專利名稱：一種檢測轉bar基因甘蔗的方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種檢測轉抗除草劑基因甘蔗的方法，特別涉及一種檢測轉bar基因 甘蔗的方法和應用。
背景技術：
隨著分子生物學的發(fā)展，轉基因技術在作物育種上的應用也越來越廣泛。目前，
轉基因作物的面積逐年增加，含有抗除草劑轉基因作物在目前種植的轉基因作物中占比例
最大。雜草每年給甘蔗生產帶來巨大損失，研制抗除草劑轉基因甘蔗有極大的經濟價值。
bar基因是現在應用比較廣泛的抗除草劑基因，導入該基因能夠提高甘蔗對除草劑BASTA
的耐性，從而生產上通過噴灑除草劑能夠有效的殺滅雜草而對抗除草劑轉基因甘蔗沒有危
害。同時bar基因常常作為植物轉基因研究中的抗性標記基因，在植物轉基因研究中廣泛
應用?？焖勹b定出bar基因在甘蔗生產和甘蔗轉基因研究中都有重要的作用。 目前較為常規(guī)的bar基因檢測方法包括PCR， SOUTHERN BLOT， NORTHERN BLOT和
涂抹法等。這些方法都需要一定的實驗條件，程序復雜、操作繁瑣、成本高。特別是前兩種
方法還不能確定外源基因的表達量。涂抹法容易受到外界影響，而且不一致，給實驗帶來誤
差，導致結果不準確。

發(fā)明內容
為了克服現有技術的缺點與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種檢測轉bar基 因甘蔗的方法。 本發(fā)明的另一 目的在于提供上述檢測轉bar基因甘蔗方法的應用。 本發(fā)明的目的通過下述技術方案實現一種檢測轉bar基因甘蔗的方法，包括以
下步驟 (1)選取生長部位一致的野生型甘蔗葉片，剪成長度為2 5cm的小段，分別浸沒 于5ml的不同濃度梯度的膦絲菌素溶液中，然后置于人工氣候箱中進行培養(yǎng)3 5天觀察 結果，確定能夠傷害野生型甘蔗葉片的膦絲菌素溶液的最低濃度，導致野生型甘蔗葉片剛 剛全部變黃的膦絲菌素溶液的濃度為最低濃度； (2)取待檢測的甘蔗葉片，剪成長度為2 5cm的小段，同時取與待測甘蔗葉片老 嫩程度相同的野生型甘蔗葉片作為對照，同樣剪成2 5cm小段，分別置于5ml能夠傷害野 生型甘蔗葉片的膦絲菌素溶液的最低濃度中，在人工氣候箱中以與步驟(1)相同的培養(yǎng)條 件培養(yǎng)3 5天；然后通過和作為對照的野生型甘蔗葉片比較，葉片保持綠色的即為抗除草 劑轉基因甘蔗，同時通過觀察葉片的傷害程度還能初步判斷bar基因在轉基因甘蔗中的表 達量的大小，葉片越綠說明bar基因的表達量越大，否則，表達量較低。
所述人工氣候箱的設置為適合甘蔗生長的條件； 所述人工氣候箱的設置優(yōu)選為溫度為25t:，光照為2000LX，光照時間為14h，非光 照時間為10h ;
所述的濃度梯度優(yōu)選為0 、 50 、 100 、 150 、 200 、 250和300ppm (質量體積比)；其中溶 質為膦絲菌素，溶劑為去離子水。 所述方法應用于含有bar基因的甘蔗的鑒定。 所述方法特別適合應用于甘蔗轉bar基因后的甘蔗植株的篩選。 本發(fā)明的原理是除草劑BASTA是一種以谷氨酰胺合成酶(GS)為靶標酶的有機
磷類非傳導性滅生除草劑，其主要成分膦絲菌素(PPT，glufosinateammonium)，能通過抑制
GS的酶活性，引起植物體內氨的迅速積累，發(fā)生氨中毒，導致植物死亡。bar基因編碼的產
