專利名稱：還原型輔酶Q₁₀的穩(wěn)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及還原型輔酶Qltl (reduced coenzyme Q10)的穩(wěn)定方法和利用它的保存方法、分離(結(jié)晶)方法以及組合物，還涉及還原型輔酶Acl的制備方法。與現(xiàn)已用作食品等的氧化型輔酶Acl相比，還原型輔酶仏。表現(xiàn)出高的口服吸收性，它是可以用作優(yōu)質(zhì)食品、營(yíng)養(yǎng)功能食品、特定保健用食品、營(yíng)養(yǎng)輔助劑、營(yíng)養(yǎng)劑、動(dòng)物藥物、飲料、飼料、化妝品、藥品、治療藥物、預(yù)防藥物等的化合物。
背景技術(shù)：
生物界中廣泛分布的苯醌衍生物——氧化型輔酶( 1(1，由于其維生素樣功能也被稱為維生素Q，是作為使減弱的細(xì)胞活性恢復(fù)健康狀態(tài)的營(yíng)養(yǎng)源而使機(jī)體恢復(fù)活力的的成分。另一方面，還原型輔酶是氧化型輔酶Qltl的二電子還原體，氧化型輔酶Qltl為橙色結(jié)晶，而還原型輔酶Qltl為白色結(jié)晶。已知還原型輔酶Qltl和氧化型輔酶Qltl存在于線粒體、溶酶體、高爾基體、微粒體、過(guò)氧化物酶體或細(xì)胞膜等，作為電子傳遞系統(tǒng)的構(gòu)成成分，參與ATP的生成活化、機(jī)體內(nèi)的抗氧化作用、膜穩(wěn)定化，是維持機(jī)體機(jī)能必不可少的物質(zhì)。還原型輔酶( 1(ι容易被分子氧氧化成氧化型輔酶Qltl，在工業(yè)規(guī)模的制備、保存和處理中極難完全除去或阻斷氧，并且，各操作所需的時(shí)間不同于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的制備，需要極長(zhǎng)的時(shí)間，因此，還原型輔酶( 1(ι被殘留氧氧化成氧化型輔酶( 1(ι等的不良影響大。這樣就難于在工業(yè)規(guī)模上獲得高質(zhì)量的還原型輔酶的結(jié)晶，即使制備了高品質(zhì)的還原型輔酶( 1(1，在加工成食品、營(yíng)養(yǎng)功能食品、特定保健用食品、營(yíng)養(yǎng)輔助劑、營(yíng)養(yǎng)劑、動(dòng)物藥物、飲料、飼料、化妝品、藥品、治療藥物、預(yù)防藥物等或這些的原材料或組合物時(shí)，和/或加工后保存時(shí)，還原型輔酶Acl的氧化穩(wěn)定性是極其重要的問(wèn)題。在上述加工和保存時(shí)也極難完全除去或阻斷氧，特別是加工時(shí)的加熱或長(zhǎng)期保存的過(guò)程中，殘留或混入的氧造成很大的不良影響。上述制備、保管、處理以及加工、保存中的氧化防護(hù)及其重要。上述還原型輔酶( 1(ι氧化產(chǎn)生的副產(chǎn)物氧化型輔酶Qltl降低還原型輔酶Qltl的收率，并且，氧化型輔酶Ao難于從還原型輔酶Q10中分離，因此作為雜質(zhì)混入產(chǎn)品還原型輔酶Qltl中，出現(xiàn)純度降低，或者結(jié)晶變黃而給消費(fèi)者和顧客不好的感覺(jué)的問(wèn)題。已知還原型輔酶Giltl可以通過(guò)下述方法獲得(特開平10-109933好公報(bào))例如，通過(guò)合成、發(fā)酵、從天然物提取等以外公知的方法得到輔酶( 1(ι后，將還原型輔酶Qltl的色譜洗脫液進(jìn)行濃縮的方法等。該公開公報(bào)中記載，此時(shí)可以用硼氫化鈉、連二亞硫酸鈉等普通還原劑將上述還原型輔酶Qltl中作為雜質(zhì)存在的氧化型輔酶( 1(ι還原，然后通過(guò)色譜法進(jìn)行濃縮，另外，也可以通過(guò)上述還原劑作用于現(xiàn)有的高純度輔酶的方法獲得還原型輔酶Q10O還已知用鋅作為還原劑的方法(Journal of Lavelled Compounds，第6卷，1970年，66-7 。但是，還原型輔酶( 1(ι的上述制備方法不一定能滿足要求。例如，使用色譜法的方法在工業(yè)規(guī)模使用中比較麻煩，上述還原劑在工業(yè)規(guī)模使用時(shí)，或者在制備用于食品、營(yíng)養(yǎng)功能食品、特定保健用食品、營(yíng)養(yǎng)輔助劑、營(yíng)養(yǎng)劑、動(dòng)物藥物、飲料、飼料、化妝品、藥品、治療藥物、預(yù)防藥物等的還原型輔酶Qltl時(shí)，存在產(chǎn)生氣體(氫、二氧化硫等)、臭氣、安全性、使用后的處理、處理困難等問(wèn)題，因此不一定是優(yōu)選的。通過(guò)色譜法獲得輔酶Qltl的級(jí)分后用上述還原劑獲得還原型輔酶( 1(ι的方法離優(yōu)選的工業(yè)制備方法就更遠(yuǎn)了。當(dāng)工序和后處理的復(fù)雜時(shí)后述分子氧引起的氧化導(dǎo)致質(zhì)量降低的原因。進(jìn)一步地，即使想分離通過(guò)上述方法獲得的還原型輔酶( 1(ι，從還原型輔酶( 1(ι對(duì)分子氧的不穩(wěn)定性方面考慮，以高純度的狀態(tài)進(jìn)行分離并不一定容易，例如，多得到含有以氧化型輔酶Qltl為首的雜質(zhì)的低純度結(jié)晶、半固體狀或油狀物。這樣，即使通過(guò)還原反應(yīng)得到了完全或幾乎不含氧化型輔酶Qltl的還原型輔酶Qltl的反應(yīng)混合物，也極難獲得高質(zhì)量的還原型輔酶Ao的結(jié)晶。因此，穩(wěn)定還原型輔酶( 1(ι，即保護(hù)其不被氧化是非常重要的課題，但是迄今為止還原型輔酶Acl沒(méi)有上市，有關(guān)穩(wěn)定保持還原型輔酶Qici的方法等的研究基本上尚未進(jìn)行。只發(fā)現(xiàn)上述W001/5^22A1稍微涉及了包含還原劑的組合物及其制備方法。上述W001/5^22A1公開了下述方法用維生素C(即抗壞血酸、棕櫚酸抗壞血酸酯、硬脂酸抗壞血酸酯等抗壞血酸類)或維生素E等多種還原劑作為可以用于食品等的更優(yōu)選的還原劑進(jìn)行還原，由此制備還原型輔酶( 1(ι。另外，還提出了 將還原型輔酶( 1(ι、還原劑和表面活性劑或植物油或它們的混合物等組成的組合物、以及用于將上述組合物制成明膠膠囊或片劑進(jìn)行口服的組合物，進(jìn)一步地，作為獲得上述組合物的方法，提出了用氧化型輔酶Acl和還原劑通過(guò)進(jìn)行原位制備的方法。上述組合物及其制備方法復(fù)雜、麻煩，這是由于期待上述組合物有多種作用(即，第一，用于將氧化型輔酶Acl還原成還原型輔酶Acl的反應(yīng)的組合物；第二，用于穩(wěn)定保持還原型輔酶Ao的組合物)的原因。換而言之，在極特殊的環(huán)境中，將氧化型輔酶Ao還原成還原型輔酶Acl的同時(shí)，可以穩(wěn)定地保持還原型輔酶^)。但是，該方法是在表面活性劑或植物油等高沸點(diǎn)成分或脂溶性成分中進(jìn)行還原的方法，還原反應(yīng)后還原型輔酶Acl的分離很困難，實(shí)質(zhì)上限制了上述穩(wěn)定方法和組合物直接應(yīng)用到食用等方面。上述方法僅在反應(yīng)混合物中可以保持還原型輔酶Qltl的純粹狀態(tài)，是原位制備。上述W001/5^22A1記載的組合物中，作為溶劑，可以根據(jù)需要含有例如甘油、1，2-丙二醇等多元醇或乙醇等有機(jī)溶劑0. 25 50重量％，優(yōu)選1 25重量％，更優(yōu)選1. 5 15-20重量％。但是，上述多元醇或乙醇不是必需成分，本發(fā)明說(shuō)明書的實(shí)施例中，實(shí)施例2記載了不含這些物質(zhì)的組合物，實(shí)施例4記載了含甘油或丙二醇1. 63重量％的組合物，實(shí)施例1和3中分別記載了含甘油4重量％、3. 55重量％的組合物。本發(fā)明對(duì)還原型輔酶( 1(ι的穩(wěn)定化進(jìn)行了預(yù)備研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，維生素C類有穩(wěn)定效果，但維生素E沒(méi)有穩(wěn)定效果，另外，維生素C類與甘油等3元或3元以上的醇一起使用時(shí)，穩(wěn)定效果非常小。上述W001/5^22A1中沒(méi)有詳細(xì)記載組合物中所含的還原型輔酶Glltl的質(zhì)量和穩(wěn)定效果等，也沒(méi)有特別公開與一元醇的組合發(fā)揮極其優(yōu)良的穩(wěn)定效果。進(jìn)一步地，對(duì)利用維生素C類與一元和/或二元醇的并用產(chǎn)生的穩(wěn)定效果的結(jié)晶方法、組合物以及處理、保存(包括在通常遇到的溫度下的長(zhǎng)期穩(wěn)定保存)也沒(méi)有描述。
因此，在還原氧化型輔酶( 1(ι來(lái)制備還原型輔酶( 1(ι并穩(wěn)定保存的方法中，現(xiàn)有方法并不一定能滿足要求。在這種情況下，亟待開發(fā)克服了上述問(wèn)題的適用性高的穩(wěn)定方法和利用該方法的保存方法、分離(結(jié)晶)方法以及組合物。另外，也希望開發(fā)不僅以反應(yīng)混合物的形式得到高質(zhì)量的還原型輔酶兌0、還可以方便地獲得結(jié)晶，便于用于各種用途的制備方法。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于上述問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供還原型輔酶Qltl的簡(jiǎn)便并且合適的穩(wěn)定方法、利用該方法的保存方法、分離(結(jié)晶)方法和組合物。進(jìn)一步地，本發(fā)明的目的是提供利用上述穩(wěn)定方法制備具有廣泛應(yīng)用性的還原型輔酶Qltl的方法。本發(fā)明認(rèn)為，如果能夠建立優(yōu)良的穩(wěn)定方法，則可以將該穩(wěn)定方法恰當(dāng)?shù)赜糜诒４娣椒?、分離(結(jié)晶、制備)方法或組合物。因此，進(jìn)行悉心研究，發(fā)現(xiàn)以下結(jié)果，從而完成本發(fā)明(1)在枸櫞酸類和/或抗壞血酸類的存在下，可以很好地保護(hù)還原型輔酶Qltl不被分子氧氧化，特別是在一元或二元醇類和/或醇類以外的水溶性溶劑的存在下，可以很好地防護(hù)。(2)通過(guò)在枸櫞酸類和/或抗壞血酸類的存在下進(jìn)行結(jié)晶，還原型輔酶可以在使氧化型輔酶的附帶生成最小化的狀態(tài)下轉(zhuǎn)化成結(jié)晶狀態(tài)，從而獲得高質(zhì)量的還原型輔酶Qltl結(jié)晶，特別是在一元或二元醇類和/或醇類以外的水溶性溶劑的存在下，可以很好地結(jié)晶。