專利名稱：以dna作為元件的生物傳感器的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及利用與分析物特異性結合的傳感蛋白、和由該傳感蛋白特異性識別的 核酸來檢測和/或定量被測試樣中的分析物的方法等。
背景技術：
目前，據(jù)報道，鉛、鎘或砷等有害金屬化合物導致了土壤、地下水或地表水等的污 染，在世界各地成為很大的問題。作為在環(huán)境中有害金屬污染的分析中使用的方法，已知有 火焰原子吸收光譜法(AAS)、無焰原子吸收光譜法(FLAA)、電感耦合等離子體原子發(fā)射光 譜法(ICP-AES)、電感耦合等離子體質譜法(ICP-MS)等。但是，這些儀器分析法為了進行分 析，需要對試樣進行預處理，存在不僅無法應對現(xiàn)場的快速分析、而且操作成本高的缺點。正在加緊進行可彌補這種儀器分析法的缺點的、有害金屬的簡易檢測法的開發(fā)。 作為這樣的簡易檢測法之一，使用可識別檢測對象物質的、來源于生物的酶、抗體、受體等 被測分子作為傳感元件的生物傳感器受到關注。生物傳感器中，檢測反應基于生物化學反 應或結合的特異性，因此可列舉能夠進行高靈敏度測定、測定和檢測快速且簡便、操作成 本低、傳感器自身較小因而移動性優(yōu)異等優(yōu)點。另外，通過利用酶反應、抗原抗體反應、配體 在受體上的結合等生物化學反應，具有能夠進行與特定物質的特異性高的分析的特征，因 此以少量試樣即可進行分析，也可以實現(xiàn)傳感系統(tǒng)的微小化。在各種生物傳感器的研究中，利用微生物細胞的生物傳感器由于培養(yǎng)容易、基因 操作容易，因而能夠廣泛地選擇檢測對象物質或報告基因，用途的擴大受到期待。重組微生 物生物傳感器利用了包含宿主細胞、對特定物質產生應答而促進下游基因轉錄的誘導型啟 動子以及啟動子下游的報告基因這三個要素，并根據(jù)情況組合有用于檢測報告物所發(fā)出的 信號的裝置的系統(tǒng)。該系統(tǒng)的情況下，常用作報告物的有來源于細菌或螢火蟲的熒光素酶 (參見非專利文獻1 3)、來源于維多利亞水母的GFP (參見非專利文獻2和4)、來源于大 腸桿菌的LacZ(參見非專利文獻2和5)等。本發(fā)明人已經開發(fā)出了以類胡蘿卜素合成系酶CrtA作為報告物、以海洋光合細 菌嗜硫小紅卵菌(Rhodovulum sulfidophilum)作為宿主的砷應答生物傳感器(非專利文 獻6)。嗜硫小紅卵菌具有作為類胡蘿卜素合成系之一的球形烯途徑，本來是蓄積其終產物 球形烯酮(7 7工α < y 7 > )而呈紅色的細菌。但是，該傳感器由于使用了破壞crtA而 得到的crtA缺陷株，該crtA編碼催化球形烯途徑的最終階段的球形烯單加氧酶(CrtA)，因 而蓄積作為球形烯酮的前體的球形烯而呈黃色。因此，通過向嗜硫小紅卵菌的菌體內導入 以crtA作為報告基因、且在其上游插入有砷誘導型啟動子的質粒，則在砷存在下CrtA活性 恢復，產生由黃色向紅色的色調變化。以這樣的色調變化為指標，能夠判斷砷的存在。此外，本發(fā)明人著眼于能夠在厭氧條件下培養(yǎng)的淡水性紅色細菌沼澤紅假單胞 菌、和沼澤紅假單胞菌所具有的螺菌黃素途徑中由八氫番茄紅素脫氫酶(CrtI)催化的從 八氫番茄紅素到番茄紅素的脫氫反應，通過向沼澤紅假單胞菌的菌體內導入在來源于大腸 桿菌的砷誘導型操縱子/啟動子區(qū)域的下游插入有報告基因crtl的質粒，并在砷存在下使CrtI活性恢復，開發(fā)出了不需要振蕩培養(yǎng)器的砷應答生物傳感器(專利文獻1)?，F(xiàn)有技術文獻專利文獻專利文獻1 日本特愿2007-340804非專利文獻非專利文獻 1 :ffilson Τ,Hastings Jff(1998)Bioluminescence AnnuRev Cell Dev Biol 14 197-230非專利文獻 2 :Stocker J, BalluchD, Gsell Μ, Harms H, Feliciano J,DaunertS, MalikKA, van der Meer JR(2003)Environ Sci Technol 37:4743—4750非專禾O文獻 3 Trang PT, Berg Μ, Viet PH, van MuiN, van derMeerJR(2005) Environ Sci Technol 39 :7625_7630非專利文獻4 =Tsien RY (1998) Ann Rev Biochem 67 :509_544非專利文獻5 :Silhavy TJ, Beckwith JR(1985)Microbiol Rev49 :398_418非專禾Ij 文獻 6 :Fujimoto et al.， (2006) Appl Microbiol Biotechnol73 (2) 332-338

