信使 活性的任何下游效應(yīng)。本發(fā)明的實(shí)施方式涉及在各種細(xì)胞類(lèi)型中表達(dá)嵌合GPCR蛋白，所述細(xì)胞類(lèi)型包 括但不限于哺乳動(dòng)物細(xì)胞、干細(xì)胞、植物細(xì)胞以及酵母和大腸桿菌等單細(xì)胞生物。本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式
涉及優(yōu)化表達(dá)連接有熒光蛋白以利于目測(cè)觀察的嵌 合蛋白，以及形態(tài)的優(yōu)化應(yīng)用以研究光誘導(dǎo)的第二信使活性的下游效應(yīng)。發(fā)明的實(shí)施方式涉及本文所述的遺傳靶向嵌合GPCR蛋白，涉及在其中表達(dá)蛋白 質(zhì)的具體細(xì)胞群。存在的細(xì)胞類(lèi)型特異性啟動(dòng)子在靶細(xì)胞類(lèi)型中選擇性表達(dá)(例如，突觸 蛋白-1靶向神經(jīng)元；肌鈣蛋白變體靶向心臟組織)。將這些啟動(dòng)子置于表達(dá)載體中嵌合 GPCR蛋白的上游可使蛋白質(zhì)在感興趣的細(xì)胞類(lèi)型內(nèi)靶向表達(dá)。其中包括可誘導(dǎo)、可逆、或其 他可控制的啟動(dòng)子系統(tǒng)，如iTet-響應(yīng)、ER-響應(yīng)和Cre/Lox系統(tǒng)。根據(jù)本發(fā)明的示例性實(shí)施方式，開(kāi)發(fā)了遺傳可編碼蛋白質(zhì)，從而，當(dāng)這些蛋白質(zhì)在 感興趣細(xì)胞類(lèi)型中表達(dá)時(shí)就會(huì)響應(yīng)光而產(chǎn)生環(huán)腺苷酸(cAMP)。例如，這可用于目測(cè)觀察細(xì) 胞生理學(xué)的下游效應(yīng)，包括但不限于藥物篩選。其他實(shí)施方式采用導(dǎo)致響應(yīng)光而釋放第二 信使的嵌合和異源GPCR。示例性的第二信使包括cAMP、環(huán)鳥(niǎo)苷酸(cGMP)、肌醇三磷酸/肌 醇1，4，5-三磷酸/三磷酸肌醇(IP3)和花生四烯酸。
與本發(fā)明的實(shí)施方式一致，一種方法被用于評(píng)價(jià)與胞內(nèi)形式相關(guān)的假定治療方案 (例如，藥物或電刺激或通過(guò)這些第二信使發(fā)揮作用的任何其他物質(zhì))的功效。用一個(gè)或多 個(gè)異源受體亞單位{例如，腎上腺素能受體(α 1，β 2)}修飾核苷酸序列以表達(dá)光反應(yīng)性嵌 合膜蛋白(例如，視紫質(zhì))。所述光反應(yīng)性膜蛋白在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)以便響應(yīng)光產(chǎn)生第二信使。 所述蛋白質(zhì)暴露于光。評(píng)價(jià)治療效果?？砂凑账璐碳で€施加光。在一種實(shí)施方式中，表達(dá)的膜蛋白在數(shù)十毫秒內(nèi)響 應(yīng)光。因此，這種刺激曲線可包括一系列快速交替的光脈沖，并可利用例如Ca2+敏感染料監(jiān) 測(cè)所得效果。在一個(gè)例子中，首先可刺激細(xì)胞而不作處理。一旦給予處理后再次刺激細(xì)胞?？?比較各次測(cè)試的結(jié)果以評(píng)價(jià)治療效果。所述處理可包括多種不同方法，其中包括但不限于藥物、對(duì)細(xì)胞的修飾(遺傳修 飾或其他修飾)、細(xì)胞的物理參數(shù)(例如，溫度變化或電刺激)或施加于生物的治療方案。在一種實(shí)施方式中，所述處理是光刺激表達(dá)的膜蛋白。在該例子中，例如，可通過(guò) 監(jiān)測(cè)與被治療疾病相關(guān)的癥狀來(lái)監(jiān)測(cè)效果。在另一實(shí)施方式中，所述治療方案被用作疾病或病癥建模的一部分。例如，可使用 疾病模型(細(xì)胞或動(dòng)物)并評(píng)估背景/基線狀態(tài)，然后表達(dá)蛋白質(zhì)并評(píng)價(jià)治療方案。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，可通過(guò)用cAMP-誘導(dǎo)物和cAMP-靶陽(yáng)離子通道轉(zhuǎn)染細(xì)胞并用 Ca2+-敏感染料目測(cè)觀察所得結(jié)果來(lái)目測(cè)觀察光引發(fā)的cAMP對(duì)靶離子通道的調(diào)節(jié)。第二信 使活性的這種遺傳可編碼的、光活化調(diào)節(jié)物的組合可用于篩選新的療法，且其本身就可作 為一種新的治療形式，暗示了 cAMP涉及ADHD和心臟通道病變等眾多疾病狀態(tài)?？晒こ虡?gòu) 建該蛋白質(zhì)用于各種其他第二信使(例如，IP3),通過(guò)工程構(gòu)建視黃醛結(jié)合位點(diǎn)或選擇具有 不同吸收/作用光譜的視紫質(zhì)或錐形視蛋白的嵌合體用于光活化的其它顏色，以及第二信 使的其他下游效應(yīng)，如鈣信號(hào)傳導(dǎo)和/或激酶活性。

