專利名稱：：小環(huán)dna載體制劑及其制備方法和使用方法小環(huán)DNA載體制劑及其制備方法和使用方法政府權(quán)利本發(fā)明得到國立衛(wèi)生研究院授予的聯(lián)邦基金HL64274號資助，在政府支持下獲得。美國政府對本發(fā)明享有一定權(quán)利。
背景技術(shù)：
：將外源性核酸序列引入細(xì)胞內(nèi)稱為“轉(zhuǎn)化”的過程在各種生物技術(shù)和相關(guān)應(yīng)用中，包括研究、合成和治療性應(yīng)用中發(fā)揮了重要效益。轉(zhuǎn)化起到關(guān)鍵作用的研究應(yīng)用包括產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因細(xì)胞和動物。轉(zhuǎn)化起到關(guān)鍵作用的合成應(yīng)用包括產(chǎn)生肽和蛋白質(zhì)、以及治療性RNA如干擾性RNA或核酶。轉(zhuǎn)化起到重要作用的治療性應(yīng)用包括基因治療應(yīng)用。由于轉(zhuǎn)化可普遍用于上述應(yīng)用和其他應(yīng)用，已開發(fā)了各種不同的轉(zhuǎn)化方法。在轉(zhuǎn)化的許多應(yīng)用中，引入外源性DNA的方式需要能使該外源DNA長期表達(dá)其編碼的蛋白質(zhì)。外源DNA的長期表達(dá)主要通過將該外源DNA摻入到靶細(xì)胞的基因組中而實(shí)現(xiàn)?；蚪M整合的一種方法是采用同源重組載體。而依賴同源重組的技術(shù)缺點(diǎn)在于不可能總是具有這種必須的同源性，及重組過程緩慢等等。因此，基于同源重組的方法不是完全令人滿意的方法。相應(yīng)地開發(fā)了基于病毒的另一種替代轉(zhuǎn)化方法，此法中，采用病毒為載體將外源DNA引入細(xì)胞內(nèi)，然后將引入的DNA整合入靶細(xì)胞的基因組中。發(fā)現(xiàn)可采用的基于病毒的載體包括逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，如莫洛尼小鼠白血病病毒載體。發(fā)現(xiàn)可采用的其它病毒載體包括腺病毒衍生載體、HSV衍生載體，辛德比斯病毒衍生載體等等。雖然病毒載體可提供一些優(yōu)點(diǎn)，但在許多情況下，采用它們不是最優(yōu)的。病毒載體相關(guān)的缺點(diǎn)包括具有免疫原性、病毒并發(fā)癥以及整合介導(dǎo)產(chǎn)生突變的問題等等。因此，開發(fā)用外源核酸轉(zhuǎn)化細(xì)胞以持久、長期表達(dá)所編碼蛋白質(zhì)的其它方法仍然令人感興趣。特別感興趣的是開發(fā)不伴有基因組整合而能持久表達(dá)蛋白質(zhì)的、非病毒的核酸體內(nèi)轉(zhuǎn)移方法和載體，所述載體應(yīng)能提供不依賴于其表達(dá)盒的序列和取向的持久表達(dá)。相關(guān)文獻(xiàn)感興趣的美國專利包括5，985，847和5，922，687。還感興趣的有W0/11092和已公開的美國專利申請?zhí)?0040214329。其它感興趣的參考文獻(xiàn)包括=Wolff等.，“基因體內(nèi)直接轉(zhuǎn)移到小鼠肌肉中”(DirectGeneTransferintoMouseMuscleinVivo),Science(1990)247:1465-1468；Hickman等，“DNA直接注入肝臟后的基因表達(dá)”(GeneExpressionFollowingDirectInjectionofDNAintoLiver),Hum.Gen.Ther.(1994)5:1477-1483；Acsadit等.，“體內(nèi)大鼠心臟中的直接基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)”(DirectGeneTransferandExpressionintoRatHeartinVivo)NewBiol.(1991年1月)3:71-81禾口ChenZY等，HumanGeneTherapyl6:126,2005。發(fā)明概述本發(fā)明提供用于給予對象的小環(huán)核酸載體制劑。這種小環(huán)核酸載體包含感興趣的多核苷酸如要表達(dá)的感興趣序列，和作為單向位點(diǎn)特異性重組酶的重組產(chǎn)物并缺乏質(zhì)粒骨架細(xì)菌DNA序列的序列(質(zhì)粒BB)。本技術(shù)的特征包括含有單一小環(huán)群體的小環(huán)制劑，所述小環(huán)包含轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒單體，該單體的結(jié)構(gòu)對于體內(nèi)遞送和表達(dá)基因已優(yōu)化，在這種環(huán)形DNA中基本上沒有不良內(nèi)切核酸酶和重組酶的編碼基因，因此允許更容易地制備臨床級的小環(huán)DNA載體，所述方法允許大大減少L-阿拉伯糖的用量來誘導(dǎo)DNA編輯酶，顯著降低小環(huán)的生產(chǎn)成本，以及該載體尺寸較小使得親代質(zhì)粒的構(gòu)建更容易。含所述小環(huán)核酸載體的制劑的特征是基本上沒有污染的核酸序列，更重要的是完全沒有污染的編碼重組酶如WiiC31的環(huán)形核酸序列，和/或污染的編碼限制性內(nèi)切核酸酶如IScel的核酸序列。這類污染序列不良，因?yàn)樗鼈儾淮罂赡茉谵D(zhuǎn)化過程中轉(zhuǎn)運(yùn)入受者細(xì)胞中并表達(dá)，其表達(dá)產(chǎn)物可能損壞受者細(xì)胞的基因組DNA。本文也提供制備本發(fā)明制劑的方法，以及將該小環(huán)核酸載體制劑給予對象的方法。發(fā)現(xiàn)所述方法和組合物可用于多種不同應(yīng)用，包括研究和治療應(yīng)用。本領(lǐng)域技術(shù)人員通過閱讀以下更全面描述的本發(fā)明詳細(xì)內(nèi)容將會明白本發(fā)明的這些和其他目的、優(yōu)點(diǎn)和特征。附圖簡要說明通過閱讀以下詳述并結(jié)合伴隨的附圖可以最佳地了解本發(fā)明。要強(qiáng)調(diào)的是根據(jù)常規(guī)實(shí)踐，該附圖中的各種特征不成比例。相反，為澄清起見，各特征的維度尺寸可隨意擴(kuò)大或縮小。包括以下附圖。圖1A-1G顯示各種質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)圖。圖A顯示先前所述的p20C31.hFIX質(zhì)粒，它是小環(huán)產(chǎn)生質(zhì)粒(Chen等，HumanGeneTherapy161，2005)。BAD，araC-BAD調(diào)控系統(tǒng)的阿拉伯糖誘導(dǎo)型啟動子；araC，阻抑基因；0C31，從鏈霉菌噬菌體衍生的重組酶基因；attB，重組酶0C31的細(xì)菌附著位點(diǎn)；attP，噬菌體附著位點(diǎn)；IkeIg，編碼限制性酶ISce1的基因；ISceIs,ISceI限制性位點(diǎn)；sApoE，先前詳述的人造增強(qiáng)子/啟動子(Miao等，MolTher1=522,2000)；hFIX，編碼人血凝蛋白IX因子的基因；AmpR，氨芐青霉素抗性基因；UC，質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)。圖B顯示質(zhì)粒p20C31.hFIX通過0C31-介導(dǎo)的重組所產(chǎn)生的編碼sApoE.hFIX盒的小環(huán)MC.hFIX。MC，小環(huán)；attR，右側(cè)雜交序列。圖C顯示質(zhì)粒BB，該細(xì)菌質(zhì)粒的骨架環(huán)通過0C312介導(dǎo)的重組衍生自p20C31.hFIX；attL，左側(cè)雜交序列。圖D顯示p20C31.ISceIg&s質(zhì)粒，即從圖A所示P20C31.hFIX中刪除hFIX盒以及側(cè)接attB和attP所產(chǎn)生的質(zhì)粒。圖E為pKanR.endA質(zhì)粒，該質(zhì)粒用于滅活細(xì)菌endA基因；KanR，卡那霉素抗性基因；endA，編碼細(xì)菌內(nèi)切核酸酶1的基因。圖F顯示p3BAD.Ikelg.KanR.UMU質(zhì)粒，該質(zhì)粒用于整合3BAD.IkeI盒；UMU，細(xì)菌的UMU基因座。圖G顯示p8ISceIs質(zhì)粒，它是含有8個連續(xù)的ISceI限制性位點(diǎn)的基于pBlueScript(加利福尼亞州拉霍亞的司查塔基公司(Stratagene,LaJolla,CA))白勺Mf^0圖2A-2B顯示除去了雜質(zhì)但DNA發(fā)生降解的BW27783菌株。用質(zhì)粒p20C31.hFIX與BW27783或iTop10菌株產(chǎn)生小環(huán)(Chen等，HumanGeneTherapy16:126,2005)；用BglII加EcoNl酶消化DNA后以瓊脂糖凝膠試驗(yàn)檢測該小環(huán)的質(zhì)量。在Top10菌株產(chǎn)生的小環(huán)中明顯觀察到包含有親代質(zhì)粒(PP)和質(zhì)粒BB(PB)的雜質(zhì)DNA，但在BW27783菌株產(chǎn)生的小環(huán)中觀察不到，甚至當(dāng)用低至0.001%濃度的誘導(dǎo)劑L-阿拉伯糖培養(yǎng)時也觀察不到。限制性，限制性作用；細(xì)菌，細(xì)菌菌株；L-arab，L-阿拉伯糖。圖B顯示DNA降解，在由BW27783制備的質(zhì)粒、小環(huán)及細(xì)菌基因組樣品中明顯有DNA降解，但ToplO菌株制備的沒有這種現(xiàn)象。圖3A-3C顯示通過刪除endA基因克服了DNA降解問題。圖A為流程圖，說明刪除endA的過程。我們按照Datsenko和WannerBL(PNAS97=6640,2000)的方案，用Pmel消化質(zhì)粒pKanR.endA制備了包含2個endA-靶向序列的DNA片段(圖1E)，用以滅活BW27783的endA基因。簡言之，我們用質(zhì)粒pBAD.RED轉(zhuǎn)化BW27783菌落，30°C在含1%L-阿拉伯糖的LB中培養(yǎng)所得細(xì)菌菌落至0D600讀數(shù)達(dá)到約0.5，誘導(dǎo)噬菌體λ的RecB⑶重組酶復(fù)合體表達(dá)；我們用該線性靶向DNA片段轉(zhuǎn)化所得感受態(tài)細(xì)胞，選擇卡那霉素抗性菌落作進(jìn)一步研究。43°C培養(yǎng)所得BWendA.KanR細(xì)胞過夜去除質(zhì)粒pBAD.RED。為去除基因組中的卡那霉素抗性基因，用質(zhì)粒p20C31.ISceIg&s(圖ID)轉(zhuǎn)化該中間菌株BWendA.KanR，然后用含1%L-阿拉伯糖的LB肉湯培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞菌落誘導(dǎo)0C31和ISce1二酶表達(dá)，通過0C31介導(dǎo)的attB與attP之間的重組導(dǎo)致其卡那霉素抗性基因的丟失，同時通過Ikel介導(dǎo)的限制作用糾正質(zhì)粒P20C31.ISceIg&So選擇氨芐青霉素和卡那霉素敏感菌落作進(jìn)一步特征分析。圖B顯示對DNA整合的證實(shí)。采用二對引物，每對含卡那霉素基因的一端(引物448或449)和含endA的另一端(引物1269或1279)作PCR試驗(yàn)證實(shí)卡那霉素抗性基因的整合。4個菌落有3個分別檢測到大小為0.5-kb和1.Okb的預(yù)期PCR產(chǎn)物。Bff,BW27783基因組；ZY650，質(zhì)粒pKanR.endA(圖IE)。圖C顯示對內(nèi)切核酸酶1活性喪失的證實(shí)。用BglII加Encom酶切所得菌株BWAendA和Top10產(chǎn)生小環(huán)MC.hFIX，每種酶切割該小環(huán)或質(zhì)粒BB—次，作凝膠電泳分析。圖4A-4C顯示BAD.IkeI基因的整合。圖A為DNA整合的流程圖。通過I^stl消化從質(zhì)粒P3BAD.ISceI.KanR.UMU(圖1F)制備的線性靶向DNA含有串連的三拷貝BDA.ISceI盒和一個卡那霉素盒及二個側(cè)接的UMU靶向序列；我們按照圖3所述的Datsenko和WannerBL(PNAS97:6640，2000)的相同方案將其整合入BWΔendA菌株的UMU基因座中。最終獲得新的菌株BWAednA.3ISceI。圖B顯示整合的Ikel基因的PCR說明。同樣，采用IScel-基因特異性引物時，BWAendA.3ISce1菌株產(chǎn)生了預(yù)期的PCR產(chǎn)物但其前體BWAendA菌株不產(chǎn)生，證實(shí)了該IScel基因的整合。圖C為ISceI活性的說明。用含有8個相連ISceI限制性位點(diǎn)的質(zhì)粒p8ISceIs(圖1G)轉(zhuǎn)化菌株BWΔendA.3ISceI。將轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌用含或不含L-阿拉伯糖的新鮮LB重懸浮培養(yǎng)過夜，37°C再培養(yǎng)4小時，取一等份不作任何處理用作對照。分離得到質(zhì)粒DNA，用^Cbal線性化作瓊脂糖凝膠(電泳)分析。用無L-阿拉伯糖的二個培養(yǎng)物得到的DNA條帶可明顯看出且大約相等，但用表達(dá)IScel酶的培養(yǎng)物幾乎得不到此條帶，表明該整合的Ikel基因已發(fā)揮了功能。圖5A-5C顯示采用含滅活endA基因和整合的BAD.Ike1基因的細(xì)菌制備的小環(huán)制劑。圖A顯示用于產(chǎn)生小環(huán)載體的親代質(zhì)粒構(gòu)建物。該質(zhì)粒包含一個拷貝的BDA.0C31重組酶基因和多個ISce1限制性位點(diǎn)(N=8、32或64個)。圖B顯示在存在(+)或缺乏(-)1%L-阿拉伯糖培養(yǎng)4小時的三個小環(huán)制劑中估計的污染核酸量(MC=小環(huán)，PP=親代質(zhì)粒，PB=質(zhì)粒骨架，gDNA=基因組DNA)。從圖A所述質(zhì)粒產(chǎn)生小環(huán)，用Spe1和)(ba1消化該DNA，它們分別在小環(huán)或質(zhì)粒骨架(BB)上切割一次。圖C顯示在不同溫度下測定的小環(huán)制劑的質(zhì)量。用)(bal切割該DNA，該酶同時切割小環(huán)(MC)和質(zhì)粒BB(PB)—次。圖6A-6E顯示親代質(zhì)粒的不同實(shí)施方式。圖A顯示能表達(dá)重組酶和限制性內(nèi)切核酸酶的親代質(zhì)粒。圖B顯示能表達(dá)重組酶的親代質(zhì)粒。圖C顯示能表達(dá)限制性內(nèi)切核酸酶的親代質(zhì)粒。圖D顯示不含重組酶或內(nèi)切核酸酶編碼序列的親代質(zhì)粒。圖E顯示重組后的最終小環(huán)載體。圖7A-7B顯示本發(fā)明的一種實(shí)施方式。圖A顯示小環(huán)親代質(zhì)粒構(gòu)建物。圖B顯示含有所有遺傳改變的相應(yīng)細(xì)菌菌株。Pbla，衍生自司查塔基公司(加利福尼亞州拉霍亞)的質(zhì)粒pBlueScript的大腸桿菌β-內(nèi)酰胺酶基因的啟動子。圖8A-8D.BAD.0C31基因的基因組整合。