專利名稱：一種還原型輔酶q10的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種輔酶QlO生產(chǎn)技術(shù)，特別是一種以動物細胞生產(chǎn)還原型輔酶QlO 的方法，屬于生物制作技術(shù)類。
背景技術(shù)：
輔酶QlO又名泛醌10，是一種脂溶性醌，在室溫下是橙黃色結(jié)晶物，熔點48°C，無 臭無味，其結(jié)構(gòu)類似于維生素K，因其母核六位上的側(cè)鏈(聚異戊二烯基的聚合度為10而得 名)，是一種醌類化合物。它的另一種形式為還原型輔酶Qio，其生理功能主要來源于醌基 的氧化還原特性和類異戊二烯側(cè)鏈的物理特性，它在人體生理技能中主要有兩個作用一 是有明顯的抗脂質(zhì)過氧化作用；二是在營養(yǎng)物質(zhì)在線粒體內(nèi)轉(zhuǎn)化為能量的過程中起重要的 作用。其醌環(huán)在氧化呼吸鏈中起傳遞電子和質(zhì)子的作用，這種作用不僅是所有生命形式必 不可少的，而且還是形成ATP的關(guān)鍵所在。它作為細胞自身的天然抗氧化劑和細胞代謝激 活劑。具有保護和恢復(fù)生物膜結(jié)構(gòu)的完整性，穩(wěn)定膜電位作用，是肌體的非特異性免疫增強 劑。目前臨床應(yīng)用于心臟病，肝炎等疾病的輔助治療等方面。在人的肌體內(nèi)93%是還原型輔酶Q10，7%是氧化型輔酶Q10，起上述2個主要作用 的輔酶QlO是屬于還原型輔酶Q10。所以生產(chǎn)還原型輔酶QlO是對人體有直接的積極意義， 特別是天然的還原型輔酶Q10。但是，由于還原型輔酶QlO容易被分子氧氧化，目前還未見 具有工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)還原型輔酶QlO技術(shù)方面的報道。此外，由于還原型輔酶QlO是氧化型輔酶QlO的二電子還原體，因此在目前公諸于 世的眾多涉及還原型氧輔酶QlO制作技術(shù)中，都是通過用還原劑將氧化型輔酶QlO作為原 料，還原生成還原型輔酶Q10。這類制作技術(shù)的共同特點，不僅在于都選擇氧化輔酶Q10，更 大的一個共同點在于還原過程中大量使用化學(xué)還原劑，或者添加有機溶劑類保護劑、添加 劑等。顯然將利用上述工藝方法制作的還原型輔酶Q10，在應(yīng)用于保健食品、飲料、化妝品、 和藥品等領(lǐng)域時，不僅在還原型輔酶QlO生產(chǎn)過程中存在對環(huán)境的污染問題，而且由于都 存在著分子氧化的問題，因此將其作為食品、飲料、化妝品的功能性添加劑，或者是藥品的 組成料等直接或間接作用于人體時，或許其對人體的危害還會遠大于輔酶QlO對人體的積 極作用。因此，探尋一種對人體無害化的還原型輔酶QlO工業(yè)化生產(chǎn)方法，就成為該技術(shù) 領(lǐng)域研究人員的一個重要課題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的旨在提出一種對人體無害化的還原型輔酶QlO工業(yè)化生產(chǎn)方法， 既使之區(qū)別于現(xiàn)有的用氧化型輔酶QlO生產(chǎn)還原型輔酶QlO方法，更重要的是探索一種無 害的工業(yè)化生產(chǎn)還原型輔酶QlO生產(chǎn)工藝，使還原型輔酶QlO產(chǎn)品真正地能造福于人類。這種還原型輔酶QlO的方法，其特征在于采用所有人和動物的細胞系或細胞株 作為生產(chǎn)還原型輔酶QlO的母體，通過在生物培養(yǎng)劑DMEM-I培養(yǎng)液中的細胞培養(yǎng)法獲得含有大量還原型輔酶QlO的細胞液，隨后通過離心分離濃縮的方法，或者是先用乙醇萃取濃 縮、后冷卻結(jié)晶的方法獲得還原型輔酶QlO最終產(chǎn)品。