物草丁膦乙酰輔酶A轉移酶(PAT)通過對PPT的自由氨基乙酰化，從而使PPT失去了抑制
GS活性的能力，使得轉基因植物都獲得了對除草劑PPT的抗性。 本發(fā)明相對于現有技術具有如下的優(yōu)點及效果本發(fā)明能簡便快速地完成轉基因 甘蔗的鑒定。目前該方法在甘蔗轉基因研究上還沒有相關的報道。本方法和目前采用的分 子檢測方法相比較該方法，需要的儀器少，操作簡單。比起涂抹法，本方法不受外界環(huán)境的 影響，處理更均一，效果更為準確。本方法只需取長度為2 5cm左右的葉片即可，能應用 于大批量活體轉基因甘蔗的鑒定，為轉基因甘蔗活體檢測提供新方法。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。
實施例l 所用試驗材料為甘蔗品種新臺糖20號和以其為受體的轉bar基因株系，依序包括 如下試驗步驟 1、野生型甘蔗葉片敏感試驗 (1)配制不同濃度的PPT溶液，濃度分別為用去離子水配制不同濃度梯度的PPT 溶液，濃度分別為0、50、100、150、200、250和300卯m(質量體積比，100卯m為lg PPT溶解 于IOL去離子水中，其他同理)； (2)取7支干凈的10ml玻璃試管，分別向每支試管添加5ml PPT溶液，得到含有不 同PPT濃度的7支試管； (3)選取生長部位一致的野生型甘蔗葉片，剪成5cm左右的小段，分別放入7支含 有不同PPT濃度的玻璃試管中； (4)將試管放到人工氣候箱中，培養(yǎng)條件溫度25 °C ，光照2000LX，光照時間 (14h/10h); (5) 5天后觀察結果，在PPT溶液中甘蔗葉片都會受到傷害，導致葉片為黃色，隨著 濃度的增加，黃色的面積和顏色逐漸加深。通過選擇剛剛導致甘蔗葉片全部發(fā)黃的濃度為 最適合的濃度。本實施例中的適合濃度為200卯m;
2、抗除草劑轉基因甘蔗的檢測 (1)按照敏感試驗的結果，配制濃度為200卯m的PPT溶液；
(2)取10ml的干凈的玻璃試管，每支添加5ml PPT溶液； (3)取以新臺糖20號為受體的轉bar基因甘蔗植株的葉片，同時取與待測甘蔗葉 片老嫩程度相同的未轉基因的葉片作為對照，剪成5cm左右的小段，放入含有PPT溶液的干 凈的玻璃試管中；
4
(4)將試管放到人工氣候箱中，培養(yǎng)條件溫度25 °C ，光照2000LX，光照時間 (14h/10h); (5)5天后觀察結果，通過和對照比較，以新臺糖20號為受體的轉bar基因甘蔗植 株的葉片保持綠色，未轉基因的葉片變黃。 本實施例通過對PPT檢測出為陽性的抗除草劑轉基因甘蔗進行PCR驗證，結果一 致。陽性植株均能擴出相應的特異條帶，而未轉基因的則沒有。從而說明本方法完全可靠。
實施例2 所用試驗材料為甘蔗品種新臺糖20號和以其為受體的轉bar基因株系，依序包括 如下試驗步驟 1、野生型甘蔗葉片敏感試驗 (1)配制不同濃度的PPT溶液，濃度分別為用去離子水配制不同濃度梯度的PPT 溶液，濃度分別為:0、50、100、150、200、250和300ppm(質量體積比); (2)取7支干凈的10ml玻璃試管，分別向每支試管添加5ml PPT溶液，得到含有不 同PPT濃度的7支試管； (3)選取生長部位一致的野生型甘蔗葉片，剪成2cm左右的小段，分別放入7支含 有不同PPT濃度的玻璃試管中； (4)將試管放到人工氣候箱中，培養(yǎng)條件溫度25 °C ，光照2000LX，光照時間 (14h/10h); (5) 3天后觀察結果，在PPT溶液中甘蔗葉片都會受到傷害，導致葉片為黃色，隨著 濃度的增加，黃色的面積和顏色逐漸加深。通過選擇剛剛導致甘蔗葉片全部發(fā)黃的濃度為 最適合的濃度。本實施例中的適合濃度為200卯m;