圖9A-9D顯示第二代L-阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的整合。流程圖9A顯示敲除菌株CC20C31(D2)的野生型LacY基因。我們用作靶向序列的線性DNA含有四環(huán)素抗性基因和側(cè)接LacY基因上下游的LacZ基因的420_bp序列及LacA基因的227_bp。我們用相同的RED-介導(dǎo)的整合方法來整合該線性DNA(圖3A)。選擇含四環(huán)素標(biāo)記的菌落后，通過對用LacZ基因和四環(huán)素抗性基因特異性引物產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物作DNA測序，證實(shí)該中間菌株已敲除了LacY基因(圖9C)。圖9B顯示突變體LacYA177C(muLacY)整合在LacY的原先位置。野生型LacY蛋白是乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白而muLacY獲得的額外功能是L-阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Morgan-KissRM等，PNAS99:7373,2002)。利用得自β-乳糖苷酶基因(bla)的組成型啟動子驅(qū)動該突變蛋白的表達(dá)。為了制備這種整合性DNA，我們用含卡那霉素抗性基因側(cè)接attB和attP及bla.muLac盒的DNA序列取代上述線性整合DNA中的四環(huán)素基因(圖9A)。同樣，我們用相同的RED-介導(dǎo)的整合方法來整合突變LacY基因(圖3A)。我們選出含卡那霉素抗性標(biāo)記的菌落，然后用含阿拉伯糖的LB培養(yǎng)細(xì)菌，誘導(dǎo)0C31-介導(dǎo)的重組而去除卡那霉素抗性基因。通過檢測用bla和LacA特異性引物所產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物的DNA序列，我們證實(shí)了這種整合(圖9D)。muLacY,LacYA177C；bla,β-乳糖苷酶基因啟動子。圖10A-10D顯示4拷貝串連BAD.0C31盒的整合。圖IOA說明在CCD20C31.muLacy基因組中制備靶位點(diǎn)。我們用構(gòu)建物p20C31.R6KFRT(圖8B)成功地整合了2拷貝的BAD.0C31盒，但重復(fù)同一方法未能整合入更多拷貝的0C31基因。我們假設(shè)事先存在的3個FRT位點(diǎn)阻斷了FLP重組酶的功能；原先的菌株BW27783含有2個FRT位點(diǎn)，CC20C31菌株因整合了2個BAD.0C31而獲得了一個額外的位點(diǎn)。為克服此問題，我們采用也處在araC.BAD系統(tǒng)控制下的噬菌體TP901-1的重組酶(TPin)來取代FLP。象0C31一樣，TPin可介導(dǎo)單向反應(yīng)。為了與0C31相區(qū)別，我們用縮寫9attB和9attP分別代表TPin的細(xì)菌和噬菌體附著位點(diǎn)。由于設(shè)計細(xì)致，這二種酶通過順序反應(yīng)每次去除二種雜交序列，即attL/attR和9attL/9attR之一將產(chǎn)生穩(wěn)定的整合子。為了使可有可無的araD基因靶向插入菌株CC20C31.muLacY(圖9B)的基因組中，我們采用了含四環(huán)素抗性基因和attB及9attP位點(diǎn)、并側(cè)接araD基因5，-末端275-bp和3，-末端310-bp序列的線性DNA0選出四環(huán)素抗體性菌落后，我們對用araD的5’部分和polB基因的特異性引物對產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物進(jìn)行DNA測序，證實(shí)了這種整合；在細(xì)菌基因組中polB基因位于araD的下游，因此，我們得到了所需的中間菌株CC20C31.muLacY.ΔaraD(圖10A)。預(yù)計可能需要更多拷貝的0C31基因，我們制備了另一種含有串連的4拷貝BAD.0C31盒的整合質(zhì)粒pAlO1.40C31；我們采用的另一種溫度敏感性質(zhì)粒DNA復(fù)制起點(diǎn)AlOl也可經(jīng)43°C培養(yǎng)細(xì)菌而糾正(圖10B)。為制備含有該額外4BAD.0C31盒的菌株，我們用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化CC20C31.muLacY.ΔaraD菌株，30°C在含0.001%L-阿拉伯糖的5-mlLB中培養(yǎng)所選菌落2小時誘導(dǎo)0C31介導(dǎo)的整合。為選擇含整合子的菌落，我們選擇了對四環(huán)素和卡那霉素二者具有抗性的菌落。為去除這二種抗生素的抗性基因，我們用質(zhì)粒pBAD.TPin轉(zhuǎn)化細(xì)菌后43°C用含0.001%L-阿拉伯糖的LB培養(yǎng)所得菌落2小時，以誘導(dǎo)TPin-介導(dǎo)的9attB與9attP之間的整合，然后接種無抗生素平板。43°C培養(yǎng)平板過夜，除細(xì)菌生長更快外，此步也糾正了質(zhì)粒pBAD.TPin。我們先前發(fā)現(xiàn)0C31能介導(dǎo)attL與attR之間的逆向反應(yīng)而導(dǎo)致喪失該整合子，可能是因?yàn)榧?xì)菌表達(dá)了這種逆向反應(yīng)所需的輔因子(資料沒顯示)。為了最大程度減少這種不良的逆向反應(yīng)，我們在43°C培養(yǎng)細(xì)菌，在此溫度時，TPin重組酶能維持基本活性但0C31活性很低或無(StaphenieM等，Jbacterial184:3657,2002)。為了穩(wěn)定該整合子，我們設(shè)計了靶序列和整合性質(zhì)粒，通過0C31和TPin依次介導(dǎo)的重組反應(yīng)，只留下雜交體attR和9attL，從而使attL與attR之間，或9attL與9attR之間的逆向反應(yīng)不可能發(fā)生。為獲得所需的菌落，我們從無抗生素的平板選擇菌落，將各菌落轉(zhuǎn)移到含各抗生素的平板培養(yǎng)，證實(shí)已喪失抗生素抗性基因。我們通過對PCR產(chǎn)物、基因組和整合子特異性引物所產(chǎn)生的PRl和PR2作DNA測序，進(jìn)一步證實(shí)了這種整合子(圖IOB和10D)。A101，溫度敏感型質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)；無，非特異性產(chǎn)物；對照，對照模板DNA的PCR產(chǎn)物。圖11A-11B.菌株D6和簡化的親代質(zhì)粒的基因分型。圖11A.菌株D6基因型的小結(jié)。除Cp8.araE、endA和araC3xBAD.Kcel基因及2拷貝的BAD.0C31外，菌株D6還攜帶有第2代L-阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白bla.muLacY和4個額外的BAD.0C31拷貝，共含6個拷貝的BAD.0C31。圖11B，編碼RSV.hAAT.bpA盒的簡化親代質(zhì)粒。定義“核酸構(gòu)建物”指通過構(gòu)建而含有自然界未發(fā)現(xiàn)的一種或多種功能單元的核酸序列。例子包括環(huán)形、線形、雙鏈DNA，染色體外DNA分子(質(zhì)粒)，粘粒(含λ噬菌體COS序列的質(zhì)粒)，含非天然核酸序列的病毒基因組等等?！拜d體”能夠?qū)⒑怂嵝蛄修D(zhuǎn)運(yùn)給靶細(xì)胞。例如，載體可包含能在靶細(xì)胞中表達(dá)的編碼序列。對于本發(fā)明的目的，“載體構(gòu)建物”、“表達(dá)載體”和“基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體”通指能夠指導(dǎo)感興趣基因表達(dá)和用于將感興趣基因轉(zhuǎn)運(yùn)入靶細(xì)胞內(nèi)的任何核酸構(gòu)建物。因此，該術(shù)語包括克隆和表達(dá)運(yùn)載體，以及整合性載體?！氨磉_(dá)盒”包括能夠指導(dǎo)含有感興趣的基因/編碼序列的任何RNA轉(zhuǎn)錄物表達(dá)以及非翻譯性RNA(如shRNA、微小RNA、siRNA、反義RNA等)的核酸構(gòu)建物?？蓪⑦@種盒構(gòu)建入“載體”、“載體構(gòu)建物”、“表達(dá)載體”和“基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體”中，以將此表達(dá)盒轉(zhuǎn)運(yùn)入靶細(xì)胞內(nèi)。因此，該術(shù)語包括克隆和表達(dá)運(yùn)載體，以及病毒載體?！靶…h(huán)”載體本文用于指一種小的雙鏈環(huán)形DNA分子，它能提供該載體中的感興趣序列的持久、高水平表達(dá)，所述感興趣序列可以是編碼多肽的序列、shRNA、反義RNA、siRNA等，至少實(shí)質(zhì)是表達(dá)盒序列和取向不依賴的。感興趣的序列操作性連接于小環(huán)載體中的調(diào)控序列使調(diào)控序列能控制其表達(dá)。這類小環(huán)載體的描述可參見，例如通過引用專門納入本文作為參考的已公開的美國專利申請US20040214329。本發(fā)明小環(huán)載體的全長足以包含下面所述的所需元件，但其長度不會以不可接受的水平阻礙或顯著抑制該載體接觸靶細(xì)胞時進(jìn)入靶細(xì)胞的能力，如通過全身給予含該細(xì)胞的宿主時。因此，該小環(huán)載體通常至少長0.31Λ，常常至少長約1.01Λ，該載體可以長101Λ或更長，但在某些實(shí)施方式中，不超過此長度。小環(huán)載體不同于細(xì)菌質(zhì)粒載體之處在于它們?nèi)鄙偌?xì)菌質(zhì)粒中常見的復(fù)制起點(diǎn)，和缺少藥物選擇標(biāo)記，如β-內(nèi)酰胺酶、tet等。也缺少(例如)質(zhì)粒骨架中所見的表達(dá)沉默序列，如從親代質(zhì)粒骨架中切下的這種小環(huán)載體。所述小環(huán)基本上不含有除重組酶雜交產(chǎn)物序列和感興趣序列(即被轉(zhuǎn)錄序列)及表達(dá)所需的調(diào)控序列以外的載體序列。“感興趣的多核苷酸”或“感興趣的序列”指適合引入靶細(xì)胞內(nèi)的任何核酸片段。感興趣多核苷酸的合適例子包括啟動子元件、編碼序列如治療性基因(序列)、標(biāo)記基因等、調(diào)控區(qū)、特征產(chǎn)生片段、執(zhí)行基因破壞的核酸元件、以及不編碼多肽的核酸，包括編碼非翻譯性RNA(如shRNA，在依據(jù)基因表達(dá)調(diào)控的RNA干擾中具有作用)的多核苷酸。此小環(huán)載體包含單向位點(diǎn)特異性重組酶的產(chǎn)物雜交序列，此產(chǎn)物雜交序列是單向位點(diǎn)特異性重組酶介導(dǎo)了二種重組酶底物序列(如本領(lǐng)域所知的attB和attP底物序列)重組的結(jié)果，它們可以是產(chǎn)生的attR或attL雜交序列。通常這種雜交序列產(chǎn)物的長度范圍約為10_500bp。在某些實(shí)施方式中，該序列產(chǎn)物是作為整合酶的單向位點(diǎn)特異性重組酶的產(chǎn)物雜交序列，所述感興趣的整合酶包括但不限于野生型噬菌體整合酶或其突變體，代表性的感興趣特異性整合酶包括但不限于OC31、R4、TP901-1、ΦΒΤ1、Bxbl、RV_1、AA118、U153、ΦFCl等的整合酶。在本發(fā)明中，“衍生自噬菌體的”重組酶不必明確是噬菌體本身產(chǎn)生的，只是認(rèn)為噬菌體是該重組酶和其編碼序列的最初來源即可。例如，可用本領(lǐng)域已知的方法重組產(chǎn)生或合成制備重組酶，或者，可從培養(yǎng)的感染噬菌體的細(xì)菌中純化獲得重組酶?！盎旧霞兓摹蓖ǔＶ阜蛛x得到的物質(zhì)(化合物、多核苷酸、蛋白質(zhì)、多肽、多肽組合物)，這種物質(zhì)占所在樣品的大多數(shù)百分比，樣品中基本上純化的成分至少占約50%，如所需成分占約80%-85%，約90-95%以及約99%或更多。純化感興趣多核苷酸和多肽的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的，例如包括離子交換層析、親和層析和密度沉降技術(shù)。術(shù)語“外源性”本文用于定義DNA，如本文的DNA構(gòu)建物，將其通過人工方法，如本發(fā)明的方法引入細(xì)胞內(nèi)。在通過轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化等引入之前，外源性DNA可含有與細(xì)胞中存在的內(nèi)源性DNA相同或不同的序列。轉(zhuǎn)染細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域熟知的。“被轉(zhuǎn)染的”指攝入外源核酸(通常為DNA)所導(dǎo)致的細(xì)胞改變。采用術(shù)語“轉(zhuǎn)染”不意味限制用任何實(shí)施方法引入外源核酸。合適的方法包括病毒感染、偶聯(lián)、納米微粒遞送、電穿孔、基因槍技術(shù)、磷酸鈣沉淀、直接顯微注射等。方法的選擇通常取決于要轉(zhuǎn)染的細(xì)胞類型和進(jìn)行轉(zhuǎn)染的微環(huán)境(即體外、離體或體內(nèi))。這些方法的總體敘述可參見Ausubel等，《分子生物學(xué)的簡明方案》(ShortProtocolsinMolecularBiology)，第3版，韋利森出版社(Wiley&Sons)，1995。術(shù)語“核酸分子”和“多核苷酸”可互換使用，指任何長度的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的聚合形式或其類似物。多核苷酸可有三維結(jié)構(gòu)，可執(zhí)行任何已知或未知的功能。多核苷酸的非限制性例子包括基因、基因片段、外顯子、內(nèi)含子，信使RNA(mRNA)、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA、核糖體RNA、核酶、cDNA、shRNA、短的或長的單鏈RNA、重組多核苷酸、分枝多核苷酸、質(zhì)粒、載體、任何序列的分離的DNA、對照區(qū)、任何序列的分離的RNA、核酸探針和引物。核酸分子可以是線型或環(huán)形?！熬幋a序列”或“編碼”所選多肽的序列，例如，當(dāng)該核酸存在于活細(xì)胞內(nèi)(體內(nèi))置于合適的調(diào)控序列(或調(diào)控元件)控制下時是可轉(zhuǎn)錄(如DNA)和翻譯(如mRNA)為多肽的核酸分子。編碼序列的邊界通常由5'(氨基)末端的起始密碼子和3'(羧基)末端的終止密碼子確定。編碼序列可包括但不限于病毒的DNA、原核或真核的mRNA、病毒的基因組DNA、原核或真核的DNA和合成的DNA序列。轉(zhuǎn)錄終止序列位于編碼序列的3，端，啟動子位于編碼序列的5’端，如果需要可連結(jié)附加的調(diào)控序列，如增強(qiáng)子、內(nèi)含子、聚腺苷酸化位點(diǎn)等?？刹捎盟x細(xì)胞偏愛的密碼子呈遞所需多肽編碼序列的DNA拷貝來優(yōu)化該多肽的DNA編碼序列的表達(dá)。