專利名稱：一種利用生物反應(yīng)器生產(chǎn)豬瘟細(xì)胞活疫苗的方法及其制品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于獸用生物制品技術(shù)領(lǐng)域，更具體是涉及一種利用生物反應(yīng)器生產(chǎn)豬瘟
細(xì)胞活疫苗的方法及其制品。
背景技術(shù)：
當(dāng)前豬瘟細(xì)胞活疫苗的生產(chǎn)主要是轉(zhuǎn)瓶細(xì)胞培養(yǎng)的傳統(tǒng)培養(yǎng)方式，該培養(yǎng)方式是 培養(yǎng)細(xì)胞貼壁生長于玻璃培養(yǎng)瓶的內(nèi)壁上，雖然其操作技術(shù)要求較低和技術(shù)成熟穩(wěn)定；但 轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)使用數(shù)十年，與當(dāng)前大規(guī)模動物疫苗生產(chǎn)不相適應(yīng)，主要表現(xiàn)為(l)轉(zhuǎn) 瓶細(xì)胞培養(yǎng)，不能做到培養(yǎng)條件適時(shí)調(diào)整，無法保證細(xì)胞培養(yǎng)處于最佳條件，培養(yǎng)細(xì)胞密度 小，培養(yǎng)病毒滴度低，動物的免疫效果差；(2)轉(zhuǎn)瓶細(xì)胞培養(yǎng)，細(xì)胞碎片與雜蛋白多，疫苗的 雜質(zhì)多，導(dǎo)致免疫動物的副反應(yīng)大；(3)轉(zhuǎn)瓶細(xì)胞培養(yǎng)，細(xì)胞批間差異較大，產(chǎn)品質(zhì)量不均 一、不穩(wěn)定；(4)轉(zhuǎn)瓶細(xì)胞培養(yǎng)，生產(chǎn)效率低，生產(chǎn)成本高。

發(fā)明內(nèi)容
為克服上述技術(shù)缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種利用生物反應(yīng)器生產(chǎn)豬瘟細(xì)胞活 疫苗的方法及豬瘟細(xì)胞活疫苗產(chǎn)品。 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先提供了 一種利用生物反應(yīng)器生產(chǎn)豬瘟細(xì)胞活疫苗的
方法，該方法包括如下步驟 (1)用細(xì)胞生長液培養(yǎng)制苗用細(xì)胞； (2)將所述步驟(1)得到的細(xì)胞接種含豬瘟兔化弱毒毒種的維持液，并進(jìn)行繁殖 培養(yǎng)； (3)接毒后1 3日或流加方式收獲所述步驟(2)得到的細(xì)胞培養(yǎng)毒液； (4)在所述步驟(3)得到的細(xì)胞培養(yǎng)毒液中加穩(wěn)定劑和抗生素，經(jīng)冷凍真空干燥
得到豬瘟細(xì)胞活疫苗； 其中，上述方法中使用了含微載體的生物反應(yīng)器進(jìn)行培養(yǎng)。 優(yōu)選的，所述步驟(1)包括如下步驟將所述生物反應(yīng)器和微載體經(jīng)消毒后接種 所述制苗用細(xì)胞，并加入細(xì)胞生長液進(jìn)行培養(yǎng)。 優(yōu)選的，所述步驟(2)包括如下步驟將所述生物反應(yīng)器接種所述含豬瘟兔化弱 毒毒種的維持液，繼續(xù)培養(yǎng)。 優(yōu)選的，所述步驟(1)和(2)中的培養(yǎng)溫度為36°C 37°C。 優(yōu)選的，所述步驟(l)中的細(xì)胞生長液含90X 92X體積百分比的MEM液、抗菌
素和8% 10%體積百分比的犢牛血清，所述細(xì)胞生長液的pH值為7. 0 7. 2。 優(yōu)選的，所述步驟(2)中的接種時(shí)的接種量為1% 2%體積百分比的生產(chǎn)用細(xì)胞
毒種的維持液。 優(yōu)選的，所述步驟(2)中的細(xì)胞維持液含95% 98%體積百分比的MEM液、抗菌 素和2% 5%體積百分比的犢牛血清，所述細(xì)胞維持液的pH值為7. 2 7. 4。