(3)用抗壞血酸類將氧化型輔酶( 1(ι還原成還原型輔酶后，通過(guò)使生成的還原型輔酶在抗壞血酸類的存在下繼續(xù)結(jié)晶，可以在使氧化型輔酶Qici的附帶生成最小化的狀態(tài)下轉(zhuǎn)化成結(jié)晶狀態(tài)，從而獲得高質(zhì)量的還原型輔酶結(jié)晶，特別是在一元或二元醇類和/或醇類以外的水溶性有機(jī)溶劑的存在下，可以很好地實(shí)施。S卩，本發(fā)明涉及還原型輔酶( 1(ι的穩(wěn)定方法，其特征在于，使還原型輔酶( 1(ι與枸櫞酸類共存。本發(fā)明還涉及還原型輔酶Qltl的穩(wěn)定方法，其特征在于，該方法是通過(guò)使還原型輔酶Qltl與抗壞血酸類共存將還原型輔酶( 1(ι穩(wěn)定化的方法，所述共存在一元或二元醇和/或醇以外的水溶性溶劑的存在下進(jìn)行，一元或二元醇和/或醇以外的水溶性溶劑占全部混合物的5重量％或以上。另外，本發(fā)明還涉及還原型輔酶( 1(ι的結(jié)晶方法，其特征在于，使還原型輔酶(^在含有枸櫞酸類和/或抗壞血酸類的溶劑中結(jié)晶。進(jìn)一步地，本發(fā)明還涉及還原型輔酶( 1(ι的制備方法，其特征在于，用抗壞血酸類將氧化型輔酶Ao還原成還原型輔酶Aci后，生成的還原型輔酶仏。的枸櫞酸類和/或抗壞血酸類的存在下繼續(xù)結(jié)晶。另外，本發(fā)明還涉及將通過(guò)上述方法穩(wěn)定的還原型輔酶Gjici在50°C或50°C以下保存的還原型輔酶Qltl的保存方法。本發(fā)明進(jìn)一步涉及含有還原型輔酶( 1(ι的組合物，其特征在于，含有還原型輔酶和枸櫞酸類。本發(fā)明和涉及含有還原型輔酶Acl的組合物，其特征在于，含有還原型輔酶Α。、抗壞血酸類以及一元或二元醇和/或醇以外的水溶性溶劑，并且一元或二元醇和/或醇以外的水溶性溶劑占全部混合物的5重量％或以上。具體地，本發(fā)明涉及如下方面1、還原型輔酶Qltl的穩(wěn)定方法，其特征在于使還原型輔酶Qltl與枸櫞酸類共存。2、項(xiàng)1所述的穩(wěn)定方法，其中枸櫞酸類選自枸櫞酸、其酯和其鹽中的至少一種。3、項(xiàng)1或2所述的穩(wěn)定方法，其特征在于，相對(duì)100重量份還原型輔酶Glltl，存在0. 1重量份或0. 1重量份以上的枸櫞酸類。4、項(xiàng)1 3中任意一項(xiàng)所述的穩(wěn)定方法，其中枸櫞酸類以固相形式存在于包含還原型輔酶Aci的液相中。5、項(xiàng)1 3中任意一項(xiàng)所述的穩(wěn)定方法，其中還原型輔酶Glltl以固相形式存在于包含枸櫞酸類的液相中。6、項(xiàng)1 3中任意一項(xiàng)所述的穩(wěn)定方法，其中還原型輔酶Glltl與枸櫞酸類同時(shí)為液相，或共同存在于液相中。7、項(xiàng)4 6中任意一項(xiàng)所述的穩(wěn)定方法，其中液相為均一相。8、項(xiàng)4 7中任意一項(xiàng)所述的穩(wěn)定方法，其特征在于液相中的溶劑是選自烴類、脂肪酸酯類、醚類、醇類、脂肪酸類、酮類、氮化合物類、硫化合物類和水中的至少一種。9、項(xiàng)4 7中任意一項(xiàng)所述的穩(wěn)定方法，其特征在于液相中的溶劑是一元或二元醇類和/或醇類以外的水溶性溶劑。10、項(xiàng)4 7中任意一項(xiàng)所述的穩(wěn)定方法，其特征在于液相中的溶劑是乙醇、1，
2-丙二醇、聚乙二醇。11、項(xiàng)1 10中任意一項(xiàng)所述的穩(wěn)定方法，除枸櫞酸類外，還存在抗壞血酸類。12、還原型輔酶( 1(ι的保存方法，將通過(guò)項(xiàng)1 11中任意一項(xiàng)所述的方法穩(wěn)定化的還原型輔酶Qiq在50°C或50°C以下保存。13、項(xiàng)12所述的方法，其中還原型輔酶Qltl的保存在脫氧的氣氛中進(jìn)行。14、還原型輔酶Qltl的穩(wěn)定方法，其特征在于，該方法是通過(guò)使還原型輔酶和抗壞血酸類共存而使還原型輔酶Ao穩(wěn)定化的方法，所述共存在一元或二元醇和/或醇以外的水溶性溶劑的存在下進(jìn)行，一元或二元醇和/或醇以外的水溶性溶劑的占全部混合物的5
重量％或5重量％以上。15、項(xiàng)14所述的方法，其中抗壞血酸類是選自抗壞血酸、鼠李糖型抗壞血酸、阿拉伯糖型抗壞血酸、葡糖型抗壞血酸、巖藻糖型抗壞血酸、葡庚糖型抗壞血酸、木糖型抗壞血酸、半乳糖型抗壞血酸、古洛糖型抗壞血酸、阿洛糖型抗壞血酸、赤蘚糖型抗壞血酸、6-脫氧抗壞血酸以及它們的酯和鹽中的至少一種。16、項(xiàng)14或15所述的穩(wěn)定方法，其特征在于，相對(duì)100重量份還原型輔酶Glltl，存在0. 1重量份或0. 1重量份以上的抗壞血酸類。17、項(xiàng)14 16中任意一項(xiàng)所述的穩(wěn)定方法，其中抗壞血酸類以固相形式存在于包含還原型輔酶Ac1的液相中。18、項(xiàng)14 16中任意一項(xiàng)所述的穩(wěn)定方法，其中還原型輔酶Qltl以固相形式存在于包含抗壞血酸類的液相中。19、項(xiàng)14 16中任意一項(xiàng)所述的穩(wěn)定方法，其中還原型輔酶Glltl與抗壞血酸類同時(shí)為液相，或共同存在于液相中。20、項(xiàng)17 19中任意一項(xiàng)所述的穩(wěn)定方法，其中液相為均一相。21、項(xiàng)17 20中任意一項(xiàng)所述的穩(wěn)定方法，其特征在于液相中的溶劑是選自乙醇、1，2-丙二醇和聚乙二醇中的至少一種。22、項(xiàng)14 21中任意一項(xiàng)所述的穩(wěn)定方法，除抗壞血酸類外，還存在枸櫞酸類。23、還原型輔酶Qltl的保存方法，將通過(guò)項(xiàng)14 22中任意一項(xiàng)所述的方法穩(wěn)定化的還原型輔酶Qltl在50°C或50°C以下保存。24、項(xiàng)23所述的保存方法，其中還原型輔酶Qltl的保存在脫氧的氣氛中進(jìn)行。25、還原型輔酶Qltl的結(jié)晶方法，其特征在于，使還原型輔酶在含有枸櫞酸類和/或抗壞血酸的溶劑中結(jié)晶。26、項(xiàng)25所述的結(jié)晶方法，其中枸櫞酸類是選自枸櫞酸、其酯或其鹽中的至少一種。27、項(xiàng)25或沈所述的結(jié)晶方法，其特征在于，相對(duì)100重量份的溶劑，存在0. 01重量份或0.01重量份以上的枸櫞酸類。28、項(xiàng)25所述的結(jié)晶方法，其中抗壞血酸類是選自抗壞血酸、鼠李糖型抗壞血酸、阿拉伯糖型抗壞血酸、葡糖型抗壞血酸、巖藻糖型抗壞血酸、葡庚糖型抗壞血酸、木糖型抗壞血酸、半乳糖型抗壞血酸、古洛糖型抗壞血酸、阿洛糖型抗壞血酸、赤蘚糖型抗壞血酸、6-脫氧抗壞血酸以及它們的酯和鹽中的至少一種。29、項(xiàng)25或28所述的結(jié)晶方法，其特征在于，相對(duì)100重量份溶劑，存在0. 01重量份或0.01重量份以上的抗壞血酸類。30、項(xiàng)25 四中任意一項(xiàng)所述的結(jié)晶方法，其中溶劑是選自烴類、脂肪酸酯類、醚類、醇類、脂肪酸類、酮類、氮化合物類、硫化合物類和水中的至少一種。31、項(xiàng)30所述的結(jié)晶方法，其中溶劑是一元或二元醇類和/或醇類以外的水溶性溶劑。32、項(xiàng)31所述的結(jié)晶方法，其特征在于，一元或二元醇類和/或醇類以外的水溶性溶劑以一元或二元醇類和/或醇類以外的水溶性有機(jī)溶劑和水的混合溶劑的形式使用，一元或二元醇類和/或醇類以外的水溶性有機(jī)溶劑的比例為90 99. 5%。33、項(xiàng)31或32所述的方法，其中一元或二元醇類和/或醇類以外的水溶性有機(jī)溶劑為乙醇、丙酮或它們的混合物。34、項(xiàng)30所述的結(jié)晶方法，其中溶劑是選自烴類、脂肪酸酯類、醚類和腈中的至少一種。35、項(xiàng)25 34中任意一項(xiàng)所述的結(jié)晶方法，結(jié)晶中單獨(dú)或組合實(shí)施冷卻、濃縮、溶劑置換或弱溶劑的使用。36、項(xiàng)35所述的結(jié)晶方法，其中結(jié)晶溫度為25°C或25°C以下。37、項(xiàng)35或36所述的結(jié)晶方法，其中結(jié)晶單獨(dú)使用或并用冷卻晶析。38、項(xiàng)38所述的結(jié)晶方法，其中冷卻速度為40°C /小時(shí)或以下。39、項(xiàng)25 38中任意一項(xiàng)所述的結(jié)晶方法，在相對(duì)100重量份的溶劑含有1重量份或1重量份以上的還原型輔酶Qltl的濃度下使還原型輔酶Acl結(jié)晶。40、項(xiàng)39所述的結(jié)晶方法，在相對(duì)100重量份的溶劑含有5 10重量份的還原型輔酶Qltl的濃度下使還原型輔酶Ao結(jié)晶。41、項(xiàng)25 40中任意一項(xiàng)所述的結(jié)晶方法，結(jié)晶在單位體積的攪拌所需動(dòng)力為0. 01kff/m3或以上的強(qiáng)制流動(dòng)下進(jìn)行。42、項(xiàng)25 41中任意一項(xiàng)所述的結(jié)晶方法，結(jié)晶時(shí)添加晶種。43、項(xiàng)25 42中任意一項(xiàng)所述的結(jié)晶方法，結(jié)晶在脫氧的氣氛中進(jìn)行。44、項(xiàng)25 43中任意一項(xiàng)所述的結(jié)晶方法，其中從母液中除去雜質(zhì)。45、項(xiàng)44所述的結(jié)晶方法，其中除去的雜質(zhì)是選自還原型輔酶％、還原型輔酶％和還原型輔酶Gl7中的至少一種。46、還原型輔酶( 1(ι結(jié)晶的制備方法，其特征在于，用抗壞血酸類將氧化型輔酶( 1(ι還原成還原型輔酶后，生成的還原型輔酶( 1(ι在枸櫞酸類和/或抗壞血酸類的存在下繼續(xù)結(jié)晶。47、項(xiàng)46所述的制備方法，其中抗壞血酸類是選自抗壞血酸、鼠李糖型抗壞血酸、阿拉伯糖型抗壞血酸、葡糖型抗壞血酸、巖藻糖型抗壞血酸、葡庚糖型抗壞血酸、木糖型抗壞血酸、半乳糖型抗壞血酸、古洛糖型抗壞血酸、阿洛糖型抗壞血酸、赤蘚糖型抗壞血酸、6-脫氧抗壞血酸以及它們的酯和鹽中的至少一種。48、項(xiàng)46或47所述的制備方法，還原反應(yīng)中所用的抗壞血酸類的用量為可以將氧化型輔酶( 1(ι變成還原型輔酶Qltl的有效量。