術(shù)語“編碼”指編碼多肽序列的核酸序列。此外，“編碼”也指編碼非翻譯性RNA，如shRNA或反義RNA或其它小RNA的核酸序列。“操作性連接于”指諸元件的安排使所述各組分的配置能執(zhí)行它們的通常功能。因此，將某給定的啟動子操作性連接于編碼序列(如報告表達(dá)盒)，當(dāng)存在合適的酶時就能夠影響該編碼序列的表達(dá)。所述啟動子或其它調(diào)控元件不需要與編碼序列相鄰，只要它們發(fā)揮功能指導(dǎo)其表達(dá)即可。例如，在啟動子序列與編碼序列之間插入有非翻譯性轉(zhuǎn)錄序列時，仍認(rèn)為啟動子序列與編碼序列“操作性相連”。“靶細(xì)胞”本文用于指需要作遺傳修飾的細(xì)胞。靶細(xì)胞可以是分離(如培養(yǎng))的細(xì)胞或是多細(xì)胞生物中(如胚泡，胎兒，出生后的動物等)的細(xì)胞。本申請?zhí)貏e感興趣的細(xì)胞包括但不限于培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞，包括CHO細(xì)胞、培養(yǎng)的原代細(xì)胞如成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等、和干細(xì)胞如胚胎干細(xì)胞(如具有胚胎干細(xì)胞表型的細(xì)胞)、成人干細(xì)胞、多能干細(xì)胞、造血干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞等等。發(fā)明詳述在描述本發(fā)明前，應(yīng)理解本發(fā)明不限于所述的具體實(shí)施方式，這些方式當(dāng)然是可改變的。還應(yīng)理解本文所用的術(shù)語目的只是描述具體的實(shí)施方式，不意味限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍只受所附權(quán)利要求書的限制。除非另有清楚說明，當(dāng)提供數(shù)值的范圍時，應(yīng)理解為還具體公開了該范圍上下限之間以下限單位十分之一為間隔的各個插入數(shù)值。本發(fā)明包括所述范圍內(nèi)任何所述數(shù)值以及插入數(shù)值之間或所述范圍內(nèi)的任何其他所述數(shù)值和插入數(shù)值之間的各個較小范圍。這些較小范圍的上下限可獨(dú)立地包括或排除在該范圍外，本發(fā)明還包括或不包括該較小范圍的上下限之一或二者，也可排除所述范圍的任一界限。當(dāng)所述范圍包括一個界限或二個界限時，本發(fā)明還包括除這二個界限之一或二者外的范圍。除非另有定義，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語含義與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員共同理解的相同。雖然實(shí)施或測試本發(fā)明可采用與本文所述相似或相當(dāng)?shù)娜魏畏椒ê筒牧?，但現(xiàn)在描述的是一些是有潛力的優(yōu)選方法和材料。本文提及的和通過引用納入本文的所有出版物公開和描述了與所引用出版物相關(guān)的方法和/或材料。應(yīng)明白本文公開的內(nèi)容可替代所引用出版物公開的有矛盾的內(nèi)容。必須注意本文和附件權(quán)利要求書中所用的單數(shù)形式“一個”，“一種”和“這種”包括其復(fù)數(shù)，除非文中另有說明。因此，“一種細(xì)胞”包括多個該種細(xì)胞，“這種化合物”包括一個或多個化合物，以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的等價物，如此等等。本文提供的所述出版物只是由于它們發(fā)表于本申請的申請日之前，不要理解為本發(fā)明承認(rèn)晚于這些出版物作出。另外，所提供的出版日期可能與實(shí)際出版日期不符而需要獨(dú)立地確認(rèn)。還要指出起草的權(quán)利要求書可能排除了任選的要素。因此，與引用權(quán)利要求或采用“否定性”限制相聯(lián)系時，預(yù)計此種陳述的作用是使用排它術(shù)語如“只有”、“僅僅”等的先行基石出。小環(huán)DNA制劑本發(fā)明提供的小環(huán)核酸載體制劑基本上沒有污染性核酸，即沒有非小環(huán)核酸，這種小環(huán)核酸載體當(dāng)引入哺乳動物靶細(xì)胞內(nèi)時可持久高水平表達(dá)蛋白質(zhì)。也提供產(chǎn)生該小環(huán)核酸載體制劑的制備方法。不良的污染性核酸序列包括重組酶如WiiC31的編碼序列，和/或編碼限制性內(nèi)切核酸酶如Ikel的污染性核酸序列。這種污染性序列之所以不良是由于轉(zhuǎn)入受者細(xì)胞內(nèi)的可能性很小。這些不良序列可能存在于未重組親代質(zhì)粒和質(zhì)粒骨架環(huán)(質(zhì)粒BB)中，因此需要確保完成了重組和限制性酶消化。在某些實(shí)施方式中，通過將重組酶和限制性內(nèi)切核酸酶的編碼序列整合入細(xì)菌染色體中來減少污染，而不是在親代質(zhì)粒中提供編碼序列。用含有側(cè)接了單向位點(diǎn)特異性重組酶重組位點(diǎn)和非細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)源性的限制性內(nèi)切核酸酶所識別的至少一個限制性位點(diǎn)的感興趣序列的親代質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染經(jīng)遺傳修飾能組成型表達(dá)araE并且缺乏功能性內(nèi)切核酸酶1的細(xì)菌細(xì)胞，產(chǎn)生小環(huán)載體。存在于親代質(zhì)粒或細(xì)菌細(xì)胞染色體中的序列編碼單向位點(diǎn)特異性重組酶和能切割親代質(zhì)粒的非內(nèi)源性限制性內(nèi)切核酸酶?？蓪⒋酥亟M酶和/或限制性內(nèi)切核酸酶編碼序列操作性連接于對阿拉伯糖起反應(yīng)的誘導(dǎo)型啟動子。培養(yǎng)這種轉(zhuǎn)染的細(xì)菌細(xì)胞至所需濃度，培養(yǎng)時間應(yīng)足以激活單向位點(diǎn)特異性重組酶的表達(dá)而重組attB與attP之間的重組位點(diǎn)；并且能激活限制性內(nèi)切核酸酶的表達(dá)而在限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)處消化質(zhì)粒骨架。該培養(yǎng)步驟導(dǎo)致產(chǎn)生包含感興趣多核苷酸和單向位點(diǎn)特異性重組酶的產(chǎn)物雜交序列的小環(huán)載體，其沒有親代質(zhì)粒骨架序列。然后純化此小環(huán)載體提供基本上沒有污染性核酸的小環(huán)核酸載體制劑。—般而言，用本文所述方法產(chǎn)生的小環(huán)核酸載體制劑所含的核酸至少約80%為小環(huán)核酸載體，至少約90%為小環(huán)核酸載體，至少約95%為小環(huán)核酸載體，至少約96%為小環(huán)核酸載體，至少約97%為小環(huán)核酸載體，至少約98%為小環(huán)核酸載體，至少約99%為小環(huán)核酸載體，至少約99.5%為小環(huán)核酸載體，至少約99.9%為小環(huán)核酸載體。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道這種制劑可包含緩沖劑、賦形劑和其它非核酸組分。在某些實(shí)施方式中，可通過，例如篩檢制劑中存在的蛋白質(zhì)活性(如果存在污染性核酸編碼序列則存在這種活性)來定量測定該小環(huán)載體制劑的純度。示范性的這類蛋白質(zhì)包括單向位點(diǎn)特異性重組酶和細(xì)菌細(xì)胞的非內(nèi)源性限制性內(nèi)切核酸酶。因此，該小環(huán)載體制劑的純度可通過篩檢重組酶和/或限制性內(nèi)切核酸酶的活性，與含有已知量污染性核酸的對照品以及缺乏污染性核酸的陰性對照品相比較來定量測定。在這類實(shí)施方式中，所述小環(huán)載體制劑產(chǎn)生的活性低于對照制劑，即用常規(guī)細(xì)菌細(xì)胞產(chǎn)生的或用本領(lǐng)域已知方法產(chǎn)生的小環(huán)對照制劑至少1.5倍，包括活性低于所述對照約2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍或更低?；蛘撸捎美鏟CR等方法檢測的污染性重組酶和內(nèi)切核酸酶序列的存在。本發(fā)明的一個特征是本文所述用于制備基本上沒有污染性核酸的小環(huán)載體制劑的方法和細(xì)胞系，所述污染性核酸序列包括但不限于真核質(zhì)粒骨架序列、編碼單向位點(diǎn)特異性重組酶如WiiC31的核酸序列、和編碼限制性內(nèi)切核酸酶如IScel的核酸序列。本發(fā)明最顯著的特征是制備的小環(huán)載體完全沒有編碼單向位點(diǎn)特異性重組酶如WiiC31的環(huán)形核酸序列和編碼限制性內(nèi)切核酸酶如Ikel的核酸序列。因?yàn)樗鼈冊谖锢硇再|(zhì)上類似于小環(huán)載體，這些環(huán)形污染物比線性污染物更難去除。所述單向位點(diǎn)特異性重組酶和限制性酶可能損害靶細(xì)胞的基因組DNA。污染性核酸包括線性核酸片段和環(huán)形核酸。一般而言，用經(jīng)遺傳修飾的細(xì)菌制備本發(fā)明的小環(huán)核酸載體制劑，所述細(xì)菌能有效表達(dá)⑴單向位點(diǎn)特異性重組酶和(ii)該細(xì)菌細(xì)胞非內(nèi)源性的限制性內(nèi)切核酸酶中的一種或二種。這些DNA修飾組分可由一種表達(dá)載體編碼和/或由基因組整合表達(dá)盒編碼，在小環(huán)親代質(zhì)粒產(chǎn)生該小環(huán)載體期間可由基本上所有的細(xì)菌細(xì)胞表達(dá)，這樣可確保產(chǎn)生小環(huán)載體并完全破壞親代質(zhì)粒骨架。如下文更詳細(xì)所述，在某些實(shí)施方式中，遺傳修飾的細(xì)菌包含在組成型啟動子調(diào)控下的L-阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白araE基因的一個或多個基因組整合編碼序列和缺乏功能性內(nèi)切核酸酶1表達(dá)。在這類實(shí)施方式中，細(xì)胞組成型表達(dá)L-阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白使得能夠?qū)-阿拉伯糖(當(dāng)將其加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中時)有效轉(zhuǎn)運(yùn)到所有的細(xì)胞內(nèi)。由于這種有效的底物轉(zhuǎn)運(yùn)，在對L-阿拉伯糖起反應(yīng)的誘導(dǎo)型啟動子如araC-BAD啟動子調(diào)控下，編碼序列可在基本上所有的培養(yǎng)細(xì)胞中連續(xù)、均勻和高水平地產(chǎn)生所編碼的蛋白質(zhì)。本發(fā)明方法采用這種遺傳修飾的細(xì)菌提供了多種優(yōu)點(diǎn)。(1)可確保含有在誘導(dǎo)型啟動子如araC-BAD啟動子調(diào)控下的編碼單向位點(diǎn)特異性重組酶和限制性內(nèi)切核酸酶染色體外載體和/或基因組整合表達(dá)盒的基本上所有的細(xì)菌，能夠由拷貝數(shù)有限的基因充分表達(dá)。(可確保在所有細(xì)胞中完成重組酶介導(dǎo)的attb與attP之間的重組和隨后形成小環(huán)載體。因此，完成該制備過程時，小環(huán)載體制劑將基本上沒有由于重組酶在至少一小群培養(yǎng)菌中表達(dá)不足而導(dǎo)致的未重組親代質(zhì)粒殘留。C3)可確保在質(zhì)粒骨架DNA破壞期，所有培養(yǎng)的細(xì)菌中質(zhì)粒骨架細(xì)菌DNA環(huán)和殘留的未重組親代質(zhì)粒被切開，如此保證了小環(huán)載體制劑為基本純形式。(4)最后，可用較低濃度的L-阿拉伯糖來激活在阿拉伯糖誘導(dǎo)型啟動子調(diào)控下的重組酶和/或限制性內(nèi)切核酸酶的表達(dá)，從而提供了降低試劑費(fèi)用、促進(jìn)該方法擴(kuò)大規(guī)模生產(chǎn)出大量小環(huán)載體制劑的額外優(yōu)點(diǎn)。在某些實(shí)施方式中，所述遺傳修飾的細(xì)菌包含非該菌內(nèi)源性的限制性內(nèi)切核酸酶的基因組整合編碼序列，在組成型啟動子調(diào)控下的L-阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白araE基因的基因組整合編碼序列，和缺乏功能性內(nèi)切核酸酶1表達(dá)。在其它實(shí)施方式中，所述遺傳修飾的細(xì)菌包含非該菌內(nèi)源性的限制性內(nèi)切核酸酶和單向位點(diǎn)特異性重組酶的基因組整合編碼序列，在組成型啟動子調(diào)控下的L-阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白araE基因的基因組整合編碼序列，和缺乏功能性內(nèi)切核酸酶1表達(dá)。在包含限制性內(nèi)切核酸酶和/或單向位點(diǎn)特異性重組酶(總稱為“所述酶”)編碼序列的這類實(shí)施方式中，不將所述酶的編碼序列引入細(xì)菌中單獨(dú)存在的環(huán)形染色體外表達(dá)載體中。由于所述酶的編碼序列整合在基因組中，完全防止了所述限制性內(nèi)切核酸酶和/或單向位點(diǎn)特異性重組酶的編碼核酸序列作為污染性環(huán)形核酸存在于該小環(huán)載體制劑中的機(jī)會。至關(guān)重要的是應(yīng)注意，當(dāng)編碼所述酶的核酸序列整合于基因組中時，由于純化小環(huán)載體期間基因組被剪切它們?nèi)匀豢赡艽嬖谟诩兓^程中。然而，采用常規(guī)純化方法不難使細(xì)菌染色體的線性DNA片段與小環(huán)載體分離，相反地環(huán)形核酸則更難與小環(huán)載體分離。通過整合編碼單向位點(diǎn)特異性重組酶如WiiC31和/或限制性內(nèi)切核酸酶如Ikel的核酸序列，除組成型表達(dá)L-阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白外，這種遺傳修飾的細(xì)菌提供的不僅僅是確?；旧纤械呐囵B(yǎng)菌以有效方式從親代質(zhì)粒形成小環(huán)載體，而且有利地確保了所述酶的編碼序列不會污染最終的小環(huán)載體制劑?？蓪⒍鄠€拷貝的單向位點(diǎn)特異性重組酶編碼核酸序列整合在基因組中。遺傳修飾細(xì)菌細(xì)胞的應(yīng)用在某些實(shí)施方式中，用包含在組成型啟動子調(diào)控下的L-阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白araE基因的一個或多個基因組整合編碼序列和缺乏功能性內(nèi)切核酸酶1表達(dá)的遺傳修飾細(xì)菌產(chǎn)生小環(huán)載體。