圖1A、1B和IC顯示了從optc^s和optoGq獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，它們是已經(jīng)開(kāi)發(fā)出來(lái) 的第二信使信號(hào)傳導(dǎo)的光活化誘導(dǎo)物的兩個(gè)例子(‘optoXR’)。這些光活化誘導(dǎo)物是視紫 質(zhì)/GPCR嵌合體。OptoGq為Gq信號(hào)傳導(dǎo)提供光反應(yīng)性控制，而OptMs為(is信號(hào)傳導(dǎo)提供 光反應(yīng)性控制。在opto(is和optoGq中都顯示出在黑暗中基線cAMP和IP3水平的差異可忽略，且 與其他第二信使途徑如cGMP途徑?jīng)]有交叉。光刺激optoGq時(shí)看到的cAMP水平的升高是 IP3產(chǎn)生的預(yù)期下游效應(yīng)。圖IA是與本發(fā)明的示例性實(shí)施方式一致的optc^s和optoGq的示意圖。對(duì)于每種 蛋白，視紫質(zhì)的胞內(nèi)環(huán)被那些通常偶聯(lián)于或Gq(Cil)的腎上腺素能蛋白代替。遺 傳編碼序列為在人和鼠細(xì)胞中表達(dá)最優(yōu)化。所得序列的例子包括optc^s =Seq. Id. No. 1和 Seq. Id. No. 2 ；optoGq :Seq. Id No. 3 禾口 Seq. Id. No 4。如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，提供的蛋白質(zhì)的氨基酸序列是支持實(shí)施方式的非限制 性例子，其范圍涵蓋提供一致、可互換或等價(jià)結(jié)果的遺傳序列的變化形式(例如，點(diǎn)突變)。圖IB是與本發(fā)明的示例性實(shí)施方式一致的未被轉(zhuǎn)染或者用optc^s或optoGq轉(zhuǎn) 染的細(xì)胞的cAMP(上圖)、cGMP(中圖)和IP1(下圖；IP3的降解產(chǎn)物)的酶聯(lián)免疫吸附試 驗(yàn)(ELISA)示意圖。如圖所示，圖IB的結(jié)果在從在每個(gè)點(diǎn)上用504nm光(波長(zhǎng)20nm)刺激1分鐘或保持在黑暗中的細(xì)胞獲得的。用環(huán)境控制倒式培養(yǎng)顯微鏡(萊卡(Leica) DMI6000B)進(jìn)行刺激。在cAMP試驗(yàn)中， 一些細(xì)胞用IOuM福司柯林處理30分鐘作為試驗(yàn)的飽和、陽(yáng)性對(duì)照。Optc^s響應(yīng)光而顯著 提高cAMP水平。在Optc^s作用下未發(fā)現(xiàn)cAMP基線水平顯著升高，也未發(fā)現(xiàn)cGMP或IP3水 平有差異。OptoGq響應(yīng)光而顯著提高IP3水平，但未顯著改變cGMP水平。cAMP水平和IP3 產(chǎn)量的提高被認(rèn)為是胞內(nèi)Ca2+釋放的共有序列。圖IC是與本發(fā)明的示例性實(shí)施方式一致的被opto(is和optoGq的mCherry融合 蛋白轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的Ca-成像示意圖。為檢測(cè)cAMP，轉(zhuǎn)染超過(guò)OPtc^s的環(huán)核苷酸門(mén)控Ca2+通 道CNGA2的cAMP-選擇性突變體。IP3激活胞內(nèi)Ca2+儲(chǔ)存的釋放，從而提供可靠的Gq活化 信號(hào)。對(duì)照群也僅用mCherry轉(zhuǎn)染，存在過(guò)量突變體CNGA2。細(xì)胞用fura-2 (培育20-25分 鐘)加載，并且每2秒鐘在340nm和380nm下暴露2毫秒。在optoGs和optoGq每種情況 下，單獨(dú)照射都足以產(chǎn)生Ca信號(hào)，而在對(duì)照群中未檢測(cè)到顯著信號(hào)。圖1顯示了從具體實(shí)驗(yàn)裝置獲得的數(shù)據(jù)，但本發(fā)明不限于此。例如，可采用除轉(zhuǎn)染 外的各種遞送技術(shù)，其中包括但不限于病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)、彈道基因遞送(基因槍)以及自發(fā)核酸攝 入。可修飾基礎(chǔ)-視紫質(zhì)以用于任何合適的異源受體亞單位，如Gi-偶聯(lián)受體如 α 2-腎上腺素能受體或多巴胺D2受體或血清素5ΗΤ2Α受體；或其他Gs-或Gq-偶聯(lián)受體 如多巴胺DlA受體或親代謝性谷氨酸鹽受體。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式，所述基礎(chǔ)-視紫質(zhì)是衍生自歐洲牛(Bostaurus)的 蛋白質(zhì)。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，也可使用除上述基礎(chǔ)-視紫質(zhì)之外的基礎(chǔ)-蛋白質(zhì)，包括各種 7-跨膜蛋白，如錐形視蛋白(紅色、綠色或藍(lán)色)、其他物種的視紫質(zhì)、以及配體-門(mén)控受體 如多巴胺或血清素受體。各種實(shí)現(xiàn)方式涉及在哺乳動(dòng)物體內(nèi)應(yīng)用。這些實(shí)現(xiàn)方式包括，但不限于，測(cè)試以及 證實(shí)神經(jīng)回路和疾病模式。