專利名稱：一種感染核果類果樹的蘋果花葉病毒的分子檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及感染核果類果樹的蘋果花葉病毒的分子檢測方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng) 域。
背景技術(shù)：
蘋果花葉病毒(APMV)，主要侵染蘋果、沙果、海棠、梨、山楂，還侵染桃、李、杏、梅、 櫻桃等核果類果樹。該病毒主要靠嫁接(芽接、切接)傳染，通過接穗或砧木傳播。蘋果花 葉病毒不能用液汁傳染，但是可用組織快速接種法傳病，也可用菟絲子來接種傳毒。目前 尚未發(fā)現(xiàn)傳毒昆蟲和根部接觸傳病。該病毒對果樹的危害十分嚴(yán)重，主要表現(xiàn)在感染病毒 后的苗木和樹體生長勢減弱，樹冠稀疏，新梢年生長量和干周增長率明顯下降，還嚴(yán)重影響 果實(shí)的大小、外觀、品質(zhì)和產(chǎn)量。樹體感染蘋果花葉病毒(APMV)后，全身帶毒，終生危害。 萌芽后不久即表現(xiàn)癥狀，4 5月發(fā)展迅速，其后減緩，7 8月基本停止發(fā)展，甚至出現(xiàn)潛 隱現(xiàn)象，抽發(fā)秋梢后又重新發(fā)展。蘋果花葉病毒(APMV)，無法通過病毒侵染寄主后寄主表 現(xiàn)出的特異反應(yīng)進(jìn)行判斷，只能通過生物學(xué)分析、電鏡、血清學(xué)和分子生物學(xué)方法來進(jìn)行檢 測。血清學(xué)方法需要制備抗血清，而抗血清制備技術(shù)復(fù)雜，且需時較長。電鏡檢測需要通 過病原形態(tài)特征判斷，對于形態(tài)相近的病原無法有效區(qū)分。分子生物學(xué)檢測方法中，雙鏈 RNA(Double-stranded RNA. dsRNA)電泳技術(shù)，不適合大量樣品的檢測，而且需要一定的技 術(shù)和知識才能準(zhǔn)確進(jìn)行診斷。免疫捕捉PCR技術(shù)(IC-RT-PCR)需要有病毒特異性抗體，且 成本較高；多重PCR技術(shù)，就是在同一反應(yīng)體系中，加入多種病毒特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，同 時擴(kuò)增多個序列，該法可以降低檢測工作量及成本，但引物設(shè)計要合理，各種引物的比例須 搭配適宜，條件難以控制。因此現(xiàn)有技術(shù)尚不能夠靈敏、方便、快捷，高效地檢測感染核果類 果樹的蘋果花葉病毒。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種檢測感染核果類果樹的蘋果花葉病毒的方法，該方法靈 敏、方便、快捷，大大提高了檢測效率。本發(fā)明提供的感染核果類果樹的蘋果花葉病毒的分子檢測方法包括下列步驟(1)從樣品中提取RNA。(2)以步驟(1)獲得的RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄-PCR反應(yīng)，其中正向引 物 APMVF(5，-3，)為GTGAGGAAGTTTAGGTTGGTTTTGG，反向弓丨物 APMVR(5，-3，)為 CCTAATCGGGGCATCAATTTCTTTC ；(3)特異性PCR擴(kuò)增反應(yīng)以步驟(2)獲得的反轉(zhuǎn)錄-PCR反應(yīng)產(chǎn)物為模板進(jìn)行特 異性PCR擴(kuò)增反應(yīng)，其中正向引物APMVF(5，-3，)為GTGAGGAAGTTTAGGTTGGTTTTGG，反向弓丨 物 APMVR(5，_3，)為CCTAATCGGGGCATCAATTTCTTTC ；(4)對特異性PCR擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，若在414BP處有目的條帶，則確定 該樣品被蘋果花葉病毒感染。
步驟(2)所述反轉(zhuǎn)錄-PCR反應(yīng)，具體步驟為(a)加入步驟(1)獲得的 RNA 0. 1 5 μ g，引物 APMVF 和 APMVR 各15 20pmol, 用體積濃度為0. 的DEPC的雙蒸水溶液加至總體積達(dá)11 μ L，70°C下反應(yīng)5min ；(b)力口入 4μ L 的 5Xreaction buffer，2 μ L 濃度為 IOmM 的 DNTP 再加入 20U 的 RNA酶抑制劑，用體積濃度為0. 1 %的DEPC的雙蒸水溶液加至總體積達(dá)19 μ L，37°C下反應(yīng) 5min ；(c)加入 200U 的 M_MuLV 反轉(zhuǎn)錄酶(Fermentas)，42°C下反應(yīng) 60min，然后 70°C下 反應(yīng)lOmin。步驟(3)所述特異性PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為5yL的IOXTaq buffer，1 μ L濃度為 IOmM 的 DNTP，引物 APMVF 和 APMVR 各 0. 5 1 μ M，Taq DNA Polymerasel. 25U, 3 μ L 濃度為 25mM的MgCl2,模板IOpg 1 μ g，雙蒸水將反應(yīng)體系補(bǔ)充到50 μ L。步驟(3)所述特異性PCR擴(kuò)增反應(yīng)的具體步驟為95 V變性2min ；94 V變性 30sec，43°C退火 30sec，72°C延伸 30sec，72°C最后延伸 10min，35 個循環(huán)。本發(fā)明的正向引物APMVF和反向引物APMVR是根據(jù)登錄號為U15608的病毒序列 設(shè)計進(jìn)行引物設(shè)計，通過進(jìn)行多對引物的擴(kuò)增效果的實(shí)驗(yàn)，選取了具有高特異性，無發(fā)卡結(jié) 構(gòu)，不易生成二聚體的下列引物APMVF(5，-3，) GTGAGGAAGTTTAGGTTGGTTTTGG (正向弓丨 物)，APMVR(5，-3，) :CCTAATCGGGGCATCAATTTCTTTC(反向引物)。本發(fā)明檢測感染核果類果樹的蘋果花葉病毒的方法靈敏、方便、快捷，大大提高了 檢測效率。


