專利名稱：草銨膦耐受性稻的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及稻植物、植物材料和種子，其特征在于帶有特定的轉(zhuǎn)化事件，具體而言，在稻基因組特定位點存在CaMV35S啟動子控制下的bar基因。本發(fā)明的稻植物兼有草銨膦耐受性，以及最佳的綜合農(nóng)學(xué)特性、遺傳穩(wěn)定性和針對不同遺傳背景的適應(yīng)性。
此處引用的所有文獻均特此引入作為參考。
稻生產(chǎn)通常受多種雜草威脅，其中有些雜草競爭性強，侵襲嚴(yán)重時會導(dǎo)致作物產(chǎn)量大幅下降，以至喪失經(jīng)濟效益。就直接播種、機械化稻耕作的典型的適度生產(chǎn)而言，栽培實踐(例如作物輪換、灌溉管理)及除草劑均為控制雜草所必需(Hill等人，1994)。
bar基因(Thompson等人，1987，EMBO J.62519-2523；Deblock等人，1987，EMBO J.62513-2518)是編碼膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶(phosphinothricin acetyl transferase，PAT)的基因，在植物中表達(dá)時，可耐受除草劑化合物膦絲菌素(也叫草銨膦)或雙丙氨酰膦(參見例如美國專利5,646,024和5,561,236號)及其鹽和旋光異構(gòu)體。其它編碼PAT的基因已有描述(參見例如Wohlleben等人，1988，基因(Gene)7025-37；歐洲專利275,957號；美國專利5,276,268、5,637,489、5,273,894號)。
美國專利5,641,664號描述了單子葉植物的轉(zhuǎn)化，其中利用電穿孔轉(zhuǎn)化能形成致密胚性愈傷組織的完整組織，或者由這樣的完整組織獲得的致密胚性愈傷組織。此處公開了利用電穿孔將bar基因轉(zhuǎn)化稻致密胚性愈傷組織以及轉(zhuǎn)基因稻植物的再生。
已描述了利用DNA包裹的金微粒轟擊法轉(zhuǎn)化未成熟稻胚細(xì)胞，獲得的含有g(shù)us基因以及bar基因或提供潮霉素抗性的hyg基因二者之一的轉(zhuǎn)基因稻植物(Christou等人，1991，生物技術(shù)(Biotechnology)9957)。
美國專利5,679,558號描述了利用電穿孔聚集的懸浮細(xì)胞將bar基因轉(zhuǎn)化稻。
然而，前述文獻未能指導(dǎo)或者啟發(fā)本發(fā)明。
iii)一對EcoRV片段，其一長度介于約2838和約4507bp之間，優(yōu)選地約3，8kbp，另一長度超過約5077bp，優(yōu)選地約12kbp；iv)一條HindIII片段，其長度介于約5077和約11497bp之間，優(yōu)選地約5，3kbp；v)一對NcoI片段，二者長度均介于約2838和約4507bp之間，優(yōu)選地其一約3，1kbp，另一約4，1kbp；vi)一條NsiI片段，其長度介于約4749和約11497bp之間，優(yōu)選地約5，1kbp；其中各限制性片段在標(biāo)準(zhǔn)的嚴(yán)謹(jǐn)條件下，均能夠與約1327bp的片段雜交，該片段可由EcoRI消化具有SEQ ID No 8核苷酸序列的質(zhì)粒而獲得；和/或，b)該植物、細(xì)胞、組織或種子的基因組DNA能夠用于擴增一條介于290和350bp之間的DNA片段，優(yōu)選地約313bp，所用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的兩條引物分別具有SEQ ID No 4和SEQ ID No 5的核苷酸序列(或者包含一條約290到約350bp的DNA片段，優(yōu)選地約313bp，擴增所用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的兩條引物分別具有SEQ ID No 4和SEQ ID No5的核苷酸序列)。
本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因的耐受草銨膦的稻植物、細(xì)胞、組織或種子，其特征在于具有該植物、細(xì)胞、組織或種子的基因組DNA能夠產(chǎn)生至少一種，有利地至少兩種或多種，例如至少三種，優(yōu)選地至少四種，例如至少五種，更優(yōu)選地六種選自上述包含i)、ii)、iii)、iv)、v)和vi)描述的限制性片段或限制性片段對之組中的限制性片段或限制性片段對，該選擇可以包括上述i)、ii)、iii)、iv)、v)和vi)的任意組合。
本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因的耐受草銨膦的稻植物、細(xì)胞、組織或種子，優(yōu)選地其特征在于兼有上述a)和b)所描述的特征。
本發(fā)明也涉及存放在ATCC的編號為ATCC 203352的種子，由該種子長成的植物，以及源自該植物的細(xì)胞或組織。本發(fā)明進一步涉及可從由存放在ATCC的編號為ATCC 203352的種子長成的稻植物通過繁殖和/或育種獲得的植物。
本發(fā)明還涉及包含此處所述帶有35S-bar基因(如此處所述)及其側(cè)翼區(qū)的植物、種子、細(xì)胞或組織(例如稻植物、種子、細(xì)胞或組織)，或包含下述一段核苷酸序列的植物、種子、細(xì)胞或組織(例如稻植物、種子、細(xì)胞或組織)，該核苷酸序列與此處公開的序列至少65％，例如至少75％，例如至少80％，例如至少85％，例如至少90％，例如至少95％或者甚至97％或100％類似，例如側(cè)翼區(qū)-35S-bar基因-側(cè)翼區(qū)構(gòu)建體或插入?yún)^(qū)的序列。
本發(fā)明另外涉及上述本發(fā)明稻植物的栽培方法，更具體而言包含使用以草銨膦為活性成分的除草劑處理栽培稻植物的方法。
相信本發(fā)明的稻植物，如果按照上述包含使用以草銨膦為活性成分的除草劑的方法栽培，較之未轉(zhuǎn)化的相同稻栽培品種，生長將得到改善(US 5,739,082)。因而，本發(fā)明包含一種增強稻植物產(chǎn)量或生長的方法。
本發(fā)明也提供稻育種方法，該方法包含與本發(fā)明的稻植物雜交。
本發(fā)明還提供生產(chǎn)稻植物轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或由此獲得的植物的方法，該方法包含將特征在于具有SEQ ID No 9序列的重組DNA分子插入稻細(xì)胞的部分染色體DNA，并且任選地，從轉(zhuǎn)化的稻細(xì)胞再生出稻植物。