所采用的人和動物的細胞系或細胞株為肺部細胞系、肝部細胞系、腎部細胞系、 胃腸部細胞系、真皮細胞系、尿道細胞系、生殖細胞系、淋巴細胞系、骨細胞系、骨骼肌細胞 系、臍帶細胞系、間葉干細胞系、內(nèi)皮細胞系等。所述的還原型輔酶QlO的具體生產(chǎn)方法是A、首先取2. 2LpH值為7. 4DMEM-1培養(yǎng)液，將其在121°C下滅菌處理10分鐘，而后 加入生產(chǎn)還原型輔酶QlO的細胞的人體細胞系材料，使其在37°C環(huán)境下，5%體積的0)2，在 轉(zhuǎn)速300rpm條件下進行48小時的細胞培養(yǎng)，制得含有還原型輔酶QlO的細胞培養(yǎng)液；B、向已制得的細胞培養(yǎng)液中注入克分子濃度為25%的枸櫞酸30mL，并對加酸處 理后的培養(yǎng)液進行離心分離處理，將分離后獲得的含水物用純水洗滌數(shù)次獲得洗凈的細胞 體；；C、在洗凈的細胞體中重新加入適量的純水使之成為漿狀，通過噴霧干燥處理后獲 得干燥細胞體。A、將已干燥的細胞體放入作為提取溶劑的乙醇溶液中，在50°C下攪拌30分鐘后， 進行離心分離后除去乙醇溶液相；B、再次加入乙醇，在50°C下攪拌30分鐘后，通過過濾得到含有99%的還原型輔酶 QlO提取液；C、先對該提取液進行不少于10小時的冷卻處理至4°C，使還原型輔酶QlO析出，得 到還原型輔酶QlO的初次結(jié)晶；而后再使用乙醇通過用10小時冷卻至10°C，即可得到純度 為99. 8%的還原型輔酶QlO的結(jié)晶。所述的DMEM-I培養(yǎng)液由含4500mg/L D-葡萄糖、L-谷氨酰胺及不含丙酮酸鈉和 碳酸氫鈉的HEPES溶液組成。所述HEPES溶液，由238. 3g HEPES溶解在800ml蒸餾水中組成初始溶液，而后加 IM的NaOH水溶液，使pH調(diào)至7. 0，然后用蒸餾水定容IOOOml的適用溶液，并于4°C保存。所述的HEPES 緩沖鹽溶液由 6g NaCU0. 74g KC1、0. 27gNa2HP04. 2H20、2g 葡聚糖 (glucan or dextran)和IOg HEPES溶解在900ml的蒸餾水配置初始溶液，而后用IM NaOH 調(diào)節(jié)PH至所需7. 0，再用蒸餾水定容至IOOOml的適用溶液。根據(jù)以上技術(shù)方案提出的這種還原型輔酶QlO的方法，與現(xiàn)在已公開的還原型輔 酶QlO生產(chǎn)方法相比較，具有以下優(yōu)點1、穩(wěn)定，不被空氣的氧氧化；2.純天然產(chǎn)品，沒有還原劑的殘留物，也沒有任何抗氧化劑，保護劑等化學(xué)制品；3、用于食品，藥品，化妝品，安全可靠；4、用細胞培養(yǎng)法生產(chǎn)還原型輔酶QlO可用于針劑，輸液，對人體沒有免疫原性反應(yīng)。
具體實施例方式以下結(jié)合本發(fā)明給出的技術(shù)方案進一步闡述本發(fā)明，并給出實施例。實施例1
選用人體肝細胞系Fa2N_4 (ATCC-5566)作為生產(chǎn)還原型輔酶QlO母本材料。由DMEM-I ((高葡萄糖)含4500mg/L D-葡萄糖、L-谷氨酰胺和25MmHEPES不 含丙酮酸鈉和碳酸氫鈉)培養(yǎng)液PH7.4，在2. 2L，DMEM-I培養(yǎng)液的3L細胞發(fā)生器，121°C 下滅菌10分鐘，加入占培養(yǎng)液體積10%的生產(chǎn)還原型輔酶QlO的母本材料——肝細胞系 Fa2N-4 (ATCC-5566)，在 37°C，5% C02，攪拌轉(zhuǎn)數(shù) 300rpm 條件下培養(yǎng) 48 小時。培養(yǎng)結(jié)束時，向培養(yǎng)液中加30ml 25%枸櫞酸溶液，通過離心分離培養(yǎng)物收集得到 的180g含細胞濕物體，用水洗滌3次后得到洗凈細胞體。然后，使用Mulitibeads shocker (多細胞培養(yǎng)振蕩器)，B300震蕩，攪拌1小時 后，使細胞體破碎，離心分離得到沉淀物。用高效液相色譜法分析，證實所得沉淀物中的還 原型輔酶Q10。最后，在洗凈的細胞體中重新加入適量的純水使之成為漿狀，通過噴霧干燥處理 后獲得干燥的還原型輔酶QlO的細胞體。使用的培養(yǎng)液按以下方式配置UlOOOml IM HEPES, pH = 7. 0 溶液的配制