發(fā)明內容
上述的使用微生物的生物傳感器存在不僅需要用于培養(yǎng)的器具和時間、而且細胞 所致的偏差較大等問題，為了解決這些問題，需要開發(fā)無細胞系生物傳感器。本發(fā)明的課 題在于提供一種在成本、操作性、快速性方面優(yōu)異的方法，該方法能夠利用與分析物特異性 結合的傳感蛋白和由所述傳感蛋白特異性識別的核酸，檢測和/或定量被測試樣中的分析 物。為了解決上述課題，本發(fā)明人首先嘗試開發(fā)了利用熒光共振能量轉移 (Fluorescence Resonance Energy Transfer ；FRET)的方法，即，開發(fā)了利用對 DNA 與蛋白 質的相互作用所介導的復合體分子的高級結構的變化進行檢測的熒光共振能量轉移的體 系。FRET是指激發(fā)能量從作為供體的能量供給體向作為受體的能量接受體轉移的現(xiàn)象。其 中重要的是，預先選擇好作為供體的熒光分子的發(fā)射能級與作為受體的熒光分子的吸收能 級相重疊的兩個不同的熒光分子(圖24)。如果在處于激發(fā)態(tài)的供體附近存在受體，則在供 體尚未產生發(fā)光的期間內，該激發(fā)能量使受體被激發(fā)，從而能夠檢測到受體的發(fā)光。由于距 離越近越容易產生FRET，因而可以作為檢測分子間的相互作用、分子的結構變化的手段使 用。因此，對利用鉛和鎘傳感蛋白ZntR的生物傳感器進行了研究。大腸桿菌(E. coli) 中存在基因zntA，該基因zntA編碼起到將重金屬排出到細胞外的作用的酶。在從該zntA 的轉錄起始位點起上游的-10堿基和-35堿基的區(qū)域存在啟動子區(qū)域DNA(以下，稱為啟動 子DNA)的堿基序列，鉛和鎘傳感蛋白ZntR與該啟動子DNA結合，形成ZntR蛋白-啟動子 DNA的復合體。在不存在鉛、鎘化合物等重金屬的條件下，啟動子DNA的高級結構為曲折的 狀態(tài)。另一方面，在重金屬存在下，重金屬與ZntR蛋白結合，高級結構發(fā)生變化，與之相伴 啟動子DNA成為直鏈狀。因而考慮是否可以利用該重金屬的有無所引起的ZntR蛋白-啟 動子DNA復合體的高級結構的變化來進行重金屬生物傳感器的開發(fā)。
圖25表示利用FRET對該重金屬的有無所引起的高級結構變化進行外部提示的 設計原理。首先，在啟動子DNA的兩個末端結合不同的兩種熒光物質、即異硫氰酸熒光素 (Fluorescein isothiocyanate ；FITC)禾口四甲基若丹明(Tetramethylrhodamine ;TAMRA)。 此時，通過FRET，TAMRA吸收FITC發(fā)出的熒光而被激發(fā)，從而發(fā)出熒光。在不存在重金屬 的條件下，啟動子DNA的高級結構為曲折的狀態(tài)，F(xiàn)ITC與TAMRA接近，因而當照射FITC的 激發(fā)光時，TAMRA被FITC發(fā)出的熒光激發(fā)，主要檢測到TAMRA的熒光。但是，在重金屬存在 下，啟動子DNA的高級結構變?yōu)橹辨湢?，因而FITC與TAMRA間的距離變長，TAMRA難以吸收 FITC的熒光。因此，TAMRA難以被激發(fā)，主要檢測到FITC的熒光。認為通過利用熒光光度 計測定該重金屬的有無所引起的熒光波長的變化，能夠檢測或者定量鉛或鎘化合物。同樣地，對利用砷傳感蛋白ArsR的生物傳感器進行了研究。大腸桿菌中存在對 細胞提供砷抗性的砷抗性操縱子。砷抗性操縱子的表達由基因arsR所編碼的砷傳感蛋白 ArsR調控。ArsR蛋白在不存在砷化合物的條件下與啟動子DNA結合，形成ArsR蛋白-啟 動子DNA復合體。因此，RNA聚合酶無法與啟動子DNA結合，砷抗性操縱子的轉錄被抑制。 但是，在砷化合物的存在下，ArsR蛋白與砷化合物結合，其高級結構發(fā)生變化，ArsR蛋白從 啟動子DNA解離，因而RNA聚合酶與啟動子DNA結合而開始砷抗性操縱子的轉錄。