本發(fā)明進一步涉及鑒定轉(zhuǎn)基因植物或其細(xì)胞或組織的方法，該方法包含確認(rèn)轉(zhuǎn)基因植物或其細(xì)胞或組織的基因組DNA是否具有以下一或兩個特征a)植物、細(xì)胞、組織或種子的基因組DNA能夠產(chǎn)生至少三種，優(yōu)選地至少四種，例如至少五種，更優(yōu)選地六種選自下述的限制性片段或限制性片段對，選自i)一條EcoRI片段，其長度介于約1159和約1700bp之間，優(yōu)選地約1327bp；ii)一對BamHI片段，其一長度介于約805和約1093bp之間，優(yōu)選地約805bp，另一長度介于約1700和約2140bp之間，優(yōu)選地約2，0kbp；iii)一對EcoRV片段，其一長度介于約2838和約4507bp之間，優(yōu)選地約3，8kbp，另一長度超過約5077bp，優(yōu)選地約12kbp；iv)一條HindIII片段，其長度介于約5077和約11497bp之間，優(yōu)選地約5，3kbp；v)一對NcoI片段，二者長度均介于約2838和約4507bp之間，優(yōu)選地其一約3，1kbp，另一約4，1kbp；vi)一條NsiI片段，其長度介于約4749和約11497bp之間，優(yōu)選地約5，1kbp；其中各限制性片段在標(biāo)準(zhǔn)的嚴(yán)謹(jǐn)條件下，均能夠與約1327bp的下述片段雜交，該片段可由EcoRI消化具有SEQ ID No 8核苷酸序列的質(zhì)粒而獲得；和/或，b)該植物、細(xì)胞、組織或種子的基因組DNA能夠用于擴增一條介于290和350bp之間的DNA片段，優(yōu)選地約313bp，其中所用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的兩條引物分別具有SEQ ID No 4和SEQ ID No 5的核苷酸序列。
本發(fā)明另外涉及用來鑒定包含本發(fā)明原種事件的轉(zhuǎn)基因植物的試劑盒，該試劑盒包含識別外源DNA以及GAT-OS2的3’或5’側(cè)翼序列的PCR探針，優(yōu)選地分別具有SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示核苷酸序列，用于PCR鑒定程序。附圖簡述通過舉例給出下列詳述，但并非意在限制本發(fā)明于所述特定實施方案，本發(fā)明可以結(jié)合在此引入作為參考的附圖理解，其中

圖1消化GAT-OS2基因組DNA得到的限制性圖譜。Southern印跡凝膠加樣順序泳道1，PstI消化的Lambda DNA，泳道2，EcoRI消化的GAT-OS2 DNA，泳道3，BamHI消化的GAT-OS2 DNA，泳道4，EcoRV消化的GAT-OS2 DNA，泳道5，HindIII消化的GAT-OS2 DNA，泳道6，NcoI消化的GAT-OS2DNA，泳道7，NsiI消化的GAT-OS2 DNA，泳道8，未轉(zhuǎn)基因稻DNA，泳道9，EcoRI消化的質(zhì)粒DNA對照。
圖2使用GAT-OS2 PCR鑒定方案對不同品系進行PCR分析。凝膠加樣順序泳道1，分子量標(biāo)準(zhǔn)(100bp階梯)，泳道2-11，包含不同轉(zhuǎn)基因事件稻植物的DNA樣品，泳道12，M202野生型DNA，泳道13，Bengal野生型DNA，泳道14，陰性對照(水)，泳道15，分子量標(biāo)準(zhǔn)(100bp階梯)。發(fā)明詳述此處所用術(shù)語“基因”是指任意DNA序列，該序列包含幾種有效連接的DNA片段，例如共同構(gòu)成啟動子區(qū)的啟動子和5’非翻譯區(qū)(5’UTR)、編碼區(qū)(編碼或不編碼蛋白質(zhì))以及包含多聚腺苷酸化位點的3’非翻譯區(qū)(3’UTR)。一般在植物細(xì)胞中，5’UTR、編碼區(qū)和3’UTR轉(zhuǎn)錄出一條RNA，如果是蛋白質(zhì)編碼基因，該RNA可翻譯成蛋白質(zhì)?；蚩梢园硗獾腄NA片段，例如內(nèi)含子。此處所用遺傳位點為指定基因在植物基因組上的位置。
當(dāng)涉及基因或DNA序列時，術(shù)語“嵌合”用于指該基因或DNA序列至少包含兩種功能相關(guān)的DNA片段(例如啟動子、5’UTR、編碼區(qū)、3’UTR、內(nèi)含子)，它們彼此間沒有天然關(guān)聯(lián)并起源于例如不同來源。當(dāng)涉及植物種類有關(guān)的基因或DNA序列時，“外源”用于指該基因或DNA序列非天然存在于該植物種類中。
此處所用術(shù)語“轉(zhuǎn)基因”是指摻入植物基因組的重組DNA分子。術(shù)語“重組DNA分子”用于例證并因而包括分離的核酸分子，該核酸分子可能是DNA并可通過重組或其它方法獲得。該重組DNA分子通常包含至少一個目的基因(例如嵌合基因)的至少一個拷貝，該目的基因能夠使轉(zhuǎn)化植物具備一種或多種特定的特征。“轉(zhuǎn)基因植物”是指其所有細(xì)胞的基因組中都包含轉(zhuǎn)基因的植物。
植物基因組中重組DNA分子的摻入一般源于細(xì)胞或組織的轉(zhuǎn)化(或者其它基因操作)。摻入的具體位點或出于隨機，或在預(yù)定位點(如果利用定點整合方法)。
轉(zhuǎn)基因可以通過重組DNA分子在植物基因組中摻入位點的位置和結(jié)構(gòu)進行鑒定。轉(zhuǎn)基因在植物基因組中的插入位點也稱為“插入位點”或“靶位點”。轉(zhuǎn)基因插入植物基因組可能與植物DNA的缺失相關(guān)聯(lián)，稱為“靶位點缺失”。此處所用“側(cè)翼區(qū)”或“側(cè)翼序列”是指植物基因組中至少20bp，優(yōu)選地至少50bp，甚至多達(dá)5000bp的序列，該序列位于轉(zhuǎn)基因上游或下游并與其緊密相鄰。使轉(zhuǎn)基因隨機整合的轉(zhuǎn)化方法會導(dǎo)致轉(zhuǎn)化子帶有不同的側(cè)翼區(qū)，該側(cè)翼區(qū)對每個轉(zhuǎn)化子都是特定并唯一的。當(dāng)利用傳統(tǒng)雜交方法將轉(zhuǎn)基因?qū)胫参飼r，其在植物基因組中的插入位點或其側(cè)翼區(qū)通常不會改變。此處所用“插入?yún)^(qū)”是指對應(yīng)于插入位點(及可能的靶位點缺失)所涉及區(qū)域以及(未轉(zhuǎn)化)植物基因組中轉(zhuǎn)基因的上游和下游側(cè)翼區(qū)的區(qū)域。
轉(zhuǎn)基因表達(dá)是指表達(dá)包含在轉(zhuǎn)基因中的目的基因，使得植物具有一種或多種表型特征(例如除草劑耐受性)，該表型特征是欲通過(基于部分或全部目的基因的結(jié)構(gòu)和功能)轉(zhuǎn)化中所用重組DNA分子-轉(zhuǎn)化DNA的導(dǎo)入而賦予的性狀。
事件定義為通過基因操作而攜帶包含目的基因至少一個拷貝的轉(zhuǎn)基因的(人工)遺傳位點。事件的一般等位基因狀態(tài)是存在或不存在轉(zhuǎn)基因，事件的表型特征在于轉(zhuǎn)基因表達(dá)。在遺傳水平上，事件是植物遺傳組成的一部分。在分子水平上，事件可由限制性圖譜(例如通過Southern印跡鑒定)，和/或轉(zhuǎn)基因的上游和/或下游側(cè)翼序列，和/或轉(zhuǎn)基因的分子結(jié)構(gòu)鑒定。利用包含至少一個目的基因的轉(zhuǎn)化DNA轉(zhuǎn)化植物，通常引發(fā)各自獨特的多個事件。