圖3Α和:3Β顯示了在體內(nèi)應(yīng)用第二信使信號(hào)傳導(dǎo)光活化誘導(dǎo)物的兩個(gè)例 子-optoGs (opto-β 2AR)和optoGq (opto-Ci1AR)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。本發(fā)明的一些方面涉及遺傳 編碼光學(xué)工具(‘optoXR’ )萬(wàn)能家族的應(yīng)用和開(kāi)發(fā)，所述家族能平衡G-蛋白-偶聯(lián)受體 (GPCR)的一般構(gòu)效關(guān)系，以便以高時(shí)空精確度募集和控制受體引發(fā)的生物化學(xué)信號(hào)傳導(dǎo)途徑。圖3A和:3B所示結(jié)果涉及兩種響應(yīng)光而選擇性募集不同的靶信號(hào)傳導(dǎo)途徑的特定 optoHL在體內(nèi)，這兩種opto)(R對(duì)伏核的波峰形成具有相反作用，其本身對(duì)伏核的精確定 時(shí)opto)(R光刺激足以驅(qū)動(dòng)自由移動(dòng)小鼠的條件位置偏好。optdR法能夠以可尋靶和時(shí)間 上精確的方式測(cè)試與行為哺乳動(dòng)物中生化信號(hào)傳導(dǎo)因果影響有關(guān)的假說(shuō)。對(duì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)的光學(xué)控制被用于哺乳動(dòng)物，采用GPCR的共有構(gòu)效關(guān)系在體內(nèi) 開(kāi)發(fā)和表達(dá)具有將信號(hào)偶聯(lián)于效應(yīng)物的新轉(zhuǎn)導(dǎo)邏輯(transduction logic)的多種不同視 蛋白/GPCR2嵌合體。與各種應(yīng)用一致，工程構(gòu)建一種或多種嵌合視蛋白-受體蛋白在哺乳 動(dòng)物體內(nèi)發(fā)揮功能，可被特定細(xì)胞尋靶，以及響應(yīng)精確定時(shí)的光脈沖。這種方法能夠在精確 確定且行為相關(guān)的時(shí)刻使用高速光學(xué)刺激(和蛋白質(zhì)響應(yīng))來(lái)測(cè)試和表征胞內(nèi)生化事件。一些非限制性的例子包括，脈動(dòng)與補(bǔ)充調(diào)節(jié)(tonic modulation)，不同調(diào)節(jié)系統(tǒng)之間的同 步，以及指定細(xì)胞類(lèi)型在一段時(shí)間量程內(nèi)的其他基礎(chǔ)生理與病理過(guò)程。哺乳動(dòng)物應(yīng)用已被成功實(shí)現(xiàn)。在一個(gè)示例性應(yīng)用中，首先通過(guò)比對(duì)Gq-偶聯(lián)人Cila 腎上腺素能受體(α :AR)和Gs-偶聯(lián)倉(cāng)鼠β 2-腎上腺素能受體(β 2AR)與Gt-偶聯(lián)牛視紫 質(zhì)的保守殘基，用特定腎上腺素能受體的那些環(huán)取代視紫質(zhì)的胞內(nèi)環(huán)(圖1A)。基于結(jié)構(gòu)模 型工程改造交換每個(gè)受體的胞內(nèi)區(qū)(包括羧基末端結(jié)構(gòu)域)以便從Gt轉(zhuǎn)移G-蛋白偶聯(lián)，并 為在哺乳動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)最優(yōu)化各受體。用各種配體活化后，天然受體可具有多種總體狀態(tài) 以募集配體-偏好信號(hào)傳導(dǎo)現(xiàn)象的經(jīng)典和非經(jīng)典途徑。opto)(R在讀出燈(sensing light) 下可能以生物依賴(lài)性方式選擇單一活性總體狀態(tài)。編碼嵌合體(opto- α AR和opto β 2AR)的基因融合于熒光蛋白。用僅被 opto-CI1AR轉(zhuǎn)染的HEK細(xì)胞(預(yù)計(jì)通過(guò)Gq募集[Ca2+]》或同時(shí)被opto-β 2AR(預(yù)計(jì)通 過(guò)(is募集環(huán)狀A(yù)MP)和cAMP-門(mén)控Ca2+通道CNGA2-C460W/E583M轉(zhuǎn)染的HEK細(xì)胞中的成 像[Ca2+] i (胞內(nèi)鈣濃度)確認(rèn)功能性opto)(R表達(dá)。參比[Ca2+] 1成像證實(shí)60秒綠光刺激 (504+/-6nm,7mff mm2)足以驅(qū)動(dòng)顯著的opto)(R下游[Ca2+] i信號(hào)，但對(duì)照條件下除外(圖 2)，顯示功能性表達(dá)。為測(cè)試每種opto)(R控制的信號(hào)傳導(dǎo)的特異性，轉(zhuǎn)導(dǎo)的HEK細(xì)胞用3mW mm 2504+/-6nm光照射60秒，然后裂解并通過(guò)免疫測(cè)定分析cGMP、cAMP和IP1 (IP3降解產(chǎn) 物)的水平。opto-β 2AR的預(yù)計(jì)經(jīng)典模式對(duì)應(yīng)于其分子設(shè)計(jì)，即光學(xué)刺激在opto-β 2AR-表 達(dá)細(xì)胞中導(dǎo)致顯著產(chǎn)生cAMP(圖3A，上圖)，類(lèi)似于野生型β 2AR藥理學(xué)刺激且不募集 IP3(圖3A，中圖)、[&2丄所實(shí)現(xiàn)的(圖2)或?qū)嵸|(zhì)上的暗活性。