認為通 過對這樣的砷化合物的有無所引起的ArsR蛋白與啟動子DNA的結合和解離的變化進行外 部提示，能夠開發(fā)出檢測砷化合物的生物傳感器。另外，與使用ZntR蛋白的情況同樣地，設想了通過FRET對蛋白質與DNA的結合 和解離的變化進行外部提示的體系(圖26)。首先，使TAMRA與啟動子DNA的一個末端 結合。另外，使用為了對ArsR蛋白進行熒光修飾而在ArsR蛋白上融合有綠色熒光蛋白 (GreenFluorescent Protein ；GFP)的 ArsR-GFP 融合蛋白。此時，通過 FRET，TAMRA 吸收 GFP 發(fā)出的熒光而被激發(fā)，從而發(fā)出熒光。在不存在砷化合物的條件下，啟動子DNA與ArsR-GFP 融合蛋白為結合的狀態(tài)，TAMRA與GFP接近，因而當照射GFP的激發(fā)光時，TAMRA被GFP發(fā) 出的熒光激發(fā)，主要檢測到TAMRA的熒光。但是，在砷化合物的存在下，啟動子DNA鏈與 ArsR-GFP融合蛋白變?yōu)榻怆x的狀態(tài)，因而TAMRA與GFP間的平均距離變長，TAMRA難以吸收 GFP的熒光。因此，TAMRA難以被激發(fā)，主要檢測到GFP的熒光。認為通過利用熒光光度計 測定該砷化合物的有無所引起的熒光波長的變化，能夠檢測或者定量砷化合物。但是，由后述的比較例可知，通過FRET法無法解決本發(fā)明的課題。因此，迫切需要 開發(fā)不同的方法，本發(fā)明人著眼于與砷結合的傳感蛋白ArsR蛋白、以及與鎘和鉛結合的傳 感蛋白CadC蛋白，將各蛋白質分別與綠色熒光蛋白(GFP)融合而制作ArsR-GFP、CadC-GFP。 確認到這些融合蛋白與各自的特異性識別序列DNA結合，并且，它們的結合被金屬離子抑 制。接著，制作了固定有ArsR蛋白的識別序列DNA(Pms-DNA)的板，發(fā)現(xiàn)ArsR-GFP在固定 有Pare-DNA的板上的結合量以亞砷酸濃度依賴的方式降低，由此完成了本發(fā)明。S卩，本發(fā)明涉及以下方法。(1) 一種在水體系中檢測或定量被測試樣中的分析物的方法，其特征在于，包括以 下的步驟㈧和步驟⑶(A)在被測試樣的存在下，使與所述分析物特異性結合的傳感蛋白和包含由該傳 感蛋白特異性識別的序列的、固定于支撐體上的核酸反應的步驟；(B)檢測或測定所固定的核酸上結合的傳感蛋白的步驟。
(2)如上述(1)所述的方法，其特征在于，傳感蛋白用能夠檢測的標記物進行了標記。(3)如上述(1)所述的方法，其特征在于，傳感蛋白是與能夠檢測的標記蛋白形成 的融合蛋白。(4) 一種在水體系中檢測或定量被測試樣中的分析物的方法，其特征在于，包括以 下的步驟㈧和步驟⑶(A)在被測試樣的存在下，使固定于支撐體上的、與所述分析物特異性結合的傳感 蛋白和包含由該傳感蛋白特異性識別的序列的核酸反應的步驟；(B)檢測或測定所固定的傳感蛋白上結合的核酸的步驟。(5)如上述(4)所述的方法，其特征在于，核酸用能夠檢測的標記物進行了標記。另外本發(fā)明涉及以下方法。(6)如上述⑴ (5)中任一項所述的方法，其特征在于，傳感蛋白與核酸的結合 被分析物抑制。(7)如上述⑴ (6)中任一項所述的方法，其特征在于，傳感蛋白為由金屬應答 操縱子編碼的蛋白質。(8)如上述(7)所述的方法，其特征在于，由金屬應答操縱子編碼的蛋白質為ArsR 蛋白或CadC蛋白。(9)如上述(1) (8)中任一項所述的方法，其特征在于，分析物為重金屬化合物。(10)如上述(9)所述的方法，其特征在于，重金屬化合物選自砷(As)化合物、鎘 (Cd)化合物和鉛(Pb)化合物。(11)如上述(10)所述的方法，其特征在于，預先對五價的砷(As(V))化合物進行 還原處理，使其轉變?yōu)槿齼r的砷(As(III))化合物。(12)如上述(9) (11)中任一項所述的方法，其特征在于，在pH7. 4的5OmM以上 的磷酸緩沖液中，進行傳感蛋白和包含由該傳感蛋白特異性識別的序列的核酸的反應。(13)如上述(9) (11)中任一項所述的方法，其特征在于，在40mM以上的氯化鈉 溶液中，進行傳感蛋白和包含由該傳感蛋白特異性識別的序列的核酸的反應。此外，本發(fā)明涉及以下試劑盒。(14) 一種被測試樣中的分析物的檢測或定量用試劑盒，其特征在于，包括與分 析物特異性結合的傳感蛋白，和包含由該傳感蛋白特異性識別的序列的、固定于支撐體上 的核酸。