如上所述，在這類實(shí)施方式中，組成型表達(dá)L-阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白能有效將L-阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)給所有細(xì)胞。任選地，也可使細(xì)菌細(xì)胞組成型表達(dá)第二代L-阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。第二代L-阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的一個例子是突變LacY蛋白；突變賦予了產(chǎn)生的該LacYA177C具有其野生型蛋白沒有的L-阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)功能(Morgan-KissRM等，PNAS99:7373，2002)。結(jié)果，將基因置于對L-阿拉伯糖起反應(yīng)的誘導(dǎo)型啟動子如BAD啟動子調(diào)控下，就能使基本上所有的培養(yǎng)細(xì)胞連續(xù)均勻和高水平地有效產(chǎn)生編碼的蛋白質(zhì)?？捎冒辽僖粋€側(cè)接(單向位點(diǎn)特異性重組酶識別的)attB和attP位點(diǎn)的感興趣多核苷酸、至少一個非該細(xì)菌內(nèi)源性的限制性內(nèi)切核酸酶(例如罕見切割性的限制性內(nèi)切核酸酶IScel)識別的限制性位點(diǎn)、和親代質(zhì)粒在宿主菌中增殖維持所需序列(例如復(fù)制起點(diǎn)和任選的編碼可選擇標(biāo)記的核酸序列)的親代質(zhì)粒來產(chǎn)生小環(huán)載體(圖6A)。此外，所述親代質(zhì)?？砂幋a阻抑蛋白araC(在非誘導(dǎo)條件下可阻止受BAD啟動子調(diào)控的核酸序列表達(dá))的核酸序列?？稍谟H代質(zhì)粒中或細(xì)菌細(xì)胞中提供所述單向位點(diǎn)特異性重組酶的編碼序列及所述限制性內(nèi)切核酸酶的編碼序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，各種限制性內(nèi)切核酸酶均可用于本文所述的方法和組合物，要求是該限制性內(nèi)切核酸酶不是所述細(xì)菌細(xì)胞的內(nèi)源性酶。在某些實(shí)施方式中，所述限制性內(nèi)切核酸酶是罕見切割性的限制性內(nèi)切核酸酶，包括但不限于NotI、SfiI、NruI、MluI,SacII、Sdal、BssHII、I-Tlil、I-CeuI,I-PpoI,I-SceI,I-PspI和PUcel。在某些實(shí)施方式中，所述限制性內(nèi)切核酸酶是Heel。為產(chǎn)生小環(huán)載體，用親代質(zhì)粒轉(zhuǎn)化遺傳修飾的細(xì)菌細(xì)胞并培養(yǎng)該細(xì)胞至所需密度。然后提供條件誘導(dǎo)或使重組酶表達(dá)。當(dāng)親代質(zhì)粒與重組酶接觸時，attB與attP位點(diǎn)發(fā)生重組。該重組的二種產(chǎn)物是包含感興趣序列和雜交重組位點(diǎn)的小環(huán)載體；和包含親代質(zhì)粒原核骨架序列、至少一個限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)和雜交重組位點(diǎn)如attL位點(diǎn)或attR位點(diǎn)的質(zhì)粒骨架環(huán)(圖6E)。例如，在包含attR位點(diǎn)的小環(huán)核酸載體的實(shí)施方式中，所述質(zhì)粒骨架環(huán)將包含attL位點(diǎn)。在包含attL位點(diǎn)的小環(huán)核酸載體的實(shí)施方式中，所述質(zhì)粒骨架環(huán)將包含attR位點(diǎn)。當(dāng)在親代質(zhì)粒中提供重組酶和限制性內(nèi)切核酸酶的編碼序列時，這些序列將包含在質(zhì)粒骨架環(huán)中。在用單向位點(diǎn)特異性重組酶重組attB和attP位點(diǎn)后，改變細(xì)菌培養(yǎng)條件以優(yōu)化限制性內(nèi)切核酸酶的活性。質(zhì)粒骨架中的細(xì)菌DNA序列環(huán)和殘留的親代質(zhì)粒被限制性內(nèi)切核酸酶在限制性位點(diǎn)處消化，然后被細(xì)菌的內(nèi)源性外切核酸酶降解。由于所述小環(huán)核酸載體均是游離型的環(huán)形DNA，如同標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)粒，可用常規(guī)的商品化可得方法，如親和柱層析法從細(xì)菌中分離得到。如此，該小環(huán)載體將不會含有可能干擾其用于治療、診斷、預(yù)防或研究應(yīng)用的質(zhì)粒骨架環(huán)及未重組的親代質(zhì)粒。在其它實(shí)施方式中，用細(xì)菌細(xì)胞產(chǎn)生的小環(huán)載體，除包含在組成型啟動子調(diào)控下的L-阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白araE基因編碼序列和缺乏功能性內(nèi)切核酸酶1表達(dá)外，將包含非該細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)源性的基因組整合的限制性內(nèi)切核酸酶(如罕見切割性的限制性內(nèi)切核酸酶IScel)編碼序列。在這類實(shí)施方式中，親代質(zhì)粒如上所述，但不包含非該細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)源性的限制性內(nèi)切核酸酶編碼序列。其制備方法如上所述，重組后限制性內(nèi)切核酸酶的編碼序列存在于細(xì)菌染色體中而不在質(zhì)粒骨架環(huán)中。此系統(tǒng)的好處是，細(xì)菌細(xì)胞中可能污染小環(huán)核酸載體制劑的非細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)源性的限制性內(nèi)切核酸酶編碼序列不在染色體外環(huán)形載體中。相反，當(dāng)收集小環(huán)核酸載體制劑時，限制性內(nèi)切核酸酶的編碼序列作為整合在基因組中的元件仍留在菌體中或?yàn)榫€型片段。如果存在于制劑中的該序列為線型DNA片段，易與小環(huán)載體物理區(qū)分。因此，即使有污染也不難用常規(guī)純化方法去除這種線性DNA片段。例如可用λ外切核酸酶選擇性消化線性DNA片段而不損傷小環(huán)載體。在另一種實(shí)施方式中，用于產(chǎn)生小環(huán)載體的細(xì)菌細(xì)胞，除包含在組成型啟動子調(diào)控下的L-阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白araE基因編碼序列和缺乏功能性內(nèi)切核酸酶1表達(dá)外，將包含整合在基因組中的單向位點(diǎn)特異性重組酶(如0C31整合酶)和非該細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)源性的限制性內(nèi)切核酸酶(如罕見切割性的限制性內(nèi)切核酸酶IScel)的編碼序列。其制備方法如上所述，重組后限制性內(nèi)切核酸酶和重組酶的編碼序列存在于細(xì)菌染色體中而不在質(zhì)粒骨架環(huán)中。此系統(tǒng)的好處是，細(xì)菌細(xì)胞中可能污染小環(huán)核酸載體制劑的單向位點(diǎn)特異性重組酶和非細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)源性的限制性內(nèi)切核酸酶編碼序列不存在于染色體外載體中。調(diào)節(jié)性啟動子在某些實(shí)施方式中，將單向位點(diǎn)特異性重組酶和限制性內(nèi)切核酸酶的編碼序列置于誘導(dǎo)型啟動子的控制下，只有當(dāng)誘導(dǎo)該啟動子，如L-阿拉伯糖反應(yīng)性誘導(dǎo)型啟動子araC-BAD時才表達(dá)編碼序列。在這類實(shí)施方式中，細(xì)菌細(xì)胞不組成性表達(dá)單向位點(diǎn)特異性重組酶和限制性內(nèi)切核酸酶。而是只有激活該誘導(dǎo)型啟動子時才表達(dá)單向位點(diǎn)特異性重組酶和限制性內(nèi)切核酸酶?？蓪⒍鄠€拷貝的單向位點(diǎn)特異性重組酶編碼序列整合入基因組中。在某些實(shí)施方式中，將單向位點(diǎn)特異性重組酶和限制性內(nèi)切核酸酶的編碼核酸序列置于二種不同的誘導(dǎo)型啟動子控制下。在這類實(shí)施方式中，將單向位點(diǎn)特異性重組酶置于第一種誘導(dǎo)型啟動子控制下，將限制性內(nèi)切核酸酶置于第二種誘導(dǎo)型啟動子控制下。這二種不同的誘導(dǎo)型啟動子可使單向位點(diǎn)特異性重組酶與限制性內(nèi)切核酸酶順次表達(dá)。例如，可先表達(dá)單向位點(diǎn)特異性重組酶以使親代質(zhì)粒中的attB和attP位點(diǎn)重組而產(chǎn)生小環(huán)核酸載體，然后表達(dá)限制性內(nèi)切核酸酶以消化質(zhì)粒骨架環(huán)。只在某些可控制的條件下，調(diào)節(jié)性啟動子(即去阻遏型或誘導(dǎo)型)才表達(dá)感興趣的基因。去阻遏型元件是與啟動子一起作用結(jié)合阻遏蛋白的DNA序列元件(如大腸桿菌中的lacO/lacIq阻遏系統(tǒng))。誘導(dǎo)型元件是與啟動子一起作用結(jié)合誘導(dǎo)蛋白的DNA序列元件(如酵母菌中的gall/gal4誘導(dǎo)系統(tǒng))。這二個例子中，轉(zhuǎn)錄實(shí)際上被“關(guān)閉”直到通過改變環(huán)境條件(如在lacO/lacIq系統(tǒng)中加入IPTG或在gall/gal4系統(tǒng)中加入半乳糖)來去阻遏或誘導(dǎo)所述啟動子才“打開”轉(zhuǎn)錄。另一種類型的調(diào)節(jié)性啟動子是“阻抑型”啟動子，可通過改變環(huán)境條件關(guān)閉起初的基因表達(dá)。在阻抑型系統(tǒng)中，進(jìn)行組成性轉(zhuǎn)錄直到阻抑蛋白結(jié)合小的調(diào)節(jié)分子時才“關(guān)閉”轉(zhuǎn)錄。此型啟動子的一個例子是四環(huán)素/四環(huán)素阻抑蛋白系統(tǒng)。當(dāng)此系統(tǒng)中四環(huán)素與四環(huán)素阻抑蛋白結(jié)合時，該阻抑蛋白通過結(jié)合啟動子中的DNA元件而關(guān)閉基因表達(dá)。誘導(dǎo)型真核啟動子的例子包括噬菌體的主要右側(cè)和左側(cè)啟動子(PL和PR)；大腸桿菌的trp、recA、lacZ、AraC和gal啟動子；枯草芽孢桿菌的α-淀粉酶啟動子(UlmanenEtt等，J.Bacteriol.162176-182，1985)和σ-28-特異性啟動子(Gilman等，Genesequence32:11-20(1984))；芽孢桿菌噬菌體的啟動子(Gryczan，刊登于“芽孢桿菌的分子生物學(xué)”(TheMolecularBiologyoftheBacilli)AcademicPress,Inc,NY(1982))；鏈霉菌啟動子(Ward等，Mol.Gen.Genet.203=468-478,1986)等等。示范性的真核啟動子的綜述可參見Glick(J.Ind.Microtiot.1:277-282,1987),Cenatiempo(Biochimie68505-516，1986)禾口Gottesman(Ann.Rev.Genet.18:415-442,1984)。單向位點(diǎn)特異性重組酶已報導(dǎo)了噬菌體和單細(xì)胞酵母菌的二種重要的單向位點(diǎn)特異性重組酶家族整合酶或酪氨酸重組酶家族，包括Cre、Flp、R和λ整合酶(Argos等，EMB0J.5=433-440,(1986))；和解離酶/轉(zhuǎn)化酶或絲氨酸重組酶家族，包括某些噬菌體整合酶，如噬菌體0C31、R4和TP901-1的整合酶(Hallet和Sherratt，F(xiàn)EMSMicrobiol.Rev.21157-178(1997))。在某些實(shí)施方式中，單向位點(diǎn)特異性重組酶是絲氨酸整合酶?？捎糜隗w外和體內(nèi)重組的絲氨酸整合酶包括但不限于噬菌體0C31、R4、TP901-1、phiBTl、BxbURV-UA118、U153和phiFCl的整合酶，以及大絲氨酸整合酶家族中的其它整合酶(Gregory，Till和Smith,J.Bacteriol，185:5320-5323(2003)；Groth和Calos,J.Mol.Biol.335667-678(2004)；Groth等，PNAS97:5995-6000(2000)；Olivares,Hollis和Calos，Gene278:167-176(2001)；Smith和Thorpe,Molec.Microbiol.,4:122-129(2002)；Stoll,Ginsberg和Calos,J.Bacteriol.，184:3657-3663(2002))。一般而言，將細(xì)菌基因組中位點(diǎn)特異性重組酶識別的特異性重組位點(diǎn)設(shè)計為細(xì)菌附著位點(diǎn)("attB")，將噬菌體中相應(yīng)的特異性重組位點(diǎn)設(shè)計為噬菌體附著位點(diǎn)(“attP")。這些位點(diǎn)長度很短約34-40個堿基對(bp)Groth,A.C等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA97,5995-6000(2000))。這些位點(diǎn)通常如下安排:AttB包含第一DNA序列attB5'、核心區(qū)和第二DNA序列attB3'，相對順序?yàn)閍ttB5'-核心區(qū)_attB3'；attP包含第一DNA序列(attP5‘)、核心區(qū)和第二DNA序列(attP3‘)，相對順序?yàn)閍ttP5‘-核心區(qū)-attP3'。例如，對于噬菌體0C31attP(噬菌體附著位點(diǎn))，所述核心區(qū)是5‘-TTG-3‘，其二側(cè)的序列是attP5'和attP3'，因此attP重組位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)是attP5‘-TTG-attP3‘。相應(yīng)地，對于細(xì)菌基因組的天然靶位點(diǎn)，所述核心區(qū)是5'-TTG-3‘，其二側(cè)的序列是attB5'和attB3'，因此attB重組位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)是attB5'-TTG_attB3'。因?yàn)閍ttB與attP位點(diǎn)的序列不同，重組導(dǎo)致產(chǎn)生二個雜交的位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)(左側(cè)和右側(cè)命名為attL或attR)，此attB序列或attP序列在功能上不能被有關(guān)的單向位點(diǎn)特異性重組酶識別為特異性重組位點(diǎn)，因此排除了單向位點(diǎn)特異性重組酶催化attL與attR之間的二次重組反應(yīng)(從而逆轉(zhuǎn)第一次重組反應(yīng))的可能性。