此處所用的種質(zhì)事件，是指選自基于轉(zhuǎn)基因表達(dá)和穩(wěn)定性以及與包含該轉(zhuǎn)基因的植物的最佳農(nóng)學(xué)特性的相容性，轉(zhuǎn)化同一轉(zhuǎn)化DNA而獲得的事件之一。因此，原種事件的選擇標(biāo)準(zhǔn)是下列一個或多個，優(yōu)選地兩個或多個，有利地所有下列特征a)轉(zhuǎn)基因的存在不干擾需要的其它植物特性，例如那些與農(nóng)學(xué)特性或商業(yè)價值有關(guān)的特性；b)該事件的特征在于具有確知的可穩(wěn)定遺傳的分子結(jié)構(gòu)，并可開發(fā)適當(dāng)?shù)蔫b別同一性對照的工具；c)轉(zhuǎn)基因中的目的基因在該事件的雜合(或半合子)及純合條件下，具有空間和時間上正確、適當(dāng)并穩(wěn)定的表型表達(dá)，在攜帶該事件的植物于常規(guī)農(nóng)業(yè)應(yīng)用中可能處于的環(huán)境條件范圍內(nèi)，具有商業(yè)上可接受的表達(dá)水平。
優(yōu)選地轉(zhuǎn)基因與植物基因組中允許漸滲入所需的商業(yè)遺傳背景的位置相關(guān)聯(lián)。
作為原種事件的事件的狀況可由該原種事件在不同的相關(guān)遺傳背景中的漸滲以及與上述標(biāo)準(zhǔn)，例如a)、b)和c)中的一個、兩個或全部的符合情況進行證實。
因而，“原種事件”涉及包含轉(zhuǎn)基因且符合上述標(biāo)準(zhǔn)的遺傳位點。植物、植物材料及其后代，例如種子，可以在其基因組中包含該原種事件。
所開發(fā)的用于鑒定原種事件或包含原種事件的植物或植物材料的“鑒定工具”，是基于該原種事件的特定基因組特性，例如包含轉(zhuǎn)基因和/或轉(zhuǎn)基因側(cè)翼區(qū)序列的基因組區(qū)域的特異性限制性圖譜。此處所用的“限制性圖譜”是指一套Southern印跡圖形，該圖形通過將植物基因組DNA用某一特定的限制性酶或一套限制性酶酶切并同與轉(zhuǎn)基因具有序列相似性的探針雜交(在特定條件下)而獲得。由于在轉(zhuǎn)基因插入前，植物基因組中存在(內(nèi)源的)限制性位點，而插入轉(zhuǎn)基因會改變該基因組的特異性限制性圖譜。因而，可通過一種或多種限制性圖形來鑒別由此獲得的特定的轉(zhuǎn)化子或其后代。用來確定某事件限制性圖譜的條件列于限制性圖譜鑒定方案中。
可替代地，可根據(jù)PCR鑒定方案的檢測來鑒定包含原種事件的植物或植物材料。該PCR使用可特異性識別該原種事件的引物。基本上應(yīng)用一套引物，它們可識別a)原種事件3’或5’側(cè)翼序列內(nèi)的序列以及b)外源DNA內(nèi)的序列，優(yōu)選地可擴增介于100和350個核苷酸之間的片段(整合片段)。優(yōu)選地，包含一套擴增該植物物種管家基因內(nèi)片段(優(yōu)選地長于所擴增的整合片段的片段)的引物作為對照。最適PCR條件，包括特定的引物序列列在PCR鑒定方案中。
術(shù)語“相似性”，例如涉及核苷酸序列時，是指兩個序列間同源性的定量測量。序列相似性百分比計算為(Nref-Ndif)*100/Nref，其中Ndif是比對時兩個序列中不一致殘基的總數(shù)，Nref是序列之一的殘基數(shù)。因此，DNA序列AGTCAGTC與DNA序列AATCAATC的序列相似性為75％(Nref＝8；Ndif＝2)。本發(fā)明包含具有與此處公開序列有至少65％，例如至少70％，例如至少75％，或至少80％，或有利地至少85％，例如至少90％，至少95％或甚至97％或100％相似性的序列的核酸分子；以及包含這樣的核酸分子的植物、細(xì)胞、組織、種子和其后代(例如稻植物、細(xì)胞、組織、種子和其后代)。可替代地或另外地，涉及序列的“相似性”是指按照Wilbur和Lipwann算法(Wilbur和Lipman，1983 PNAS USA80726)，將相同核苷酸的位點數(shù)目除以比對的兩個序列中較短序列的核苷酸數(shù)目，所用的窗口大小為20個核苷酸，字節(jié)長度為4個核苷酸，缺口罰分為4，利用IntelligeneticsTMSuite程序(IntelligeneticsInc.CA)可便利地對包含比對的序列數(shù)據(jù)進行計算機輔助分析和解釋?！盎鞠嗨啤钡男蛄芯哂兄辽偌s75％，有利地至少約80％，例如至少約85％，優(yōu)選地至少約90％，特別地約95％，例如至少約97％，特別地約100％的相似性或同一性。很明顯，當(dāng)RNA序列被稱為與DNA序列基本相似或相似，或者具有一定程度的同一性時，認(rèn)為DNA序列中的胸腺嘧啶(T)等同于RNA序列中的尿嘧啶(U)。
本發(fā)明涉及在稻中產(chǎn)生原種事件GAT-OS2以及源自該事件的植物、植物細(xì)胞或植物材料。包含原種事件GAT-OS2的植物，是通過如實施例1所述轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pB5/35Sbar(SEQ ID No8)的1501bp PvuI-HindIII片段獲得的。用于產(chǎn)生該原種事件的重組DNA分子，包含編碼膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶和花椰菜花葉病毒35S啟動子的DNA序列，其中編碼膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶的序列位于花椰菜花葉病毒35S啟動子控制之下(命名為“35S-bar基因”)。該35S啟動子在稻中具有“組成型”的表達(dá)形式(Battraw等人，1990，plant Mol Biol 15527-538)，意味著其在植物大部分的生命周期、大多數(shù)的植物細(xì)胞類型中均顯著表達(dá)。稻植物中35S-bar基因的表達(dá)，可賦予其對除草劑化合物膦絲菌素，或雙丙氨酰膦，或草銨膦，或更一般的谷氨酰胺合成酶抑制劑，或者其鹽或旋光異構(gòu)體的耐受性。
包含GAT-OS2的植物或植物材料可按照如此處實施例3b)(1)所述的限制性圖譜鑒定方案進行鑒定。簡要地，稻基因組DNA經(jīng)選自以下EcoRI、BamHI、EcoRV、HindIII、NcoI、NsiI的限制性酶(優(yōu)選地至少1種，例如至少2種，有利地至少3種，或至少4種，或至少5種，例如3-6種)消化，然后轉(zhuǎn)到尼龍膜上，與質(zhì)粒pB5/35Sbar的約1327bp的EcoRI片段雜交，然后就所用的限制性酶確定是否能鑒定出下列片段-EcoRI一條介于約1159和約1700bp之間的片段，優(yōu)選地約1327bp；
-BamHI一條介于約1700和約2140bp之間的片段，優(yōu)選地約2，0kbp，和一條介于約805和約1093bp之間的片段，優(yōu)選地約805bp；-EcoRV一條大于約5077bp的片段，優(yōu)選地約12kbp，和一條介于約2838和約4507bp之間的片段，優(yōu)選地約3，8kbp；-HindIlI一條介于約5077和約11497bp之間的片段，優(yōu)選地約5，3kbp；-NcoI兩條均介于約2838和約4507bp之間的片段，優(yōu)選地一條約4，1kbp，另一條約3，1kbp；-NsiI一條介于約4749和約11497bp之間的片段，優(yōu)選地約5，1kbp。
DNA片段長度通過與一套已知長度的DNA片段相比較來決定，具體而言是噬菌體lambda DNA的PstI片段。
