專利名稱：一種快速評判微藻細胞生長活力的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種快速評判微藻細胞生長活力的方法。即通過檢測微藻細胞總ATP 酶活力的大小來評判微藻細胞的生長活力。本發(fā)明是一種快速，準(zhǔn)確的藻細胞生長活力的 評價方法，可適用于所有單細胞藻類細胞生長活力的評判。
背景技術(shù)：
微藻是一類單細胞或單細胞集群的生物，在自然界分布廣泛、環(huán)境適應(yīng)力強、光合 作用效率高、生長周期短、生物產(chǎn)量高。目前對微藻的開發(fā)利用涉及飼料、水產(chǎn)、食品、藥品、 保健品、污水處理和環(huán)境保護及生物能源開發(fā)等多個領(lǐng)域，具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景。微藻 作為水產(chǎn)動物魚、蝦、貝類育苗的生物餌料時，是影響幼苗成活率和質(zhì)量的關(guān)鍵因素之一。 在微藻培養(yǎng)過程中，微藻細胞的生長活性如何直接關(guān)系到培養(yǎng)措施的調(diào)整及微藻培養(yǎng)的成 敗，而所培養(yǎng)的微藻能否按生產(chǎn)計劃持續(xù)、穩(wěn)定地供給又直接關(guān)系到水產(chǎn)動物苗種培育的 成敗。因此，研究快捷、簡便的藻細胞生長活力檢測方法是十分必要的。在藻細胞培養(yǎng)過程中，通常采用培養(yǎng)一段時間前后藻細胞密度的變化來判定藻細 胞的生長活力。這種方法一般需要培養(yǎng)M小時以上才能得出結(jié)果，耗時較長，不能即時反 應(yīng)特定時刻藻細胞的生長活力。通過測定藻液中溶解氧的變化，也可以間接地判斷微藻細 胞的生長活性，但這種方法只適用于微藻的靜止培養(yǎng)，無法應(yīng)用于充氣培養(yǎng)，而微藻的生產(chǎn) 性培養(yǎng)多為充氣培養(yǎng)。在動物細胞活力鑒定方面，傳統(tǒng)的方法是使用臺盼藍染色法。但藻類細胞因其具 有色素體，特別是藍綠藻，干擾染色效果的判別，影響鑒定的準(zhǔn)確性，不適用于微藻細胞活 力的快速判別。熒光染色法(FDA)也被用于檢測動物細胞的活性，但FDA法實際是對細胞 膜完整性和細胞內(nèi)酶活性的檢測，細胞膜完整性通常與細胞活性相關(guān)。而微藻細胞通常具 有細胞壁，即使胞內(nèi)酶失去活力，藻細胞膜還有可能保持完好，此時的藻細胞可能不被FDA 染色，表現(xiàn)為不發(fā)熒光。因此熒光染色法(FDA)檢測微藻細胞的活性也有局限性。三磷酸腺苷(ATP)是體內(nèi)最重要的能量來源，在維持生物體的正常機能上有著無 可替代的作用。ATP作為代謝作用的能量載體，存在于所有的動物、植物和微生物的活體細 胞中。它與活體微生物量之間的相關(guān)性，使其成為較好的活體微生物的檢測指標(biāo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種有效、即時、簡便的評判微藻細胞生長活力的方法。使用本方法可 快速判斷微藻細胞的生長活力。為達到上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是用離心收集藻細胞，用超聲波細胞 粉碎機破碎藻細胞，用ATP酶測定試劑盒測定藻細胞總ATP酶活力，根據(jù)藻細胞酶活力的高 低判別細胞生長活力。所述的快速評判微藻細胞生長活力的方法，其檢測步驟為1)將待檢測藻液裝入 5ml離心管中，4C離心，棄上清液，留沉淀的藻細胞，加適量生理鹽水制備成IO6個細胞/ml的藻細胞懸液，并準(zhǔn)確計數(shù)細胞濃度；2)采用超聲波細胞粉碎機在冰水浴中對藻細胞進行完全破碎處理；3)取細胞破碎液lOOul，用總ATP酶測定試劑盒測藻細胞總ATP酶活力大 ?。豢侫TP酶的定義為規(guī)定每小時IO6個藻細胞中ATP酶分解ATP產(chǎn)生Iumol無機磷的量 為一個ATP酶活力單位。所述的快速評判微藻細胞生長活力的方法，其藻液離心的速率和時間隨微藻 種類不同而不同，如離心扁藻(Platymonas spp.)細胞采用5000r/min，3min ；等邊金藻 (Isochrysis spp.)8000r/min,5min。所述的快速評判微藻細胞生長活力的方法，其超聲破碎是在冰水浴中進行。所述的快速評判微藻細胞生長活力的方法，其藻細胞完全破碎時的超聲波工作參 數(shù)隨微藻種類不同而不同，如扁藻細胞破碎時超聲波輸出效率為400W，超聲時間3S，間隔 時間3S，全程時間5min，等邊金藻細胞破碎時超聲波輸出效率為400W，超聲時間3S，間隔時 間3S，全程時間8min。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其優(yōu)點為方法簡單易操作，省時，具有較強的實際應(yīng)用 性。