將238. 3g HEPES溶解在800ml蒸餾水中，加IM的NaOH水溶液調(diào)節(jié)至少所需 PH7. 0，然后用蒸餾水定容至1000ml，于4°C保存。2、HEPES緩沖鹽溶液的配制將16g NaCl、0.74g KC1、0. 27g Na2HP04. 2H20、2g 葡聚糖(glucan ordextran) 和IOg HEPES溶解在900ml的蒸餾水，用IM NaOH調(diào)節(jié)至所需的pH7. 0，再用蒸餾水定容至 1000ml。上述實施例中選用的人體肝細胞系Fa2N_4 (ATCC-5566)，也可以用人體正常細胞 肺部細胞系、肝部細胞系、腎部細胞系、胃腸部細胞系、真皮細胞系、尿道細胞系、生殖細胞 系、淋巴細胞系、骨細胞系、骨骼肌細胞系、臍帶細胞系、間葉干細胞系、內(nèi)皮細胞系等替代； 或者也可以用其它動物的細胞系來替代。實施例2.選用人體血清白蛋白作為生產(chǎn)還原型輔酶Ql的母本材料。由DMEM_1((高葡萄 糖)含4500mg/L D-葡萄糖、L-谷氨酰胺和2525Mm HEPES不含丙酮酸鈉和碳酸氫鈉)培 養(yǎng)液PH7. 4，在2. 2L,DMEM-I培養(yǎng)液的3L細胞發(fā)生器，121°C下滅菌10分鐘，加入占培養(yǎng)液 體積10%的生產(chǎn)還原型輔酶QlO的細胞母本材料——人體血清白蛋白。在37°C，5% C02， 攪拌轉(zhuǎn)數(shù)300rpm條件下培養(yǎng)48小時。培養(yǎng)結(jié)束時，向培養(yǎng)液中加30ml 25%枸櫞酸溶液，通過離心分離培養(yǎng)物收集得到 的180g含細胞濕物體，用水洗滌3次后得到洗凈細胞體。然后，使用Mulitibeads shocker (多細胞培養(yǎng)振蕩器)，B300震蕩，攪拌1小時 后，使細胞體破碎，離心分離得到沉淀物。用高效液相色譜法分析，證實所得沉淀物中的還 原型輔酶QlO。對上述離心分離而得到的180g濕細胞體中添加水，使其恢復(fù)漿狀后，通過噴霧干 燥得到干燥細胞體。而后，繼續(xù)向該干燥細胞體中加入作為提取溶劑的IOOOml乙醇，在50°C下攪拌30 分鐘后，離心分離，除去乙醇溶液相。再次加入乙醇，在50°C下攪拌30分鐘后，通過過濾得到提取液。該提取液中含有99%的還原型輔酶Q10。通過對該提取液用10小時以上冷卻至4°C，使還原型輔酶QlO析出，得到還原型 輔酶QlO的結(jié)晶。使用乙醇通過用10小時冷卻至10°C，得到純度為99. 8%的還原型輔酶 QlO的結(jié)晶。上述實施例2中選用的人體血清白蛋白，也可以用人體正常細胞肺部細胞系、肝 部細胞系、腎部細胞系、胃腸部細胞系、真皮細胞系、尿道細胞系、生殖細胞系、淋巴細胞系、 骨細胞系、骨骼肌細胞系、臍帶細胞系、間葉干細胞系、內(nèi)皮細胞系等替代，也可以用其它動 物細胞系來替代，作為制作還原型輔酶QlO的細胞母本。此外，在本技術(shù)方案中萃取用的乙醇為濃度為100%的乙醇。使用的培養(yǎng)液按以下方式配置UlOOOml IM HEPES, pH = 7. 0 溶液的配制238. 3g HEPES溶解在800ml蒸餾水中，加IM的NaOH水溶液調(diào)節(jié)至少所需pH7. 0， 然后用蒸餾水定容至1000ml，于4°C保存。2、HEPES緩沖鹽溶液的配制將16g NaCl、0.74g KC1、0. 27g Na2HP04. 2H20、2g 葡聚糖(glucan ordextran) 和IOg HEPES溶解在900ml的蒸餾水，用IM NaOH調(diào)節(jié)至所需的pH7. 