49、項(xiàng)48所述的制備方法，其中有效量是相對(duì)氧化型輔酶Qltl為1倍摩爾量或以上。50、項(xiàng)46 49中任意一項(xiàng)所述的制備方法，其中在堿性物質(zhì)或亞硫酸氫鹽的存在下進(jìn)行還原。51、項(xiàng)46 50中任意一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于，結(jié)晶時(shí)，相對(duì)100重量份溶劑，存在0. 01重量份或0. 01重量份以上的枸櫞酸類和/或抗壞血酸類。52、權(quán)利要求46 51中任意一項(xiàng)所述的制備方法，其中所用溶劑是選自烴類、脂肪酸酯類、醚類、醇類、脂肪酸類、酮類、氮化合物類、硫化合物類和水中的至少一種。53、項(xiàng)52所述的制備方法，其中所用溶劑是一元或二元醇類和/或醇類以外的水溶性溶劑。54、項(xiàng)53所述的制備方法，其特征在于，結(jié)晶在一元或二元醇類和/或醇類以外的水溶性有機(jī)溶劑與水的混合溶劑中進(jìn)行，一元或二元醇類和/或醇類以外的水溶性有機(jī)溶劑的含量為90 99. 5%。55、項(xiàng)53或M所述的制備方法，其中一元或二元醇類和/或醇類以外的水溶性有機(jī)溶劑為乙醇、丙酮、水或它們的混合物。56、項(xiàng)55所述的制備方法，結(jié)晶溫度為25°C或25°C以下。57、項(xiàng)46 56中任意一項(xiàng)所述的制備方法，其中在30°C或30°C以上進(jìn)行還原反應(yīng)后，在25°C或25°C以下進(jìn)行結(jié)晶。58、項(xiàng)46 57中任意一項(xiàng)所述的制備方法，其中結(jié)晶時(shí)單獨(dú)使用或者并用冷卻晶析。59、項(xiàng)58所述的制備方法，冷卻晶析過(guò)程中的冷卻速度為40°C /小時(shí)或以下。60、項(xiàng)46 59中任意一項(xiàng)所述的制備方法，其在脫氧的氣氛中進(jìn)行。CN 102381948 A
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7/24 頁(yè)61、項(xiàng)46 60中任意一項(xiàng)所述的制備方法，其中從母液中除去雜質(zhì)。62、項(xiàng)61所述的結(jié)晶方法，其中除去的雜質(zhì)是選自還原型輔酶％、還原型輔酶％和還原型輔酶Gl7中的至少一種。63、含有還原型輔酶Qltl的組合物，其特征在于，含有還原型輔酶Qltl和枸櫞酸類。64、項(xiàng)63所述的含有還原型輔酶Qltl的組合物，其中枸櫞酸類是選自枸櫞酸、其酯或其鹽中的至少一種。65、項(xiàng)63或64所述的含有還原型輔酶Qltl的組合物，其中相對(duì)還原型輔酶QltlIOO 重量份，含有枸櫞酸類0.1重量份或0.1重量份以上。66、項(xiàng)63 65中任意一項(xiàng)所述的含有還原型輔酶Qltl的組合物，其進(jìn)一步含有選自乙醇、1，2-丙二醇和聚乙二醇的中至少一種作為溶劑。67、項(xiàng)63 66中任意一項(xiàng)所述的含有還原型輔酶Qltl的組合物，除了枸櫞酸類以外，其還含有抗壞血酸類。68、項(xiàng)63 67中任意一項(xiàng)所述的含有還原型輔酶Qltl的組合物，其中還原型輔酶 Qltl為外部添加物。69、項(xiàng)63 68中任意一項(xiàng)所述的含有還原型輔酶Qltl的組合物，其中除了還原型輔酶Qltl外，還含有其它活性物質(zhì)。70、項(xiàng)63 69中任意一項(xiàng)所述的組合物，其被加工成口服給藥的形式。71、項(xiàng)70所述的組合物，其中所述形式為膠囊劑。72、項(xiàng)71所述的組合物，其中膠囊劑為軟膠囊。73、項(xiàng)63 72中任意一項(xiàng)所述的組合物，在脫氧的氛圍下制備或保存。74、含有還原型輔酶( 1(ι的組合物，其特征在于，含有還原型輔酶Qltl、抗壞血酸類和一元或二元醇和/或醇以外的水溶性溶劑，并且一元或二元醇和/或醇以外的水溶性溶劑為全部組合物的5重量％或以上。75、項(xiàng)74所述的含有還原型輔酶Glltl的組合物，其中抗壞血酸類是選自抗壞血酸、 鼠李糖型抗壞血酸、阿拉伯糖型抗壞血酸、葡糖型抗壞血酸、巖藻糖型抗壞血酸、葡庚糖型抗壞血酸、木糖型抗壞血酸、半乳糖型抗壞血酸、古洛糖型抗壞血酸、阿洛糖型抗壞血酸、赤蘚糖型抗壞血酸、6-脫氧抗壞血酸以及它們的酯和鹽中的至少一種。76、項(xiàng)74或75所述的含有還原型輔酶Qltl的組合物，其特征在于相對(duì)還原型輔酶 Q10IOO重量份，含有抗壞血酸類0. 1重量份或0. 1重量份以上。77、項(xiàng)74 76中任意一項(xiàng)所述的含有還原型輔酶Qltl的組合物，其進(jìn)一步含有選自乙醇、1，2-丙二醇和聚乙二醇的中至少一種作為溶劑。78、項(xiàng)74 77中任意一項(xiàng)所述的含有還原型輔酶Qltl的組合物，除了抗壞血酸類以外，其還含有枸櫞酸類。79、項(xiàng)74 78中任意一項(xiàng)所述的含有還原型輔酶Qltl的組合物，其中還原型輔酶 Qltl為外部添加物。80、項(xiàng)74 79中任意一項(xiàng)所述的含有還原型輔酶Qltl的組合物，其中除了還原型輔酶Qltl外，還含有其它活性物質(zhì)。81、項(xiàng)74 80中任意一項(xiàng)所述的組合物，其被加工成口服給藥的形式。82、項(xiàng)81所述的組合物，其中所述形式為膠囊劑。CN 102381948 A
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8/24 頁(yè)83、項(xiàng)82所述的組合物，其中膠囊劑為軟膠囊。84、項(xiàng)74 83中任意一項(xiàng)所述的組合物，在脫氧的氛圍下制備或保存。根據(jù)本發(fā)明，用安全并且容易處理的試劑，可以根據(jù)其目的或用途適當(dāng)選擇溶劑， 可以適用于還原型輔酶( 1(ι的分離或進(jìn)一步衍生化、食用或藥物用等的組合物，是可以廣泛使用的方法，因此其益處很大。發(fā)明詳述下面詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。實(shí)施本發(fā)明時(shí)，采用枸櫞酸類和/或抗壞血酸類，抑制還原型輔酶氧化成氧化型輔酶( 1(ι，從而使還原型輔酶Acl穩(wěn)定化，或者穩(wěn)定地保存還原型輔酶^)。從而獲得高質(zhì)量的還原型輔酶仏。。對(duì)枸櫞酸類(citric acid or a related compound thereof)沒(méi)有特別限制,可以列舉枸櫞酸、枸櫞酸異丙酯、枸櫞酸乙酯、枸櫞酸丁酯、枸櫞酸甘油酯等枸櫞酸酯和枸櫞酸鈉、枸櫞酸鉀等鹽。特別優(yōu)選枸櫞酸、枸櫞酸異丙酯、枸櫞酸甘油酯。本發(fā)明還原型輔酶 Qltl的穩(wěn)定方法、保存方法、結(jié)晶方法和組合物中，可以根據(jù)其目的或用途自由選擇上述枸櫞酸類。這些枸櫞酸類可以單獨(dú)或多種混合使用，也可以與后述抗壞血酸類并用。對(duì)抗壞血酸類(ascorbic acid or a related compound thereof)沒(méi)有特別限制， 不僅包括抗壞血酸、還包括例如鼠李糖型抗壞血酸(rhamno-ascorbic acid)、阿拉伯糖型抗壞血酸、葡糖型抗壞血酸、巖藻糖型(fuco)抗壞血酸、葡庚糖型(glucoh印to)抗壞血酸、 木糖型抗壞血酸、半乳糖型抗壞血酸、古洛糖型(gulo)抗壞血酸、阿洛糖型(alio)抗壞血酸、赤蘚糖型(erythro)抗壞血酸、6_脫氧抗壞血酸等抗壞血酸衍生物，也可以是它們的酯或鹽。這些物質(zhì)可以是L-構(gòu)型、D-構(gòu)型或外消旋體。具體地，可以列舉例如L-抗壞血酸、 棕櫚酸L-抗壞血酸酯(L-ascorbyl palmitate)、硬脂酸L-抗壞血酸酯、2棕櫚酸L-抗壞血酸酯、L-抗壞血酸鈉、L-抗壞血酸鈣、D-阿拉伯糖型-抗壞血酸等。在本發(fā)明的還原型輔酶結(jié)晶制備方法中，可以適當(dāng)使用上述抗壞血酸中的任何一種，但考慮到與生成的還原型輔酶的分離容易性等，上述抗壞血酸系列化合物中，特別優(yōu)選用水溶性高的物質(zhì)， 從便于獲得、價(jià)格等方面考慮，最優(yōu)選L-抗壞血酸、D-阿拉伯糖型-抗壞血酸等游離體。在本發(fā)明還原型輔酶的穩(wěn)定方法、保存方法、結(jié)晶方法和組合物中，可以根據(jù)其目的或用途自由選擇上述抗壞血酸類。這些抗壞血酸類可以單獨(dú)或多種混合使用，也可以與前述枸櫞酸類并用。本發(fā)明還原型輔酶( 1(ι的穩(wěn)定方法、保存方法、結(jié)晶方法和組合物中均可以使用上述枸櫞酸類和/或抗壞血酸類。另外，在本發(fā)明的還原型輔酶Acl的制備方法中，可以特別優(yōu)選使用上述抗壞血酸類，根據(jù)需要，也可以與上述枸櫞酸類并用。還原型輔酶( 1(ι不特別限于與枸櫞酸類和/或抗壞血酸類共存的形態(tài)，即，使還原型輔酶Qltl與枸櫞酸類和/或抗壞血酸類接觸的形態(tài)?？梢粤信e下述情況，例如，還原型輔酶Ao和枸櫞酸類和/或抗壞血酸類一起以固相存在的情況；在含有還原型輔酶Qltl的液相中，至少一種枸櫞酸類和/或抗壞血酸類以固相存在的情況；在含有至少一種枸櫞酸類和/ 或抗壞血酸類中的液相中，還原型輔酶Qltl以固相存在的情況；還原型輔酶Acl與枸櫞酸類和/或抗壞血酸類都為液相，或都存在于液相中的情況等。上述液相可以均勻，也可以不均勻(由不同的多種液相構(gòu)成)，但優(yōu)選均勻。當(dāng)然，還原型輔酶Ao與枸櫞酸類和/或抗壞血CN 102381948 A