2、抗除草劑轉基因甘蔗的檢測 (1)按照敏感試驗的結果，配制濃度為200ppm的PPT溶液；
(2)取10ml的干凈的玻璃試管，每支添加5ml PPT溶液； (3)取以新臺糖20號為受體的轉bar基因甘蔗植株的葉片，同時取與待測甘蔗葉 片老嫩程度相同的未轉基因的葉片作為對照，剪成2cm左右的小段，放入含有PPT溶液的干 凈的玻璃試管中； (4)將試管放到人工氣候箱中，培養(yǎng)條件溫度25 °C ，光照2000LX，光照時間 (14h/10h); (5)3天后觀察結果，通過和對照比較，以新臺糖20號為受體的轉bar基因甘蔗植 株的葉片保持綠色，未轉基因的葉片變黃。 本實施例通過對PPT檢測出為陽性的抗除草劑轉基因甘蔗進行PCR驗證，結果一 致。陽性植株均能擴出相應的特異條帶，而未轉基因的則沒有。從而說明本方法完全可靠。
上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內。
權利要求
一種檢測轉bar基因甘蔗的方法，其特征在于包括以下步驟(1)選取生長部位一致的野生型甘蔗葉片，剪成長度為2～5cm的小段，分別浸沒于5ml的不同濃度梯度的膦絲菌素溶液中，然后置于人工氣候箱中進行培養(yǎng)3～5天觀察結果，確定能夠傷害野生型甘蔗葉片的膦絲菌素溶液的最低濃度，導致野生型甘蔗葉片剛剛全部變黃的膦絲菌素溶液的濃度為最低濃度；(2)取待檢測的甘蔗葉片，剪成長度為2～5cm的小段，同時取與待測甘蔗葉片老嫩程度相同的野生型甘蔗葉片作為對照，同樣剪成2～5cm小段，分別置于5ml能夠傷害野生型甘蔗葉片的膦絲菌素溶液的最低濃度中，在人工氣候箱中以與步驟(1)相同的培養(yǎng)條件培養(yǎng)3～5天；然后通過和作為對照的野生型甘蔗葉片比較，葉片保持綠色的即為抗除草劑轉基因甘蔗，同時通過觀察葉片的傷害程度還能初步判斷bar基因在轉基因甘蔗中的表達量的大小。
2. 根據權利要求1所述檢測轉bar基因甘蔗的方法，其特征在于所述人工氣候箱的 設置為溫度為25t:，光照為2000LX，光照時間為14h，非光照時間為10h。
3. 根據權利要求1所述檢測轉bar基因甘蔗的方法，其特征在于所述的濃度梯度為 0、50、100、150、200、250和300卯m ;其中溶質為以質量膦絲菌素，溶劑為以體積計的去離子 水。
4. 權利要求1 3任一項所述方法應用于含有bar基因的甘蔗的鑒定。
5. 權利要求1 3任一項所述方法應用于對甘蔗轉bar基因后的甘蔗植株的篩選。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測轉bar基因甘蔗的方法和應用。本發(fā)明通過將待檢測的甘蔗葉片直接浸泡在除草劑溶液中進行處理，同時以不含有bar基因的甘蔗葉片作為對照，通過直接觀察傷害程度就能判斷結果。該方法應用于含有bar基因的甘蔗植株的鑒定，特別適合轉基因再生植株的快速檢測，能夠大大降低轉基因植株分子檢測工作，大幅度提高檢測效率，降低檢測成本。
文檔編號C12Q1/68GK101698883SQ200910193440
公開日2010年4月28日 申請日期2009年10月29日 優(yōu)先權日2009年10月29日
發(fā)明者張劍亮, 曹干, 王繼華 申請人:廣東省農業(yè)科學院作物研究所