(15) 一種被測試樣中的分析物的檢測或定量用試劑盒，其特征在于，包括固定 于支撐體上的與分析物特異性結合的傳感蛋白、和包含由該傳感蛋白特異性識別的序列的 核酸。另外，本發(fā)明的實施方式中包括特征在于傳感蛋白用能夠檢測的標記物進行了 標記的上述試劑盒；特征在于傳感蛋白為與能夠檢測的標記蛋白形成的融合蛋白的上述試 劑盒；特征在于核酸用能夠檢測的標記物進行了標記的上述試劑盒。另外，本發(fā)明的實施方式中包括特征在于傳感蛋白與核酸的結合被分析物抑制 的上述任一項所述的試劑盒；特征在于傳感蛋白為由金屬應答操縱子編碼的蛋白質的上述 任一項所述的試劑盒；特征在于由金屬應答操縱子編碼的蛋白質為ArsR蛋白或CadC蛋白的上述試劑盒；特征在于分析物為砷(As)、鎘(Cd)、鉛(Pb)等重金屬的化合物的上述任一 項所述的試劑盒。


圖1是表示細菌的有害金屬抗性操縱子的轉錄調控機制的圖。當環(huán)境中不存在有 害金屬離子時，由于傳感蛋白與啟動子DNA的結合，傳感蛋白基因與其下游基因的表達被 抑制。圖2是表示以DNA作為元件的有害金屬生物傳感器的原理的圖。圖3是表示以DNA作為元件的砷化合物生物傳感器的構成要素的圖。圖4是表示為了產生重組ArsR-GFP而導入到E. coli BL21 (DE3) (pLysS)中的質 粒(pETarsRgfp)的制作程序的圖。圖5是表示非變性(木一〒4 7—)PAGE(非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳)中的 Pars-DNA與ArsR-GFP蛋白的復合體形成以及添加亞砷酸引起的復合體的解離的圖。圖6是表示對添加到固定有Pms-DNA的孔中后的蛋白質通過電泳進行分析的結果 的圖。泳道1 將蛋白粗提液添加到孔中，反應后除去提取液并進行孔清洗后，回收所結合 的蛋白而得到的級分；泳道2 將蛋白粗提液添加到孔中，反應后除去提取液并進行孔清洗 后，回收蛋白而得到的級分；泳道3 蛋白粗提液；泳道4 分子量標志物。圖7是表示隨著所添加的蛋白粗提液量的變化，ArsR-GFP蛋白在固定有Pms-DNA 的板上的結合量的變化的圖。圖8是表示利用以Pms-DNA作為元件的生物傳感器的亞砷酸的檢測結果的圖。女 表示P < 0. 05的顯著性差異，* *表示P < 0. 005的顯著性差異。圖9是表示清洗條件(緩沖液)引起的Pms-ArsR-GFP復合體量的變化的圖。各 測定值表示在各次清洗結束后測定的熒光強度。圖10是表示將五價的砷As (V)還原為三價的砷As (III)的處理的流程的圖。圖11是表示ArsR-GFP的不同形態(tài)對砷的應答性的差異的圖。圖表示η = 3的平 均值士標準差。圖12是表示經硫代硫酸鈉還原處理的As(V)的檢測結果的圖。砷濃度共為 100 μ g/L。圖表示η = 3的平均值士標準差。圖13是表示緩沖液和ρΗ的差異對砷檢測的影響的圖。示出制備時的緩沖液ρΗ。 圖表示η = 3的平均值士標準差。圖14是表示As (III)檢測中的ArsR-GFP的標準曲線的圖。曲線表示η = 3的平 均值士標準差。R2 = 0. 95。圖15是表示砷傳感器的交叉應答性的研究結果的圖。圖中，將不添加金屬㈠的 試樣的熒光強度評價為1，示出η = 3的平均值士標準差。圖16是表示為了產生重組CadC-GFP蛋白而導入到E. coli BL21 (DE3) (pLysS)中 的質粒(pETcadCgfp)的制作程序的圖。圖17是表示非變性PAGE中的Pead-DNA與CadC-GFP蛋白的復合體形成以及添加 二價鉛引起的復合體的解離的圖。圖18是表示對微孔板中的Pcad與CadC-GFP的復合體形成進行確認的概要圖。E1、E2表示固定有Pcad34的孔、E3表示沒有固定的孔。圖19是表示固定有Pcad34的孔中殘存的蛋白的分析結果的圖。泳道1、3、4的試 樣參見圖18。泳道2為含有CadC-GFP的蛋白粗提液，泳道5為分子量標志物(預染蛋白分 子量標志物、寬范圍(6 175kDa)、NewEngland Biolabs公司)。圖20是表示CadC-GFP結合量隨孔中Pcad34的添加濃度的變化的圖。圖21是表示含有CadC-GFP的蛋白粗提液的添加量的研究結果的圖。上圖為在添 加到固定有Pcad34的孔中后進行測定。下圖為將孔清洗2次后進行測定。曲線表示n = 3的平均值士標準差。圖22是表示孵育前添加NaCl對鉛的檢測試驗的影響的圖。圖表示η = 3的平均 值士標準差。圖23是表示Pb(II)和Cd(II)檢測中的CadC-GFP的標準曲線的圖。曲線表示η =3的平均值士標準差。*和* *分別表示與ομ g/L之間具有5%水平和水平的顯