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酸類接觸效率高的系統(tǒng)有利于氧化防護(hù)，特別優(yōu)選還原型輔酶Ao與枸櫞酸類和/或抗壞血酸類都為液相，或都存在于液相中的情況，另外，優(yōu)選液相均勻。當(dāng)然，包含還原型輔酶Ao 的液相可以是還原型輔酶Qltl的溶液，也可以是還原型輔酶Qltl的熔融液(melt)。對(duì)本發(fā)明所用的溶劑沒(méi)有特別限制，可以列舉烴類、脂肪酸酯類、醚類、醇類、脂肪酸類、酮類、氮化合物類(包括腈類、酰胺類)，硫化合物類和水等。上述溶劑也可以任意兩種或兩種以上混合使用。對(duì)烴沒(méi)有特殊限制，可以列舉脂肪烴、芳烴、鹵代烴等。特別優(yōu)選脂肪烴、芳烴，更優(yōu)選脂肪烴。作為脂肪烴、不論環(huán)狀或非環(huán)狀，或者飽和或不飽和，對(duì)其沒(méi)有特殊限制，但一般優(yōu)選使用飽和脂肪烴。通常優(yōu)選使用碳原子數(shù)為3 20，特別優(yōu)選碳原子數(shù)為5 12，更優(yōu)選碳原子數(shù)為5 8的脂肪烴。具體例子可以列舉丙烷、丁烷、異丁烷、戊烷、2-甲基丁烷、 己烷、2-甲基戊烷、2，2_ 二甲基丁烷、2，3_ 二甲基丁烷、庚烷、庚烷異構(gòu)體(例如2-甲基己烷、3-甲基己烷、2，3-二甲基戊烷、2，4_二甲基戊烷)、辛烷、2，2，3-三甲基戊烷、異辛烷、壬烷、2，2，5-三甲基己烷、癸烷、十二烷、2-戊烯、1-己烯、1-庚烯、1-辛烯、1-壬烯、1-癸烯、 環(huán)戊烷、甲基環(huán)戊烷、環(huán)己烷、甲基環(huán)己烷、乙基環(huán)己烷、對(duì)-薄荷烷(p-menthane)和環(huán)己烯等。優(yōu)選戊烷、2-甲基丁烷、己烷、2-甲基戊烷、2，2_ 二甲基丁烷、2. 3-二甲基丁烷、庚烷、 庚烷異構(gòu)體(例如2-甲基己燒、3-甲基己烷、2，3_ 二甲基戊烷、2，4_ 二甲基戊烷)、辛烷、 2，2，3-三甲基戊烷、異辛烷、壬烷、2，2，5-三甲基己烷、癸烷、十二烷、環(huán)戊烷、甲基環(huán)戊烷、 環(huán)己烷、甲基環(huán)己烷、乙基環(huán)己烷和對(duì)薄荷烯等。特別優(yōu)選戊烷、2-甲基丁烷、己烷、2-甲基戊烷、2，2_ 二甲基丁烷、2，3_ 二甲基丁烷、庚烷、庚烷異構(gòu)體(例如2-甲基己烷、3-甲基己烷、2，3_ 二甲基庚烷、2，4_ 二甲基庚烷)、辛烷、2，2，3_三甲基戊烷、異辛烷、環(huán)戊烷、甲基環(huán)戊烷、環(huán)己烷、甲基環(huán)己烷、乙基環(huán)己烷等。一般來(lái)說(shuō)，優(yōu)選庚烷，優(yōu)選使用具有7個(gè)碳原子的甲基環(huán)己烷等多種庚烷或它們的多種混合物。通常優(yōu)選使用碳原子數(shù)為5的戊烷類(例如戊烷等)、碳原子數(shù)為6的己烷類(例如己烷、環(huán)己烷等)、碳原子數(shù)為7的庚烷類(例如庚烷、甲基環(huán)己烷等)，但最優(yōu)選庚烷類(例如庚烷、甲基環(huán)己烷等)，特別優(yōu)選庚烷。對(duì)芳烴沒(méi)有特別限制，但通常優(yōu)選使用碳原子數(shù)為6 20，特別優(yōu)選碳原子數(shù)為 6 12，更優(yōu)選碳原子數(shù)為7 10的芳烴。具體例子可以列舉苯、甲苯、二甲苯、鄰二甲苯、 間二甲苯、對(duì)二甲苯、乙基苯、枯烯、均三甲苯、四氫萘(tetralin)、丁基苯、對(duì)甲基異丙基苯、環(huán)己基苯、二乙基苯、戊基苯、二戊基苯、月桂基苯和苯乙烯等。優(yōu)選甲苯、二甲苯、鄰二甲苯、間二甲苯、對(duì)二甲苯、乙基苯、枯烯、均三甲苯、四氫萘、丁基苯、對(duì)甲基異丙基苯、環(huán)己基苯、二乙基苯、戊基苯等。特別優(yōu)選甲苯、二甲苯、鄰二甲苯、間二甲苯、對(duì)二甲苯、枯烯和四氫萘等。最優(yōu)選枯烯。作為鹵代烴，不論環(huán)狀或非環(huán)狀，或者飽和或不飽和，對(duì)其沒(méi)有特殊限制，但一般優(yōu)選使用非環(huán)狀的鹵代烴。通常優(yōu)選使用氯代烴、氟代烴，特別優(yōu)選氯代烴。適合使用碳原子數(shù)為1 6，特別優(yōu)選碳原子數(shù)為1 4，更優(yōu)選碳原子數(shù)為1 2的鹵代烴。具體例子可以列舉二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、1，1-二氯乙烷、1，2-二氯乙烷、1，1，1-三氯乙烷、1，1， 2-三氯乙烷、1，1，1，2-四氯乙烷、1，1，2，2-四氯乙烷、五氯乙烷、六氯乙烷、1，1-二氯乙烯、 1，2-二氯乙烯、三氯乙烯、四氯乙烯、1，2-二氯丙烷、1，2，3-三氯丙烷、氯苯、1，1，1，2-四氟乙烷等。優(yōu)選二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、1，1- 二氯乙烷、1，2- 二氯乙烷、1，1，1-三氯乙烷、CN 102381948 A
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1，1，2_三氯乙烷、1，1-二氯乙烯、1，2-二氯乙烯、三氯乙烯、1，1，1，2-四氟乙烷等。特別優(yōu)選二氯甲烷、氯仿、1，2-二氯乙烷、三氯乙烯、氯苯、1，1，1，2-四氟乙烷等。對(duì)脂肪酸酯類沒(méi)有特殊限制，可以列舉丙酸酯、醋酸酯、甲酸酯等。特別優(yōu)選醋酸酯、甲酸酯，更優(yōu)選乙酸酯。沒(méi)有特別限制，但一般使用碳原子數(shù)為1 8的烷基酯或芳烷基酯，優(yōu)選碳原子數(shù)為1 6的烷基酯，更優(yōu)選碳原子數(shù)為1 4的烷基酯。丙酸酯的具體例子可以列舉丙酸甲酯、丙酸乙酯、丙酸丁酯、丙酸異戊酯等。醋酸酯的具體例子可以列舉醋酸甲酯、醋酸乙酯、醋酸丙酯、醋酸異丙酯、醋酸丁酯、醋酸異丁酯、醋酸仲丁酯、醋酸戊酯、 醋酸異戊酯、醋酸仲己酯、醋酸環(huán)己酯、醋酸芐酯等，優(yōu)選醋酸甲酯、醋酸乙酯、醋酸丙酯、醋酸異丙酯、醋酸丁酯、醋酸異丁酯、醋酸仲丁酯、醋酸戊酯、醋酸異戊酯、醋酸仲己酯、醋酸環(huán)己酯等，最優(yōu)選醋酸甲酯、醋酸乙酯、醋酸丙酯、醋酸異丙酯、醋酸丁酯、醋酸異丁酯等，尤其優(yōu)選醋酸乙酯。甲酸酯的具體例子可以列舉甲酸甲酯、甲酸乙酯、甲酸丙酯、甲酸異丙酯、甲酸丁酯、甲酸異丁酯、甲酸仲丁酯、甲酸戊酯等。優(yōu)選甲酸甲酯、甲酸乙酯、甲酸丙酯、甲酸丁酯、甲酸異丁酯、甲酸戊酯等，最優(yōu)選甲酸乙酯。作為醚類，不論環(huán)狀或非環(huán)狀，或者飽和或不飽和，對(duì)其沒(méi)有特殊限制，但一般優(yōu)選使用飽和醚類。通常優(yōu)選使用碳原子數(shù)為3 20，特別優(yōu)選碳原子數(shù)為4 12，更優(yōu)選碳原子數(shù)為4 8的醚類。具體例子可以列舉乙醚、甲基叔丁基醚、二丙基醚、二異丙基醚、 二丁基醚、二己基醚、乙基乙烯基醚、丁基乙烯基醚、苯甲醚、苯乙醚、丁基苯基醚、甲氧基甲苯、二噁烷、呋喃、2-甲基呋喃、四氫呋喃、四氫吡喃、乙二醇二甲基醚、乙二醇二乙基醚、乙二醇二丁基醚、乙二醇一甲基醚、乙二醇一乙基醚、乙二醇二丁基醚等。優(yōu)選乙醚、甲基叔丁基醚、二丙基醚、二異丙基醚、二丁基醚、二己基醚、苯甲醚、苯乙醚、丁基苯基醚、甲氧基甲苯、二噁烷、2-甲基呋喃、四氫呋喃、四氫吡喃、乙二醇二甲基醚、乙二醇二乙基醚、乙二醇二丁基醚、乙二醇一甲基醚、乙二醇一乙基醚等。特別優(yōu)選乙醚、甲基叔丁基醚、苯甲醚、二噁烷、四氫呋喃、乙二醇一甲基醚、乙二醇一乙基醚等。最優(yōu)選乙醚、甲基叔丁基醚、苯甲醚、二噁烷、四氫呋喃等。尤其優(yōu)選二噁烷、四氫呋喃。作為腈類，不論環(huán)狀或非環(huán)狀，或者飽和或不飽和，對(duì)其沒(méi)有特殊限制，但一般優(yōu)選使用飽和腈類。通常優(yōu)選使用碳原子數(shù)為2 20，特別優(yōu)選碳原子數(shù)為2 12，更優(yōu)選碳原子數(shù)為2 8的腈類。具體例子可以列舉乙腈、丙腈、丙二腈(7 π 7 二卜U >)、丁腈、異丁腈、丁二腈、戊腈、戊二腈、己腈、庚基腈、辛基腈、十一烷基腈、十二烷基腈、十三烷基腈、 十五烷基腈、硬脂腈、氯代乙腈、溴代乙腈、氯代丙腈、溴代丙腈、甲氧基乙腈、氰基乙酸甲酯、氰基乙酸乙酯、甲苯基腈、芐腈、氯代芐腈、溴代芐腈、氰基苯甲酸、硝基芐腈、茴香腈、對(duì)苯二甲腈、溴代甲苯基腈、甲基氰基苯甲酸酯、甲氧基芐腈、乙酰基芐腈、萘甲腈、二苯基腈、 苯基丙腈、苯基丁腈、甲基苯基乙腈、二苯基乙腈、萘基乙腈、硝基苯基乙腈、氯苯乙腈、環(huán)丙烷腈、環(huán)己烷腈、環(huán)庚烷腈、苯基環(huán)己烷腈、甲苯基環(huán)己烷腈等，其中優(yōu)選乙腈。作為醇類，不論環(huán)狀或非環(huán)狀，或者飽和或不飽和，對(duì)其沒(méi)有特殊限制，但一般優(yōu)選使用飽和醇類。通常使用碳原子數(shù)為1 20，特別是碳原子數(shù)為1 12，尤其是碳原子數(shù)為1 6的醇類，其中優(yōu)選碳原子數(shù)為1 5的一元醇或優(yōu)選碳原子數(shù)為2 5的二元醇。 這些醇類的具體例子可以列舉甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、2-丁醇、異丁醇、叔丁醇、1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、2-甲基-1- 丁醇、異戊醇、叔戊醇、3-甲基-2- 丁醇、新戊醇、 1-己醇、2-甲基-1-戊醇、4-甲基-2-戊醇、2-乙基-1-丁醇、1-庚醇、2-庚醇、3-庚醇、CN 102381948 A
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11/24 頁(yè)1-辛醇、2-辛醇、2-乙基-1-己醇、1-壬醇、1-癸醇、Ι-i^一烷醇、1-十二烷醇、烯丙醇、炔丙醇、芐醇、環(huán)己醇、1-甲基環(huán)己醇、2-甲基環(huán)己醇、3-甲基環(huán)己醇、4-甲基環(huán)己醇、2-甲氧基乙醇、2-乙氧基乙醇、2-(甲氧基甲氧基)乙醇、2-異丙氧基乙醇、2-丁氧基乙醇、2-(異戊氧基)乙醇、2_(己氧基)乙醇、糠醇、二乙二醇單甲基醚、二乙二醇單乙基醚、二乙二醇單丁基醚、三乙二醇單甲基醚、1-甲氧基-2-丙醇、1-乙氧基-2-丙醇、二丙二醇單甲基醚、二乙二醇單乙基醚、三乙二醇單甲基醚、1，2-乙二醇、1，2-丙二醇、1，3-丙二醇、1，2- 丁二醇、 1,3- 丁二醇、1，4- 丁二醇、2，3- 丁二醇、1，5-戊二醇、2- 丁烯-1，4- 二醇、2-甲基-2，4-戊二醇、2-乙基-1，3-己二醇、二乙二醇、三乙二醇、四乙二醇、聚乙二醇、二丙二醇、聚丙二醇寸。一元醇優(yōu)選甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1- 丁醇、2- 丁醇、異丁醇、叔丁醇、1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、2-甲基-1- 丁醇、異戊醇、叔戊醇、3-甲基-2- 丁醇、新戊醇、1-己醇、