圖1為凱基法提取的樣品RNA的瓊脂糖電泳圖，其中各泳道為不同樣品。圖2為特異性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖，其中1、3、4為樣品的條帶，2為陰性對照(健 康的桃指示植物GF305的葉片)，5為MARK。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1采用本發(fā)明方法檢測感染桃樹的蘋果花葉病毒本實(shí)施例以感染桃樹的蘋果花葉病毒的檢測為例，以說明本發(fā)明檢測方法的詳細(xì) 實(shí)施過程。該檢測方法也適用于感染其他核果類果樹的蘋果花葉病毒的檢測。一.從樣品中提取RNA采集帶葉芽的桃枝作為樣品。將桃枝抹去花芽，基部剪口剪去0. 5 1. Ocm，置于 灌有約5cm深清水的水桶里，24°C，光照，保濕水培。每隔2 3天換一次水。當(dāng)葉片長至 3 5cm時采下，-70°C保存。凱基TRIzoI試劑法提取樣品RNA的步驟如下(1)取100 200mg葉片，加液氮研磨成粉末狀，加Iml TRIzol總RNA提取試劑 (購于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)，勻漿，室溫放置5min(使核酸蛋白質(zhì)復(fù)合體解 離)，在 4°C、12000r/min 離心 IOmin0(2)加入0. 2ml三氯甲烷，用力振搖15sec，室溫放置2 3min，在4°C、12000r/min 離心15min，取上層水相(約0. 6ml)。
(3)加入0. 6ml異丙醇，混勻，室溫放置lOmin，在4°C、12000r/min離心lOmin。(4)棄上清，沉淀用Iml濃度為75% (體積濃度)的乙醇(用O. (體積濃度) DEPC溶液配制)洗滌1 2遍，在4°C、12000r/min離心lOmin，沉淀于室溫晾干(約5 IOmin)(5)以10 μ 1的O. 1 % (體積濃度)DEPC溶液溶解，可在55 60°C助溶，于_70°C貯存。取3 5μ L待檢樣品的RNA，在的非變性瓊脂糖凝膠上電泳，電泳緩沖液為 1ΧΤΑΕ。能夠看見明顯的28s、18s和5s，說明提取的RNA基本完整，可進(jìn)行下步的實(shí)驗(yàn)(圖 1)。
用DEPC處理雙蒸水，然后用該雙蒸水稀釋1 μ L的RNA樣品至100 μ L，在核酸蛋白 測定儀上測定OD26tl及OD28tl,確定其純度和濃度。如條件有限，無核酸蛋白測定儀，可利用瓊脂糖電泳粗略估計其濃度。2.對獲得的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄-PCR反應(yīng)(1)加入 O. 1 5 μ g 樣品 RNA, 15 20pmol 引物(APMVF 和 APMVR)，并用 0. 1 % (體積濃度)DEPC的雙蒸水溶液補(bǔ)充體積至11 μ L，70°C 5min。(2)加入 4 μ L 的 5 X reaction buffer,體積為 2 μ L 濃度為 IOmM 的 DNTP，20U 的 RNA酶抑制劑，0. 1 % (體積濃度)DEPC的雙蒸水溶液補(bǔ)充體積至19 μ L，37°C 5min。(3)加入 200U 的 M MuLV 反轉(zhuǎn)錄酶(Fermentas)，42°C 60min, 70°C IOmin0注DEPC來自南京基天生物技術(shù)有限公司，DNTP來自生工有限公司，M_MuLV反轉(zhuǎn) 錄酶、5Xreaction buffer 來源于 Fermentas life sciences 公司。三.特異性PCR擴(kuò)增反應(yīng)，該反應(yīng)如下反應(yīng)體系如下5μ L的IOXTaq buffer，1 μ L濃度為IOmM的DNTP，引物APMVF禾口 APMVR 各 0. 5 1 μ M，Taq DNA Polymerase 1. 25U, 25mMMgCl2 3 μ L,模板 IOpg 1 μ g,雙 蒸水將反應(yīng)體系補(bǔ)充到50 μ L0以RT-PCR(反轉(zhuǎn)錄-PCR)反應(yīng)產(chǎn)物為模板，引物是APMVF和APMVR，進(jìn)行特異性PCR 擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件步驟為95°C下反應(yīng)2min ；PCR循環(huán)(35個循環(huán))94°C變性30sec，43°C 退火 30sec，72°C延伸 30sec，72°C最后延伸 lOmin。注該P(yáng)CR反應(yīng)中用到的試劑來源于Taq DNA Polymerase試劑盒。