在使用至少1種，例如至少2種，有利地至少3種，優(yōu)選地至少4種，特別地至少5種，更優(yōu)選地所有的這些限制性酶進行消化以后，如果植物材料能產(chǎn)生與上述相同長度的DNA片段，可確定該稻植物帶有原種事件GAT-OS2。
包含GAT-OS2的植物或植物材料也可根據(jù)此處實施例3b)(2)所述PCR鑒定方案進行鑒定。簡要地，利用PCR擴增稻基因組DNA，所用一條引物可特異性識別GAT-OS2的側(cè)翼序列，具體而言為具有SEQ ID No5序列的引物，另一條引物可識別轉(zhuǎn)基因內(nèi)序列，具體而言為具有SEQID No 4序列的引物。稻的內(nèi)源性引物用作對照。如果植物材料能產(chǎn)生一條介于約290和約350bp之間、優(yōu)選地約313bp的片段，可確定該稻植物攜帶有原種事件GAT-OS2。
帶有GAT-OS2的植物也可通過其草銨膦耐受性鑒定。在本發(fā)明的上下文中，其包含耐受除草劑LibertyTM的植物。LibertyTM耐受性定義為在3-4葉期(3V-4V)，每公頃至少使用200g(g.a.i./ha)，優(yōu)選地400g.a.i./ha，以及可能高達(dá)1600g.a.i./ha的活性成分，而不殺傷植物的標(biāo)準(zhǔn)。帶有GAT-OS2的植物還可通過其細(xì)胞中經(jīng)PAT分析(DeBlock等人，1987，上文)確認(rèn)存在膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶而鑒定。
帶有GAT-OS2的植物可以，例如得自存放于ATCC編號為ATCC203352的種子。該植物可進一步繁殖和/或用于常規(guī)育種方法，以生產(chǎn)具有相同特征的轉(zhuǎn)化植物，或者將本發(fā)明的原種事件引入相同植物物種的其它栽培品種。得自該植物的種子包含穩(wěn)定摻入其基因組的原種事件。
本發(fā)明的稻植物能以傳統(tǒng)方式栽培，轉(zhuǎn)基因的存在可確保其耐受草銨膦。因此，在生長該稻植物的田間，可以通過應(yīng)用包含草銨膦為活性成分的除草劑(例如LibertyTM)來控制雜草。
攜帶有GAT-OS2的植物也可通過具有與下列美國市面上可買到的稻品種Priscilla、Cypress、Bengal、Cocadrie、Jefferson、Madison、M202、M201、M103、Drew、Kaybonnet、Lagrue可相比的農(nóng)學(xué)特性進行鑒定，相關(guān)的農(nóng)學(xué)特性是植物高度、桿強度/硬度、抗倒伏、葉片形態(tài)(長度、寬度以及劍葉角度)、成熟時間、小花形態(tài)、園錐花序育性、種莢全閉合、谷粒大小和形狀以及谷物產(chǎn)量和產(chǎn)率。
已經(jīng)注意到，在稻植物基因組中該區(qū)域，更具體而言在稻植物基因組中該位點存在該轉(zhuǎn)基因，使該事件具有特別有利的表型和分子特征。更準(zhǔn)確地說，在基因組該特定位點存在轉(zhuǎn)基因，可導(dǎo)致該轉(zhuǎn)基因穩(wěn)定的表型表達(dá)，而不損害該植物任何方面的預(yù)期農(nóng)學(xué)特性。因而，對應(yīng)SEQ ID No 9的插入?yún)^(qū)域，更具體而言其GAT-OS2的插入位點，被證明特別適于引入目的基因，例如除草劑抗性基因，更準(zhǔn)確地說，是位于35S啟動子控制下的編碼膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶的基因，具體而言是質(zhì)粒pB5/35Sbar的PvuI-HindIII片段。
重組DNA分子能夠通過定點插入方法特異性地插入該插入?yún)^(qū)。該方法為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知，包含比如使用重組酶的同源重組，例如但不局限于來自釀酒酵母(Saccharomyces cervisiae)的FLP重組酶(美國專利5,527,695)，或來自大腸桿菌(Escherichia coli)P1噬菌體的CRE重組酶(PCT申請公開WO9109957)，或來自魯氏酵母(Saccharomyces rouxii)pSRI的重組酶(Araki等人，1985，JMolBiol 182191-203)，或例如美國專利4,673,640所述的lambda噬菌體重組系統(tǒng)。
能夠利用包括電穿孔方法、DNA包裹的金微粒轟擊或生物彈射擊法(biolistic methods)、或者農(nóng)桿菌或聚乙二醇介導(dǎo)法等技術(shù)，將DNA插入植物基因組，例如稻基因組。
此處所用“包含”可解釋為詳細(xì)說明陳述的特征、整數(shù)、步驟或成分的存在，但不排除存在或增加一個或多個特征、整數(shù)、步驟或成分，或其組合。因而，例如包含核苷酸或氨基酸序列的核酸或蛋白質(zhì)，可能包含比實際列舉的更多的核苷酸或氨基酸，即包含在更大的核酸或蛋白質(zhì)中。包含結(jié)構(gòu)或功能上定義的DNA序列的嵌合基因，可以包含另外的DNA序列以及其它。
下列實施例描述了帶有原種事件GAT-OS2的稻植物的開發(fā)和特征。
除非另有說明，所有的重組DNA技術(shù)均按照如下所述標(biāo)準(zhǔn)方案進行Sambrook等人(1989)分子克隆實驗室手冊，第二版，冷泉港實驗室出版社，紐約，以及Ausubel等人(1994)通用分子生物學(xué)方案，通用方案，卷1和2，美國。在英國BIOS科學(xué)出版有限公司(英國)和布萊克威爾科學(xué)出版社出版的“Plant Molecular BiologyLabfax(1993)”中描述了標(biāo)準(zhǔn)的植物分子操作的材料和方法。
在詳述和實施例中引用了下列序列SEQ ID NO 1包含GAT-OS2 5’側(cè)翼區(qū)的序列SEQ ID NO 2包含GAT-OS2 3’側(cè)翼區(qū)的序列SEQ ID NO 3包含GAT-OS2插入位點的序列
SEQ ID NO 4OSA03PCR鑒定方案的引物SEQ ID NO 5OSA04PCR鑒定方案的GAT-OS2-特異性引物SEQ ID NO 6OSA01稻內(nèi)源性引物SEQ ID NO 7OSA02稻內(nèi)源性引物SEQ ID NO 8質(zhì)粒pB5/35SbarSEQ ID NO 9插入?yún)^(qū)
b)轉(zhuǎn)化稻Bengal品種是由路易斯安那農(nóng)業(yè)實驗局稻研究站培育的中粒稻，正式推廣于1992年，譜系包含MARS和M201(Linscombe S.D.等人，1993，作物科學(xué)(Crop Science)33645-646)。
采用DNA直接轉(zhuǎn)移方法，將pB5/35Sbar的1501bp PvuI-HindIII片段轉(zhuǎn)化稻。各階段均用膦絲菌素(PPT)選擇，幼苗再生除外，其中無PPT以促進其生長。這樣產(chǎn)生一批初級轉(zhuǎn)化子(T0代植物)。
實施例2事件的產(chǎn)生