相反，產(chǎn)生的光刺激顯著 上調(diào)opto-Ci1AR-表達(dá)細(xì)胞中的IP3信號(hào)傳導(dǎo)(圖3A，中圖)，類(lèi)似于野生型α ^R藥理學(xué) 刺激誘導(dǎo)的水平。結(jié)合[(^21評(píng)估(圖2)，這些數(shù)據(jù)揭示了 Gq募集的預(yù)期模式，一種在 0 切-0義1 -表達(dá)細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)的模式(圖34，上圖)。光學(xué)刺激表達(dá)任一構(gòu)建物的細(xì)胞不 能調(diào)節(jié)cGMP水平(圖3Α，下圖)，進(jìn)一步說(shuō)明了嵌合蛋白的信號(hào)傳導(dǎo)特異性。類(lèi)似試驗(yàn)顯 示，optoXR的作用光譜非常接近天然視紫質(zhì)，能夠整合生物適用的光通量范圍內(nèi)的信號(hào)，并 且能夠激活非-經(jīng)典途徑到與野生型受體類(lèi)似的程度，如p42/p44-MAPK信號(hào)傳導(dǎo)。已經(jīng)測(cè)試了完整神經(jīng)組織內(nèi)OptdR的性能，包括是否需要補(bǔ)充視黃醛輔因子。在 該測(cè)試中，攜帶受突觸蛋白-I啟動(dòng)子控制的opto)(R融合基因的慢病毒載體(為了將生化 調(diào)節(jié)靶向局部神經(jīng)元而非其他潛在的(is/Gq-反應(yīng)性細(xì)胞組織元件，如神經(jīng)膠質(zhì)和內(nèi)皮細(xì) 胞；圖:3B，上左)被立體定位注入成年小鼠的伏核。這種方法的目標(biāo)是用伏核內(nèi)的軀體樹(shù) 突區(qū)室對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行生化調(diào)節(jié)( 95% GABA能中型棘神經(jīng)元，無(wú)進(jìn)一步的亞型特異性；圖 3B，左圖)，并且，由于這些慢病毒屬不能通過(guò)軸突轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞，從而排除通道纖維或傳入突觸 前末稍。轉(zhuǎn)導(dǎo)2周后，在人造腦脊液內(nèi)制備伏核的急性冠狀切片(acute coronal slice), 光學(xué)刺激10分鐘，立即固定并用kr 133-磷酸化CREB (pCREB, cAMP和Ca2+-偶聯(lián)信號(hào)傳導(dǎo) 級(jí)聯(lián)的生化整合物)染色。在沒(méi)有補(bǔ)充外源類(lèi)視色素時(shí)，在表達(dá)opto)(R的細(xì)胞群內(nèi)觀察到 PCREB顯著升高(圖:3B，右圖)，但在未光照組織內(nèi)無(wú)此現(xiàn)象。用靶向轉(zhuǎn)導(dǎo)的伏核的光電極通過(guò)記錄多單位體內(nèi)神經(jīng)元開(kāi)通(multi-unit in vivo neuronal firing)來(lái)確定opto)(R激活對(duì)伏核局部電活性的功能后果(圖4A)。在黑 暗中用任一構(gòu)建物均未觀察到基線代謝率有顯著差異(圖4A，右下)。光學(xué)刺激導(dǎo)致表達(dá) opto-i32AR的伏核中網(wǎng)絡(luò)開(kāi)通降低(圖4B左圖顯示了效應(yīng)動(dòng)力學(xué)；總結(jié)數(shù)據(jù)分別顯示在圖4C和4D中)，與之前靶向(is的藥理學(xué)研究一致。光學(xué)刺激增加了表達(dá)opto- α :AR的伏核 中的開(kāi)通(圖4B右圖；圖4C，4D)。波峰頻率直方圖顯示，opto)(R對(duì)代謝率的影響的動(dòng)力學(xué) 與生物化學(xué)一致，而非信號(hào)的電引發(fā)(圖4D)。這些電生理學(xué)數(shù)據(jù)以及早期生化驗(yàn)證結(jié)果都 支持opto)(R能在體內(nèi)功能性表達(dá)，允許對(duì)胞內(nèi)級(jí)聯(lián)進(jìn)行差異性光可激活控制，以及調(diào)節(jié)網(wǎng)
絡(luò)生理學(xué)。在一種應(yīng)用中，光遺傳學(xué)(optogenetic)被用來(lái)評(píng)價(jià)精確定時(shí)的opto)(R刺激調(diào)節(jié) 自由移動(dòng)小鼠行為的能力。將便攜式固態(tài)光傳送與轉(zhuǎn)基因表達(dá)optdR組合以便以用于操 作性行為的時(shí)間精確方式對(duì)伏核神經(jīng)元內(nèi)的胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)進(jìn)行光學(xué)控制(圖5A)。共焦分 析顯示表達(dá)局限于局部伏核；尤其在傳入纖維中、在伏核的遠(yuǎn)端突出區(qū)域、在神經(jīng)膠質(zhì)內(nèi)或 在周?chē)鷧^(qū)域內(nèi)未觀察到標(biāo)記。