優(yōu)選的，所述生物反應(yīng)器為TideCell固定床微載體生物反應(yīng)器。TideCell生物 反應(yīng)器可達(dá)到簡化至只需一般針筒以及無血清培養(yǎng)細(xì)胞方式，培養(yǎng)之載體細(xì)胞均勻分布成 長，其有效量產(chǎn)經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)， 一個(gè)TideCell生物反應(yīng)器，產(chǎn)能約一般傳統(tǒng)生物反應(yīng)器的4 倍。 優(yōu)選的，所述制苗用細(xì)胞為豬睪丸細(xì)胞系ST、豬腎細(xì)胞系PK15或豬腎細(xì)胞系 I服S-2。 本發(fā)明的目的之二是提供一種豬瘟細(xì)胞活疫苗制品，該豬瘟細(xì)胞活疫苗通過上述 方法得到。 本發(fā)明利用生物反應(yīng)器大規(guī)模高密度培養(yǎng)技術(shù)，可最大限度地提高生物反應(yīng)器中 單位體積細(xì)胞生長密度，在病毒疫苗生產(chǎn)中具有很大潛力和優(yōu)勢，具體表現(xiàn)為(l)細(xì)胞密 度大大增加，病毒濃度極大提高；(2)疫苗效價(jià)提高，副反應(yīng)減?。?3)降低勞動強(qiáng)度，減少 生產(chǎn)成本；(4)疫苗生產(chǎn)可監(jiān)控性提高；(5)保證產(chǎn)品質(zhì)量均一穩(wěn)定。利用本發(fā)明生產(chǎn)的豬 瘟細(xì)胞活疫苗安全性好、免疫效力高，對豬瘟強(qiáng)毒攻擊具有較好的免疫保護(hù)作用。
具體實(shí)施例方式
為使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這 些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍，下列實(shí)施例中未提及的具體實(shí)驗(yàn) 方法，通常按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行。 利用生物反應(yīng)器大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，生產(chǎn)豬瘟細(xì)胞活疫苗的生產(chǎn)工藝技術(shù)與方 法，包括如下步驟 (1)選擇生物反應(yīng)器TideCell固定床微載體生物反應(yīng)器。 (2)選擇細(xì)胞系作為制苗用細(xì)胞本實(shí)施例中選擇豬睪丸(ST)細(xì)胞系作為制苗用 細(xì)胞。在另兩個(gè)實(shí)施例中，分別選用豬腎(PK15)細(xì)胞系和豬腎(IBRS-2)細(xì)胞系。
(3)利用生物反應(yīng)器培養(yǎng)制苗用細(xì)胞選擇適宜的細(xì)胞系，生物反應(yīng)器和微載體 經(jīng)消毒后接種適宜的細(xì)胞濃度(10e 8X10e個(gè)細(xì)胞/ml)并加入適量的培養(yǎng)基，通過調(diào) 整細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中各培養(yǎng)條件溶氧濃度為50% 100%、 C02濃度為5%、葡萄糖含量為 500 3000mg/L和pH值為7. 0 7. 4，培養(yǎng)高密度的細(xì)胞系作為制苗用細(xì)胞。
(4)選擇制苗用毒種豬瘟兔化弱毒株。 (5)生物反應(yīng)器繁殖制苗用毒液將生物反應(yīng)器中生長良好的上述傳代細(xì)胞微載 體培養(yǎng)灌中的細(xì)胞生長液棄去，接種含適量毒種的維持液，繼續(xù)培養(yǎng)；接毒后1 3日或流 加方式收獲細(xì)胞培養(yǎng)毒液，收獲的毒液置_15°C以下保存； 制苗毒液的檢驗(yàn)按《中華人民共和國獸藥典》(2005年版)附錄15、19頁進(jìn)行檢 驗(yàn)，無細(xì)菌、霉菌、支原體生長。細(xì)胞毒液對豬安全無副作用，各收次病毒培養(yǎng)液分別用兔測 定效價(jià)，每lml含病毒^ 2X1()6兔體感染量(RID)。 (6)配苗、分裝及凍干將檢驗(yàn)合格的病毒培養(yǎng)液，混合于同一容器內(nèi)，加入穩(wěn)定 劑，同時(shí)加入抗生素，充分搖勻，定量分裝；分裝后迅速進(jìn)行冷凍真空干燥后即得成品。
成品檢驗(yàn)按《中華人民共和國獸藥典》(2005年版)進(jìn)行檢驗(yàn)，符合"豬瘟細(xì)胞活 疫苗"的規(guī)定，對豬安全無副作用，每頭份疫苗含病毒^ 1.5X104RID。
其中，上述方法中涉及到的具體的條件如下
4