著性差異。圖24是表示發(fā)生FRET時的供體與受體熒光分子的光譜的重疊的圖。圖25是表示生物傳感器中通過FRET檢測鉛和鎘化合物的原理的圖。圖26是表示生物傳感器中通過FRET檢測砷化合物的原理的圖。圖27是表示未用His標簽修飾的ZntR蛋白表達用大腸桿菌菌株的培育的概要的 圖。圖28是表示重組ZntR蛋白表達的確認結果的圖。圖29是表示利用肝素柱進行的ZntR蛋白純化的色譜的結果的圖。圖30是表示利用肝素柱得到的純化級分中的ZntR蛋白的確認結果的圖。圖31是表示蛋白質的部分純化物中所含的ZntR蛋白的確認結果的圖。圖32是表示使用了用FITC (左)或者TAMRA (右)標記的探針DNA的EMSA的結 果的圖。圖33是表示使用了用FITC和TAMRA進行雙重標記的探針DNA的EMSA的結果的 圖。圖34是表示在雙重標記的探針DNA和ZntR蛋白部分純化液的混合反應液中、有 無添加Pb的條件下的各熒光光譜的圖。圖35是表示重組ArsR蛋白表達用大腸桿菌菌株的培育的概要的圖。圖36是表示重組ArsR-GFP融合蛋白表達用大腸桿菌菌株的培育的概要的圖。圖37是表示重組ArsR-GFP融合蛋白的表達確認結果的圖。圖38是表示肝素柱純化中以A280和GFP的熒光強度為指標的色譜結果的圖。圖39是表示肝素柱純化級分中的ArsR-GFP融合蛋白的確認結果的圖。圖40是表示離子交換柱純化中以A28tl和GFP的熒光強度為指標的色譜結果的圖。圖41是表示離子交換柱純化級分中的ArsR-GFP融合蛋白的確認結果的圖。圖42是表示使用了 ParsR-350探針DNA和ArsR-GFP融合蛋白的As的檢測試驗 的結果的圖。圖43是表示使用了 ParsR-50探針DNA和ArsR-GFP融合蛋白的As的檢測試驗的 結果的圖。
圖44是表示使用了 R773-50探針DNA和ArsR-GFP融合蛋白的As的檢測試驗的 結果的圖。
具體實施例方式作為本發(fā)明的檢測或定量被測試樣中的分析物的方法，只要是以下[1]或[2]的 方法則沒有特別限定[1]在被測試樣的存在下，使與被測試樣中的分析物特異性結合的 傳感蛋白和包含由該傳感蛋白特異性識別的序列的、固定于支撐體上的核酸反應，在水體 系(水的存在下)中檢測和/或測定所固定的核酸上結合的傳感蛋白的方法；[2]在被測試 樣的存在下，使固定于支撐體上的、與該分析物特異性結合的傳感蛋白和包含由該傳感蛋 白特異性識別的序列的核酸反應，在水體系中檢測和/或測定所固定的傳感蛋白上結合的 核酸的方法。在上述[1]的方法中，通過使用用能夠檢測的標記物進行了標記的傳感蛋白、 或與能夠檢測的標記蛋白融合的傳感蛋白，并將未結合到所固定的核酸上的傳感蛋白排出 到體系外，能夠在水體系中檢測和/或測定所固定的核酸上結合的傳感蛋白。另外，在上述 [2]的方法中，通過使用用能夠檢測的標記物進行了標記的核酸，并將未結合到所固定的傳 感蛋白上的核酸排出到體系外，能夠在水體系中檢測和/或測定所固定的傳感蛋白上結合 的核酸。另外，作為被測試樣，沒有特別限定，可優(yōu)選列舉含有重金屬的河川水、污水、井水、 工廠廢水、污染土壤等，在污染土壤等固態(tài)物的情況下，可以使用其水懸浮液或水提取液。另外，作為本發(fā)明的被測試樣中的分析物的檢測或定量用試劑盒，只要是以下[3] 或[4]的試劑盒則沒有特別限定[3] —種被測試樣中的分析物的檢測或定量用試劑盒，其 特征在于，包括與分析物特異性結合的傳感蛋白，和包含由該傳感蛋白特異性識別的序列 的、固定于支撐體上的核酸；[4] 一種被測試樣中的分析物的檢測或定量用試劑盒，其特征 在于，包括與分析物特異性結合的固定于支撐體上的傳感蛋白、和包含由該傳感蛋白特異 性識別的序列的核酸。在上述[3]的試劑盒中，通過使用用能夠檢測的標記物進行了標記 的傳感蛋白、或與能夠檢測的標記蛋白融合的傳感蛋白，能夠檢測/測定所固定的核酸上 結合的傳感蛋白。另外，在上述[4]的試劑盒中，通過使用用能夠檢測的標記物進行了標記 的核酸，能夠檢測/測定所固定的傳感蛋白上結合的核酸。