0，再用蒸餾水定容至 1000ml。實施例3.選用中國倉鼠卵巢細胞CHO細胞作為生產(chǎn)還原型輔酶QlO母本材料。由 DMEM-I ((高葡萄糖)含4500mg/L D-葡萄糖、L-谷氨酰胺和25Mm HEPES不含丙酮酸鈉和 碳酸氫鈉)培養(yǎng)液PH7. 4，在2. 2L,DMEM-I培養(yǎng)液的3L細胞發(fā)生器，121°C下滅菌10分鐘， 加入占培養(yǎng)液體積10%的生產(chǎn)還原型輔酶QlO的細胞母本材料——中國倉鼠卵巢細胞CHO 細胞。在37°C，5% C02，攪拌轉(zhuǎn)數(shù)300rpm條件下培養(yǎng)48小時。培養(yǎng)結(jié)束時，向培養(yǎng)液中加30ml 25%枸櫞酸溶液，通過離心分離培養(yǎng)物收集得到 的180g含細胞濕物體，用水洗滌3次后得到洗凈細胞體。然后，使用Mulitibeads shocker (多細胞培養(yǎng)振蕩器)，B300震蕩，攪拌1小時 后，使細胞體破碎，離心分離得到沉淀物。用高效液相色譜法分析，證實所得沉淀物中的還 原型輔酶QlO。對上述離心分離而得到的180g濕細胞體中添加水，使其恢復(fù)漿狀后，通過噴霧干 燥得到干燥細胞體。或者再向該干燥細胞體中加入作為提取溶劑的IOOOml乙醇，在50°C下攪拌30分 鐘后，離心分離，除去乙醇溶液相。再次加入乙醇，在50°C下攪拌30分鐘后，通過過濾得到 提取液。該提取液中含有99%的還原型輔酶Q10。通過對該提取液用10小時以上冷卻至4°C，使還原型輔酶QlO析出，得到還原型 輔酶QlO的結(jié)晶。使用乙醇通過用10小時冷卻至10°C，得到純度為99. 8%的還原型輔酶 QlO的結(jié)晶。上述實施例中選用的中國倉鼠卵巢細胞CHO細胞，也可以用人體正常細胞肺部 細胞系、肝部細胞系、腎部細胞系、胃腸部細胞系、真皮細胞系、尿道細胞系、生殖細胞系、淋 巴細胞系、骨細胞系、骨骼肌細胞系、臍帶細胞系、間葉干細胞系、內(nèi)皮細胞系等替代，也可以用其它動物此外，在本技術(shù)方案中萃取用的乙醇為濃度為100%的乙醇。使用的培養(yǎng)液按以下方式配置UlOOOml IM HEPES, pH = 7. 0 溶液的配制238. 3g HEPES溶解在800ml蒸餾水中，加IM的NaOH水溶液調(diào)節(jié)至少所需pH7. 0， 然后用蒸餾水定容至1000ml，于4°C保存。2、HEPES緩沖鹽溶液的配制將16g NaCl、0.74g KC1、0. 27g Na2HP04. 2H20、2g 葡聚糖(glucan ordextran) 和IOg HEPES溶解在900ml的蒸餾水，用IM NaOH調(diào)節(jié)至所需的pH7. 0，再用蒸餾水定容至 1000ml。本技術(shù)方案中選用的DMEM-I培養(yǎng)液和HEPES緩沖鹽溶液均是生物化學(xué)中常用的
培養(yǎng)液。綜上所述，本發(fā)明的使用細胞培養(yǎng)法生產(chǎn)還原型輔酶QlO的方法，具有上述諸 多優(yōu)點及實用價值，并在同類制備方法中未見有類似的設(shè)計公開發(fā)表或使用.而確屬創(chuàng) 新.并且具有產(chǎn)業(yè)化的廣泛利用價值.上述說明僅是本發(fā)明技術(shù)方案的概述，為了能夠更 清楚了解本發(fā)明的技術(shù)手段，而可依照說明書公開的內(nèi)容予以參照實施。
權(quán)利要求
一種還原型輔酶Q10的生產(chǎn)方法，其特征在于采用所有人和動物的細胞系或細胞株作為生產(chǎn)還原型輔酶Q10的母本，通過在生物培養(yǎng)劑DMEM 1培養(yǎng)液中進行的細胞培養(yǎng)，獲得含有大量還原型輔酶Q10的細胞液，隨后通過離心分離濃縮的方法，或者是先用乙醇萃取濃縮、后冷卻結(jié)晶的方法獲得還原型輔酶Q10最終產(chǎn)品。