2-甲基-1-戊醇、4-甲基-2-戊醇、2-乙基-1-丁醇、1-庚醇、2-庚醇、3-庚醇、1-辛醇、 2-辛醇、2-乙基-1-己醇、1-壬醇、1-癸醇、1-十一烷醇、1-十二烷醇、芐醇、環(huán)己醇、1-甲基環(huán)己醇、2-甲基環(huán)己醇、3-甲基環(huán)己醇、4-甲基環(huán)己醇、2-甲氧基乙醇、2-乙氧基乙醇、 2-(甲氧基甲氧基)乙醇等，特別優(yōu)選甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、2-丁醇、異丁醇、叔丁醇、1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、2-甲基-1- 丁醇、異戊醇、叔戊醇、3-甲基-2- 丁醇、 新戊醇、1-己醇、2-甲基-1-戊醇、4-甲基-2-戊醇、2-乙基-1- 丁醇、環(huán)己醇等，這其中又優(yōu)選甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1- 丁醇、2- 丁醇、異丁醇、叔丁醇、1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、2-甲基-1- 丁醇、異戊醇、叔戊醇、3-甲基-2- 丁醇、新戊醇等，最優(yōu)選甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1- 丁醇、2- 丁醇、異丁醇、2-甲基-1- 丁醇、異戊醇等，這其中又優(yōu)選甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇，特別優(yōu)選乙醇。二元醇優(yōu)選1，2_乙二醇、1，2-丙二醇、1，3-丙二醇、2-丁烯-1，4-二醇、2-甲基-2，4-戊二醇、2-乙基-1，3-己二醇、二乙二醇、三乙二醇、四乙二醇、聚乙二醇、二丙二醇、聚丙二醇等，最優(yōu)選1，2_丙二醇、聚乙二醇。使用枸櫞酸類時(shí)，也可以使用三元醇，三元醇優(yōu)選甘油。脂肪酸類可以列舉甲酸、乙酸、丙酸、油酸、亞油酸、亞麻酸等，優(yōu)選甲酸、乙酸，最優(yōu)選乙酸。對(duì)酮類沒(méi)有特殊限制，通常適合使用碳原子數(shù)為3 6的酮類。具體例子可以列舉丙酮、甲基乙基酮、甲基丁基酮、甲基異丁基酮等，特別優(yōu)選丙酮、甲基乙基酮，最優(yōu)選丙酮。氮化合物可以列舉硝基甲烷、三乙胺、吡啶、甲酰胺、N-甲基甲酰胺、N, N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮等。硫化合物可以列舉二甲亞砜、環(huán)丁砜等。上述溶劑中，烴類、脂肪酸酯類、醚類或腈類，優(yōu)選水溶性的醚類或腈類(例如四氫呋喃、二噁烷、乙腈等)，是氧化防護(hù)效果高的溶劑，因此，它們可以促進(jìn)枸櫞酸類和/或抗壞血酸類的還原型輔酶Acl穩(wěn)定化效果，抑制副產(chǎn)物氧化型輔酶Qici的產(chǎn)生。另外，上述溶劑中，一元或二元醇和/或醇以外的水溶性溶劑(優(yōu)選水溶性有機(jī)溶劑)發(fā)揮抗壞血酸類和/或枸櫞酸類的顯著的氧化防護(hù)效果，最好地發(fā)揮本發(fā)明的效果。使用抗壞血酸類時(shí)，與一元或二元醇和/或醇以外的水溶性溶劑(優(yōu)選水溶性有機(jī)溶劑)共存效果好，其中與一價(jià)醇的共存效果特別好。
一元或二元醇可以具體列舉甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、2-丁醇、異丁醇、叔丁醇、1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、2-甲基-1-丁醇、異戊醇、叔戊醇、3-甲基-2-丁醇、新戊醇、1-己醇、2-甲基-1-戊醇、4-甲基-2-戊醇、2-乙基-1-丁醇、1-庚醇、2-庚醇、3-庚醇、1-辛醇、2-辛醇、2-乙基-1-己醇、1-壬醇、3，5，5_三甲基-1-己醇、癸醇、^一烷醇、1-十二烷醇、烯丙醇、炔丙醇、芐醇、環(huán)己醇、1-甲基環(huán)己醇、2-甲基環(huán)己醇、3-甲基環(huán)己醇、4-甲基環(huán)己醇、芐醇、2-甲氧基乙醇、2-乙氧基乙醇、2-(甲氧基甲氧基)乙醇、2-異丙氧基乙醇、2-丁氧基乙醇、2-(異戊氧基)乙醇、2-(己氧基)乙醇、糠醇、二乙二醇單甲基醚、二乙二醇單乙基醚、二乙二醇單丁基醚、三乙二醇單甲基醚、1-甲氧基-2-丙醇、1-乙氧基-2-丙醇、二丙二醇單甲基醚、二乙二醇單乙基醚、三乙二醇單甲基醚、1，2-乙二醇、1， 2-丙二醇、1，3-丙二醇、1，2-丁二醇、1，3-丁二醇、1，4_ 丁二醇、2，3-丁二醇、1，5-戊二醇、 2-丁烯-1，4-二醇、2-甲基-2，4-戊二醇、2-乙基-1，3-己二醇、二乙二醇、三乙二醇、四乙二醇、聚乙二醇、二丙二醇、聚丙二醇等。一元醇優(yōu)選甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、 2- 丁醇、異丁醇、叔丁醇、1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、2-甲基-1- 丁醇、異戊醇、叔戊醇、3-甲基-2-丁醇、新戊醇、1-己醇、2-甲基-1-戊醇、4-甲基-2-戊醇、2-乙基-1-丁醇、1-庚醇、 2-庚醇、3-庚醇、1-辛醇、2-辛醇、2-乙基-1-己醇、1-壬醇、1-癸醇、^一烷醇、1-十二烷醇、芐醇、環(huán)己醇、1-甲基環(huán)己醇、2-甲基環(huán)己醇、3-甲基環(huán)己醇、4-甲基環(huán)己醇、2-甲氧基乙醇、2-乙氧基乙醇、2-(甲氧基甲氧基)乙醇等，特別優(yōu)選甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、 1- 丁醇、2- 丁醇、異丁醇、叔丁醇、1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、2-甲基-1- 丁醇、異戊醇、叔戊醇、3-甲基-2-丁醇、新戊醇、1-己醇、2-甲基-1-戊醇、4-甲基-2-戊醇、2-乙基-1-丁醇、環(huán)己醇等，這其中又優(yōu)選甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、2-丁醇、異丁醇、叔丁醇、 1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、2-甲基-1-丁醇、異戊醇、叔戊醇、3-甲基-2-丁醇、新戊醇等，最優(yōu)選甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1- 丁醇、2- 丁醇、異丁醇、2-甲基-1- 丁醇、異戊醇等，這其中又優(yōu)選甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇，特別優(yōu)選乙醇。二元醇優(yōu)選1，2_乙二醇、1，2_丙二醇、1，3-丙二醇、2-丁烯-1，4-二醇、2-甲基-2，4-戊二醇、2-乙基-1，3-己二醇、二乙二醇、三乙二醇、四乙二醇、聚乙二醇、二丙二醇、聚丙二醇等，最優(yōu)選1，2-丙二醇、聚乙二醇。醇以外的水溶性溶劑可以列舉四氫呋喃、二噁烷等醚類，丙酮、甲基乙基酮等酮類，乙腈、二甲亞砜等氮化合物和水等，優(yōu)選四氫呋喃、丙酮，更優(yōu)選丙酮。其中，用于食用和醫(yī)藥用時(shí)，乙醇、1，2-丙二醇、聚乙二醇(優(yōu)選分子量為300 1000的聚乙二醇)等特別合適，當(dāng)然，也適合使用它們的混合物。對(duì)上述溶劑的用量沒(méi)有特殊限制，只要是能夠產(chǎn)生預(yù)期的合適效果和能力的量 (即有效量)即可。一般地，在全部混合物中，例如通常為5重量％或以上，優(yōu)選10重量％ 或以上，更優(yōu)選20重量％或以上，特別優(yōu)選30重量％或以上，尤其優(yōu)選40重量％或以上， 特別是50重量％或以上，最優(yōu)選超過(guò)50重量％。特別是在抗壞血酸類的情況下，優(yōu)選上述溶劑的用量為60重量％或以上，更優(yōu)選 70重量％或以上，進(jìn)一步優(yōu)選80重量％或以上。另外，從最大限度地發(fā)揮枸櫞酸類和/或抗壞血酸類的效果的角度出發(fā)，優(yōu)選簡(jiǎn)單的組成，優(yōu)選基本上不含植物油和/或表面活性劑。首先說(shuō)明還原型輔酶Qltl的穩(wěn)定方法和保存方法。本發(fā)明所用的枸櫞酸類和/或抗壞血酸類的用量，例如只要是能夠產(chǎn)生預(yù)期的合適效果和能力的量(即有效量)即可。具體地，只要是可以防止還原型輔酶氧化成氧化型輔酶Qltl的有效量即可。因此，盡管根據(jù)枸櫞酸類和/或抗壞血酸類的種類有所不同，對(duì)其用量沒(méi)有特別限制，通常相對(duì)100重量份的還原型輔酶( 1(1，其用量為0. 1重量份或以上， 優(yōu)選1重量份或以上，更優(yōu)選10重量份或以上。有溶劑混合存在時(shí)，根據(jù)枸櫞酸類或抗壞血酸類的種類其用量有所不同，相對(duì)100重量份的溶劑，其用量通常為0. 01重量份或以上， 優(yōu)選0. 1重量份或以上，更優(yōu)選1重量份或以上。溶劑中還原型輔酶Gjici的氧化防護(hù)效果有在還原型輔酶Gjici的高濃度溶液中更高的傾向，因此沒(méi)有特別限制，對(duì)100重量分的溶劑，還原型輔酶( 1(ι通常為1重量份以上，優(yōu)選 2重量份以上的濃度。另外，保存時(shí)可能更有效。實(shí)施本發(fā)明的穩(wěn)定方法時(shí)，對(duì)溫度沒(méi)有特殊限制，但是，為了最大限度地發(fā)揮穩(wěn)定效果，通常為50°C或以下，優(yōu)選40°C或以下，更優(yōu)選30°C或以下。因此，將通過(guò)上述穩(wěn)定方法穩(wěn)定的還原型輔酶仏。在50°C或以下，優(yōu)選40°C或以下，更優(yōu)選30°C或以下保存的方案也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。如上所述，根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)使用上述枸櫞酸類和/或抗壞血酸類，可以防止還原型輔酶被分子氧氧化，從而穩(wěn)定化。