作為三天操作性條件化位置偏好試驗(yàn)的一部分，光學(xué)刺激靶 向轉(zhuǎn)導(dǎo)的伏核(圖5A)。在該測(cè)試的每一天讓動(dòng)物自由探索位置偏好裝置(圖5A，下圖)。 在第1天，動(dòng)物自由探索該裝置而不作光學(xué)刺激。在第2天，一旦動(dòng)物自由進(jìn)入指定的條件 室，安裝在轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)的激光二極管-偶聯(lián)光學(xué)纖維傳遞IOHz的光脈沖以接近強(qiáng)獎(jiǎng)勵(lì)期間單 胺能輸入類(lèi)似的強(qiáng)度。路徑追蹤顯示，柔性光學(xué)纖維法能夠完全地不受障礙地探索整個(gè)室 (圖5A，下圖)。在第3天再讓動(dòng)物自由探索沒(méi)有光刺激的裝置，通過(guò)兩個(gè)獨(dú)立的不知情記 錄員量化動(dòng)物花費(fèi)在條件室內(nèi)的時(shí)間。顯然，表達(dá)opto-Ci1AR的動(dòng)物在光學(xué)刺激后對(duì)裝置 的條件化側(cè)有強(qiáng)烈偏好(圖5B)。這種時(shí)間上精確的生化調(diào)節(jié)效果在兩次獨(dú)立opto-a AR 動(dòng)物測(cè)試中是可重現(xiàn)的(每次測(cè)試斯氏t檢驗(yàn)為n = 5-6，P < 0. 05，對(duì)條件室中的時(shí)間； η = ILP < 0.01，對(duì)所有群體)，而其他視蛋白基因，opto-β 2AR和ChR2，顯示出較少驅(qū)使 偏好效應(yīng)。opto- α AR對(duì)伏核的刺激效應(yīng)特異于獎(jiǎng)勵(lì)相關(guān)行為，并且不能延伸至直接調(diào)節(jié) 焦慮-相關(guān)行為或運(yùn)動(dòng)行為，因?yàn)樵跁鐖?chǎng)測(cè)試中輸送到相同動(dòng)物組的相同光學(xué)刺激顯示對(duì) 朝墻壁的移動(dòng)距離或偏好沒(méi)有顯著影響(圖5C)?，F(xiàn)在將描述與上述實(shí)驗(yàn)一致的一個(gè)具體的非限制性實(shí)施方式。體內(nèi)記錄和分析采 用光電極，其由與記錄電極(1MV鎢，A-M系統(tǒng)(A-M Systems))偶聯(lián)的直徑200mm的多模光 學(xué)纖維(托爾實(shí)驗(yàn)室(Thor labs))構(gòu)成，降低200-400mm的電極/纖維端點(diǎn)到端點(diǎn)的距離 從而進(jìn)入小鼠轉(zhuǎn)導(dǎo)的伏核(電極端點(diǎn)低于前鹵4. 8-5. 2mm)，小鼠被放置在立體定向框架內(nèi) (DK儀器公司(David Kopf Instruments))并用異氟醚麻醉。473nm 二極管激光器(CL公 司(CrystaLaser))的光經(jīng)纖維傳送。使電信號(hào)通過(guò)帶通濾波器并放大(0. 3-lkHz，1800微 電極交流放大器，A-M系統(tǒng))，并用pClamp 10. 0 (分子裝置公司(Molecular Devices))分 析。通過(guò)閾值檢測(cè)波峰，并由檢測(cè)人員獨(dú)立驗(yàn)證。采用光刺激進(jìn)行行為分析，通過(guò)偶聯(lián)于473nm藍(lán)色二極管激光器(CL公司)的光 學(xué)纖維(直徑200mm，托爾實(shí)驗(yàn)室)施加光刺激，并用套管尋靶伏核(距離端點(diǎn)O-IOOmm)登 記。通過(guò)函數(shù)發(fā)生器(Agilent 33220A)給opto)(R輸送脈沖寬度為50ms的光。在標(biāo)準(zhǔn)裝 置(SD儀器公司(SD Instruments))內(nèi)進(jìn)行位置偏好(測(cè)試)，移開(kāi)兩室之間的墻壁以允許 自由探索。采用MATLAB (Mattiworks)運(yùn)行定制的計(jì)數(shù)軌跡(tallying script)，由兩名獨(dú)立 的不知情的觀察者根據(jù)錄像分析數(shù)據(jù)，以了解動(dòng)物花費(fèi)在每個(gè)室上的時(shí)間量。對(duì)于曠場(chǎng)測(cè) 試，將動(dòng)物放在40340cm的方形曠場(chǎng)內(nèi)；用與位置偏好實(shí)驗(yàn)相同的參數(shù)輸送光刺激。采用自 動(dòng)軟件(Viewpoint)分析錄像，以了解在中間15315cm方形區(qū)域以及外部環(huán)狀區(qū)域(場(chǎng)地 的其余部分)內(nèi)的總時(shí)間和總距離。
9