2.如權(quán)利要求1所述的一種還原型輔酶QlO的生產(chǎn)方法，其特征在于所采用的人和 動物的細胞系或細胞株為肺部細胞系、肝部細胞系、腎部細胞系、胃腸部細胞系、真皮細胞 系、尿道細胞系、生殖細胞系、淋巴細胞系、骨細胞系、骨骼肌細胞系、臍帶細胞系、間葉干細 胞系、內(nèi)皮細胞系等。
3.如權(quán)利要求1所述的一種還原型輔酶QlO的生產(chǎn)方法，其特征在于所述的還原型 輔酶QlO的具體生產(chǎn)方法是A、首先取2.2LpH值為7. 4DMEM-1培養(yǎng)液，將其在121°C下滅菌處理10分鐘，而后加入 生產(chǎn)還原型輔酶QlO的人體細胞母本、或者其它動物細胞系材料，使其在37°C、占營養(yǎng)液體 積5%的CO2的環(huán)境條件中，在轉(zhuǎn)速300rpm下進行48小時的細胞培養(yǎng)，制的得含有還原型 輔酶QlO的細胞培養(yǎng)液；B、向已制得的細胞培養(yǎng)液中注入克分子濃度為25%的枸櫞酸30mL，并對加酸處理 后的培養(yǎng)液進行離心分離處理，將分離后獲得的含水物用純水洗滌數(shù)次獲得洗凈的細胞 體；；C、在洗凈的細胞體中重新加入適量的純水使之成為漿狀，通過噴霧干燥處理后獲得干 燥細胞體。
4.如權(quán)利要求1所述的一種還原型輔酶QlO的生產(chǎn)方法，其特征在于所述的還原型 輔酶QlO的具體生產(chǎn)方法是A、首先取2.2LpH值為7. 4DMEM-1培養(yǎng)液，將其在121°C下滅菌處理10分鐘，而后加入 生產(chǎn)還原型輔酶QlO的人體細胞母本，或者其它動物細胞系材料，使其在37°C環(huán)境下，占營 養(yǎng)液體積5%的CO2環(huán)境中，在轉(zhuǎn)速300rpm條件下進行48小時的細胞培養(yǎng)，制得含有還原 型輔酶QlO的細胞培養(yǎng)液；B、向已制得的細胞培養(yǎng)液中注入克分子濃度為25%的枸櫞酸30mL，并對加酸處理 后的培養(yǎng)液進行離心分離處理，將分離后獲得的含水物用純水洗滌數(shù)次獲得洗凈的細胞 體；；C、在洗凈的細胞體中重新加入適量的純水使之成為漿狀，通過噴霧干燥處理后獲得干 燥細胞體；D、將已干燥的細胞體放入作為提取溶劑的乙醇溶液中，在50°C下攪拌30分鐘后，進行 離心分離后除去乙醇溶液相；E、再次加入乙醇，在50°C下攪拌30分鐘后，通過過濾得到含有99%的還原型輔酶QlO 提取液；F、先對該提取液進行不少于10小時的冷卻處理至4°C，使還原型輔酶QlO析出，得到 還原型輔酶QlO的初次結(jié)晶；而后再使用乙醇通過用10小時冷卻至10°C，即可得到純度為 99. 8%的還原型輔酶QlO的結(jié)晶。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種還原型輔酶Q10的生產(chǎn)方法，其特征在于采用所有人和動物的細胞系或細胞株作為生產(chǎn)還原型輔酶Q10的母本，通過在生物培養(yǎng)劑DMEM-1培養(yǎng)液中進行的細胞培養(yǎng)，獲得含有大量還原型輔酶Q10的細胞液，隨后通過離心分離濃縮的方法，或者是先用乙醇萃取濃縮、后冷卻結(jié)晶的方法獲得還原型輔酶Q10最終產(chǎn)品。與現(xiàn)在已公開的還原型輔酶Q10生產(chǎn)方法相比較，具有穩(wěn)定，不被空氣的氧氧化；既沒有還原劑的殘留物，也沒有任何抗氧化劑，保護劑等化學(xué)殘留；能用于食品，藥品，化妝品，或者可用于針劑，輸液之用，對人體沒有免疫原性反應(yīng)。
文檔編號C12R1/91GK101967499SQ200910201918
公開日2011年2月9日 申請日期2009年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月9日
發(fā)明者婁彩玲, 宋敬民, 熊軍 申請人:河南東都生物科技有限公司