因此，可以在萃取、水洗、濃縮、柱色譜等操作時(shí)適當(dāng)?shù)貙?shí)施，并且可以穩(wěn)定地保存還原型輔酶仏0。其次，說(shuō)明本發(fā)明的結(jié)晶方法。本發(fā)明中，使還原型輔酶在包含枸櫞酸類和/ 或抗壞血酸類的溶劑中結(jié)晶。結(jié)晶所用的還原型輔酶( 1(ι可以通過(guò)例如合成、發(fā)酵、從天然物中萃取等以外公知的方法獲得。優(yōu)選通過(guò)還原還原型輔酶Qltl中所含的氧化型輔酶( 1(ι或氧化型輔酶( 1(ι而獲得，更優(yōu)選利用后述本發(fā)明的還原反應(yīng)獲得的還原型輔酶(^。本發(fā)明的結(jié)晶方法也可以適用于含有較多氧化型輔酶( 1(ι的還原型輔酶( 1(ι，但對(duì)通過(guò)后述還原方法等制備的高純度還原型輔酶( 1(ι特別有效。本發(fā)明中，一并除去含有還原型輔酶Qltl的反應(yīng)液或萃取液中所含的雜質(zhì)的精制晶析特別有效，所述還原型輔酶Acl通過(guò)現(xiàn)有公知的方法獲得，或者通過(guò)后述的還原方法制備。由此可以從母液中除去通常不一定容易除去的結(jié)構(gòu)類似的化合物(具體為還原型輔酶％、還原型輔酶％和還原型輔酶(^等)。 當(dāng)然，上述精制晶析作為再精制還原型輔酶Qltl的重結(jié)晶法也非常有效。還原型輔酶( 1(ι的結(jié)晶中，可以將冷卻、濃縮、溶劑置換、弱溶劑的使用等一般結(jié)晶操作單獨(dú)或適當(dāng)組合實(shí)施。特別優(yōu)選使用或并用冷卻操作(冷卻晶析)。本發(fā)明所用的枸櫞酸類和/或抗壞血酸類的用量，例如只要是能夠產(chǎn)生預(yù)期的合適效果和能力的量(即有效量)即可。具體地，只要是可以防止還原型輔酶兌。氧化成氧化型輔酶Qltl的有效量即可。一般地，盡管根據(jù)枸櫞酸類和/或抗壞血酸類的種類其用量有所變化，對(duì)其用量沒(méi)有特別限制，通常相對(duì)100重量份的還原型輔酶Qltl，其用量為0. 1重量份或以上，優(yōu)選1重量份或以上，更優(yōu)選10重量份或以上。相對(duì)100重量份的溶劑，其用量通常為0.01重量份或以上，優(yōu)選0. 1重量份或以上，更優(yōu)選1重量份或以上。其上限沒(méi)有特別限制，但從經(jīng)濟(jì)方面考慮，通常為10重量份或以下，優(yōu)選5重量份或以下，更優(yōu)選1重量份或以下即可。還原型輔酶Qltl的結(jié)晶優(yōu)選在強(qiáng)制流動(dòng)下實(shí)施。為了抑制過(guò)飽和的形成，順利成核、使晶體成長(zhǎng)，或者，從提供質(zhì)量的方面考慮，單位容積攪拌所需的動(dòng)力通常為約0. Olkff/m3或以上，優(yōu)選約0. lkW/m3或以上，更優(yōu)選約0.3kW/m3或以上的流動(dòng)。通常通過(guò)攪拌葉的旋轉(zhuǎn)來(lái)提供上述強(qiáng)制流動(dòng)，但不一定必須用攪拌葉來(lái)獲得上述流動(dòng)，也可以利用例如液體循環(huán)的方法等。結(jié)晶時(shí)，為了抑制過(guò)飽和的形成，順利成核、使晶體成長(zhǎng)，優(yōu)選添加晶種。還原型輔酶Qltl的結(jié)晶溫度(結(jié)晶時(shí)的冷卻溫度)因結(jié)晶溶劑的種類和結(jié)晶方法而異，因此不能統(tǒng)一規(guī)定，例如，優(yōu)選25°C或以下，更優(yōu)選20°C或以下，特別是15°C或以下， 尤其是10°C或以下。下限為體系的固化溫度。通?？梢栽? 25°C左右實(shí)施。為了使得到的還原型輔酶Qltl中混入的各種雜質(zhì)最少，或者為了獲得性狀良好的漿液，結(jié)晶時(shí)可以控制單位時(shí)間內(nèi)的析出的結(jié)晶量。單位時(shí)間內(nèi)的晶體析出量?jī)?yōu)選為例如單位時(shí)間析出總晶體析出量的約50%量的速度以下(即最大為50%總量/小時(shí))，優(yōu)選單位時(shí)間析出總晶體析出量的約25%量的速度以下(即最大為25%總量/小時(shí))。另外，冷卻晶析過(guò)程中的冷卻速度通常為約40°C /小時(shí)以下，優(yōu)選約20°C /小時(shí)以下。溶劑中還原型輔酶Glici的氧化防護(hù)效果有在還原型輔酶Glici的高濃度溶液中更高的傾向，因此沒(méi)有特別限制，對(duì)100重量份的溶劑，還原型輔酶( 1(ι通常為1重量份以上，優(yōu)選 2重量份以上的濃度結(jié)晶可能更有效。另外，結(jié)晶濃度的上限因結(jié)晶溶劑的種類和結(jié)晶方法而異，因此不能統(tǒng)一規(guī)定，例如，對(duì)結(jié)晶完畢時(shí)的結(jié)晶溶劑100重量份，還原型輔酶( 1(ι優(yōu)選約15重量份或以下，更優(yōu)選約13重量份或以下，特別是約10重量份或以下。通?？梢杂眉s5 10重量份實(shí)施。按照上述方法獲得的還原型輔酶Qltl優(yōu)選通過(guò)例如離心分離、加壓過(guò)濾、減壓過(guò)濾等進(jìn)行固液分離，進(jìn)一步地，可以根據(jù)需要洗滌濾餅，得到濕體物。另外，將濕體物裝入內(nèi)部用惰性氣體置換的減壓干燥器(真空干燥器)中，在減壓下干燥，可以得到干燥物，優(yōu)選獲得干燥物的形式。上述結(jié)晶方法中可以使用的溶劑可以列舉上述的烴類、脂肪酸酯類、醚類、醇類、 脂肪酸類、酮類、氮化合物類(包括腈類和酰胺類)、硫化合物類和水等，但最適合使用的溶劑是如上所述的一元或二元醇和/或醇以外的水溶性溶劑。特別優(yōu)選的溶劑為甲醇、乙醇、 1-丙醇、2-丙醇、丙酮、甲乙酮或水或它們的混合物，特別優(yōu)選是乙醇、丙酮或它們的混合物。使用一元或二元醇或酮，優(yōu)選一元或二元醇或水溶性的酮(具體地，甲醇、乙醇、 1-丙醇、2-丙醇、丙酮、甲乙酮等，優(yōu)選乙醇、丙酮等)時(shí)，可以獲得漿狀物形狀或結(jié)晶性狀的好還原型輔酶Ao結(jié)晶。進(jìn)一步地，從適當(dāng)降低還原型輔酶( 1(ι的溶解性從而獲得高收率、改善漿狀物性狀、特別值得注意的是大幅改善固液分離性(過(guò)濾性)這些方面考慮，特別優(yōu)選在一元或二元醇和/或醇以外的水溶性有機(jī)溶劑中存在少量的水。一元或二元醇和/或醇以外的水溶性有機(jī)溶劑與水的比例因溶劑的種類而異，因此不能統(tǒng)一規(guī)定。只要是實(shí)質(zhì)上以一元或二元醇和/或醇以外的水溶性有機(jī)溶劑為主成分的溶劑，則沒(méi)有特殊限制，但對(duì)于100重量份的總?cè)軇鲜鲆辉蚨己?或醇以外的水溶性有機(jī)溶劑的比例下限通常為約90重量份，優(yōu)選約91重量份，更優(yōu)選約92重量份，特別優(yōu)選約93重量份，上限為約99. 5重量份， 優(yōu)選約99重量份，更優(yōu)選約98重量份，特別優(yōu)選約97重量份。通常在約93 97重量份最適合實(shí)施。
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溶劑中的還原型輔酶Gjici的氧化防護(hù)效果有在還原型輔酶Gjici的高濃度溶液中則更高的傾向，因此沒(méi)有特別限制，但對(duì)于100重量份的溶劑，作為還原型輔酶( 1(ι，通常使之在1 重量份或1重量份以上，優(yōu)選2重量份或2重量份以上的濃度結(jié)晶則更有效。根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)使還原型輔酶( 1(ι在抗壞血酸類和/或枸櫞酸類的存在下結(jié)晶， 可以在使不希望發(fā)生的氧副反應(yīng)最小化的狀態(tài)下結(jié)晶，以高收率獲得高質(zhì)量的還原型輔酶 Qioo通過(guò)本發(fā)明的結(jié)晶方法獲得的還原型輔酶( 1(ι結(jié)晶質(zhì)量極高，可以期望還原型輔酶Qiq/氧化型輔酶Qiq的重量比達(dá)到98/2或更高，優(yōu)選99/1或更高。下面說(shuō)明還原型輔酶( 1(ι的制備方法。本發(fā)明中，用抗壞血酸類將氧化型輔酶還原成還原型輔酶后，使生成的還原型輔酶( 1(ι在枸櫞酸類和/或抗壞血酸類的存在下繼續(xù)結(jié)晶(直接分離法(7 >《〃卜)。所述“繼續(xù)結(jié)晶”是指對(duì)還原反應(yīng)所得的反應(yīng)液不進(jìn)行萃取、洗滌等附加操作便進(jìn)行結(jié)晶。由此使操作簡(jiǎn)便并且最短，從而可以使分子氧導(dǎo)致的氧化最小化。首先對(duì)還原反應(yīng)進(jìn)行說(shuō)明。本發(fā)明中，使用上述的抗壞血酸類作為還原劑。上述抗壞血酸類的用量沒(méi)有特殊限制，例如，只要是可以產(chǎn)生預(yù)期的合適效果或能力的量(即有效量)即可，具體地，只要是可以將氧化型輔酶變成還原型輔酶的有效量即可。一般來(lái)說(shuō)，對(duì)于氧化型輔酶Qltl,通常為1倍摩爾量或以上，優(yōu)選1.2倍摩爾量或以上。對(duì)上限沒(méi)有特殊限制，從經(jīng)濟(jì)性方面考慮，通常為10倍摩爾量，優(yōu)選5倍摩爾量，更優(yōu)選3倍摩爾量。另外，盡管枸櫞酸類不起還原劑的作用，但從持續(xù)結(jié)晶時(shí)的穩(wěn)定效果方面考慮，可以從還原反應(yīng)時(shí)添加枸櫞酸類。采用上述抗壞血酸類的還原可以使制備還原型輔酶Qltl時(shí)作為反應(yīng)促進(jìn)劑(例如降低反應(yīng)溫度，縮短反應(yīng)時(shí)間等)的堿性物質(zhì)或亞硫酸氫鹽等具有反應(yīng)促進(jìn)效果的添加劑共存而實(shí)施。對(duì)上述減小物質(zhì)沒(méi)有特殊限制，例如，不管是無(wú)機(jī)化合物或有機(jī)化合物都可以使用。對(duì)所述無(wú)機(jī)化合物沒(méi)有特殊限制，例如金屬氫氧化鈉(優(yōu)選堿金屬氫氧化物和堿土金屬氫氧化物)，碳酸鹽和碳酸氫鹽?？梢粤信e例如氫氧化鈉等堿金屬氫氧化物、碳酸鈉等堿金屬碳酸鹽、碳酸氫鈉等堿金屬碳酸氫鹽和碳酸鎂等堿土類金屬碳酸鹽等。對(duì)上述有機(jī)化合物沒(méi)有特殊限制，可以列舉三乙胺等胺類等。上述堿性物質(zhì)中，特別優(yōu)選使用金屬(優(yōu)選堿金屬、堿土類金屬等)的碳酸鹽、碳酸氫鹽、銨等無(wú)機(jī)化合物，三乙胺等胺等有機(jī)化合物等弱堿性物質(zhì)。