a)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因純合系各種T0代半合子幼苗從組織培養(yǎng)過渡后，轉(zhuǎn)到溫室土壤，使其開花、結(jié)籽。評估幼苗的繁殖力、結(jié)實性以及對草銨膦的耐受性。選擇19株植物作進一步分析。從這些植物收集自交產(chǎn)生的T1代種子，在田間生長。用LibertyTM除草劑噴灑T1代植物，每公頃800g活性成分(g.a.i/ha；推薦給農(nóng)民的劑量是400g.a.i/ha)。選擇應(yīng)用除草劑后存活的、除草劑耐受性以3∶1分離的事件，作進一步鑒定，評價對耐受植物的損傷(葉尖灼傷)。
于全部所選事件的耐受性植物的圓錐花序收集T2代種子，成行播種，用LibertyTM除草劑噴灑(1600g.a.i/ha)T2代植物，以鑒定其除草劑耐受性的分離。選擇那些100％存活，因而相當(dāng)于轉(zhuǎn)基因純合系的行，再鑒定其除草劑損傷和表型特性。根據(jù)在圓錐花序行內(nèi)的表型一致性進一步進行事件的選擇(所需的特征)。
b)轉(zhuǎn)基因事件的鑒定-GAT-OS2的選擇轉(zhuǎn)基因事件通過Southern印跡圖譜，一般表型和農(nóng)學(xué)特性，以及產(chǎn)量進一步鑒定，適宜時在田間條件下確定這些特征。
Southern印跡分析采用標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡分析方法，通過用EcoRV酶切消化稻基因組DNA，與pB5/35Sbar的1327bp EcoRI片段雜交，檢測轉(zhuǎn)基因的存在。相對帶強度可指示植物在轉(zhuǎn)基因位點是純合還是半合子。發(fā)現(xiàn)兩個事件有簡單的插入，其轉(zhuǎn)基因的分離模式可以通過孟德爾單位點遺傳來解釋證實了這一點。
植物一般表型和農(nóng)學(xué)特性鑒定T1和T2代植物的多種表型性狀，包括植株高度、稻桿強度/硬度、倒伏傾向、葉片形態(tài)(太細(xì)或劍葉角度不正確)、晚熟、小花構(gòu)造、園錐花序不育或育性不完全、種子谷殼不完全閉合(可導(dǎo)致疾病易感性提高)、谷粒大小和形狀以及谷物產(chǎn)量和產(chǎn)率。各系經(jīng)鑒定，其顯示的農(nóng)學(xué)特性較之未轉(zhuǎn)化的Bengal栽培品種以及下列稻品種Priscilla，Cypress，Cocadrie，Jefferson，Madison，M202，M201，M103，Drew，Kaybonnet，Lagrue相似(或有所改良)。有時，園錐花序行內(nèi)的植物因為體細(xì)胞克隆變異而使上述一種或多種性狀發(fā)生分離。除非這會導(dǎo)致引入具有商業(yè)利用價值的表型性狀，否則舍棄這些植物。
產(chǎn)量評估的田間試驗從選擇的純合群體中大批收集T2代種子，與Bengal品種標(biāo)準(zhǔn)比較。將該種子在代表每一事件的獨立地塊中成行種植。轉(zhuǎn)基因地塊用1,600g.a.i/ha的LibertyTM除草劑噴灑或者不噴灑(“未噴灑”地塊)，未轉(zhuǎn)基因品種標(biāo)準(zhǔn)的地決不噴灑LibertyTM。所有地塊均使用標(biāo)準(zhǔn)除草劑處理，以控制本地雜草。
在不同地域?qū)D(zhuǎn)基因事件進行產(chǎn)量性狀的測試，包括Louisiana和Puerto Rico(冬季苗圃)。
完成農(nóng)學(xué)參數(shù)的統(tǒng)計分析以及植物形態(tài)學(xué)和其它非參數(shù)數(shù)據(jù)的秩統(tǒng)計，并與親代品種、Bengal以及下列稻品種Priscilla，Cypress，Cocadrie，Jefferson，Madison，M202，M201，M103，Drew，Kaybonnet，Lagrue比較，鑒定最具商業(yè)價值的侯選品種。在產(chǎn)生一系列育種系方面，GAT-OS2事件最具實用性。
實施例3GAT-OS2事件的鑒定a)位點的分子和遺傳深入分析一旦GAT-OS2事件鑒定為轉(zhuǎn)基因表達(dá)及全面農(nóng)學(xué)特性最佳的事件，即在分子水平詳細(xì)分析其轉(zhuǎn)基因位點，包括詳細(xì)的Southern印跡分析和轉(zhuǎn)基因側(cè)翼區(qū)域序列分析。
(1)使用多個限制酶進行Southern印跡分析從轉(zhuǎn)基因及對照植物中收集葉片組織，參照Dellaporta等人(1983，植物分子生物學(xué)報告(Plant Molecular Biology Reporter)，1，vol.3，p.19-21)從葉片組織中分離總基因組DNA，在分光光度計中波長260nm處測量光密度，確定每個樣品的DNA濃度。
應(yīng)用制造商建議的條件，在40ul終反應(yīng)體積中對10ug基因組DNA進行限制性酶切。調(diào)整酶切時間和/或限制酶用量，以保證基因組DNA樣品酶切完全，而無非特異性降解。酶切后，在酶切的DNA樣品中加入4ul載樣染料，上樣于1％瓊脂糖凝膠。
下列對照DNA也上樣于該凝膠-由未轉(zhuǎn)基因稻植物制備的基因組DNA，用于陰性對照。該陰性對照用于證實無雜交背景。
-DNA陽性對照Oryza sativa基因組整合有雜合的單拷貝轉(zhuǎn)基因，10ug基因組DNA的分子數(shù)相當(dāng)于±19pg1501bp的pB5/35Sbar DNAPvuI-HindIII片段(Oryza sativa二倍體基因組大小0.8x109bp)。將代表每基因組一個質(zhì)?？截惖臄?shù)量，加入1ug酶解的未轉(zhuǎn)基因Oryzasativa DNA中。該重新組成的樣品用于表明雜交在允許探針與靶序列雜交的條件下完成。
用PstI消化噬菌體Lambda DNA(Clind 1 ts 857 Sam 7株，LifeTechnologies)，用作分子量標(biāo)準(zhǔn)。
電泳后，將DNA樣品(消化的稻基因組DNA、對照以及分子量標(biāo)準(zhǔn)DNA)通過毛細(xì)印跡12-16小時轉(zhuǎn)到尼龍膜上。用于探針制備的DNA模板通過EcoRI限制性酶切質(zhì)粒pB5/35Sbar制備，產(chǎn)生的1327bp DNA片段包含轉(zhuǎn)化DNA的相關(guān)部分(1501bpPvuI-HindIII片段)。純化后參照標(biāo)準(zhǔn)方法標(biāo)記該DNA片段，用于與膜雜交。
在標(biāo)準(zhǔn)的嚴(yán)謹(jǐn)條件下進行雜交標(biāo)記的探針在95-100℃水浴中加熱5-10分鐘變性，冰上驟冷5-10分鐘，加入雜交液(6xSSC(20xSSC為3.0M NaCl，0.3M檸檬酸鈉，pH7.0)，5xDenhardt’s(100xDenhardt’s＝2％Ficoll，2％聚乙烯吡咯烷酮，2％牛血清白蛋白)，0.5％SDS和20ug/ml變性的載體DNA(單鏈魚精DNA，平均長度為120-3000核苷酸))。65℃雜交過夜，用洗滌溶液(2xSSC，0.1％SDS)65℃20-40分鐘洗膜3次。
對放射自顯影進行電子掃描用不同的限制性酶消化GAT-OS2基因組DNA，由此獲得的限制性圖譜列于圖1，匯總于表1。
