專利名稱：含有高葉綠素的耐鹽性小球藻的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有高葉綠素的耐鹽性小球藻，它是食品著色材料，且高濃度含有具有抗胃潰瘍作用、抗變態(tài)反應(yīng)作用、抗腦血管性疾病作用、除臭作用、抗變異原作用、二噁英類排泄促進作用等功能的葉綠素，作為健康食品、功能性食品、醫(yī)藥原材料優(yōu)異的，且在海水中存活期長的適用于海面養(yǎng)殖飼料、水產(chǎn)飼料等。
背景技術(shù)：
小球藻是屬于綠球藻目的單細胞綠藻，由于生長速度比較快，蛋白質(zhì)含量高，含有較多的必須氨基酸即賴氨酸，以前作為健康食品源或養(yǎng)魚用輪蟲的餌料而大量培養(yǎng)。另外，小球藻中含有的葉綠素除了以前報道的抗胃潰瘍作用、抗肝障礙作用、抗變態(tài)反應(yīng)作用、抗腦血管性疾病作用、除臭作用之外，抗變異原作用或二噁英類排泄促進作用最近也有報道(《食品和開發(fā)》Vol.33，No.8，1998，p18-20)。根據(jù)該報道，人體吸收作為環(huán)境污染物質(zhì)最成問題的二噁英類，90％以上是從食物攝取的，特別地，由從海水以食物鏈?zhǔn)綕饪s的魚類和貝類攝取60％，另外，二噁英類一般經(jīng)小腸的吸收率高，由于很難被代謝，在脂肪組織或肝臟中蓄積。
另一方面，以前作為提高小球藻中的葉綠素含量的技術(shù)，已知以下技術(shù)通過在0.5-6ppm的范圍調(diào)節(jié)培養(yǎng)液中的溶解的氧濃度，調(diào)節(jié)培養(yǎng)液至pH5.5-7.5的范圍，在0.1mg-0.5mg/培養(yǎng)基L的范圍添加蛋白質(zhì)的水解物或氨基酸，且連續(xù)調(diào)整培養(yǎng)液的葡萄糖的量至10-40mg/培養(yǎng)基L，不對小球藻進行光照，而在罐中培養(yǎng)的方法(特公昭58-40462號公報)，或者通過紫外線照射處理小球藻，經(jīng)變異處理，制備總?cè)~綠素含量以干重計為3％以上的含有高葉綠素的小球藻(特許第2620045號公報)。但是，該總?cè)~綠素含有量以干燥重量計為3％以上的高葉綠素含有性的小球藻屬變異株在含有氯化鈉的培養(yǎng)基中不能生長。
發(fā)明概述由于最近對環(huán)境激素的關(guān)心提高，一直在尋求不被二噁英類等環(huán)境污染物質(zhì)污染的安全的食品或食品材料。對于以輪蟲為餌料，在海水中養(yǎng)殖的魚類也不例外，對被由海水經(jīng)食物鏈濃縮的二噁英類等的環(huán)境污染物質(zhì)污染少的魚類的期望很大。為了提供這樣的養(yǎng)殖魚類，作為該餌料的輪蟲等餌料的小球藻，使用具有抗變異原作用或二噁英類排泄促進作用的葉綠素含量高的小球藻是有效的。
另一方面，實際利用小球藻作為水產(chǎn)飼料的情況下，撒到海面上的小球藻雖然是褶皺臂尾輪蟲等的活餌料，但如果將不具有耐鹽性的小球藻撒到海面上，由于在海水中不能生長，就會逐漸死掉，作為養(yǎng)魚用輪蟲等餌料，不但在當(dāng)初的期待以下，而且由于死掉的小球藻成為殘餌料，使水質(zhì)變壞的可能性高，為此，以前的小球藻即使葉綠素含量高一些，在作為水產(chǎn)飼料的有用性方面也不能滿足。而且，使小球藻具有耐鹽性，使之適應(yīng)于海水以前是不知道的。
本發(fā)明的課題在于提供含有高葉綠素的耐鹽性的小球藻，其葉綠素含量高，在作為養(yǎng)魚用輪蟲餌料的情況下，能夠供給被從海水以食物鏈?zhǔn)綕饪s的二噁英類等環(huán)境污染物質(zhì)污染少的魚類，且在海水中的存活期長，適合于海面養(yǎng)殖飼料，水產(chǎn)飼料等。