最優(yōu)選上述無(wú)機(jī)化合物，更優(yōu)選上述弱堿性無(wú)機(jī)化合物。另外，亞硫酸氫鹽可以列舉例如亞硫酸氫鈉等堿金屬亞硫酸氫鹽等合適的物質(zhì)。上述添加劑的量只要是可以發(fā)揮預(yù)期程度的反應(yīng)促進(jìn)效果的量(有效量)即可， 沒(méi)有特殊限制。一般地，從經(jīng)濟(jì)方面考慮，相對(duì)抗壞血酸類，通常為20倍摩爾量或以下，優(yōu)選10倍摩爾量或以下，更優(yōu)選5倍摩爾量或以下，特別是2倍摩爾量或以下。對(duì)下限沒(méi)有特別限制，通常為0. 01倍摩爾量或以上，優(yōu)選0. 05倍摩爾量或以上，更優(yōu)選0. 1倍摩爾量或以上，特別是0. 2倍摩爾量或以上。本發(fā)明記載的還原反應(yīng)優(yōu)選在強(qiáng)制流動(dòng)下實(shí)施。作為單位體積攪拌所需的動(dòng)力， 優(yōu)選通常為約0. 01kff/m3或以上，優(yōu)選約0. lkff/m3或以上，更優(yōu)選約0. 3kff/m3或以上的流動(dòng)。上述的強(qiáng)制流動(dòng)通常通過(guò)攪拌翼的旋轉(zhuǎn)而給與，但為了獲得上述流動(dòng)不一定必須用攪拌翼，也可以利用例如通過(guò)液體循環(huán)的方法等。還原溫度通常為30°C或以上，優(yōu)選40°C或以上，更優(yōu)選50°C或以上。上限為體系的沸點(diǎn)。通常可以在30 150°C左右，優(yōu)選40 120°C左右，更優(yōu)選50 100°C左右實(shí)施。對(duì)反應(yīng)濃度沒(méi)有特殊限制，一般地，對(duì)于100重量份的溶劑，氧化型輔酶( 1(ι的重量通常為約1重量份或以上，優(yōu)選3重量份或以上，更優(yōu)選10重量份或以上，特別是15重量份或以上。對(duì)上限沒(méi)有特別限制，通常為約60重量份，優(yōu)選約50重量份，更優(yōu)選約40重量份，特別是30重量份。一般地，可以在約2 30重量份，優(yōu)選約5 30重量份，更優(yōu)選約 10 30重量份實(shí)施。還原反應(yīng)時(shí)間隨還原劑種類和/或數(shù)量而不同，因此不能絕對(duì)限定。但是通常，反應(yīng)在48小時(shí)內(nèi)完成，優(yōu)選M小時(shí)內(nèi)，更優(yōu)選10小時(shí)內(nèi)，還更優(yōu)選5小時(shí)內(nèi)。在上述方法中，進(jìn)行還原反應(yīng)后，繼續(xù)由上述反應(yīng)液進(jìn)行上述結(jié)晶。此時(shí)，在結(jié)晶過(guò)程中，體系中可以存在上述結(jié)晶方法中記載的有效量的枸櫞酸類和/或抗壞血酸類，這些可以是還原反應(yīng)時(shí)添加的抗壞血酸類(和枸櫞酸類)。優(yōu)選還原反應(yīng)時(shí)添加的抗壞血酸類殘留并在結(jié)晶時(shí)共存。上述還原型輔酶Acl制備方法中，結(jié)晶方法的優(yōu)選方案也是上述結(jié)晶方法中記載的方案。可以用于上述制備方法的溶劑包括上述烴類、脂肪酸酯類、醚類、醇類、脂肪酸類、 酮類、氮化合物類(包括腈、酰胺類)、硫化合物類和水等，最適合使用的溶劑是如上所述的一元或二元醇和/或醇以外的水溶性溶劑。特別優(yōu)選的溶劑為甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、 丙酮、甲乙酮、水或它們的混合物，特別是乙醇、丙酮、水或它們的混合物。—元或二元醇或酮中，優(yōu)選使用一元或二元醇或水溶性酮(具體為甲醇、乙醇、 1-丙醇、2-丙醇、丙酮、甲乙酮等，優(yōu)選乙醇、丙酮等)時(shí)，可以得到漿液性狀或結(jié)晶好的還原型輔酶Ac1結(jié)晶。進(jìn)一步地，從適當(dāng)降低還原型輔酶( 1(ι的溶解性從而獲得高收率、改善漿狀物性狀、特別值得注意的是大幅改善固液分離性(過(guò)濾性)這些方面考慮，優(yōu)選在一元或二元醇和/或醇以外的水溶性有機(jī)溶劑中存在少量的水。一元或二元醇和/或醇以外的水溶性有機(jī)溶劑與水的比例因溶劑的種類而異，因此不能統(tǒng)一規(guī)定。只要是實(shí)質(zhì)上以一元或二元醇和/或醇以外的水溶性有機(jī)溶劑為主成分的溶劑，則沒(méi)有特殊限制，但對(duì)于100重量份的總?cè)軇?，上述一元或二元醇?或醇以外的水溶性有機(jī)溶劑的比例下限通常為約90重量份， 優(yōu)選約91重量份，更優(yōu)選約92重量份，特別優(yōu)選約93重量份，上限為約99. 5重量份，優(yōu)選約99重量份，更優(yōu)選約98重量份，特別優(yōu)選約97重量份。通常在約93 97重量份最適合實(shí)施。溶劑中的還原型輔酶Aci的氧化防護(hù)效果有在還原型輔酶Glici的高濃度溶液中則更高的傾向，因此沒(méi)有特別限制，但對(duì)于100重量份的溶劑，作為還原型輔酶( 1(ι，通常使之在1 重量份或1重量份以上，優(yōu)選2重量份或2重量份以上的濃度結(jié)晶則更有效。通過(guò)本發(fā)明的制備方法可以簡(jiǎn)便并且穩(wěn)定地獲得高質(zhì)量，即還原型輔酶( 1(ι/氧化型輔酶Qiq的重量比為98/2或以上，優(yōu)選99/1或以上的還原型輔酶Qltl結(jié)晶。上述制備方法作為由含有氧化型輔酶( 1(ι的還原型輔酶進(jìn)一步提高還原型輔酶 Q10的重量比的精制方法極為有效。
下面說(shuō)明本發(fā)明的組合物。本發(fā)明組合物之一是含有還原型輔酶和枸櫞酸類的含還原型輔酶Acl的組合物。本發(fā)明的組合物中，可以使用上述的烴類、脂肪酸酯類、醚類、醇類、脂肪酸類、酮類、氮化合物類(包括腈、酰胺類)、硫化合物類和水等作為溶劑，但特別優(yōu)選上述一元或二元醇和/或醇以外的水溶性溶劑(優(yōu)選水溶性有機(jī)溶劑)。本發(fā)明的另一組合物是下述含還原型輔酶( 1(ι的組合物，其含有還原型輔酶Qltl、抗壞血酸類和一元或二元醇和/或醇以外的水溶性有機(jī)溶劑，并且一元或二元醇和/或醇以外的水溶性有機(jī)溶劑為全部組合物的5重量％或以上上述本發(fā)明的組合物中，可以并用抗壞血酸類和枸櫞酸類。本發(fā)明所用的枸櫞酸類和/或抗壞血酸類的用量，例如只要是能夠產(chǎn)生預(yù)期的合適效果和能力的量(即有效量)即可。具體地，只要是可以防止還原型輔酶氧化成氧化型輔酶Qltl的有效量即可。一般地，盡管根據(jù)枸櫞酸類和/或抗壞血酸類的種類有所不同， 對(duì)其用量沒(méi)有特別限制，通常相對(duì)100重量份的還原型輔酶( 1(1，其用量為0. 1重量份或以上，優(yōu)選1重量份或以上，更優(yōu)選10重量份或以上。相對(duì)100重量份的溶劑，其用量通常為 0. 01重量份或以上，優(yōu)選0. 1重量份或以上。其上限沒(méi)有特別限制，但從經(jīng)濟(jì)方面考慮，通常為10重量份或以下，優(yōu)選5重量份或以下，更優(yōu)選1重量份或以下即可。本發(fā)明組合物中可以使用的溶劑包括上述的烴類、脂肪酸酯類、醚類、醇類、脂肪酸類、酮類、氮化合物類(包括腈、酰胺類)、硫化合物類和水等，但如上所述，最適合使用的溶劑是一元或二元醇和/或醇以外的水溶性溶劑。本發(fā)明的組合物可以根據(jù)其目的或用途選擇、使用適當(dāng)?shù)娜軇?。例如，從分離還原型輔酶Acl或用于將所得反應(yīng)混合物進(jìn)一步誘導(dǎo)化(次反應(yīng))的觀點(diǎn)考慮，特別優(yōu)選使用沸點(diǎn)為150°C或以下、優(yōu)選100°C或以下的溶劑。用于食用、醫(yī)藥用途時(shí)，優(yōu)選乙醇、1，2_丙二醇、聚乙二醇(優(yōu)選分子量為300 1000的聚乙二醇)等。上述一元或二元醇和/或醇以外的水溶性溶劑(優(yōu)選水溶性有機(jī)溶劑)的用量一般為全部組合物的例如5重量％或以上，優(yōu)選10重量％或以上，更優(yōu)選20重量％或以上、特別優(yōu)選30重量％或以上、特別是40重量％或以上，尤其是50重量％或以上，特別優(yōu)選超過(guò)50重量％。特別是在抗壞血酸類的情況下，優(yōu)選上述溶劑的用量為60重量％或以上，更優(yōu)選70重量％以上，進(jìn)一步優(yōu)選80重量％或以上。本發(fā)明的組合物用于食用、醫(yī)藥用途時(shí)，優(yōu)選用于食用、醫(yī)藥用途的口服時(shí)，在全部組合物中，上述溶劑的用量下限通常為5 重量％，優(yōu)選10重量％，更優(yōu)選20重量％，特別優(yōu)選30重量％，特別是40重量％，尤其是 50重量％，上限通常為99重量％，優(yōu)選95重量％，更優(yōu)選90重量％，特別優(yōu)選85重量％， 特別是80重量％，尤其是70重量％。還原型輔酶( 1(ι可以以通過(guò)本發(fā)明方法所得的上述反應(yīng)混合物的形式供給，另外， 也可以外部添加。外部添加時(shí)，可以使用例如從上述反應(yīng)混合物分離的物質(zhì)或通過(guò)其它途徑合成分離的物質(zhì)。使用反應(yīng)混合物時(shí)，有簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)，但不一定適應(yīng)于身體，還原反應(yīng)時(shí)產(chǎn)生的副產(chǎn)物有可能同時(shí)存在于組合物中，從這一觀點(diǎn)考慮，與使用上述反應(yīng)混合物相比，作為還原型輔酶ζ 1(1，更優(yōu)選使用外部添加的物質(zhì)。當(dāng)然，在本發(fā)明的組合物中，不妨使還原型輔酶Qltl以外的其它活性物質(zhì)共存。其它的活性物質(zhì)包括例如氨基酸、維生素、礦物質(zhì)、多元酚、有機(jī)酸、糖類、肽和蛋白質(zhì)等。