表1GAT-OS2的限制性圖譜
(*)這些片段的長度是由pB5/35S的1501bpPvuI-HindIII片段的限制性圖譜預(yù)測得來。
(2)鑒定側(cè)翼序列利用Liu等人所述熱不對稱交錯(thermal asymmetricinterlaced，TAIL-)PCR方法(1995，植物雜志(The Plant Journal)8(3)457-463)，測定GAT-OS2事件中插入轉(zhuǎn)基因的側(cè)翼區(qū)序列。該方法利用連續(xù)反應(yīng)中的3個特異性嵌套引物和1個較短的隨機簡并(AD)引物，這樣可以熱控特異性與非特異性產(chǎn)物的相對擴增效率。根據(jù)退火條件，選擇與轉(zhuǎn)基因邊界退火的特異性引物。用1％瓊脂糖凝膠分析小量(5ul)未純化的次級和三級PCR產(chǎn)物。三級PCR產(chǎn)物用于制備性擴增、純化并在自動測序儀上利用DyeDeoxy Terminator cycle試劑盒測序。
1.HindIII位點的TAIL-PCR所用引物是
其中N＝A，C，T或g；W＝A或T利用MDB556-MDB411擴增的片段約400bp，其中113bp已測序(5’側(cè)翼SEQ ID NO 1)。介于bp1和bp92之間的序列包含植物DNA，而介于bp93和bp113之間的序列對應(yīng)pB5/35Sbar DNA。
2.PvuI位點的TAIL-PCR所用引物是
其中N＝A，C，T或g；S＝C或g；W＝A或T利用MDB285-MDB410擴增的片段約1200bp(3’側(cè)翼SEQ ID NO 2)。介于bp1和bp604之間的序列對應(yīng)pB5/35Sbar DNA，而介于bp605和bp1279之間的序列包含植物DNA。
(3)鑒定靶位點缺失使用對應(yīng)野生型Oryza sativa上轉(zhuǎn)基因側(cè)翼區(qū)內(nèi)序列的引物，以Bengal品種為模板，鑒定轉(zhuǎn)基因的插入位點。
使用下列引物序列(5’→3’) 在5’側(cè)翼區(qū)內(nèi) 在3’側(cè)翼區(qū)內(nèi)的位置(SEQ ID 的位置(SEQ IDNO1) NO2)YTP059 TCg.gAC.AAC.CgC.gAT.AgT.TCg56→76 -----OSA04 TCg.CAT.ATg.TAT.gTA.ACA.CgC----- 717→697這樣得到168bp的片段(SEQ ID NO 3)，其中bp 38-55對應(yīng)靶位點缺失。
因而，所測序的完整的稻插入?yún)^(qū)域(SEQ ID NO 9)包含1-92 5’側(cè)翼區(qū) SEQ ID NO 1的bp1-9293-110靶位點缺失SEQ ID NO 3的bp38-55111-785 3’側(cè)翼區(qū) SEQ ID NO 2的bp605-1279(4)位點的遺傳分析對幾個世代的子代植物進行分子和表型分析，檢查插入片段的遺傳穩(wěn)定性。
比較T0、T1和T2代GAT-OS2稻植物的草銨膦抗性植株的Southern印跡分析，發(fā)現(xiàn)是相同的，證明包含GAT-OS2的植物中轉(zhuǎn)基因的分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。
GAT-OS2事件在至少3個后續(xù)世代中展示轉(zhuǎn)基因單遺傳位點孟德爾分離，表明插入片段是穩(wěn)定的。
根據(jù)以上結(jié)論，確定GAT-OS2為原種事件。
b)開發(fā)同一性對照的診斷工具開發(fā)以下方案，以鑒定任何包含原種事件GAT-OS2的任何稻植物材料。
(1)GAT-OS2原種事件限制性圖譜鑒定方案包含原種事件GAT-OS2的稻植物基本上可利用如實施例3a)(1)所述的Southern印跡進行鑒定。這樣，稻基因組DNA 1)用至少3種，優(yōu)選地至少4種，特別地至少5種，更特別地所有的下列限制性酶EcoRI、BamHI、EcoRV、HindIII、NcoI、NsiI進行消化，2)轉(zhuǎn)移至尼龍膜上，3)與質(zhì)粒pB5/35Sbar的1327bp EcoRI片段雜交。如果就所用的每一種限制性酶而論，能鑒定出與表1所列相同長度的DNA片段，則確認(rèn)該稻植物帶有原種事件GAT-OS2。
(2)GAT-OS2原種事件聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)鑒定方案在嘗試篩選未知物之前，必須用各種合適的對照做反應(yīng)測試。本方案可能需要優(yōu)化各實驗室間有差別的組分(模板DNA樣品、Taq DNA聚合酶、引物質(zhì)量、dNTP、熱循環(huán)儀等)在本方案中內(nèi)源性序列的擴增具有重要作用。必須獲得能夠等摩爾量擴增已知轉(zhuǎn)基因的基因組DNA模板中的內(nèi)源性及轉(zhuǎn)基因序列的PCR和熱循環(huán)條件。根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳判斷，只要未擴增出內(nèi)源性靶片段，或者擴增出的靶序列溴乙錠染色強度不相同，就必須優(yōu)化PCR條件。
模板DNA依照Edwards等人方法(核酸研究，19，p1394，1991)制備模板DNA。使用其它方法制備的DNA時，應(yīng)該用不同的模板量做反應(yīng)測試，通常50ng基因組模板DNA的結(jié)果最好。
指定陽性和陰性對照PCR測試中應(yīng)包括以下陽性和陰性對照
-Master Mix對照(DNA陰性對照)，是不加DNA的PCR反應(yīng)。如果觀察到無PCR產(chǎn)物的預(yù)期結(jié)果，表明PCR混合物沒有靶DNA污染。
-DNA陽性對照(已知包含轉(zhuǎn)基因序列的基因組DNA樣品)，成功擴增該陽性對照表明，此PCR是在允許擴增靶序列的條件下運行的。
-野生型DNA對照，該PCR中提供的模板DNA是由未轉(zhuǎn)基因植物制備的基因組DNA。如果觀察到?jīng)]有擴增出轉(zhuǎn)基因PCR產(chǎn)物、而擴增出內(nèi)源性PCR產(chǎn)物的預(yù)期結(jié)果，表明在基因組DNA樣品中沒有可檢測到的轉(zhuǎn)基因背景擴增。