為了解決上述課題，摸索找到可以制備具有葉綠素含量高和耐鹽性這2個性質(zhì)的小球藻，本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)通過在小球藻中實施紫外線和吖啶黃處理，能夠重現(xiàn)性良好地制備在海水中能夠生長發(fā)育，且高濃度含有葉綠素的小球藻，結(jié)果完成了本發(fā)明。
即，本發(fā)明涉及以在含有1重量％以上的氯化鈉的培養(yǎng)基中能夠生長發(fā)育且總?cè)~綠素含量比親代株高的含有高葉綠素的耐鹽性小球藻，或者以在含有1重量％以上的氯化鈉的培養(yǎng)基中能夠生長發(fā)育且以干燥重量計總?cè)~綠素含量為4％以上為特征的含有高葉綠素的耐鹽性小球藻，或者以小球藻是屬于小球藻屬的變異株M-207A7為特征的上述含有高葉綠素的耐鹽性小球藻，或者以通過實施變異處理得到的為特征的在含有1重量％以上的氯化鈉的培養(yǎng)基中能夠生長發(fā)育的耐鹽性小球藻，或者以干燥重量計總?cè)~綠素含量是4％以上為特征的含有高葉綠素的小球藻。
另外，本發(fā)明還涉及以通過異養(yǎng)培養(yǎng)方法培養(yǎng)上述小球藻，采集耐鹽性和/或高葉綠素含量的小球藻藻體為特征的小球藻藻體的制造方法，或者以上述含有高葉綠素的耐鹽性小球藻或耐鹽性小球藻為有效成分為特征的水產(chǎn)飼料，或者以通過在小球藻中進行紫外線照射實施變異處理和通過甲磺酸酯或吖啶黃實施變異處理為特征的變異株的制備方法，或者以變異株是在含有1重量％以上的氯化鈉的培養(yǎng)基中能夠生長發(fā)育且以干燥重量計總?cè)~綠素含量為4％以上的含有高葉綠素的耐鹽性小球藻屬變異株為特征的上述變異株的制備方法。
通過對小球藻親代株實施變異處理，可以制備本發(fā)明的含有高葉綠素的小球藻、耐鹽性小球藻或含有高葉綠素的小球藻。作為這樣的變異處理，可以例舉紫外線照射和/或采用變異藥劑的變異處理。
本發(fā)明的小球藻是指屬于綠球藻目的小球藻(Chlorella)屬的單細胞綠藻，作為被變異處理的小球藻親代株，例如從湖泊沼澤采集的從水和泥沙中分離的小球藻野生株，或者保藏株也可以，這些屬于小球藻屬的小球藻，可以列舉出C.sorokiniana、小球藻(C.vulgaris)、橢圓形小球藻(C.ellipsoidea)、C.luteoviridis、C.protothecoides、C.zopfingiensis、C.vaiegata、C.xanthella、嗜糖小球藻(C.saccharophilia)、C.miniata等。
另外，在有機物為碳源的異養(yǎng)繁殖下，優(yōu)選親代株和變異株可以一起培養(yǎng)的小球藻株。作為這樣的小球藻株的培養(yǎng)用培養(yǎng)基和變異株的選擇性培養(yǎng)用培養(yǎng)基，只要小球藻能夠繁殖，任何培養(yǎng)基都可以。可以列舉出YM肉湯液或表1所示組成的YM瓊脂培養(yǎng)基(均為Difco公司制)或表2所示的小球藻培養(yǎng)用的培養(yǎng)基。表1(YM瓊脂培養(yǎng)基；Difco公司制)酵母提取物 3.0g麥芽提取物 5.0g細菌蛋白胨 5.0g葡萄糖 10.0g瓊脂 20.0g蒸餾水 1000ml表2(小球藻培養(yǎng)用培養(yǎng)基)KNO31.0gKH2PO41.0gMgSO4.7H2O 1.0g酵母提取物 5.0g葡萄糖 25.0gFeSO4·7H2O 100mgA5溶液(注) 5ml蒸餾水 1000mlPH 6.5(注)A5溶液H3BO32.86gMnSO4·7H2O 2.5gZnSO4·7H2O 0.222gCuSO4·5H2O 79.0mgNa2MO421.0mg蒸餾水 1000ml