例如，0C31整合酶介導(dǎo)的單一位點(diǎn)特異性重組發(fā)生后，產(chǎn)生了以下重組產(chǎn)物attB5'-TTG-attP3'{9C31載體序列仏《5'-TTG-attB3'。通常在重組后，重組后的重組位點(diǎn)不再能作為0C31重組酶的底物，因?yàn)樗玫募?xì)菌菌株不表達(dá)逆向反應(yīng)所需的解離酶或輔因子。結(jié)果，重組反應(yīng)可繼續(xù)直到完成，產(chǎn)生小環(huán)核酸，更重要的是，產(chǎn)生的小環(huán)核酸是包含轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒單體的單一群體，這是體內(nèi)基因遞送和表達(dá)的最優(yōu)結(jié)構(gòu)。小環(huán)產(chǎn)生細(xì)胞本發(fā)明也提供本發(fā)明方法所用的細(xì)菌細(xì)胞。在某些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞包含有基因組整合的多核苷酸盒，此盒包含驅(qū)使L-阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白araE基因表達(dá)的組成型啟動子和endA基因中的基因突變，此突變導(dǎo)致修飾的細(xì)菌不能表達(dá)功能性內(nèi)切核酸酶1。在這類實(shí)施方式中，所述基因突變可以是endA基因中導(dǎo)致基因敲除或產(chǎn)生無功能endA的任何突變。所述遺傳修飾可以是endA編碼序列中的缺失、倒置或插入，從而導(dǎo)致產(chǎn)生無功能的內(nèi)切核酸酶1。因而在細(xì)菌中存在無功能內(nèi)切核酸酶1)。在本發(fā)明的其它實(shí)施方式中，修飾小環(huán)核酸產(chǎn)生細(xì)胞以組成性表達(dá)LacYA177C突變體。這種乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的LacYA177C突變體獲得了作為L-阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的額外功能，細(xì)菌亞群中表達(dá)該突變體的細(xì)胞克服了對L-阿拉伯糖的耐受性(即全或無現(xiàn)象)。在其它實(shí)施方式中，所述遺傳修飾的細(xì)菌包含非該細(xì)菌內(nèi)源性的限制性內(nèi)切核酸酶(如罕見切割性的限制性內(nèi)切核酸酶IScel)的基因組整合編碼序列。在還有其它實(shí)施方式中，所述遺傳修飾的細(xì)菌包含單向位點(diǎn)特異性重組酶如0C31整合酶，以及非該細(xì)菌內(nèi)源性的限制性內(nèi)切核酸酶(如罕見切割性的限制性內(nèi)切核酸酶IScel)的基因組整合編碼序列。在某些實(shí)施方式中，編碼單向位點(diǎn)特異性重組酶和限制性內(nèi)切核酸酶的核酸序列處在誘導(dǎo)型啟動子控制下。在這類實(shí)施方式中，細(xì)菌細(xì)胞不組成性表達(dá)單向位點(diǎn)特異性重組酶和限制性內(nèi)切核酸酶。而是，只有當(dāng)激活了該誘導(dǎo)型啟動子時才表達(dá)單向位點(diǎn)特異性重組酶和限制性內(nèi)切核酸酶。在某些實(shí)施方式中，編碼單向位點(diǎn)特異性重組酶和限制性內(nèi)切核酸酶的核酸序列處在二種不同的誘導(dǎo)型啟動子控制下。在這類實(shí)施方式中，單向位點(diǎn)特異性重組酶處在第一種誘導(dǎo)型啟動子的控制下，限制性內(nèi)切核酸酶處在第二種誘導(dǎo)型啟動子的控制下。這二種不同誘導(dǎo)型啟動子得以順序表達(dá)單向位點(diǎn)特異性重組酶和限制性內(nèi)切核酸酶。如上所述，此系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)是，當(dāng)與小環(huán)核酸載體一起分離時，非細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)源性的限制性內(nèi)切核酸酶和任選的單向位點(diǎn)特異性重組酶的編碼序列不是存在于細(xì)菌細(xì)胞中的染色體外載體而難以去除。相反，只要非細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)源性的限制性內(nèi)切核酸酶和任選的單向位點(diǎn)特異性重組酶的編碼序列作為整合在基因組中的元件，當(dāng)收集小環(huán)核酸載體時此編碼序列仍留在菌體內(nèi)，或作為線性DNA片段用常規(guī)純化方法不難與小環(huán)核酸載體分離。含能指導(dǎo)外源蛋白高水平表達(dá)的調(diào)控序列的細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)和表達(dá)載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的?？衫萌魏我环N這樣的系統(tǒng)來構(gòu)建在細(xì)菌中表達(dá)單向位點(diǎn)特異性重組酶和限制性內(nèi)切核酸酶的載體。然后通過轉(zhuǎn)化和隨后的基因組整合將這些載體引入細(xì)菌，以便高水平表達(dá)非內(nèi)源性或外源性酶。用于轉(zhuǎn)化合適細(xì)菌宿主細(xì)胞的載體或表達(dá)盒是本領(lǐng)域熟知的。通常這種載體或表達(dá)盒包含指導(dǎo)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的序列、可選擇性標(biāo)記和自主復(fù)制或染色體整合序列。合適的載體包含控制轉(zhuǎn)錄起始的基因5’區(qū)和控制轉(zhuǎn)錄終止的3’區(qū)DNA片段。最優(yōu)選此二控制區(qū)衍生自與被轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞同源的基因，但應(yīng)理解這種控制區(qū)不需要衍生自與所選的生產(chǎn)用宿主菌相同的特定種屬的天然基因。將構(gòu)建物整合入宿主基因組中可實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定表達(dá)?？蓪⑺鰳?gòu)建物整合入宿主菌基因組中的隨機(jī)位點(diǎn)，或通過利用含有宿主基因組中某基因座同源區(qū)的構(gòu)建物靶向所選擇的基因座。當(dāng)將構(gòu)建物靶向某內(nèi)源基因座時，該內(nèi)源基因座可提供所有的或某些轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)。通過利用表達(dá)構(gòu)建物中的選擇性標(biāo)記，然后選擇整合后表達(dá)該標(biāo)記的細(xì)胞，可實(shí)現(xiàn)感興趣基因的穩(wěn)定表達(dá)。小環(huán)DNA的給藥本發(fā)明方法可用于需要制備基本上沒有污染性核酸的小環(huán)核酸制劑和將這種外源性小環(huán)核酸序列引入靶細(xì)胞內(nèi)的各種應(yīng)用，特別感興趣的是需要在靶細(xì)胞中表達(dá)感興趣的多核苷酸。如上所述，本發(fā)明的載體可通過體外或體內(nèi)方法給予。所述靶細(xì)胞可以是存在于體內(nèi)或體外環(huán)境中，或存在于多細(xì)胞生物體中的單個細(xì)胞。因此，本發(fā)明引入小環(huán)核酸載體的方法可以是體內(nèi)方法，此法意味通過全身或局部途徑將外源核酸直接給予多細(xì)胞生物體內(nèi)的特定組織或細(xì)胞，如將小環(huán)載體局部遞送給肝細(xì)胞；或者是體外方法，即獲取多細(xì)胞生物的靶細(xì)胞使之接觸外源核酸。如上所述，本發(fā)明的載體可用于多種靶細(xì)胞，在許多實(shí)施方式中，所述靶細(xì)胞不是細(xì)菌靶細(xì)胞，常常是真核靶細(xì)胞，包括但不限于植物和動物靶細(xì)胞，如昆蟲細(xì)胞、脊椎動物細(xì)胞；特別是禽類細(xì)胞如雞細(xì)胞；魚類、兩棲類和爬行類細(xì)胞；哺乳動物細(xì)胞包括小鼠、豬、羊、馬、大鼠、有蹄動物、狗、貓、猴和人細(xì)胞等等。在本發(fā)明的方法中，可采用任何常規(guī)方法將所述載體引入靶細(xì)胞。根據(jù)靶細(xì)胞所在部位，所述方法應(yīng)能在體外或體內(nèi)將所述載體引入靶細(xì)胞。例如，當(dāng)靶細(xì)胞是分離的細(xì)胞時，可在靶細(xì)胞存活條件下用標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)化技術(shù)將所述載體直接引入靶細(xì)胞內(nèi)。這類技術(shù)包括但不限于病毒感染、轉(zhuǎn)化、偶聯(lián)、原生質(zhì)融合、電穿孔、粒子槍技術(shù)、磷酸鈣沉淀、直接顯微注射、病毒載體遞送、采用納米顆粒等等。方法的選擇一般取決于要轉(zhuǎn)化細(xì)胞的類型和進(jìn)行轉(zhuǎn)化的環(huán)境(即體外、離體或體內(nèi))。這些方法的綜述可參見Ausubel等，《分子生物學(xué)簡明方案》(ShortProtocolsinMolecularBiology)，第3版，韋利森出版社，1995?；蛘?，當(dāng)靶細(xì)胞是多細(xì)胞生物體內(nèi)的細(xì)胞時，將靶向載體給予該生物體或宿主的方式應(yīng)能使該靶向構(gòu)建物進(jìn)入靶細(xì)胞內(nèi)，例如通過體內(nèi)或離體方式。“體內(nèi)”指將靶構(gòu)建物給予動物的活機(jī)體。“離體”指在體外修飾細(xì)胞或器官，然后將這種細(xì)胞或器官返回給活機(jī)體。給予核酸構(gòu)建物的方法是本領(lǐng)域熟知的，包括Miarali等.，“有機(jī)修飾的二氧化硅納米顆粒一種用于體內(nèi)基因遞送和腦內(nèi)表達(dá)的非病毒載體”(OrganicallyModifiedSilicaNanoparticlesANonviralVectorforInVivoGeneDeliveryandExpressionintheBrain)PNAS102(32)=11539-44(2005)所述采用納米顆粒。采用陽離子脂質(zhì)(Goddard等，GeneTherapy,4:1231-1236,1997；Gorman等，GeneTherapy4:983-992,1997；Chadwick等，GeneTherapy4:937-942,1997；Gokhale等，GeneTherapy4:1289-1299,1997；Gao和Huang,GeneTherapy2:710-722,1995)；采用病毒載體(Monahan等，GeneTherapy440-49,1997；Onodera等，Blood91=30-36,1998)；通過攝入“裸DNA”等遞送核酸構(gòu)建物?？捎帽绢I(lǐng)域熟知的細(xì)胞轉(zhuǎn)化技術(shù)(參見以上所述)離體給予核酸構(gòu)建物。可憑經(jīng)驗(yàn)選擇確切的制劑、給藥途徑和劑量(參見例如Fingl等，1975，“治療方法的藥理學(xué)基礎(chǔ)”(ThePharmacologicalBasisofTherapeutics)，第1章pi)0給予多細(xì)胞生物所述載體的途徑取決于多種參數(shù)，包括攜帶該系統(tǒng)組分的載體的性質(zhì)、遞送運(yùn)載體的性質(zhì)、多細(xì)胞生物體的性質(zhì)等，給藥方式的一種共同特征是通過全身途徑將載體各組分遞送給體內(nèi)靶細(xì)胞。特別感興趣的全身給藥途徑是血管途徑，將所述載體引入宿主的血管途徑，如動脈或靜脈，許多實(shí)施方式特別感興趣的是靜脈給藥途徑?？刹捎煤线m的遞送運(yùn)載體，這種遞送運(yùn)載體通常是藥物制劑，包含有效量的置于藥學(xué)上可接受運(yùn)載體、稀釋劑和/或佐劑中、或與納米顆粒共價或非共價結(jié)合的所述核酸載體。在某些實(shí)施方式中，用水性遞送運(yùn)載體，如鹽水給予所述核酸載體。例如，在許多實(shí)施方式中，采用水性遞送運(yùn)載體，如鹽水，通過血管內(nèi)，如動脈內(nèi)或靜脈內(nèi)給予所述核酸載體。在許多實(shí)施方式中，在能充分表達(dá)所述載體中的核酸條件下，以體內(nèi)方式將所述核酸載體給予多細(xì)胞生物，引入靶細(xì)胞內(nèi)。如以上所述，本發(fā)明方法的特征是與瞬時表達(dá)相反，可持久地表達(dá)所提供的核酸。持久表達(dá)意味著給予所述載體后，核酸的表達(dá)水平在長時間內(nèi)(如果不是無限期的話)可持續(xù)檢測到。長時間指至少1周，通常2個月，更長至少6個月?？蓹z測水平指細(xì)胞和/或哺乳動物樣品，如哺乳動物血清中所述核酸表達(dá)的編碼蛋白質(zhì)或非翻譯性RNA水平與采用pBluescript載體的對照相比，可檢測到治療濃度的水平，或表達(dá)了預(yù)期的所需生物學(xué)效應(yīng)的水平，與對照相比，采用所述方法表達(dá)核酸的持續(xù)時間至少多約2倍，通常至少多約5倍，更常多至少約10倍。所述方法許多實(shí)施方式的一種特征是，不將小環(huán)核酸載體整合入宿主靶細(xì)胞的基因組中而可實(shí)現(xiàn)上述的持久表達(dá)。例如將小環(huán)核酸載體引入靶細(xì)胞內(nèi)而不整合，即不插入靶細(xì)胞的基因組，即靶細(xì)胞的一個或多個染色體中。如此，所述載體維持于游離形式，它們是能持久表達(dá)的游離型載體。本發(fā)明方法給予多細(xì)胞生物所述小環(huán)載體的具體劑量取決于載體的性質(zhì)、表達(dá)模塊和基因的性質(zhì)、遞送運(yùn)載體的性質(zhì)等。本領(lǐng)域技術(shù)人員不難憑經(jīng)驗(yàn)確定劑量，例如在許多實(shí)施方式中以鹽水溶液為運(yùn)載體靜脈注射給予小鼠該核酸載體時，核酸載體給藥量范圍約為2-100μg、通常約10-50μg?？捎盟龇椒▽⒏鞣N大小的核酸引入靶細(xì)胞中。在體內(nèi)方法中，采用所述方法將核酸引入各種不同靶細(xì)胞中。感興趣的靶細(xì)胞包括但不限于肌肉、腦、內(nèi)皮、肝細(xì)胞等。許多實(shí)施方式特別感興趣的是用所述方法將核酸至少引入宿主的肝細(xì)胞內(nèi)。用途本發(fā)明方法可用于制備核酸和將核酸引入所需靶細(xì)胞的各種應(yīng)用。本發(fā)明載體和所用方法的應(yīng)用包括研究應(yīng)用、多肽合成應(yīng)用、RNA干擾應(yīng)用和治療應(yīng)用。以下分別詳述這些應(yīng)用的各種范疇。研究應(yīng)用用本發(fā)明方法產(chǎn)生的核酸在研究上的應(yīng)用例子包括設(shè)計用于具體基因的特征鑒定。