引物使用下列特異性識別轉(zhuǎn)基因以及GAT-OS2側(cè)翼序列的引物OSA035’-gAC.TCT.gTA.TgA.ACT.gTT.CgC-3’(SEQ ID 4)(靶P35S)OSA045’-TCg.CAT.ATg.TAT.gTA.ACA.CgC-3’(SEQ ID 5)(靶植物DNA)PCR混合物中始終包括針對內(nèi)源性序列的引物，該引物在未知樣品和DNA陽性對照中用作內(nèi)部參照。使用內(nèi)源性引物對獲得陽性結(jié)果說明，在基因組DNA制劑中有適當(dāng)質(zhì)量的豐富DNA，足以生成PCR產(chǎn)物。所用內(nèi)源性引物是OSA015’-gAT.CAg.TgC.Agg.CAA.TAC.Tgg-3’(SEQ ID 6)(磷脂酶D基因Acc.No.AB001919，3836→3856)OSA025’-TTC.CTA.ACA.TgT.ggg.TgT.Cg-3’ (SEQ ID 7)(磷脂酶D基因Acc.No.AB001919，4291→4272)擴增片段PCR反應(yīng)預(yù)期的擴增片段是引物對OSA01-OSA02457bp(內(nèi)源性對照)引物對OSA03-OSA04313bp(GAT-OS2原種事件)PCR條件50ul PCR反應(yīng)混合物包含5ul模板DNA5ul 10x擴增緩沖液(與Taq聚合酶一起提供)1ul 10mM dNTP1ul OSA01(10pmole/ul)1ul OSA02(10pmole/ul)2ul OSA03(10pmole/ul)2ul OSA04(10pmole/ul)0.2ul Taq DNA聚合酶(5單位/ul)加水至50ul達(dá)到最佳結(jié)果的熱循環(huán)程序見下95℃4分鐘然后 95℃1分鐘57℃1分鐘72℃2分鐘5個循環(huán)然后 92℃30秒
57℃30秒72℃1分鐘22-25個循環(huán)然后72℃5分鐘凝膠電泳分析將10-20ul PCR樣品及適當(dāng)?shù)姆肿恿繕?biāo)志(例如100bp階梯，PHAMACIA)上樣1.5％瓊脂糖凝膠(Tris-硼酸鹽緩沖液)。
結(jié)果確認(rèn)不接受轉(zhuǎn)基因植物DNA樣品經(jīng)單一PCR反應(yīng)和單一PCR混合物獲得的數(shù)據(jù)，除非1)DNA陽性對照顯示預(yù)期的PCR產(chǎn)物(轉(zhuǎn)基因的以及內(nèi)源性的片段)，2)DNA陰性對照沒有PCR擴增(無片段)以及3)野生型DNA對照顯示預(yù)期結(jié)果(擴增出內(nèi)源性片段)。
有可見量預(yù)期大小的轉(zhuǎn)基因及內(nèi)源性PCR產(chǎn)物的泳道，表明制備基因組DNA模板的相應(yīng)植物已經(jīng)遺傳了GAT-OS2原種事件。無可見量轉(zhuǎn)基因PCR產(chǎn)物、而有可見量內(nèi)源性PCR產(chǎn)物的泳道，表明制備基因組DNA模板的相應(yīng)植物不包含該原種事件。無可見量轉(zhuǎn)基因PCR產(chǎn)物及內(nèi)源性PCR產(chǎn)物的泳道，表明基因組DNA的質(zhì)量和/或數(shù)量不能供PCR產(chǎn)物生成，不計數(shù)這樣的植物。應(yīng)該重新制備其基因組DNA，并且必須使用適當(dāng)?shù)膶φ罩匦逻\行PCR。
使用可區(qū)分PCR方案鑒定GAT-OS2依照上述方案檢驗包含不同轉(zhuǎn)基因事件的稻植物葉片材料，將來自M202野生型以及Bengal野生型的樣品作為陰性對照。
圖2所示為PCR分析的結(jié)果，確認(rèn)樣品8和9(它們實際上包含來源于相同事件的植物的DNA)包含原種事件GAT-OS2，檢驗的所有其它品系均不包該原種事件。
實施例4GAT-OS2基因漸滲入優(yōu)選的栽培品種通過反復(fù)回交將原種事件GAT-OS2引入下列栽培品種-California Temperate Japonicas(例如但不局限于M204，M202，M201，M103)-California Tropical Japonicas(例如但不局限于L201，L202)-Japanese and Korean Temperate Japonicas(例如但不局限于Koshihikari和Milyang)-Australian Temperate Japonicas(例如但不局限于Millin和Jarrah)-Mediterranean Temperate Japonicas(例如但不局限于Ballila、Arborio)-Chinese Indicas(例如但不局限于Guichao、Congui 314、Teqing)-Southern United State Tropical Japonicas，長粒(例如但不局限于Drew、Cypress、Jefferson、Priscilla、Cocadrie)-Southern United State Tropical Japonicas，中粒(例如但不局限于Bengal、Mars、Brazos、Mercury)-South American Tropical Japonicas，長粒(例如但不局限于E1 Paso144、IRGA409)-遠(yuǎn)東basmati和jasmine類型(Kasmir、Kwao Dak Mali)-非洲javanica類型(bulu稻)觀察到該原種事件基因漸滲入這些栽培品種，對其需要的表型或農(nóng)學(xué)特性沒有顯著影響(無連鎖累贅)，而由草銨膦耐受性確認(rèn)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，達(dá)到了商業(yè)上可接受的水平，這證實GAT-OS2事件為原種事件。
除非另外明確指出，術(shù)語“植物”如同以下權(quán)利要求所用一樣，是用來包括位于任何成熟期的植物組織，以及任何取自或源于該植物的細(xì)胞、組織或器官，包括但不局限于任何種子、葉、莖、花、根、單細(xì)胞、配子、細(xì)胞培養(yǎng)物、組織培養(yǎng)物或原生質(zhì)體。
包含原種事件GAT-OS2的種子以GAT-OS2存放在ATCC，編號為ATCC203352。
權(quán)利要求
1.轉(zhuǎn)基因的草銨膦耐受性稻植物、細(xì)胞、組織或種子，其特征在于a)所述植物、細(xì)胞、組織或種子的基因組DNA能夠產(chǎn)生至少3種限制性片段或限制性片段對，其中所述限制性片段或限制性片段對選自下組i)一條EcoRI片段，其長度介于約1159和約1700bp之間；ii)一對BamHI片段，其一長度介于約805和約1093bp之間，另一長度介于約1700和約2140bp之間；iii)一對EcoRV片段，其一長度介于約2838和約4507bp之間，另一長度超過約5077bp；iv)一條HindIII片段，其長度介于約5077和約11497bp之間；v)一對NcoI片段，二者長度均介于約2838和約4507bp之間；vi)一條NsiI片段，其長度介于約4749和約11497bp之間；其中所述限制性片段在標(biāo)準(zhǔn)的嚴(yán)謹(jǐn)條件下，均能夠與約1327bp的下述片段雜交，該片段可由EcoRI消化具有SEQ ID No 8核苷酸序列的質(zhì)粒獲得；和/或，b)從所述植物、細(xì)胞、組織或種子的基因組DNA，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，使用分別具有SEQ ID No 4和SEQ ID No 5的核苷酸序列的兩條引物，能夠擴增出一條介于290和350bp之間，優(yōu)選地約313bp的DNA片段。
2.如權(quán)利要求1所述的植物、細(xì)胞、組織或種子，其特征在于從所述植物、細(xì)胞、組織或種子的基因組DNA，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，使用分別具有SEQ ID No 4和SEQ ID No 5的核苷酸序列的兩條引物，能夠擴增出一條介于290和350bp之間，優(yōu)選地約313bp的DNA片段。