用雙尾斯氏t檢驗(yàn)(用Microsoft Excel計(jì)算)或單向ANOVA加Tukey后驗(yàn)測(cè)試 (GraphPad Prism)進(jìn)行上述統(tǒng)計(jì)分析。所有歸納性柱狀圖用平均值+/_s. e. m.表示，顯著 性如下*P < 0. 05，**P < 0. 01，***P < 0. 001。支持本發(fā)明各種實(shí)施方式的令人驚訝的結(jié)果和功效的進(jìn)一步細(xì)節(jié)見(jiàn)《時(shí)間上 精石角體內(nèi)控制胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)》(Temporally precise in vivo control of in vivo signalling)，Raag D. Airan 等，Nature 458，1025-10 Q009/4/23)，將其通過(guò)引用完整納 入本文。下面的內(nèi)容詳細(xì)描述了與本發(fā)明實(shí)施方式一致的具體非限制性方法。該方法的諸 多變化也包含在本發(fā)明范圍之內(nèi)。載體構(gòu)建合成opto- α AR和opto- β 2AR的哺乳動(dòng)物密碼子最佳序列(圖IA中的氨基酸 序列)，將其克隆入PCDNA3. 1，并用NotI位點(diǎn)與mCherry或YFP (刪除其起始密碼子)的 N-末端融合。optoXR和mCherry/YFP之間的接頭是5，GCGGCCGCC 3，。通過(guò)將每種optoXR mCherry的轉(zhuǎn)基因克隆入pLenti突觸蛋白I hChR2 mCherry WPRE載體的AgeI和EcoRI位 點(diǎn)來(lái)構(gòu)建含有突觸蛋白IoptoXR mCherry的慢病毒載體。慢病毒制造制造了高效價(jià)慢病毒。簡(jiǎn)言之，HEK 293FT細(xì)胞在4-層細(xì)胞工廠(Nunc)內(nèi)用含 10% FBS的DMEM平鋪培養(yǎng)至90%匯合。細(xì)胞用690 μ g上述慢病毒載體和兩種輔助質(zhì)粒 (690 μ g ρ Δ CMVR8. 74和460 μ g pMD2. G)共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染15小時(shí)后更換培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染M 小時(shí)后將培養(yǎng)基更換成200-220mL含5mM 丁酸鈉的無(wú)血清Ultra⑶LTURE (坎布萊克斯公司 (Cambrex))。在轉(zhuǎn)染后40小時(shí)將現(xiàn)在含有病毒的培養(yǎng)上清液以IOOOrpm離心5分鐘以除去 細(xì)胞碎片，然后用0.45μπι低蛋白結(jié)合抽濾瓶過(guò)濾。澄清的上清液然后用SW觀轉(zhuǎn)子(貝 克曼公司(Beckman))以55，OOOg超濾2小時(shí)以沉淀病毒。離心之后棄去上清液并將所得 病毒沉淀溶于總共100 μ L冷的)PBS。將重懸后的病毒以7000rpm離心5分鐘以除去 剩余細(xì)胞和病毒碎片。將等分樣品于-80°C冷凍直至使用。動(dòng)物外科學(xué)和行為學(xué)按照斯坦福大學(xué)的實(shí)驗(yàn)脊椎動(dòng)物手冊(cè)的規(guī)定關(guān)養(yǎng)和處理10-12周齡的雌性 C57BL/6小鼠。如下將病毒溶液輸送到右伏核。用異氟醚麻醉動(dòng)物并剪除頭頂?shù)拿?。在?氟醚麻醉下將動(dòng)物的頭放入立體定向框架(DK儀器公司)。在頭皮正中線上切一切口并在 前鹵前1. 10mm、側(cè)1. 45mm處在顱骨上鉆一個(gè)直徑約Imm的孔。然后將預(yù)先加入病毒的斜 角33號(hào)針(NanoFi 1，WP儀器公司(World Precision Instruments))插入伏核下部(針尖 距離前鹵腹側(cè)4. 70-4. 80mm)并用自動(dòng)注射泵(NanoFi 1，WP儀器公司)以IOOnL/分的速度 注射1.0 μ L病毒。注射后讓組織放松以及讓液體擴(kuò)散3-5分鐘，然后取出針頭。對(duì)進(jìn)行急 性切片或體內(nèi)記錄實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物，用牙粘固粉(朗氏牙科(Lang Dental))填充開(kāi)顱部分并用 VetB0nd(3M公司)封閉切口。對(duì)進(jìn)行行為分析的動(dòng)物，插管(C316G，在基座下切開(kāi)4. 5mm; PlasticsOne)和基座一起放入頭蓋骨。插管用Metabond(帕卡公司(Parkell))和牙粘固 粉(朗氏牙科)固定。將VetBond或牙粘固粉干燥，然后將動(dòng)物從框架中取出，使其恢復(fù)至 少1周，再進(jìn)行操作。對(duì)行為實(shí)驗(yàn)的對(duì)照動(dòng)物進(jìn)行與試驗(yàn)動(dòng)物相同的操作(手術(shù)、植入插管、 光刺激)，但僅注射載體(PBQ代替病毒。在位置偏好實(shí)驗(yàn)中，研究采用了對(duì)任一側(cè)室(>70%或< 10% )或?qū)χ虚g室(> 40% )均未顯示出基線偏好的動(dòng)物；超過(guò)90%的動(dòng)物滿 足關(guān)于非偏好、平衡位置偏好設(shè)計(jì)的標(biāo)準(zhǔn)。急性切片制備動(dòng)物用異氟醚麻醉并用外科剪刀(精細(xì)科學(xué)工具公司(Fine Science Tools)) 斷頭。