在這種應(yīng)用中，采用本發(fā)明載體將感興趣的基因引入靶細(xì)胞內(nèi)并表達(dá)，觀察插入的基因?qū)?xì)胞表型的作用。以此種方式，可推斷基因的活性和其編碼產(chǎn)物性質(zhì)的相關(guān)信息。也可用本發(fā)明方法制備細(xì)胞過度表達(dá)和/或錯誤表達(dá)感興趣基因的模型，觀察這種突變體表達(dá)模型的效果。多肽合成應(yīng)用除以上所述研究應(yīng)用外，用本發(fā)明方法產(chǎn)生的核酸也可用于多肽，例如感興趣蛋白質(zhì)的合成。在這類應(yīng)用中，將包含編碼感興趣多肽的小質(zhì)粒載體連接所需和/或理想的表達(dá)調(diào)控序列如啟動子等(即表達(dá)模塊)，通過體內(nèi)給予多細(xì)胞生物將其引入該生物的靶細(xì)胞(作為表達(dá)宿主細(xì)胞)內(nèi)而表達(dá)該多肽。體內(nèi)給予多細(xì)胞生物的宿主靶細(xì)胞后，維持在足以表達(dá)靶基因的條件下。然后收獲所表達(dá)的蛋白質(zhì)，需要時可用常規(guī)方法純化。如此，本發(fā)明方法至少能提高多細(xì)胞生物體的感興趣蛋白質(zhì)的表達(dá)量。術(shù)語“至少能提高”包括所用方法使多細(xì)胞生物體的某蛋白質(zhì)表達(dá)量高于體內(nèi)給予該載體之前該蛋白質(zhì)起初表達(dá)量的情形。術(shù)語“至少能提高”還包括給予該載體前該多細(xì)胞生物體實(shí)際上不表達(dá)該蛋白質(zhì)的情形。術(shù)語“至少能提高”指宿主中某具體蛋白質(zhì)表達(dá)量至少提高了約2倍，通常至少約5倍，更常至少約10倍。由于本發(fā)明方法至少能提高多細(xì)胞生物的蛋白質(zhì)表達(dá)量，故它們可用于各種不同的應(yīng)用，包括農(nóng)業(yè)應(yīng)用、藥物制備應(yīng)用等，以及以下更詳述的治療應(yīng)用。RNA干擾應(yīng)用除上述蛋白質(zhì)合成應(yīng)用外，本發(fā)明方法制備的小環(huán)核酸載體也可用于RNA干擾應(yīng)用，即小單鏈或雙鏈RNA，包括shRNA、siRNA、RNA誘殺物、核酶或反義RNA等介導(dǎo)的序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)沉默。在這類實(shí)施方式中，提供的感興趣多核苷酸包含能表達(dá)非翻譯性RNA產(chǎn)物的編碼序列，例如以下文獻(xiàn)McCaffery等，“成年小鼠中的RNA干W'(RNAinterferenceinadultmice),Nature418(6893):38-9(2002)；Paskowitztf等，“快速穩(wěn)定地敲除視網(wǎng)膜色素上皮中的內(nèi)源基因”(Rapidandstableknockdownofanendogenousgeneinretinalpigmentepithelium)HumGeneTher.18(10)871-80(2007)所述的shRNA；Lieber等，“通過腺病毒介導(dǎo)的核酶表達(dá)去除被感染的人肝細(xì)胞中的丙肝病毒RNA”(EliminationofhepatitisCvirusRNAininfectedhumanhepatocytesbyadenovirus-mediatedexpressionofribozymes)JVirol(1996年12月)70(12):8782-91；Lieber等，“腺病毒介導(dǎo)小鼠表達(dá)核酶相關(guān)文章”(RelatedArticlesAdenovirus-mediatedexpressionofribozymesinmice)JVirol.(1996年5月)70(:3153-8；Tang等，“靜脈注射AAV-載體包含的血管緊張素反義核酸降低了高血壓，，(IntravenousangiotensinogenantisenseinAAV-basedvectordecreaseshypertension)AmJPhysiol.(1999年12月)277(6Pt2):H2392_9；Horster等，“包含gfp-反義核酸/核酶融合序列的重組體AAV-2可監(jiān)控轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因表達(dá)和顯示抗HIV-I效力”(RecombinantAAV~2harboringgfp-antisense/ribozymefusionsequencesmonitortransduction，geneexpression,andshowanti-HIV-lefficacy)GeneTher.(1999年7月)6(7):1231-8和fillips等，“用無致病性腺相關(guān)病毒載體體內(nèi)遞送ATl-RmRNA反義核酸長時其月降低了高血壓”(Prolongedreductionofhighbloodpressurewithaninvivo,nonpathogenic,adeno—associatedviralvectordeliveryofATI-RmRNAantisense)Hypertension.(1997年1月)四(IPt2):374-80所述的反義RNA。如此，可用本發(fā)明方法將治療用非翻譯性RNA分子，如shRNA、反義RNA等遞送給宿主靶細(xì)胞。治療應(yīng)用本發(fā)明方法制備的核酸還可用于治療應(yīng)用，此時可利用該載體將治療性核酸，如基因或非翻譯性RNA(如shRNA)引入靶細(xì)胞中，即基因治療應(yīng)用，以提供持久表達(dá)該載體中核酸編碼的產(chǎn)物?？衫帽景l(fā)明的載體遞送各種各樣的治療性核酸，包括編碼蛋白質(zhì)或非翻譯性RNA的核酸。感興趣的治療性核酸包括宿主靶細(xì)胞中缺陷基因(例如負(fù)責(zé)遺傳缺陷疾病的基因)的替代基因，具有治療癌癥治療用途的基因等。感興趣的治療性核酸還包括能介導(dǎo)序列特異性轉(zhuǎn)錄后靶細(xì)胞基因表達(dá)沉默的RNA，如雙鏈RNA或shRNA的編碼核酸序列。用于治療遺傳缺陷疾病的具體治療基因包括編碼以下產(chǎn)物的基因VIII因子、IX因子、β-球蛋白、低密度脂蛋白受體、腺苷脫氨酶、嘌呤核苷磷酸化酶、鞘磷脂酶、葡萄糖腦苷脂酶、囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白、α1抗胰蛋白酶、CD-18、鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶、精氨琥珀酸合成酶、苯丙氨酸羥化酶、支鏈α-酮酸脫氫酶、延胡索酰乙酰乙酸水解酶、葡萄糖6-磷酸酶、α-L-巖藻糖苷酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、α-L-艾杜苷酸酶、半乳糖1_磷酸鹽尿苷酰轉(zhuǎn)移酶等，采用的上述蛋白質(zhì)具體編碼序列通常是要治病宿主天然所有蛋白質(zhì)的編碼序列，即人的編碼序列，用以治療人類宿主?？捎帽景l(fā)明方法遞送的癌癥治療基因包括能增強(qiáng)淋巴細(xì)胞抗腫瘤活性的基因、表達(dá)的產(chǎn)物能增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞免疫原性的基因、腫瘤抑制基因、毒素基因、自殺基因、多藥耐藥基因、反義序列等等。以上所述本發(fā)明方法的一個重要特征是，本發(fā)明方法可用于體內(nèi)基因治療應(yīng)用。體內(nèi)基因治療應(yīng)用指不需要從宿主機(jī)體取出表達(dá)治療基因用的靶細(xì)胞然后使之接觸所述載體系統(tǒng)。而是相反，可將本發(fā)明的載體直接給予多細(xì)胞生物體內(nèi)讓靶細(xì)胞攝取，然后由靶細(xì)胞表達(dá)。另一個重要特征是，無須使所述載體整合入靶細(xì)胞基因組中仍能持久表達(dá)。藥盒本發(fā)明還提供一種藥盒，用于實(shí)施本發(fā)明將制備的小環(huán)核酸遞送給靶細(xì)胞的方法，以及將所述載體引入靶細(xì)胞的方法。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的藥盒裝有包含在組成型啟動子調(diào)控下的L-阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白araE基因的基因組整合編碼序列和缺乏功能性內(nèi)切核酸酶1表達(dá)的細(xì)菌細(xì)胞。在某些實(shí)施方式中，所述藥盒裝有這類細(xì)菌細(xì)胞，還裝有包含供插入感興趣多核苷酸的限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)的小環(huán)親代質(zhì)粒，所述感興趣的多核苷酸側(cè)接單向位點(diǎn)特異性重組酶識別的attB和attP位點(diǎn)。此種親代質(zhì)粒還包含單向位點(diǎn)特異性重組酶的編碼序列、非該細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)源性的限制性內(nèi)切核酸酶的編碼序列和至少一個所編碼限制性內(nèi)切核酸酶識別的限制位點(diǎn)(以在重組反應(yīng)后破壞質(zhì)粒骨架環(huán))?？捎盟越橘|(zhì)配制所述載體或凍干。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明藥盒中所裝的細(xì)菌細(xì)胞，除了包含在組成型啟動子調(diào)控下的L-阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白araE基因的編碼序列和缺乏功能性內(nèi)切核酸酶1表達(dá)外，還包含非該細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)源性的限制性內(nèi)切核酸酶(例如罕見的切割性限制性內(nèi)切核酸酶IScel)的基因組整合編碼序列。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的藥盒裝有該細(xì)菌細(xì)胞和上述小環(huán)親代質(zhì)粒。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明藥盒中所裝的細(xì)菌細(xì)胞，如以上詳述，除了包含在組成型啟動子調(diào)控下的L-阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白araE基因的基因組整合編碼序列和缺乏功能性內(nèi)切核酸酶1表達(dá)外，還能表達(dá)單向位點(diǎn)特異性重組酶和非該細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)源性的限制性內(nèi)切核酸酶。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明藥盒中所裝的細(xì)菌細(xì)胞能表達(dá)在組成型啟動子調(diào)控下的額外L-阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白LacYA177C。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明藥盒裝有該細(xì)菌細(xì)胞和上述小環(huán)親代質(zhì)粒。本發(fā)明藥盒也可裝有水性遞送運(yùn)載體，如緩沖鹽水等。此外，藥盒還可裝有用于將感興趣核酸轉(zhuǎn)運(yùn)入小環(huán)親代質(zhì)粒中的一種或多種限制性內(nèi)切核酸酶，所述限制性內(nèi)切酶與小環(huán)親代質(zhì)粒中的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)相對應(yīng)。在本發(fā)明的藥盒中，可將上述組分組合成單一的水性組合物遞送給宿主，或?qū)⒉煌M合物分裝在不同容器中。該藥盒任選還裝有遞送水性組合物給宿主的管狀遞送裝置，如針筒等。這種遞送裝置可以預(yù)先或不預(yù)先裝入所述水性組合物。除上述組分外，本發(fā)明藥盒還裝有實(shí)施本發(fā)明方法的說明書。藥盒中的這些說明書可有多種形式，其中一種或多種裝在該藥盒中。這些說明書的一種形式是印制在合適的介質(zhì)或底材，如紙片上的信息，印制在藥盒包裝材料上的信息，或插入包裝材料中。另一種方式是計算機(jī)可讀媒體，如記錄有信息的磁盤、光盤等。還有一種方式是利用網(wǎng)址通過因特網(wǎng)進(jìn)入遠(yuǎn)程地址尋找這種信息。該藥盒提供任何一種方便的方式。實(shí)施例給出以下實(shí)施例向本領(lǐng)域普通技術(shù)人員提供了完全的公開，并說明如何產(chǎn)生和使用本發(fā)明，不意味限制本發(fā)明人所認(rèn)為的本發(fā)明范圍，也不意味以下實(shí)驗(yàn)代表了所進(jìn)行的所有的或唯一的實(shí)驗(yàn)。已努力確保所用數(shù)字(如含量，溫度等)的準(zhǔn)確性，但應(yīng)理解可能有一些實(shí)驗(yàn)誤差和偏差。除非另有說明，份數(shù)是重量份數(shù)，分子量是重均分子量，溫度單位是攝氏度，壓力是大氣壓或接近大氣壓。材料和方法質(zhì)粒。如先前(ChenZY等，HumanGeneTherapy16:126，2005)所述構(gòu)建產(chǎn)生小環(huán)的質(zhì)粒p20C31.hFIX(圖1A)；而MC.hFIX(圖1B)和質(zhì)粒BB(圖1C)是從該產(chǎn)生小環(huán)的質(zhì)粒p20C31.hFIX衍生的重組產(chǎn)物。我們通過去除質(zhì)粒p20C31.hFIX中的attB-hFIX-attP序列制備了可用于治療的質(zhì)粒p20C31.IScelg&s(圖ID)。為制備質(zhì)粒pKanR.endA(圖1E)，我們用質(zhì)粒pBK-CMV中的卡那霉素抗性基因取代p20C31.hFIX中的hFIX盒，將attB-卡那霉素-attP序列重置于pBlueScript(Stratagene，LaJolla,CA)中，產(chǎn)生中間質(zhì)粒pKanR；然后我們用endA特異性引物和ToplO基因組DNA作模板，以PCR法產(chǎn)生上下游靶向序列，將它們分別插入到attB-和attP-位點(diǎn)外側(cè)。通過將衍生自質(zhì)粒p20C31.hFIX(圖1A)的串聯(lián)的3拷貝BAD.ISceI盒插入到中間質(zhì)粒pKanR的attB位點(diǎn)的上游，和用UMU基因特異性引物與ToPlO基因組DNA進(jìn)行PCR產(chǎn)生2個UMU-靶向序列，我們構(gòu)建了p3BAD.ISceIg.KanR.UMU質(zhì)粒(圖1F)。通過將8個相連的ISec1限制性位點(diǎn)(每個由一對DNA寡聚物編碼)插入到pBlueScript的KpnI位點(diǎn)，我們制備了質(zhì)粒p8ISceIs(圖1G)。質(zhì)粒pcI857.FLP和-pBAD.RED為耶魯大學(xué)WannerBL博士(PNAS97:6640，2000)所贈。