具體實施方案以亞心形扁藻為例，在批次培養(yǎng)模式下，在不同生長階段分別取5ml藻液，5000r/ min的轉(zhuǎn)速下4°C離心3min，棄上清，留下藻細胞沉淀，加適量的生理鹽水制成IO6個ml—1細 胞懸液。在冰水浴條件下用超聲波細胞粉碎機破碎藻細胞，其超聲波細胞粉碎機的輸出效 率為400W，超聲時間3S，間隔時間3S，全程時間5min。顯微鏡下檢查發(fā)現(xiàn)，扁藻細胞破碎率 在99%以上。用ATP酶測定試劑盒測得不同生長階段藻細胞總ATP酶活力。實施效果結(jié)果表明，不同生長階段的扁藻細胞總ATP酶活性有顯著差異。處于延緩期的藻 細胞相對生長常數(shù)K為0. 066，總ATP酶活力0. 131U/百萬細胞；處于指數(shù)生長期前期的藻 細胞相對生長常數(shù)K為0. 198，總ATP酶活力最高為0. 327U/百萬細胞，后期的藻細胞相對 生長常數(shù)K為0. 203，總ATP酶活力為0. 320U/百萬細胞；相對生長下降期藻細胞相對生 長常數(shù)K為0. 178，總ATP酶活力為0. 208U/百萬細胞；靜止期藻細胞相對生長常數(shù)K為 0. 146，總ATP酶活力為0. 169U/百萬細胞。細胞相對生長常數(shù)與總ATP酶活力具有顯著的 相關(guān)性(P < 0.05)，相關(guān)系數(shù)r = 0.977。因此，本方法可作為一種即時、準(zhǔn)確判斷扁藻細 胞生長活力的有效方法。
權(quán)利要求
1.一種通過測定細胞總ATP (T-ATP)酶活性來快速評價微藻細胞生長活力的方法，其 操作步驟為1)將待檢測藻液裝入5ml離心管中，4°C離心，棄上清液，留沉淀的藻細胞，加 適量生理鹽水制備成IO6個細胞/ml的藻細胞懸液，并準(zhǔn)確計數(shù)細胞濃度；幻采用超聲波細 胞粉碎機在冰水浴中對藻細胞進行完全破碎處理；幻取細胞破碎液lOOul，用總ATP酶測定 試劑盒測藻細胞總ATP酶活力大??；總ATP酶的定義為規(guī)定每小時IO6個藻細胞中ATP酶 分解ATP產(chǎn)生Iumol無機磷的量為一個ATP酶活力單位。
2.如權(quán)利要求1所述的一種通過測定細胞總ATP(T-ATP)酶活性來快速評價微藻 細胞生長活力的方法，其藻液離心的速率和時間隨微藻種類不同而不同，如離心扁藻 (Platymonas spp.)細胞采用 5000r/min，3min ；等邊金藻(Isochrysis spp.) 8000r/min, 5min。
3.如權(quán)利要求1所述的一種通過測定細胞總ATP(T-ATP)酶活性來快速評價微藻細胞 生長活力的方法，其超聲破碎是在冰水浴中進行。
4.如權(quán)利要求1所述的一種通過測定細胞總ATP(T-ATP)酶活性來快速評價微藻細胞 生長活力的方法，其藻細胞完全破碎時的超聲波工作參數(shù)隨微藻種類不同而不同，如扁藻 細胞破碎時超聲波輸出效率為400W，超聲時間3S，間隔時間3S，全程時間5min，等邊金藻細 胞破碎時超聲波輸出效率為400W，超聲時間3S，間隔時間3S，全程時間8min。
全文摘要
本發(fā)明公布了一種通過測定細胞總ATP(T-ATP)酶活性來快速評價微藻細胞生長活力的方法。其特征是取待評價生長活力的微藻藻液，4℃離心，棄上清后取藻細胞，加生理鹽水制成106細胞/ml的藻細胞懸液并準(zhǔn)確計數(shù)細胞濃度，用超聲波細胞破碎機在冰水浴條件下將藻細胞破碎，測定每100萬藻細胞的總ATP酶活性。采用本發(fā)明所評價的藻細胞活力結(jié)果(UT-ATP/100萬細胞)與藻細胞生長能力(生長常數(shù)K)存在極顯著的線性回歸關(guān)系。處于指數(shù)生長期的藻細胞活力(UT-ATP/100萬細胞)最大，處于延緩期的藻細胞活力(UT-ATP/100萬細胞)稍低，死亡期的細胞活力(UT-ATP/100萬細胞)最小。本發(fā)明操作方便，簡單快捷，可即時評價藻細胞生長活力。
文檔編號C12Q1/42GK102041294SQ20091020171
公開日2011年5月4日 申請日期2009年10月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月23日
發(fā)明者黃征征, 黃旭雄 申請人:上海海洋大學(xué)