采用紫外線照射的變異處理，只要能夠從親代株得到目的變異株，任何變異處理都可以，所述采用紫外線照射的變異處理，例如可以列舉出采用具有254nm的紫外線燈照射的處理方法。如

圖1所示，采用紫外線照射所致變異，例如如果在4-10kerg/mm2紫外線照射量下進行，則比較容易得到目的變異株。另外，多次照射比一次照射效率高，能夠得到目的變異株的情況多。
另外，采用變異藥劑的變異處理，只要能夠從親代株得到目的變異株，任何變異處理都可以，采用這樣的變異藥劑的變異處理，例如可以列舉出使用甲磺酸酯、吖啶黃、N甲基-N′-硝基-N硝基胍、5-溴尿嘧啶、羥胺等變異藥劑的處理方法，其中，特別優(yōu)選用甲磺酸酯或吖啶黃制備目的小球藻變異株。這些變異藥劑的處理濃度或處理時間可以根據(jù)變異藥劑的種類而相應(yīng)設(shè)定，以便從親代株效率高地得到目的變異株，通常在1-500ppm的濃度和10-60分鐘的條件下處理。例如，甲磺酸酯或吖啶黃的處理濃度優(yōu)選分別是20-200ppm和5-50ppm。
而且，特別優(yōu)選將采用紫外線照射的變異處理和采用變異藥劑的變異處理兩者結(jié)合起來。例如，本發(fā)明的在含1重量％以上氯化鈉的培養(yǎng)基中可以生長發(fā)育的耐鹽性小球藻或在含1重量％以上氯化鈉的培養(yǎng)基中可以生長發(fā)育且總?cè)~綠素含量比親代株高的含有高葉綠素的耐鹽性小球藻，特別是在含1重量％以上氯化鈉的培養(yǎng)基中可以生長發(fā)育且以干燥重量計總?cè)~綠素含量是4％以上的含有高葉綠素的耐鹽性小球藻，只經(jīng)由紫外線照射處理要想以有重現(xiàn)性的制備幾乎是困難的，但如果經(jīng)過多次紫外線處理，通過合并甲磺酸酯或吖啶黃等的變異藥劑的處理，就能夠重現(xiàn)性良好地制備出來。另外，根據(jù)本發(fā)明者，這些耐鹽性株的選擇率經(jīng)試驗證實大約是1/106。
而且，通過將2次紫外線處理和采用吖啶黃變異處理結(jié)合起來，作為在含有1重量％以上的氯化鈉的培養(yǎng)基中可以生長發(fā)育且以干燥重量計總?cè)~綠素含量是4％以上的含有高葉綠素的耐鹽性小球藻的一個實例，制備屬于小球藻屬的變異株M-207A7。該M-207A7株在群馬縣高崎市宮原町3麒麟麥酒株式會社應(yīng)用開發(fā)中心保藏，按照日本特許法第27條之3的規(guī)定，是可以發(fā)放的。另外，該M-207A7株以CCTCC M 99013的保藏號于平成11年12月10日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(ChinaCenter for Type Culture Collection)(中華人民共和國，武漢430072，武漢大學(xué))。
本發(fā)明中，在含1重量％以上氯化鈉的培養(yǎng)基中可以生長發(fā)育是指接種在添加1重量％的氯化鈉的YM瓊脂培養(yǎng)基中，在35℃，在暗處培養(yǎng)7天的條件下生長發(fā)育。另外，總?cè)~綠素含量以干燥重量計4％以上是指在上述表2所示組成的小球藻培養(yǎng)用培養(yǎng)基中接種，在35℃下進行3天200rpm的振蕩培養(yǎng)的情況下，以干燥重量計，總?cè)~綠素的含量為4％以上。