0C31，鏈霉菌噬菌體重組酶基因；hFIX，人血凝蛋白IX因子；attB，細(xì)菌附著序列；attP，噬菌體附著序列；attR和attL，分別為右側(cè)和左側(cè)雜交序列；ISceIg，限制性酶ISceI的編碼基因；ISceIs,ISceI限制性位點(diǎn)；sApoE,(Miao等，MolTher1=522,2000)先前詳述的人造增強(qiáng)子/啟動子；AmpR，氨芐青霉素抗性基因；UC，pUC質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)；BDA，BAD啟動子；araC，araC阻抑基因；L-arab，L-阿拉伯糖。工程改造細(xì)菌。我們從加州大學(xué)伯克利分校的KeaslingJD博士獲得細(xì)菌菌株BW27783(KhlebnikovA等，Microbiology147:3241,2001)。為制備中間菌株BWΔendA.KanR(圖3A)，我們通過Pme1消化由質(zhì)粒pKanR.endA(圖1E)制備endA-靶向DNA片段；我們將其插入至IJBW27783中的endA基因座中，按照DatsenkoKA和WannerBL(PNAS976640,2000)的方案糾正質(zhì)粒pBAD.RED。然后我們用基因特異性引物進(jìn)行二次PCR反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)由該新菌株基因組得到的PCR產(chǎn)物具有預(yù)計大小，提示已靶向整合了該抗生素抗性基因(圖3B)。為去除BWΔendA.KanR中的卡那霉素抗性基因，我們用質(zhì)粒p20C31.IScelg&s轉(zhuǎn)化菌株BWAendA.KanR后，取菌落接種含L-阿拉伯糖的LB肉湯，30°C培養(yǎng)4小時，然后在加或不加抗生素的瓊脂平板上培養(yǎng)細(xì)菌菌落，選出氨芐青霉素和卡那霉素敏感菌落(圖3A)。為測定內(nèi)切核酸酶1是否已滅活，我們用質(zhì)粒P20C31.hFIX轉(zhuǎn)化所得菌株BWAendA，用標(biāo)準(zhǔn)方法產(chǎn)生小環(huán)，發(fā)現(xiàn)這種小環(huán)是完整的，進(jìn)一步證實(shí)已刪除了endA基因(圖3C)。采用由質(zhì)粒p3BAD.ISceI.KanR.UMU產(chǎn)生的靶向DNA(圖1F)，按同一方法，我們將串聯(lián)的3拷貝BAD.ISce1基因插入到菌株BWAendA的基因組中，產(chǎn)生新菌株BffAendA.31SeeIgo小環(huán)產(chǎn)生方法。按照Chen等，HumanGeneTherapy16126，2005所述，我們制備了小環(huán)。簡言之，我們用p20C31.hFIX轉(zhuǎn)化Top10或其它菌株，在LB中培養(yǎng)細(xì)菌菌落。我們離心沉淀培養(yǎng)過夜的細(xì)菌，用含L-阿拉伯糖的新鮮LB按41(培養(yǎng)過夜的細(xì)菌體積與新鮮肉湯之比)重懸，30°C下250rpm搖動培養(yǎng)2小時。然后加入一半體積的含L-阿拉伯糖的新鮮LB肉湯(pH8.0)，37°C再培養(yǎng)2小時以誘導(dǎo)表達(dá)。用凱杰(Qiagen)質(zhì)粒純化試劑盒(加州瓦倫西亞的凱杰公司(Qiagen，Valencia,CA))分離細(xì)菌產(chǎn)生的小環(huán)MC.FIX。實(shí)施例1降低來自BW27783的小環(huán)制劑中的雜質(zhì)DNA在我們的最初方案中，采用小環(huán)產(chǎn)生質(zhì)粒如p20C31.hFIX(圖1A)和Top10菌株來產(chǎn)生小環(huán)(ChenZY等，HumanGeneTherapy16126，2005)。然而在我們的小環(huán)制劑中，我們檢測到小量但可變化的雜質(zhì)DNA，其包含未重組的親代質(zhì)粒和質(zhì)粒骨架環(huán)(質(zhì)粒BB)。我們覺察到這種雜質(zhì)DNA主要源自“全或無”現(xiàn)象即某細(xì)菌亞群變得不能表達(dá)高負(fù)載、低親和力的L-阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白araE，并且不能吸收L-阿拉伯糖和在araC_ABD調(diào)控系統(tǒng)控制下表達(dá)0C31和ISceI基因。KhlebnikovA及其同事(Microbiology147:3241,2001)報道可用組成型啟動子cp8驅(qū)動菌株BW27783表達(dá)araE部分克服了此“全或無”現(xiàn)象。為嘗試解決此種雜質(zhì)DNA問題，我們用同樣的cp8啟動子代替天然啟動子驅(qū)使ToplO菌株表達(dá)araE。小環(huán)產(chǎn)量或污染沒有改變也許是由于未正確插入該DNA序列。此外，我們用從加州大學(xué)伯克利分校的Keasling博士獲得的BW27783菌株代替ToplO制備小環(huán)，發(fā)現(xiàn)該菌株產(chǎn)生的小環(huán)用瓊脂凝膠電泳檢測不含可測見的雜質(zhì)DNA，當(dāng)培養(yǎng)反應(yīng)液中的arac-pBAD誘導(dǎo)劑L-阿拉伯糖濃度低至0.001%(比ToplO菌株低1，000倍)時實(shí)現(xiàn)了這個目標(biāo)(圖2A)。出乎意料的是，我們發(fā)現(xiàn)小環(huán)DNA有不同程度的降解(圖2B)。實(shí)施例2去除ENDA基因克服了DNA降解問題由于已知recA會影響質(zhì)粒的穩(wěn)定性(KhlebnikovA等，JBacteriol182:7029，2000)，我們滅活了BW27783中的recA基因，但發(fā)現(xiàn)這沒有幫助(資料未顯示)，感覺這是內(nèi)切核酸酶1引起的。我們著手刪除編碼這種破壞DNA酶的endA基因。為此，我們制備了含有側(cè)接attB和attP位點(diǎn)的卡那霉素抗性基因和兩個PCR產(chǎn)生的endA基因靶向序列的質(zhì)粒pkanR.endA(圖1E)；按照DatsenkoKA和WannerBL(PNAS97:6640,2000)的方案加以修飾，用Pme1切割該質(zhì)粒得到線性靶向DNA序列后將其整合于BW27783的endA基因(圖3A)。按所提出方案采用2條35-bp靶向序列的第一次嘗試失敗(資料未顯示)；然而后來通過分別延長該靶向序列至329-和754-bp我們獲得了成功。采用卡那霉素抗性基因和endA特異性引物作PCR，在4個得到的細(xì)菌菌落中有3個檢測到整合的DNA(圖3B)。我們用質(zhì)粒P20C31.IScelg&s表達(dá)0C31重組酶介導(dǎo)attB與attP之間的重組從而去除卡那霉素抗性基因，獲得菌株BWΔendA(圖3A).然后，我們用BWAendA菌株和p20C31.hFIX(圖1A)制備小環(huán)，發(fā)現(xiàn)該小環(huán)完整(圖3C)。意外地是，我們發(fā)現(xiàn)該小環(huán)制劑中有微量雜質(zhì)DNA，而用親代菌株BW27783制備的小環(huán)制劑未見此種雜質(zhì)(圖2A)。我們假設(shè)此微量雜質(zhì)DNA來源于死亡細(xì)菌；或者來源于未完全消除Morgan-Kiss及其同事(PNAS99=7373,2002)提出的“全或無”現(xiàn)象。這些作者發(fā)現(xiàn)乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白突變體LacYA177C獲得了作為L-阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的額外功能，表達(dá)此突變體能完全消除此“全或無”現(xiàn)象。因此，我們從耶魯大學(xué)CronanJE博士獲得突變體LacYA177C基因，將其置于乳糖苷酶基因(bla)的組成型啟動子控制下，用其替代中間菌株基因組中的野生型LacY基因(圖7B；圖9A-D)。實(shí)施例3表達(dá)細(xì)菌基因組中的ISCEI基因我們假設(shè)制備無0C31-和ISceI-編碼DNA的小環(huán)的最佳方法是由細(xì)菌基因組表達(dá)重組酶0C31和限制酶ISce1。我們假設(shè)任何培養(yǎng)物中都有死亡細(xì)菌因此污染不可避免，這些雜質(zhì)DNA可引起更多危害，因?yàn)樗鼈兪黔h(huán)形穩(wěn)定的、物理上不能與所述小環(huán)相區(qū)別而難以去除。相反，將0C31和ISceI整合入細(xì)菌基因組中時，作為細(xì)菌基因組線性DNA碎片，這些有危害的基因污染機(jī)會少且更易清除，可被宿主菌外切核酸酶降解，對接受治療者無害或影響很小。因此，我們著手將小環(huán)產(chǎn)生質(zhì)粒中的BAD.ISceI盒重新置于細(xì)菌基因組中。為此，我們制備了質(zhì)粒p3BAD.ISCeIg.KanR.UMU，其含有串聯(lián)的3拷貝BAD.ISceI盒和2個PCR產(chǎn)生的細(xì)菌UMU基因座靶向序列，其側(cè)接3BAD.IScel.attB-kanR-attP盒(圖1F)。按照以上所述相同方法滅活endA基因，成功地將ISce1基因整合入BWΔendA基因組中，獲得菌株BWΔendA.3ISce1(圖4A)。同樣，用該基因特異性引物作PCR測到ISce1基因(圖4B)。為測定該整合的ISceI基因是否具有功能，我們用含8個相連的ISceI限制位點(diǎn)的質(zhì)粒pSISce1轉(zhuǎn)染新的細(xì)菌菌株(圖1G)，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)ISce1酶表達(dá)4小時后該質(zhì)粒幾乎完全消失，但不表達(dá)ISceI時該質(zhì)粒保持完整(圖4C)。我們發(fā)現(xiàn)基因組ISce1基因在小環(huán)生產(chǎn)設(shè)施中工作良好，下文將更詳細(xì)敘述(圖5B和C)。實(shí)施例4基因組ISCE1基因在小環(huán)制備設(shè)置中的功能在以上章節(jié)中，我們證明了整合的3拷貝BAD.ISce1基因功能是破壞含8個ISce1限制性位點(diǎn)的質(zhì)粒。在此，我們進(jìn)一步證明在現(xiàn)行小環(huán)制備設(shè)置中用新的菌株同樣能去除雜質(zhì)DNA。我們用新菌株進(jìn)行了二次制備小環(huán)的實(shí)驗(yàn)。第一次實(shí)驗(yàn)，我們采用了含2.3-kbRSV.hAAT.bpA盒和1拷貝BAD.0C31基因，和分別含8個或32個或64個相連ISecl位點(diǎn)的三種親代質(zhì)粒(圖5A)。用先前Chen等，HumGeneTher16=126,2005所述的常規(guī)方法以這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌株BWAendA.3ISce1并制備小環(huán)。用有限的小環(huán)制劑作瓊脂糖凝膠電泳估計雜質(zhì)DNA含量，發(fā)現(xiàn)在這三種小環(huán)制劑中幾乎看不到雜質(zhì)(圖5B)。第二次實(shí)驗(yàn)，我們采用相似的小環(huán)產(chǎn)生質(zhì)粒(質(zhì)粒骨架中編碼4.2-kb表達(dá)盒和32個IScel位點(diǎn))，發(fā)現(xiàn)幾乎看不見污染的DNA(圖5C)。因此，整合的ISce1基因與多個這種位點(diǎn)協(xié)同工作良好。實(shí)施例5將多個拷貝的0C31基因插入BWAENDA.3ISCEIG的基因組中由于小環(huán)制劑中的0C31和ISce1基因有可能危害接受治療者的基因組，從小環(huán)制劑中徹底去除它們是臨床級載體DNA的重要安全評判標(biāo)準(zhǔn)。為此，整合3拷貝ISceI基因之后，我們重新將質(zhì)粒細(xì)菌骨架序列中的0C31基因安置在細(xì)菌基因組中。期望小環(huán)制劑中污染的0C31和ISce1基因只由細(xì)菌基因組線性DNA碎片編碼，可用物理方法與小環(huán)區(qū)分開。具體說，采用多種商品化可購得的生物學(xué)試劑或物理方法更易去除這種線性DNA。例如，可采用λ外切核酸酶破碎這種線性DNA而不會損傷小環(huán)DNA制劑，得到無0C31和ISce基因的小環(huán)產(chǎn)品。將3拷貝的BAD.ISce1盒整合入細(xì)菌基因組中，發(fā)現(xiàn)其正確地發(fā)揮了功能(圖5B和C)。我們進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，將6個拷貝的BAD.0C31整合入菌株BWAendA.3ISce1的基因組中。圖7B顯示包含我們已制備和將要制備的所有遺傳改變的最終細(xì)菌基因組，可用此菌株來制備無0C31和ISce編碼序列的臨床級小環(huán)載體。圖8A-8C顯示BAD.0C31基因的整合。圖A顯示先前制備的菌株D8(BffAendA.31Sce1)ΔendA基因座中靶向attB位點(diǎn)的整合(圖3和4)。如前文所述我們用Pmel消化前體質(zhì)粒制備了含attB序列的線性DNA，通過RED酶介導(dǎo)將其整合入ΔendA基因座(圖3A)。然后，通過質(zhì)粒pcI857.FLP表達(dá)的翻轉(zhuǎn)酶(43°C培養(yǎng)細(xì)菌8小時誘導(dǎo)翻轉(zhuǎn)酶表達(dá)同時破壞該質(zhì)粒)介導(dǎo)2個FPT序列之間的重組，去除整合子中的卡那霉素抗性(KanR)基因。結(jié)果，我們獲得了含修飾的AendA基因座(其含F(xiàn)RT和attB位點(diǎn))的菌株D8FRTII。圖B顯示2拷貝BAD.0C31基因的整合。我們用質(zhì)粒p20C31轉(zhuǎn)染菌株D8FRTII并誘導(dǎo)表達(dá)0C31酶，通過attB與attP之間的重組介導(dǎo)隨后轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒p20C31.R6KFRT整合入endA基因座；通過基因組內(nèi)切核酸酶基因表達(dá)的IScel限制性消化破壞質(zhì)粒p20C31；然后如上所述通過2個FRT位點(diǎn)之間的重組去除整合子中的R6K.KanR序列(圖8A)。我們在該整合質(zhì)粒中使用DNA(復(fù)制)起點(diǎn)R6K，因?yàn)镽6K需要蛋白pi才有功能，并且只有在Pi-表達(dá)菌株如PIRl(加州卡爾斯巴德的英杰公司(Invitrogen，CarlsbadCA))中才能支持質(zhì)粒復(fù)制，但在Pi-陰性D8FRTII菌株中不能支持質(zhì)粒復(fù)制；此特征可確保只選出含整合而非游離型的質(zhì)粒P20C31.R6KFRT中編碼的抗生素抗性基因(KanR)的菌落。圖C顯示該整合子的PCR證據(jù)。采用緊靠engA基因座外側(cè)的一對引物進(jìn)行PCR反應(yīng)；泳道1和2是用CC20C31菌株克隆1和3的基因組DNA作模板產(chǎn)生的PCR反應(yīng)產(chǎn)物，而泳道3是用菌株D8FRTII產(chǎn)生的PCR反應(yīng)產(chǎn)物；PCRl(7.5-kb)和2(2.5-KB)是各自反應(yīng)的預(yù)期產(chǎn)物。