作為在本發(fā)明的檢測和/或定量被測試樣中的分析物的方法中使用的傳感蛋白， 只要是能夠與包含特定序列的核酸特異性結合、且上述與核酸的結合被特定的分析物所抑 制的蛋白質，則沒有特別限定，作為優(yōu)選例子可列舉由金屬應答操縱子編碼的傳感蛋白。作 為上述金屬應答操縱子，沒有特別限定，具體而言，作為例子可列舉編碼ArsR蛋白的ars、 編碼CzcR的czc、編碼CadC的cad、編碼ChrB的chr、編碼MerRl和Mrer2的mer、編碼pbrR 的Pbr等，其中可優(yōu)選例示ars、cad。上述由金屬應答操縱子編碼的傳感蛋白分別識別特 定的金屬應答操縱子區(qū)域DNA序列，但在特定的金屬離子的存在下，這些傳感蛋白與金屬 離子結合，高級結構發(fā)生變化，從而無法與DNA結合。例如，上述ArsR蛋白與ars區(qū)域DNA 結合，但該結合被砷抑制。另外，上述CadC蛋白與cad區(qū)域DNA結合，但該結合被鎘、鉛抑 制。上述[1]的本發(fā)明的檢測和/或定量被測試樣中的分析物的方法中，傳感蛋白優(yōu) 選用能夠檢測的標記物進行了標記，作為上述能夠檢測的標記物，只要是現(xiàn)有公知的肽標 記用的標記物則沒有特別限定，例如，具體可列舉32P、3H、14C、125I等放射性同位素；FITC、TAMRA、SYBR綠、丹磺酰氯、四甲基若丹明異硫氰酸酯等熒光物質；生物素、地高辛等生物學 相關的結合結構；生物發(fā)光化合物；化學發(fā)光化合物等。另外，上述傳感蛋白可以是與能 夠檢測的標記蛋白融合而成的融合蛋白，作為上述標記蛋白，例如，具體可以例示堿性磷酸 酶、HRP等酶，抗體的Fc區(qū)域，GFP等熒光物質等標記蛋白；MBP、凝集素、親和素等具有結合 能力的結合性蛋白；HA、FLAG、Myc等表位標簽蛋白等。其中，ArsR蛋白與GFP的融合蛋白 ArsR-GFP具有與ArsR蛋白的識別序列即Pms-DNA結合的能力，并且該結合被亞砷酸以濃度 依賴的方式抑制，因而能夠作為優(yōu)異的亞砷酸生物傳感蛋白用于本發(fā)明的檢測和/或定量 亞砷酸的方法。另外，上述[2]的本發(fā)明的檢測和/或定量被測試樣中的分析物的方法中，包含由 傳感蛋白特異性識別的序列的核酸優(yōu)選用能夠檢測的標記物進行了標記。作為上述能夠檢 測的標記物，只要是現(xiàn)有公知的核酸標記用的標記物則沒有特別限定，例如，具體可列舉 32P、3H、14C、125I等放射性同位素；FITC、TAMRA、SYBR綠、丹磺酰氯、四甲基若丹明異硫氰酸酯 等熒光物質；生物素、地高辛等生物學相關的結合結構；生物發(fā)光化合物；化學發(fā)光化合物寸。本發(fā)明的檢測和/或定量被測試樣中的分析物的方法中，作為固定傳感蛋白或核 酸的支撐體，只要是公知的支撐體則沒有特別限定，具體而言，可例示塑料(聚苯乙烯、聚 酰胺、聚乙烯、聚丙烯等)、瓊脂糖、纖維素、親水性聚乙烯醇、丙烯酸酯類聚合物、聚丙烯酰 胺玻璃、金屬等。另外，作為將傳感蛋白或核酸固定到這些支撐體上的方法，只要是公知的 方法則沒有特別限定，例如，可以采用物理吸附法、或重氮法、肽法(酰胺衍生物法、酰氯樹 脂法、碳二亞胺樹脂法、馬來酸酐衍生物法、異氰酸酯衍生物法、溴化氰活化多糖法、纖維素 碳酸酯衍生物法、使用縮合試劑的方法)、烷基化法等利用交聯(lián)試劑的載體結合法等共價結 合法，其中優(yōu)選物理吸附法。另外，在將傳感蛋白或核酸固定到支撐體上時，也可以介由其 它物質間接地進行固定。具體而言，如下述實施例所示，可以通過對核酸進行生物素標記并 利用物理吸附使生物素與支撐體(塑料板)結合，從而將核酸固定到支撐體上。如上所述，在本發(fā)明中，從原理上說明了利用以細菌的啟動子區(qū)域DNA和傳感蛋 白作為元件的砷、鉛/鎘檢測用生物傳感器能夠進行重金屬檢測。該傳感器是對細菌的轉 錄開關引起的變化進行直接捕捉的無細胞型傳感器，其特征在于，利用綠色熒光蛋白(GFP) 等的熒光對構成轉錄開關的傳感蛋白與啟動子區(qū)域DNA之間產生的結合和解離這兩種狀 態(tài)間的變化進行捕捉。以下，進行更具體的說明。在本發(fā)明的檢測和定量方法中，為了使傳感部成為可更換和裝卸的組件，將傳感 元件固定在96孔微孔板的孔內。所固定的元件為啟動子區(qū)域DNA和傳感蛋白這兩類。