四.特異性PCR擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物的電泳檢測特異性PCR擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，若在414BP處有目的條帶，則該樣 品被APMV蘋果花葉病毒感染。如圖2中泳道1、3、4的樣品在414BP處有條帶說明該樣品 被蘋果花葉病毒侵染。(注不同物種可能會有其它雜帶。)注引物由上海英俊生物技術(shù)公司合成，其余試劑為國產(chǎn)分析純。若無具體說明， “％”表示濃度時指質(zhì)量濃度。SEQUENCE LISTING<110>江蘇省農(nóng)科院<120> 一種感染核果類果樹的蘋果花葉病毒的分子檢測方法<130>NKY091<160>2
<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>25<212>DNA<213>Artificial<220><223>APMVF<400>1gtgaggaagt ttaggttggt tttgg25<210>2<211>25<212>DNA<213>Artificial<220><223>APMVR<400>2 cctaatcggg gcatcaattt ctttc2權(quán)利要求
一種感染核果類果樹的蘋果花葉病毒的分子檢測方法，包括下列步驟(1)從樣品中提取RNA；(2)以步驟(1)獲得的RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄-PCR反應(yīng)，其中正向引物APMVF(5’-3’)為GTGAGGAAGTTTAGGTTGGTTTTGG，反向引物為APMVR(5’-3’)CCTAATCGGGGCATCAATTTCTTTC；(3)特異性PCR擴(kuò)增反應(yīng)以步驟(2)獲得的反轉(zhuǎn)錄-PCR反應(yīng)產(chǎn)物為模板，引物是所述的APMVF和APMVR，進(jìn)行特異性PCR擴(kuò)增反應(yīng)；(4)對特異性PCR擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，若在414BP處有目的條帶，則確定該樣品被APMV蘋果花葉病毒感染。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分子檢測方法，其特征在于步驟(2)所述反轉(zhuǎn)錄-PCR反應(yīng)的 步驟為(a)加入步驟(1)獲得的RNAO.1 5 μ g，引物APMVF和APMVR各15 20pmol用體積 濃度為0. 的DEPC的雙蒸水溶液加至總體積達(dá)11 μ L，70°C下反應(yīng)5min ；(b)加入4μL 的 5Xreaction buffer，2 μ L 濃度為 IOmM 的 DNTP，再加入 20U 的 RNA 酶 抑制劑，用體積濃度為0. 的DEPC的雙蒸水溶液加至總體積達(dá)19μ L，37°C下反應(yīng)5min ；(c)加入200U的MMuLV反轉(zhuǎn)錄酶，42°C下反應(yīng)60min，然后70°C下反應(yīng)lOmin。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的分子檢測方法，其特征在于步驟(3)所述特異性PCR擴(kuò) 增反應(yīng)體系為:5yL的IOXTaq buffer，1 μ L濃度為IOmM的DNTP，引物APMVF和APMVR各 0. 5 1 μ M，Taq DNA Polymerase 1. 25U, 3 μ L 濃度為 25mM 的 MgCl2,模板 IOpg 1 μ g,雙 蒸水將反應(yīng)體系補(bǔ)充到50 μ L0
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的分子檢測方法，其特征在于步驟(3)所述特異性PCR擴(kuò)增反 應(yīng)條件為95°C變性2min ；94°C變性30sec，43°C退火30sec，72°C延伸30sec，72°C最后延 伸IOmin, 35個循環(huán)。
全文摘要
本發(fā)明涉及感染核果類果樹的蘋果花葉病毒的分子檢測方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。該檢測方法的步驟如下從樣品中提取RNA，以該RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄-PCR反應(yīng)，正向引物APMVF為GTGAGGAAGTTTAGGTTGGTTTTGG，反向引物APMVR為CCTAATCGGGGCATCAATTTCTTTC；以反轉(zhuǎn)錄-PCR反應(yīng)產(chǎn)物為模板，APMVF和APMVR為引物進(jìn)行特異性PCR擴(kuò)增反應(yīng)；對特異性PCR擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，若在414BP處有目的條帶，則確定該樣品被蘋果花葉病毒感染。用該方法檢測感染核果類果樹的蘋果花葉病毒，靈敏、方便、快捷，大大提高了檢測效率。
文檔編號C12Q1/70GK101818210SQ20091026309
公開日2010年9月1日 申請日期2009年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月16日
發(fā)明者俞明亮, 沈志軍, 蔡志翔, 馬瑞娟 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院