3.如權(quán)利要求1所述的植物、細(xì)胞、組織或種子，其特征在于所述植物、細(xì)胞、組織或種子的基因組DNA能夠產(chǎn)生至少3種限制性片段或限制性片段對，其中所述限制性片段或限制性片段對選自下組i)一條EcoRI片段，其長度介于約1159和約1700bp之間；ii)一對BamHI片段，其一長度介于約805和約1093bp之間，另一長度介于約1700和約2140bp之間；iii)一對EcoRV片段，其一長度介于約2838和約4507bp之間，另一長度超過約5077bp；iv)一條HindIII片段，其長度介于約5077和約11497bp之間；v)一對NcoI片段，二者長度均介于約2838和約4507bp之間；vi)一條NsiI片段，其長度介于約4749和約11497bp之間；其中所述限制性片段在標(biāo)準(zhǔn)的嚴(yán)謹(jǐn)條件下，均能夠與約1327bp的下述片段雜交，該片段可由EcoRI消化具有SEQ ID No 8核苷酸序列的質(zhì)粒而獲得。
4.如權(quán)利要求3所述的植物、細(xì)胞、組織或種子，其特征在于所述植物、細(xì)胞、組織或種子的基因組DNA能夠產(chǎn)生至少4種選自所述組的限制性片段或限制性片段對。
5.如權(quán)利要求4所述的植物、細(xì)胞、組織或種子，其特征在于所述植物、細(xì)胞、組織或種子的基因組DNA能夠產(chǎn)生至少5種選自所述組的限制性片段或限制性片段對。
6.如權(quán)利要求5所述的植物、細(xì)胞、組織或種子，其特征在于所述植物、細(xì)胞、組織或種子的基因組DNA能夠產(chǎn)生6種選自所述組的限制性片段或限制性片段對。
7.如權(quán)利要求3-6中任一項所述的植物、細(xì)胞、組織或種子，其特征還在于從所述植物、細(xì)胞、組織或種子的基因組DNA，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，使用分別具有SEQ ID No 4和SEQ ID No 5的核苷酸序列的兩條引物，能夠擴增出一條介于290和350bp之間，優(yōu)選地約313bp的DNA片段。
8.由存放于ATCC，編號為ATCC 203352的種子長成的植物。
9.如權(quán)利要求8所述植物的細(xì)胞或組織。
10.存放于ATCC、編號為ATCC 203352的種子。
11.如權(quán)利要求1-7中任一項所述的轉(zhuǎn)基因的草銨膦耐受性稻植物，該稻植物可通過由存放于ATCC編號為ATCC 203352的種子長成的稻植物，經(jīng)過繁殖和/或育種而得到。
12.稻植物的栽培方法，該方法包含培養(yǎng)如權(quán)利要求1-8中任一項所述的植物。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，該方法另外包含應(yīng)用以草銨膦為活性成分的除草劑處理栽培稻植物。
14.稻育種方法，該方法包含與如權(quán)利要求1-8中任一項所述的植物雜交。
15.生產(chǎn)稻植物轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的方法，該方法包含將重組DNA分子插入特征在于具有SEQ ID No 9序列的稻細(xì)胞染色體DNA部分內(nèi)。
16.可通過如權(quán)利要求15所述方法獲得的稻植物轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。
17.生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因稻植物的方法，該方法包含將重組DNA分子插入特征在于具有SEQ ID No 9序列的稻細(xì)胞染色體DNA部分內(nèi)，以及從轉(zhuǎn)化的稻細(xì)胞再生出稻植物。
18.可通過如權(quán)利要求17所述方法獲得的轉(zhuǎn)基因稻植物。
19.鑒定其中包含原種事件GAT-OS2的轉(zhuǎn)基因植物或細(xì)胞或組織的方法，該方法包含鑒定以下一種或兩種特性a)所述植物、細(xì)胞、組織或種子的基因組DNA能夠產(chǎn)生至少3種選自下組的限制性片段或限制性片段對i)一條EcoRI片段，其長度介于約1159和約1700bp之間；ii)一對BamHI片段，其一長度介于約805和約1093bp之間，另一長度介于約1700和約2140bp之間；iii)一對EcoRV片段，其一長度介于約2838和約4507bp之間，另一長度超過約5077bp；iv)一條HindIII片段，其長度介于約5077和約11497bp之間；v)一對NcoI片段，二者長度均介于約2838和約4507bp之間；vi)一條NsiI片段，其長度介于約4749和約11497bp之間；其中所述限制性片段在標(biāo)準(zhǔn)的嚴(yán)謹(jǐn)條件下，均能夠與約1327bp的下述片段雜交，該片段可由EcoRI消化具有SEQ ID No 8核苷酸序列的質(zhì)粒而獲得；和/或，b)從所述植物、細(xì)胞、組織或種子的基因組DNA，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，使用分別具有SEQ ID No 4和SEQ ID No 5的核苷酸序列的兩條引物，能夠擴增出一條介于290和350bp之間的DNA片段。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，該方法包含確認(rèn)所述轉(zhuǎn)基因植物或其細(xì)胞或組織的基因組DNA能否產(chǎn)生所有6種限制性片段或限制性片段對。
21.如權(quán)利要求19所述的方法，該方法包含確認(rèn)所述轉(zhuǎn)基因植物或其細(xì)胞或組織的基因組DNA能否在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中，通過分別具有SEQ ID No 4和SEQ ID No 5核苷酸序列的兩條引物，用于擴增出一條約313bp的DNA片段。
22.鑒定包含MS-B2原種事件的轉(zhuǎn)基因植物、其細(xì)胞或組織的試劑盒，所述試劑盒包含至少兩個PCR探針，其一識別GAT-OS2外源DNA內(nèi)的序列，另一識別GAT-OS2 3’或5’側(cè)翼區(qū)域內(nèi)的序列。
23.如權(quán)利要求22所述的試劑盒，所述試劑盒包含分別具有SEQID No 4和SEQ ID No 5核苷酸序列的PCR探針。
全文摘要
本發(fā)明涉及稻植物、植物材料和種子,其特征在于帶有特定的轉(zhuǎn)化事件,具體而言,在稻基因組特定位點存在CaMV 35S啟動子控制下的bar基因。本發(fā)明的稻植物兼有草銨膦耐受性,以及最佳的綜合農(nóng)學(xué)特性、遺傳穩(wěn)定性和針對不同遺傳背景的適應(yīng)性。
文檔編號C12Q1/68GK1335886SQ99814584
公開日2002年2月13日 申請日期1999年11月3日 優(yōu)先權(quán)日1998年11月3日
發(fā)明者F·米啻爾斯, K·約翰森 申請人:阿溫提斯作物科學(xué)公司