在 固定啟動子區(qū)域DNA的情況下，通過使3’末端標記有生物素的啟動子區(qū)域DNA在固定有 鏈霉親和素的96孔微孔板中反應，能夠進行DNA的固定。該系統(tǒng)為，在固定有啟動子區(qū)域 DNA的微孔板的孔內使傳感蛋白-GFP溶液反應后進行清洗操作，利用熒光酶標儀測定在孔 內與啟動子區(qū)域DNA保持結合狀態(tài)的傳感蛋白-GFP的熒光強度。在本發(fā)明方法中，例如，培育分別生產傳感蛋白ArsR-GFP和CadC-GFP的大腸桿菌 菌株，確認到這些重組蛋白與啟動子區(qū)域DNA以及重金屬結合，此外，在使用ArsR-GFP的生 物傳感器的開發(fā)中，可知通過將含有As(III)的試樣與ArsR-GFP混合，熒光強度減少。接 著，對于使啟動子區(qū)域DNA與傳感蛋白-GFP的結合穩(wěn)定化的條件、或者使結合成復合體與復合體解離的狀態(tài)變化顯著化的條件進行了研究。此外，在使用CadC-GFP的生物傳感器的 開發(fā)中，可知通過將含有Pb(II)或Cd(II)的試樣與CadC-GFP混合，熒光強度減少。其結果表明，首先，在檢測試驗的程序中，將含有傳感蛋白-GFP的蛋白粗提液與 試樣、鮭魚精子DNA、緩沖液混合，并在室溫或冰上進行30分鐘的孵育是很重要的。也考慮 過將傳感蛋白-GFP添加到孔中，先形成DNA-傳感蛋白-GFP復合體后再添加試樣，測定蛋 白質的解離程度的方法，但這樣的程序無法有效地發(fā)揮功能。另外還表明，在30分鐘的孵 育時存在40mM以上的NaCl，這在之后的測定時使熒光強度的變量顯著化方面是很重要的。在砷的檢測中，通過利用硫代硫酸鈉進行還原處理，能夠與As(III)同等地檢測 As(V)。該情況下，首先加入鹽酸調節(jié)為酸性條件，然后加入硫代硫酸鈉，最后用氫氧化鈉進 行中和。經過該過程，與在試樣中添加NaCl時同樣地存在一定濃度的離子。另外，通過對緩 沖液的最適PH的研究，確認到在pH7. 4附近最能夠發(fā)揮傳感元件的功能。并且，判斷出并不 是只有PH重要，根據(jù)所使用的緩沖液種類的不同效果也會產生變化，確認到對于ArsR-GFP 而言磷酸緩沖液是適合的，對于CadC-GFP而言三羥甲基氨基甲烷緩沖液是適合的。檢測下 限是砷為5μ g/L，鉛為10μ g/L，鎘為1 μ g/L，表明能夠進行世界衛(wèi)生組織制定的飲用水 基準值以下的檢測。隨著今后研究的進行，還可能達到更高的靈敏度。檢測所需要的時間， 包括將試樣與蛋白提取液混合后最初進行的15分鐘的孵育在內，估計在40分鐘以內完成。 并且確認=ArsR-GFP和CadC-GFP均未對100 μ M的其它金屬顯示出交叉應答性，而是與目 標金屬選擇性應答。以下，通過實施例更具體地說明本發(fā)明，但本發(fā)明的技術范圍不限于這些例示。實施例1[生物傳感器的原理]對利用熒光標記傳感蛋白與DNA的相互作用的有害金屬生物傳感器的開發(fā)進行 了嘗試。如圖1所示，ArsR蛋白、CadC蛋白等傳感蛋白在大腸桿菌(E. coli)、金黃色葡萄 球菌(S. aureus)中起到調控有害金屬抗性操縱子的轉錄活性的作用。這些蛋白質在不存 在有害金屬離子的條件下與啟動子DNA結合，形成傳感蛋白-啟動子DNA復合體。利用以 上的傳感蛋白的性質，開發(fā)了用于檢測砷、鉛和鎘化合物的生物傳感器。圖2表示生物傳感 器的原理。DNA在基材表面的固定著眼于作為低分子維生素的生物素和作為堿性糖蛋白的 鏈霉親和素這兩種物質。在這些物質間形成的結合具有IO15M4以上的極高的結合常數(shù)， 被認為是近似于不可逆的結合。著眼于該結合的理由是考慮在以下方面具有優(yōu)點用生物 素能夠修飾DNA鏈；鏈霉親和素能夠固定于96孔微孔板基材上；在酶聯(lián)免疫吸附法中是 通用的；結合不會直接影響DNA的鏈。此外由于利用96孔微孔板能夠一并處理多個試樣， 因而可以期待構建高通量篩選的檢測體系。采用在基材上修飾有鏈霉親和素的96孔微孔 板(Reacti-Bind鏈霉親和素包被高結合力96孔板；PIERCE公司)。熒光強度的測定使用 Corona熒光酶標儀MTP-60ILab (日立“^〒夕^ 口夕一 < 公司)。測定條件是激發(fā)濾光 片使用490nm、熒光測定濾光片使用530nm，檢測靈敏度為“自動”。[生物傳感器的構成要素]圖3表示砷化合物的生物傳感器的構成要素。