切下275 μ m厚的包含伏核的冠狀切片并儲(chǔ)存于含有64mM NaCl、2. 5mM KClU. 25mM NaH2PO4,25mM NaHC03、IOmM 葡萄糖、120mM 蔗糖、0. 5mM CaCl2 禾日 7mM MgCl2 的切割溶液(用 95% 02/5% CO2平衡)。切片之后將切片在切片溶液內(nèi)32-35°C培育30分鐘，然后室溫培 育直至實(shí)驗(yàn)。離體optdR刺激時(shí)將切片放在直立式顯微鏡(BX51W，奧林巴斯(Olympus)) 的載物臺(tái)上并用含有 124mM NaCl、3mM KClU. 25mM NaH2PO4,26mM NaHCO3、IOmM 葡萄糖、 2. 4mM CaCl2和1. 3mM MgCl2的人工腦脊液(用95 % 02/5 % CO2平衡)灌注。使300W Lambda DG_4(蘇特公司(Sutter))產(chǎn)生的光通過(guò)473nm士20nm帶通濾波器(薩姆洛克公司 (Semrock))并施加于切片，采用4X目鏡(0. ^NA)，照射10分鐘，然后立即固定進(jìn)行隨后的 分析。信號(hào)傳導(dǎo)確認(rèn)試驗(yàn)HEK293FT細(xì)胞(英杰公司Qnvitrogen))在M孔板內(nèi)用脂轉(zhuǎn)染胺2000 (英杰公 司)轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染4-6小時(shí)后更換成無(wú)血清培養(yǎng)基。為進(jìn)行Ca2+成像，將細(xì)胞鋪放在基質(zhì)膠 涂覆的蓋玻片上，并加入配制在Tyrode(含ΙμΜ ATR)中的F-127普流尼克/DMSO (探針公 司(Probes))中的5 μ g/ml fura_2AM，在37°C和5% CO2氣氛中培育20-25分鐘。加載后 將蓋玻片在奧林巴斯BX51W上;340nm/380nm成像，采用Metaf Iuor (艾克森儀器公司(Axon Instruments))控制300W Lambda DG_4(蘇特公司)。為進(jìn)行免疫測(cè)定，轉(zhuǎn)染18- 小時(shí) 后加入1 μ M ATR和50mM LiCl (以防止IP1降解)并將平板轉(zhuǎn)移至環(huán)境控制顯微鏡(萊卡 DMI6000 ；37°C,5% CO2)。每次光學(xué)刺激每個(gè)孔中的5個(gè)區(qū)域(蘇特300W Lambda DG-4 ；薩 姆洛克504/12nm帶通濾波器；10X 0. 30NA目鏡)；3孔/條件。培育(cAMP/cGMP :20分鐘； IP1 :1小時(shí))，之后裂解細(xì)胞并通過(guò)HTRF (CB公司(CisBio))分析，用Biotek Synergy4讀 數(shù)。免疫組織化學(xué)和共焦分析體內(nèi)刺激結(jié)束之后小鼠用冰冷卻的4%低聚甲醛(PFA)的PBS (pH 7. 4)溶液經(jīng)心 臟灌注90分鐘。取出大腦并用4% PFA固定過(guò)夜，然后用30%蔗糖的PBS溶液平衡。在冷 凍切片機(jī)上切下40 μ m厚的冠狀切片，儲(chǔ)存于4°C的冷凍保護(hù)劑直至進(jìn)行免疫組織化學(xué)處 理。自由流動(dòng)切片用PBS洗滌，然后在0. 3% TxlOO和3%標(biāo)準(zhǔn)驢血清(NDS)中培育30分 鐘。為進(jìn)行急性切片實(shí)驗(yàn)，刺激后立即將275μπι厚切片在冰冷卻的4% PFA中固定1小時(shí) 并用0. 5% TxlOO和3% NDS培育。為進(jìn)行MAPK實(shí)驗(yàn)，ΗΕΚ293細(xì)胞刺激后立即將蓋玻片固 定15分鐘，用0.6% H2O2培育，然后用3% NDS配制的0. 1% TxlOO滲透化處理。在0.01% TxlOO和3% NDS中與第一抗體培育過(guò)夜小鼠抗-GAD67 1 500 (馬薩諸塞州比爾里卡的 密里博公司(Millipore，Billerica，MA))；大鼠抗-cfos 1 500 (加利福尼亞州圣迭戈 的卡爾生化公司(Calbiochem，San Diego, CA))；大鼠抗-磷酸-CREB Serl33 1 500 (密 里博公司)。洗滌切片并與偶聯(lián)于FITC或Cy5 (賓夕法尼亞州西格羅夫的杰克遜實(shí)驗(yàn)室 (Jackson Laboratories, West Grove, PA))的第二抗體(1 1000)室溫培育 3 小時(shí)。與 DAPKl 50，000)培育20分鐘后洗滌切片并用PVD-DABC0固定在顯微鏡載玻片上。其余與第一抗體(兔抗-磷酸Erkl/2 ；抗-磷酸-MAPK p38 1 500 (威斯康星州麥迪遜的普 利馬公司(Promega，Madison，WI))；小鼠單克隆抗-多巴胺Dl受體1 50(開(kāi)米肯公司 (Chemicon))；兔多克隆抗-多巴胺D2受體1 50 (密里博公司)；山羊多克隆抗-膽堿乙 ?