發(fā)明的詳述下面，根據(jù)實施例詳細說明本發(fā)明，本發(fā)明的技術(shù)范圍不受以下實施例的限定。實施例1(含有高葉綠素的耐鹽性小球藻的取得)(親代株的分離)從1997年5月至7月，在表3所示的A10培養(yǎng)基(東京大學(xué)分子生物學(xué)研究所編LAM Catalogue of Strains.p404.1993)中添加了1％的表4所示的抗生素混合液N6(發(fā)酵工學(xué)會平成3年度大會會議錄471頁)的瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)從群馬縣的湖泊沼澤采集的水和泥沙得到的小球藻，在35℃下，7天內(nèi)，日照周期明暗各12小時進行培養(yǎng)，分離小球藻屬的單細胞綠藻類。接著，采用移液管洗凈法(《藻類學(xué)研究法》共立出版株式會社1979年12月1日發(fā)行，p70)，完全無菌化。在YM肉湯液中接種該無菌株，在35℃下，在暗處培養(yǎng)7天，使用YM瓊脂培養(yǎng)基分離繁殖的株，成為親代株。表3(A10培養(yǎng)基組成)KNO31.25gMgSO4.7H2O 1.25gKH2PO41.25gFe溶液(注) 1.0mlA5溶液 1.0ml瓊脂 18g蒸餾水 1000mlPH 6.0(注)Fe溶液FeSO4·7H2O 1.0g蒸餾水 1000mlH2SO42滴表4(抗生素混合液N6組成)青霉素G鉀鹽 334mg硫酸鏈霉素 334mg硫酸卡那霉素134mg硫酸慶大霉素134mg磷霉素 334mg制霉菌素26mg蒸餾水 100ml用0.22μm濾膜進行過濾除菌處理。
(高葉綠素變異株的選拔)在以107-108個/ml細胞密度在無菌水中懸浮上述親代株的液體中，進行2次5kerg/mm2的照射量的紫外線處理，在YM瓊脂培養(yǎng)基上，在35℃下，在暗處進行7天培養(yǎng)，在出現(xiàn)的菌落中選擇、分離比親代株綠色更深的50株菌落。在該分離的50株變異株中進一步地使用20ppm的吖啶黃，進行30分鐘的接觸處理，反復(fù)分離綠色深的菌落，再次選擇、分離50株。
(耐鹽性株的選拔)在添加了1重量％氯化鈉的YM瓊脂培養(yǎng)基中接種50株含高葉綠素的株，在35℃下，在暗處培養(yǎng)7天，從出現(xiàn)的30株群落選擇、分離含有高葉綠素且耐鹽性的變異株M-207A7。該變異株的主要性狀示于表5中。從該性狀可以看出，變異株M-207A7株在1重量％的氯化鈉下是可以生長發(fā)育的。表5(性狀以及性質(zhì))大小 4-7μm形狀 球形同化葡萄糖的能力(5％)+++同化葡萄糖的能力(10％) ++1％氯化鈉濃度的生長發(fā)育 ++同化半乳糖的能力(1％)-同化乙醇的能力 -可溶性淀粉 -(葉綠素含量的測定)在表2所示組成的小球藻培養(yǎng)用培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述得到的M-207A7株和作為比較例的市售品B-1株。另外，在表3所示組成的A10培養(yǎng)基中培養(yǎng)作為對照的小球藻C.vulgaris C-27。培養(yǎng)是將100ml各培養(yǎng)基放入500ml三角燒瓶中，在35℃下進行3天200rpm的振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)后，在3000rpm下離心分離處理培養(yǎng)液15分鐘，回收藻體。通過在650nm以及665nm下的吸光度測定藻體的甲醇提取液的方法(《藻類學(xué)研究法》共立出版株式會社1979年12月1日發(fā)行，p498中記載的方法)，測定總?cè)~綠素含量。結(jié)果示于表6中。表6株 藻體量(g/l) 葉綠素量(％) 培養(yǎng)基M-207A7(本發(fā)明)6.88 4.1 小球藻培養(yǎng)用培養(yǎng)基(表2)B-1(市售品)6.60 3.1 小球藻培養(yǎng)用培養(yǎng)基(表2)小球藻C.vulgaris C-27 2.62 1.7 A10培養(yǎng)基組成(表3)(對輪蟲的給餌試驗)在放入了3L天然海水∶自來水＝3∶1的輪蟲飼養(yǎng)用溶液的5L容積的燒杯中，放入輪蟲以使輪蟲的初始濃度為150-200個體/ml，在保持水溫27℃下的同時，4天給餌小球藻PCV(Packed Cell Volume)為60v/v％的懸浮液，每100個輪蟲個體，早上0.1ml，晚上0.2ml。