在大腸桿菌中，編碼砷的細胞外排 泵的arsB和arsC基因、與編碼ArsR傳感蛋白的arsR基因按照arsR-arsB_arsC的順序形成操縱子，其轉錄活性受ArsR蛋白調控。砷化合物生物傳感器中，選擇了 ArsR-GFP融合蛋 白、和以arsR基因上游的ArsR蛋白結合位點(操縱子序列)為中心的50個堿基對構成的 啟動子區(qū)域DNA (Pare-DNA)。關于啟動子區(qū)域DNA，是將表1所示的ParsR-50-S-3-B (序列號 1表示ParsR-50-S的序列)和ParsR-50-A(序列號2)等量混合，形成在啟動子序列下游的 3’末端標記有生物素的雙鏈DNA (記作Pars-生物素)。然后，制備濃度為25pmol/100 μ L 的Pars-生物素，用于固定。
表 權利要求
1.一種在水體系中檢測或定量被測試樣中的分析物的方法，其特征在于，包括以下的 步驟㈧和步驟⑶(A)在被測試樣的存在下，使與所述分析物特異性結合的傳感蛋白和包含由該傳感蛋 白特異性識別的序列的、固定于支撐體上的核酸反應的步驟；(B)檢測或測定所固定的核酸上結合的傳感蛋白的步驟。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，傳感蛋白用能夠檢測的標記物進行了標記。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，傳感蛋白是與能夠檢測的標記蛋白形成的融合蛋白。
4.一種在水體系中檢測或定量被測試樣中的分析物的方法，其特征在于，包括以下的 步驟㈧和步驟⑶(A)在被測試樣的存在下，使固定于支撐體上的、與所述分析物特異性結合的傳感蛋白 和包含由該傳感蛋白特異性識別的序列的核酸反應的步驟；(B)檢測或測定所固定的傳感蛋白上結合的核酸的步驟。
5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，核酸用能夠檢測的標記物進行了標記。
6.如權利要求1 5中任一項所述的方法，其特征在于，傳感蛋白與核酸的結合被分析 物抑制。
7.如權利要求1 6中任一項所述的方法，其特征在于，傳感蛋白為由金屬應答操縱子 編碼的蛋白質。
8.如權利要求7所述的方法，其特征在于，由金屬應答操縱子編碼的蛋白質為ArsR蛋 白或CadC蛋白。
9.如權利要求1 8中任一項所述的方法，其特征在于，分析物為重金屬化合物。
10.如權利要求9所述的方法，其特征在于，重金屬化合物選自砷化合物、鎘化合物和 鉛化合物。
11.如權利要求10所述的方法，其特征在于，預先對五價的砷化合物進行還原處理，使 其轉變?yōu)槿齼r的砷化合物。
12.如權利要求9 11中任一項所述的方法，其特征在于，在pH7.4的50mM以上的磷 酸緩沖液中，進行傳感蛋白和包含由該傳感蛋白特異性識別的序列的核酸的反應。
13.如權利要求9 11中任一項所述的方法，其特征在于，在40mM以上的氯化鈉溶液 中，進行傳感蛋白和包含由該傳感蛋白特異性識別的序列的核酸的反應。
14.一種被測試樣中的分析物的檢測或定量用試劑盒，其特征在于，包括與分析物特 異性結合的傳感蛋白，和包含由該傳感蛋白特異性識別的序列的、固定于支撐體上的核酸。
15.一種被測試樣中的分析物的檢測或定量用試劑盒，其特征在于，包括固定于支撐 體上的與分析物特異性結合的傳感蛋白、和包含由該傳感蛋白特異性識別的序列的核酸。
全文摘要
本發(fā)明的課題在于提供一種在成本、操作性、快速性方面優(yōu)異的方法，該方法能夠利用與分析物特異性結合的傳感蛋白和由所述傳感蛋白特異性識別的核酸，檢測和/或定量被測試樣中的分析物。本發(fā)明制作了將與砷結合的傳感蛋白ArsR蛋白和綠色熒光蛋白(GFP)融合而得到的ArsR-GFP，確認到該融合蛋白與特異性識別序列(Pars-DNA)結合，并且，它們的結合被亞砷酸抑制。接著，制作了固定有Pars-DNA的板，發(fā)現(xiàn)ArsR-GFP在固定有Pars-DNA的板上的結合量以亞砷酸濃度依賴的方式降低，由此完成了本發(fā)明。
文檔編號C12N15/09GK102083978SQ20098012595
公開日2011年6月1日 申請日期2009年7月7日 優(yōu)先權日2008年7月10日
發(fā)明者井上浩一, 前田勇, 宮坂均, 川上泰生 申請人:國立大學法人宇都宮大學