；D(zhuǎn)移酶1 200(密里博公司))培育過(guò)夜，然后與生物素化第二抗體(1 500，杰克遜 實(shí)驗(yàn)室)培育，用鏈霉抗生物素蛋白-生物素-辣根過(guò)氧化物酶(ABC試劑盒(加利福尼亞 州伯林格姆的載體實(shí)驗(yàn)室(Vector Labs,Burlingame,CA)))處理，并按照制造商的說(shuō)明進(jìn) 行TSA檢測(cè)(康涅狄格州舍爾頓的帕金埃爾默公司(Perkin Elmer，Sielton，CT))。用20X/0. 70NA或40X/1. 25NA油鏡在萊卡TCS SP5掃描激光顯微鏡上獲得共 焦熒光圖像。在插管通道下500μπι區(qū)域內(nèi)獲得每種條件的4張連續(xù)疊加圖像。采用 Volocity (Improvision)軟件，用DAPI染色來(lái)描繪伏核以確定cfos或pCREB免疫反應(yīng)性的 平均像素強(qiáng)度。陽(yáng)性或PCREB-活性細(xì)胞通過(guò)強(qiáng)度閾確定，獲取圖像并在不知曉實(shí)驗(yàn)條件的 情況下進(jìn)行分析。表 Sl數(shù)據(jù)的pCREB強(qiáng)度原始數(shù)值(au)列在圖中。每個(gè)亞組的平均值和SEM用黑體 表示；各亞組相比對(duì)照的雙尾和t檢驗(yàn)ρ-值用斜體表示。
權(quán)利要求
1.一種在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生第二信使的方法，所述方法包括用一個(gè)或多個(gè)異源受體亞單位修飾表達(dá)基于視紫質(zhì)的光反應(yīng)性嵌合膜蛋白的核苷酸 序列；和在響應(yīng)光而產(chǎn)生第二信使的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)該光反應(yīng)性膜蛋白。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述一個(gè)或多個(gè)異源受體亞單位包括腎上 腺素能受體。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述基于視紫質(zhì)的光反應(yīng)性嵌合膜蛋白是 七跨膜蛋白。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二信使是cAMP、環(huán)鳥(niǎo)苷酸(cGMP)、肌 醇三磷酸/肌醇1，4，5-三磷酸/三磷酸肌醇(IP3)和花生四烯酸中的一個(gè)。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述表達(dá)步驟在體內(nèi)完成。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述表達(dá)步驟在體外完成。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，還包括光學(xué)刺激表達(dá)的光反應(yīng)性膜蛋白的步驟。
8.一種評(píng)價(jià)涉及胞內(nèi)信使相關(guān)的假定治療方案的效果的方法，所述方法包括 用一個(gè)或多個(gè)異源受體亞單位修飾表達(dá)基于視紫質(zhì)的光反應(yīng)性嵌合膜蛋白的核苷酸序列；在響應(yīng)光而產(chǎn)生第二信使的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)該光反應(yīng)性膜蛋白； 將該蛋白暴露于光；和 評(píng)價(jià)治療效果。
9.一種表達(dá)具有一個(gè)或多個(gè)異源受體亞單位的基于視紫質(zhì)的光反應(yīng)性嵌合膜蛋白的 細(xì)胞。
10.如權(quán)利要求9所述的細(xì)胞，其特征在于，所述一個(gè)或多個(gè)異源受體亞單位是腎上腺 素能受體α 1和β 2中的至少一個(gè)。
11.一種表達(dá)具有一個(gè)或多個(gè)異源受體亞單位的基于視紫質(zhì)的光反應(yīng)性嵌合膜蛋白的 核苷酸序列。
12.一種如kq. Id. No. 1或kq. Id. No. 3及其點(diǎn)突變體所述的核苷酸序列。
13.—種表達(dá)如kq. Id. No. 1或kq. Id. No. 3及其點(diǎn)突變體所述的氨基酸的細(xì)胞。
全文摘要
許多方法、裝置和組合物用于光活化分子。一種此類(lèi)方法是在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生第二信使。用一個(gè)或多個(gè)異源受體亞單位{例如，腎上腺素能受體(α1，β2)}修飾表達(dá)光反應(yīng)性嵌合膜蛋白(例如，視紫質(zhì))的核苷酸序列。在響應(yīng)光產(chǎn)生第二信使的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)光反應(yīng)性膜蛋白。
文檔編號(hào)C12P21/06GK102076866SQ200980125913
公開(kāi)日2011年5月25日 申請(qǐng)日期2009年5月29日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月29日
發(fā)明者K·戴斯羅斯, R·D·艾然 申請(qǐng)人:利蘭·斯坦福青年大學(xué)托管委員會(huì)