該試驗反復(fù)7次，對于本發(fā)明的M-207A7株和作為比較例的市售品B-1株，調(diào)查輪蟲繁殖(4天后)的差異。7次平均結(jié)果示于表7中。從表7可以驗證輪蟲能夠很好地食用在海水中可存活的耐鹽性株。表7株 個體/ml輪蟲繁殖率M-207A7(本發(fā)明) 1850 9-12倍B-1(市售) 1600 8-10倍(M-207A7株的大量培養(yǎng))在50L容積的發(fā)酵罐中放入40L表4所記載的培養(yǎng)基，在通氣量30L/分，攪拌300rpm，在暗處，在35℃下培養(yǎng)3天，回收培養(yǎng)液，在3000rpm下離心分離處理15分鐘，得到小球藻藻體。用上述方法得到總?cè)~綠素的含量為4.3％(干燥重量計)。從該結(jié)果可以看出，通過罐中的通常的異養(yǎng)培養(yǎng)方法，在保持優(yōu)異的性狀的狀態(tài)下，可以以工業(yè)規(guī)模大量培養(yǎng)含有高葉綠素的耐鹽性小球藻。
權(quán)利要求
1.一種含有高葉綠素的耐鹽性小球藻，其特征在于，在含有1重量％以上氯化鈉的培養(yǎng)基中能夠生長發(fā)育且總?cè)~綠素含量比親代株高。
2.一種含有高葉綠素的耐鹽性小球藻，其特征在于，在含有1重量％以上氯化鈉的培養(yǎng)基中能夠生長發(fā)育且總?cè)~綠素含量以干燥重量計為4％以上。
3.根據(jù)權(quán)利要求2記載的含有高葉綠素的耐鹽性小球藻，其特征在于，小球藻是屬于小球藻屬的變異株M-207A7。
4.在含有1重量％以上氯化鈉的培養(yǎng)基中能夠生長發(fā)育的小球藻，其特征在于是通過實施變異處理得到的。
5.含有高葉綠素的小球藻，其特征在于，總?cè)~綠素含量以干燥重量計為4％以上。
6.小球藻藻體的制造方法，其特征在于，通過異養(yǎng)培養(yǎng)方法，培養(yǎng)權(quán)利要求1-5任一項記載的小球藻，采集耐鹽性和/或高葉綠素含量的小球藻藻體。
7.水產(chǎn)飼料，其特征在于，以權(quán)利要求1-3任一項所記載的含有高葉綠素的耐鹽性小球藻或在含有1重量％以上氯化鈉的培養(yǎng)基中能夠生長發(fā)育的耐鹽性小球藻為有效成分。
8.變異株的制備方法，其特征在于，在小球藻中實施采用紫外線照射的變異處理，和實施采用甲磺酸酯或吖啶黃的變異處理。
9.權(quán)利要求8記載的變異株的制備方法，其特征在于，變異株是在含有1重量％以上氯化鈉的培養(yǎng)基中能夠生長發(fā)育且總?cè)~綠素含量以干燥重量計為4％以上的含有高葉綠素的耐鹽性小球藻屬變異株。
全文摘要
本發(fā)明提供一種葉綠素含量高的,且在海水中的生存期長的,適合于海面養(yǎng)殖飼料、水產(chǎn)飼料的含有高葉綠素的小球藻,作為養(yǎng)魚用輪蟲餌料的情況下,能夠提供給養(yǎng)殖魚類,使所述養(yǎng)殖魚類被來自海水的以食物鏈濃縮的二噁英類等環(huán)境污染物質(zhì)污染減少。在小球藻中,通過實施采用多次紫外線照射的變異處理以及實施采用甲磺酸酯或吖啶黃的變異處理,可以制備在含有1重量%以上氯化鈉的培養(yǎng)基中能夠生長發(fā)育且總?cè)~綠素含量以干燥重量計為4%以上的含有高葉綠素的耐鹽性小球藻屬變異株。
文檔編號C12N1/12GK1330711SQ99814578
公開日2002年1月9日 申請日期1999年12月16日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月17日
發(fā)明者中西弘一 申請人:麒麟麥酒株式會社