圖D顯示CC20C31菌株克隆1和3產(chǎn)生的小環(huán)(MC，約2.5-kb)。該親代質(zhì)粒pattB.RHB.attP.IScelsx32編碼與圖5A所示親代質(zhì)粒相同的RHB轉(zhuǎn)基因和32個ISce1位點(diǎn)，但不含BAD.0C31基因。用Chen等，HumnGeneTher16126，2005先前所述的標(biāo)準(zhǔn)方法產(chǎn)生小環(huán)；用XbaI加BamHl限制性消化該DNA然后電泳。以上只是闡述了本發(fā)明的原理，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，雖然本文沒有清楚地描述或顯示，但可設(shè)計不同的安排使本發(fā)明的原理具體化，這些均包括在本發(fā)明的思路和范圍內(nèi)。另外，本文引用的所有例子和假定的措詞主要目的是幫助讀者理解本發(fā)明的原理和發(fā)明人的概念以促進(jìn)該技術(shù)，不應(yīng)理解為本發(fā)明限制于專門引用的實(shí)施例和條件。而且，本發(fā)明陳述的所有原理、方面的內(nèi)容和實(shí)施方式以及具體的實(shí)施例包括其結(jié)構(gòu)和功能的等同物。此外，這類等同物包括目前已知的和將來開發(fā)的等同物，即開發(fā)的、不論結(jié)構(gòu)如何，凡能執(zhí)行相同功能的任何元件。因此，本發(fā)明的范圍不限于本文所示和描述的典型實(shí)施方式，而是由附件權(quán)利要求書具體化本發(fā)明的范圍和思路。權(quán)利要求1.一種小環(huán)核酸載體制劑，其包含含有感興趣多核苷酸和單向位點(diǎn)特異性重組酶的產(chǎn)物雜交序列的小環(huán)核酸載體，限制性條件是該小環(huán)核酸載體沒有質(zhì)粒骨架DNA序列；和藥學(xué)上可接受的賦形劑，該制劑中基本上沒有污染性核酸。2.如權(quán)利要求1所述的小環(huán)核酸載體制劑，其特征在于，所述污染性核酸包括線性核酸片段。3.如權(quán)利要求1所述的小環(huán)核酸載體制劑，其特征在于，所述污染性核酸包括環(huán)形核酸序列。4.如權(quán)利要求1所述的小環(huán)核酸載體制劑，其特征在于，所述污染性核酸包括單向位點(diǎn)特異性重組酶的編碼核酸序列。5.如權(quán)利要求1所述的小環(huán)核酸載體制劑，其特征在于，所述污染性核酸包括限制性內(nèi)切核酸酶的編碼核酸序列。6.如權(quán)利要求1所述的小環(huán)核酸載體制劑，其特征在于，所述單向位點(diǎn)特異性重組酶的產(chǎn)物雜交序列是attL或attR。7.如權(quán)利要求1所述的小環(huán)核酸載體制劑，其特征在于，所述感興趣的多核苷酸包含表達(dá)盒。8.如權(quán)利要求7所述的小環(huán)核酸載體制劑，其特征在于，所述表達(dá)盒編碼多肽。9.如權(quán)利要求7所述的小環(huán)核酸載體制劑，其特征在于，所述表達(dá)盒編碼非翻譯性核糖核酸。10.如權(quán)利要求9所述的小環(huán)核酸載體制劑，其特征在于，所述非翻譯性核糖核酸是短發(fā)夾核糖核酸(shRNA)。11.如權(quán)利要求9所述的小環(huán)核酸載體制劑，其特征在于，所述非翻譯性核糖核酸是雙鏈或單鏈核糖核酸。12.如權(quán)利要求1所述的小環(huán)核酸載體制劑，其特征在于，所述小環(huán)核酸載體的長度范圍為約100bp-10kb。13.一種制備基本上沒有污染性核酸的小環(huán)核酸載體組合物的方法，該方法包括用包含(i)側(cè)接單向位點(diǎn)特異性重組酶所識別的attB和attP重組位點(diǎn)的感興趣多核苷酸；(ii)至少一個非所用細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)源性的限制性內(nèi)切核酸酶識別的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的環(huán)形親代質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染經(jīng)遺傳修飾缺乏功能性內(nèi)切核酸酶1且含有在組成型啟動子調(diào)控下的araE編碼序列的細(xì)菌細(xì)胞；其中，在所述環(huán)形親代質(zhì)?；蛩黾?xì)菌細(xì)胞中，存在單向位點(diǎn)特異性重組酶和非所用細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)源性的限制性內(nèi)切核酸酶的編碼序列；在一定條件下培養(yǎng)所述細(xì)菌細(xì)胞足夠時間，以便表達(dá)單向位點(diǎn)特異性重組酶使該單向位點(diǎn)特異性重組酶重組attB和attP位點(diǎn)，并表達(dá)限制性內(nèi)切核酸酶使該限制性內(nèi)切核酸酶消化所述限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，其中通過培養(yǎng)提供包含感興趣多核苷酸和所述單向位點(diǎn)特異性重組酶的產(chǎn)物雜交序列的小環(huán)核酸載體；純化這種小環(huán)核酸載體，提供基本上沒有污染性核酸的小環(huán)核酸載體組合物。14.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述污染性核酸包括線性核酸片段。15.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述污染性核酸包括環(huán)形核酸序列。16.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述污染性核酸包括所述單向位點(diǎn)特異性重組酶的編碼核酸序列。17.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述污染性核酸包括所述限制性內(nèi)切核酸酶的編碼核酸序列。18.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述感興趣多核苷酸包含表達(dá)盒。19.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述表達(dá)盒編碼多肽。20.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述表達(dá)盒編碼非翻譯性核糖核酸。21.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，所述非翻譯性核糖核酸是短發(fā)夾核糖核酸(shRNA)。22.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，所述非翻譯性核糖核酸是雙鏈核糖核酸。23.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述小環(huán)核酸載體沒有質(zhì)粒骨架細(xì)菌DNA序列。24.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述經(jīng)遺傳修飾的細(xì)菌細(xì)胞基因組中編碼內(nèi)切核酸酶1的endA基因受到破壞。25.如權(quán)利要求M所述的方法，其特征在于，所述破壞是插入、倒置或缺失。26.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述單向位點(diǎn)特異性重組酶是噬菌體PhiC31、R4、TP901-l、phiBTl、Bxbl、RV-l、A118、U153或phiFCl的整合酶。27.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述限制性內(nèi)切核酸酶是I-kel、I-Ceu1、Pl-Psp1或PUce1。28.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述單向位點(diǎn)特異性重組酶處在誘導(dǎo)型啟動子的控制下。29.如權(quán)利要求觀所述的方法，其特征在于，所述啟動子可用L-阿拉伯糖誘導(dǎo)。30.如權(quán)利要求觀所述的方法，其特征在于，所述單向位點(diǎn)特異性重組酶編碼序列存在于親代質(zhì)粒中。31.如權(quán)利要求觀所述的方法，其特征在于，所述單向位點(diǎn)特異性重組酶編碼序列存在于所述細(xì)菌細(xì)胞的染色體中。32.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，非所述細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)源性的限制性內(nèi)切核酸酶處在誘導(dǎo)型啟動子控制下。33.如權(quán)利要求32所述的方法，其特征在于，所述啟動子可用L-阿拉伯糖誘導(dǎo)。34.如權(quán)利要求32所述的方法，其特征在于，非所述細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)源性的限制性內(nèi)切核酸酶的編碼序列存在于所述親代質(zhì)粒中。35.如權(quán)利要求32所述的方法，其特征在于，非所述細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)源性的限制性內(nèi)切核酸酶的編碼序列存在于所述細(xì)菌細(xì)胞的染色體中。36.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述單向位點(diǎn)特異性重組酶的產(chǎn)物雜交序列是attL或attRo37.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述小環(huán)核酸載體的長度范圍為約100bp-10kb。38.一種經(jīng)遺傳修飾缺乏功能性內(nèi)切核酸酶1并包含在組成型啟動子調(diào)控下的araE編碼序列的細(xì)菌細(xì)胞。39.如權(quán)利要求38所述的細(xì)菌細(xì)胞，還包含在誘導(dǎo)型啟動子調(diào)控下的單向位點(diǎn)特異性重組酶的編碼序列，該序列整合在基因組中。40.如權(quán)利要求38所述的細(xì)菌細(xì)胞，還包含在誘導(dǎo)型啟動子調(diào)控下的非所述細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)源性的限制性內(nèi)切核酸酶的編碼序列，該序列整合在基因組中。41.如權(quán)利要求39所述的細(xì)菌細(xì)胞，還包含非所述細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)源性的限制性內(nèi)切核酸酶的編碼序列，該序列整合在基因組中。42.如權(quán)利要求39所述的遺傳修飾的細(xì)菌細(xì)胞，其特征在于，所述單向位點(diǎn)特異性重組酶是噬菌體PhiC31、R4、TP901-1、phiBTl、Bxbl、RV-1、A118、U153或phiFCl的整合酶。43.如權(quán)利要求40所述的遺傳修飾的細(xì)菌細(xì)胞，其特征在于，所述限制性內(nèi)切核酸酶是UceI、I-CeuUPl-Psp1或PUce1。44.如權(quán)利要求38所述的遺傳修飾的細(xì)菌細(xì)胞，其特征在于，所述遺傳修飾的細(xì)菌細(xì)胞基因組中編碼內(nèi)切核酸酶1的endA基因受到破壞。45.如權(quán)利要求44所述的遺傳修飾的細(xì)菌細(xì)胞，其特征在于，所述破壞是插入、倒置或缺失。46.如權(quán)利要求38所述的遺傳修飾的細(xì)菌細(xì)胞，還包含突變蛋白LacYA177C的編碼序列。47.一種將表達(dá)盒引入動物細(xì)胞內(nèi)的方法，所述方法包括給予所述動物包含沒有質(zhì)粒骨架細(xì)菌DNA序列的小環(huán)核酸載體的制劑，所述制劑基本上沒有污染性核酸，和所述小環(huán)核酸載體包含單向位點(diǎn)特異性重組酶的產(chǎn)物雜交序列和所述表達(dá)盒，存在于細(xì)胞中時能夠持久高水平地表達(dá)所述表達(dá)盒。48.如權(quán)利要求46所述的方法，其特征在于，所述引入為離體引入。49.如權(quán)利要求46所述的方法，其特征在于，所述引入為體內(nèi)引入。50.如權(quán)利要求46所述的方法，其特征在于，所述靶細(xì)胞存在于有血管的多細(xì)胞生物體內(nèi)。51.一種藥盒，其中裝有遺傳修飾的細(xì)菌細(xì)胞，該細(xì)菌細(xì)胞的基因組中含有在組成型啟動子調(diào)控下的L-阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白araE的編碼序列，該遺傳修飾的細(xì)菌細(xì)胞不表達(dá)功能性內(nèi)切核酸酶1；和用該遺傳修飾的細(xì)菌細(xì)胞制備用于給予對象的基本上沒有污染性核酸的小環(huán)核酸載體制劑的說明書。52.如權(quán)利要求50所述的藥盒，其特征在于，所述遺傳修飾的細(xì)菌細(xì)胞的基因組中還包含非所述細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)源性的限制性內(nèi)切核酸酶的編碼序列。53.如權(quán)利要求50所述的藥盒，其特征在于，所述遺傳修飾的細(xì)菌細(xì)胞的基因組中還包含單向位點(diǎn)特異性重組酶的編碼序列。54.如權(quán)利要求50所述的藥盒，其特征在于，所述遺傳修飾的細(xì)菌細(xì)胞的基因組中還包含突變蛋白LacYA177C的編碼序列。55.如權(quán)利要求50所述的藥盒，還裝有包含以下組件的環(huán)形核酸(a)側(cè)接單向位點(diǎn)特異性重組酶識別的attB和attP位點(diǎn)的克隆位點(diǎn)；和(b)至少一個非所述細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)源性的限制性內(nèi)切核酸酶識別的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。全文摘要本發(fā)明提供用于給予對象的小環(huán)核酸載體制劑，該小環(huán)核酸載體包含感興趣的多核苷酸、單向位點(diǎn)特異性重組酶的產(chǎn)物雜交序列且沒有質(zhì)粒骨架細(xì)菌DNA序列。還提供制備所述制劑的方法，以及將所述小環(huán)核酸載體制劑給予對象的方法。本發(fā)明的方法和組合物可用于各種不同應(yīng)用，包括研究和治療應(yīng)用。文檔編號C12N15/00GK102083975SQ200980125924公開日2011年6月1日申請日期2009年7月2日優(yōu)先權(quán)日2008年7月3日發(fā)明者M(jìn)·A·凱,Z·陳申請人:利蘭·斯坦福青年大學(xué)托管委員會