本發(fā)明的組合物可以直接使用，也可以將其進(jìn)一步加工成膠囊劑(硬膠囊、軟膠囊)、片劑、糖漿、飲料等口服給藥形式后使用。還可以加工成軟膏、栓劑和牙膏等形式后使用，特別優(yōu)選膠囊劑，尤其是軟膠囊。對(duì)膠囊基質(zhì)沒(méi)有特殊限制，可以是以來(lái)源于牛骨、牛皮、豬皮、魚皮等的明膠為首的基質(zhì)，也可以使用其它基質(zhì)(例如可以用作食品添加物的包括增粘穩(wěn)定劑(例如角叉菜膠、藻酸鈉等來(lái)自海藻的物質(zhì)或刺槐豆膠或愈瘡膠等來(lái)自植物種子的物質(zhì)等)或纖維素類的制造用劑)。通過(guò)在脫氧氣氛中實(shí)施本發(fā)明還原型輔酶Qltl的穩(wěn)定方法、保存方法、結(jié)晶方法及制備方法，由此可以提高氧化防止效果。另外，本發(fā)明的組合物優(yōu)選在在脫氧氣氛中制備或保管。脫氧氣氛可以通過(guò)用惰性氣體置換、減壓、沸騰或?qū)⑦@些方法組合而實(shí)現(xiàn)。至少優(yōu)選使用用惰性氣體置換，即惰性氣體氣氛。所述惰性氣體包括例如氮?dú)?、氦氣、氬氣、氫氣和二氧化碳等，?yōu)選氮?dú)狻Ｔ谏鲜龇€(wěn)定方法或上述組合物中，在規(guī)定期間的保存后，還原型輔酶( 1(ι/(還原型輔酶￠^+氧化型輔酶Acl)的重量比有望保持在90重量％或以上，優(yōu)選保持在95重量％或以上。所述保存期間為例如1天以上，優(yōu)選一周以上，更優(yōu)選一個(gè)月以上，特別是半年以上， 尤其是一年以上，特別是2年以上。本發(fā)明的方法中使用安全并且易于處理的試劑，或者，可以根據(jù)其目的或用途適當(dāng)選擇所用的溶劑，適應(yīng)于還原型輔酶Qltl的分離或進(jìn)一步衍生，以食用或藥用等的組合物或口服給藥形式利用，可以廣泛利用，其有許多有利點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式下面通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明不限于這些實(shí)施例。實(shí)施例中還原型輔酶Qltl的純度、還原型輔酶Qltl與氧化型輔酶Qltl的重量比通過(guò)下述HPLC求出，但所得的還原型輔酶( 1(ι的純度值并非規(guī)定本發(fā)明的純度界限值，同樣，還原型輔酶Qltl與氧化型輔酶Qltl的重量比中還原型輔酶Qltl的比例也是對(duì)其上限值的限制。(HPLC分析條件)柱SYMMETRYC18 (Waters)，長(zhǎng) 250mm，內(nèi)徑 4. 6mm,流動(dòng)相C2H50H CH3OH = 4 3(v v)，檢測(cè)波長(zhǎng)210nm，流速lml/min，還原型輔酶仏。的保留時(shí)間9. lmin，氧化型輔酶Qiq的保留時(shí)間13. :3min。實(shí)施例1往IOOOg乙醇中加入IOOg氧化型輔酶Qltl (含氧化型輔酶40 %，純度99. 4 % )、 60g L-抗壞血酸，在78°C攪拌進(jìn)行還原反應(yīng)。30小時(shí)后，冷卻至50°C，保持該溫度，同時(shí)加入400g乙醇。攪拌該乙醇溶液(含有IOOg還原型輔酶Glltl (含還原型輔酶40% )(攪拌所需動(dòng)力為0. 3kff/m3)，同時(shí)以10°C /小時(shí)的冷卻速度冷卻至2°C，得到白色漿狀物。將該漿狀物減壓過(guò)濾，所得的濕結(jié)晶依次用冷乙醇、冷水、冷乙醇洗滌(洗滌所用的冷溶劑溫度為2V )，然后將濕結(jié)晶減壓干燥OO 40°C，1 30mmHg)，得到白色干燥結(jié)晶95g (含還原型輔酶21%,除去率48% )(有效收率95摩爾％ )。除去減壓干燥外，所有的操作均在氮?dú)夥諊逻M(jìn)行。所得的結(jié)晶的還原型輔酶￠^/氧化型輔酶仏。重量比為99. 5/0. 5，還原型輔酶Ao的純度為99.2%。實(shí)施例2
將IOOg氧化型輔酶Gjici在25°C溶于IOOOg庚烷中，攪拌該氧化型輔酶Gjici的庚烷溶液(攪拌所需動(dòng)力為0. 3kff/m3)，同時(shí)往上述庚烷溶液慢加入IOOg連二亞硫酸鈉(純度75%以上)溶于水(1000ml)的溶液作為還原劑，在25°C、pH = 4 6下進(jìn)行還原反應(yīng)。 2小時(shí)后，從反應(yīng)液中除去水相，將庚烷相用脫氣的飽和食鹽水IOOOg洗滌6次。上述所有操作均在氮?dú)夥諊逻M(jìn)行。該庚烷溶液在減壓下進(jìn)行溶劑置換，配制相對(duì)乙醇100重量份， 還原型輔酶Qltl為1重量份的乙醇溶液。將上述乙醇溶液分注，分別加入表1所示的抗壞血酸類或枸櫞酸類，相對(duì)乙醇100 重量份，其添加量為0. 1重量份(相對(duì)還原型輔酶QltlIOO重量份為10重量份)，25°C下在空氣中攪拌。M小時(shí)后，該溶液中的還原型輔酶￠^/氧化型輔酶Q1O的重量比如表1所示。 另外，為了進(jìn)行比較，把不添加時(shí)的結(jié)果也一并表示出來(lái)。表1
I力口劑RL-抗壞血酸95.3/4.7硬脂酸L-抗壞血酸酯95.8/4.2棕櫚酸L-抗壞血酸酯95.4/4.6枸櫞酸96.3/3.7枸櫞酸異丙酯95.9/4.1不添力口56.0/44.0R 還原型輔酶Gjici/氧化型輔酶Qltl的重量比參考例與實(shí)施例同法制備乙醇溶液，相對(duì)乙醇100重量份，加入表2所示的抗氧劑0. 1重量份(相對(duì)還原型輔酶^1IOO重量份為10重量份)，25°C下在空氣中攪拌。M小時(shí)后，該溶液中的還原型輔酶( 1(1/氧化型輔酶Qltl的重量比如表1所示。表2
添力口劑R沒(méi)食子酸正丙酯4.5/95.5維生素E44.2/55.8槲皮黃素(Qurcetin)3.5/96.5蕓香苷16.1/83.9γ-谷維醇(γ-oryzanol)55.3/44.7丁基羥基曱苯51.1/48.9丁基羥基苯曱醚56.0/44.0
R 還原型輔酶Gjici/氧化型輔酶Qltl的重量比實(shí)施例3用實(shí)施例1中所得的還原型輔酶Glltl配制乙醇溶液，相對(duì)100重量份乙醇，還原型輔酶Ac1為5重量份。往該乙醇溶液中加入L-抗壞血酸，相對(duì)溶劑100重量份，其添加量為 1重量份(相對(duì)還原型輔酶GliciIOO重量份為10重量份)，50°C下在空氣中攪拌。50小時(shí)后， 該溶液中的還原型輔酶Qltl/氧化型輔酶Qltl的重量比以及L-抗壞血酸的殘留比例如表3所示。另外，為了進(jìn)行比較，把還原型輔酶Qltl和L-抗壞血酸各自單獨(dú)的結(jié)果也表示出來(lái)。這些結(jié)果表明，L-抗壞血酸的存在導(dǎo)致的還原型輔酶( 1(ι的穩(wěn)定效果不是空氣氧化生成的氧化型輔酶Acl基于L-抗壞血酸導(dǎo)致的還原作用而穩(wěn)定化。表權(quán)利要求
1.還原型輔酶Acl的結(jié)晶方法，其特征在于，使還原型輔酶在含有抗壞血酸類的溶劑中結(jié)晶。
2.權(quán)利要求1所述的結(jié)晶方法，其中溶劑中含有枸櫞酸類和抗壞血酸類。
3.權(quán)利要求2所述的結(jié)晶方法，其中枸櫞酸類是選自枸櫞酸、其酯或其鹽中的至少一種。
4.權(quán)利要求2或3所述的結(jié)晶方法，其特征在于，相對(duì)100重量份的溶劑，存在0.01重量份或0. 01重量份以上的枸櫞酸類。
5.權(quán)利要求1所述的結(jié)晶方法，其中抗壞血酸類是選自抗壞血酸、鼠李糖型抗壞血酸、阿拉伯糖型抗壞血酸、葡糖型抗壞血酸、巖藻糖型抗壞血酸、葡庚糖型抗壞血酸、木糖型抗壞血酸、半乳糖型抗壞血酸、古洛糖型抗壞血酸、阿洛糖型抗壞血酸、赤蘚糖型抗壞血酸、6-脫氧抗壞血酸以及它們的酯和鹽中的至少一種。
6.權(quán)利要求1或5所述的結(jié)晶方法，其特征在于，相對(duì)100重量份溶劑，存在0.01重量份或0. 01重量份以上的抗壞血酸類。
7.權(quán)利要求1 6中任意一項(xiàng)所述的結(jié)晶方法，其中溶劑是選自烴類、脂肪酸酯類、醚類、醇類、脂肪酸類、酮類、氮化合物類、硫化合物類和水中的至少一種。
8.權(quán)利要求1 7中任意一項(xiàng)所述的結(jié)晶方法，結(jié)晶中單獨(dú)或組合實(shí)施冷卻、濃縮、溶劑置換或弱溶劑的使用。
9.權(quán)利要求1 8中任意一項(xiàng)所述的結(jié)晶方法，在相對(duì)100重量份的溶劑含有1重量份或1重量份以上的還原型輔酶Qltl的濃度下使還原型輔酶Acl結(jié)晶。
10.權(quán)利要求1 9中任意一項(xiàng)所述的結(jié)晶方法，結(jié)晶在單位體積的攪拌所需動(dòng)力為0. 01kff/m3或以上的強(qiáng)制流動(dòng)下進(jìn)行。
11.權(quán)利要求1 10中任意一項(xiàng)所述的結(jié)晶方法，結(jié)晶在脫氧的氣氛中進(jìn)行。
12.權(quán)利要求1所述的結(jié)晶方法，其特征在于，用抗壞血酸類將氧化型輔酶還原成還原型輔酶^)，生成的還原型輔酶Ao在含有抗壞血酸類的溶劑中繼續(xù)結(jié)晶。
13.權(quán)利要求12所述的方法，其中在堿性物質(zhì)或亞硫酸氫鹽的存在下進(jìn)行還原。
14.權(quán)利要求12所述的方法，其中在30°C或30°C以上進(jìn)行還原反應(yīng)后，在25°C或25°C以下進(jìn)行結(jié)晶。
全文摘要
本發(fā)明提供可以用作營(yíng)養(yǎng)功能食品、特定保健用食品等的還原型輔酶Q10的穩(wěn)定方法、保存方法等。另外，本發(fā)明還提供適于工業(yè)生產(chǎn)還原型輔酶Q10、高質(zhì)量并且高效率的方法。通過(guò)使還原型輔酶Q10與抗壞血酸或其衍生物、枸櫞酸或其衍生物接觸，由此可以在防止分子氧氧化的狀態(tài)下處理還原型輔酶Q10，并可以穩(wěn)定保存，得到穩(wěn)定的組合物。另外，使之在抗壞血酸或其衍生物等的存在下結(jié)晶，使副產(chǎn)物氧化型輔酶Q10的產(chǎn)生最少化，在該狀態(tài)下變化到結(jié)晶狀態(tài)，制備高質(zhì)量的還原型輔酶Q10。進(jìn)一步地，用抗壞血酸類將氧化型輔酶Q10還原成還原型輔酶Q10，生成的還原型輔酶Q10在抗壞血酸類的存在下繼續(xù)結(jié)晶，由此可以使操作簡(jiǎn)便并且在較短時(shí)間內(nèi)，制備高質(zhì)量的還原型輔酶Q10。
文檔編號(hào)A61P3/02GK102381948SQ20111021729
公開日2012年3月21日 申請(qǐng)日期2002年10月10日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月10日
發(fā)明者上田恭義, 北村志郎, 大野直生, 植田尚宏, 茂呂充俊 申請(qǐng)人:株式會(huì)社鐘化