步驟(3) 、 (5)中所述的傳代細(xì)胞培養(yǎng)溫度是36 37°C。 步驟(5)中所述的接種量為含1% 2%生產(chǎn)用細(xì)胞毒種的維持液。 步驟(3)中所用生長液的配方是90% 92% MEM液、8X 10%犢牛血清、加適
量的抗菌素，pH值調(diào)整為7. 0 7. 2。 步驟(5)中所用維持液的配方是95X 98XMEM液、2X 5X犢牛血清、加適量 的抗菌素，pH值調(diào)整為7. 2 7. 4。 最后所應(yīng)當(dāng)說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對本發(fā)明保 護(hù)范圍的限制，盡管參照較佳實(shí)施例對本發(fā)明作了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng) 理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì) 和范圍。
權(quán)利要求
一種利用生物反應(yīng)器生產(chǎn)豬瘟細(xì)胞活疫苗的方法，其特征在于，包括如下步驟(1)用細(xì)胞生長液培養(yǎng)制苗用細(xì)胞；(2)將所述步驟(1)得到的細(xì)胞接種含豬瘟兔化弱毒毒種的維持液，并進(jìn)行繁殖培養(yǎng)；(3)接毒后1～3日或流加方式收獲所述步驟(2)得到的細(xì)胞培養(yǎng)毒液；(4)在所述步驟(3)得到的細(xì)胞培養(yǎng)毒液中加入穩(wěn)定劑和抗生素，經(jīng)冷凍真空干燥得到豬瘟細(xì)胞活疫苗；其中，上述方法中使用了含微載體的生物反應(yīng)器進(jìn)行培養(yǎng)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用生物反應(yīng)器生產(chǎn)豬瘟細(xì)胞活疫苗的方法，其特征在 于，所述步驟(1)包括如下步驟將所述生物反應(yīng)器和微載體經(jīng)消毒后接種所述制苗用細(xì) 胞，并加入細(xì)胞生長液進(jìn)行培養(yǎng)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用生物反應(yīng)器生產(chǎn)豬瘟細(xì)胞活疫苗的方法，其特征在 于，所述步驟(2)包括如下步驟將所述生物反應(yīng)器接種所述含豬瘟兔化弱毒毒種的維持 液，繼續(xù)培養(yǎng)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用生物反應(yīng)器生產(chǎn)豬瘟細(xì)胞活疫苗的方法，其特征在 于，所述步驟(1)和(2)中的培養(yǎng)溫度為36°C 37°C。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用生物反應(yīng)器生產(chǎn)豬瘟細(xì)胞活疫苗的方法，其特征在 于，所述步驟(1)中的細(xì)胞生長液含90X 92X體積百分比的MEM液、抗菌素和8X 10X 體積百分比的犢牛血清，所述細(xì)胞生長液的PH值為7. 0 7. 2。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用生物反應(yīng)器生產(chǎn)豬瘟細(xì)胞活疫苗的方法，其特征在 于，所述步驟(2)中的接種時(shí)的接種量為1% 2%體積百分比的生產(chǎn)用細(xì)胞毒種的維持 液。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用生物反應(yīng)器生產(chǎn)豬瘟細(xì)胞活疫苗的方法，其特征在 于，所述步驟(2)中的細(xì)胞維持液含95X 98X體積百分比的MEM液、抗菌素和2X 5X 體積百分比的犢牛血清，所述細(xì)胞維持液的PH值為7. 2 7. 4。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1 7之一所述的一種利用生物反應(yīng)器生產(chǎn)豬瘟細(xì)胞活疫苗的方法， 其特征在于，所述生物反應(yīng)器為TideCell固定床微載體生物反應(yīng)器。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1 7之一所述的一種利用生物反應(yīng)器生產(chǎn)豬瘟細(xì)胞活疫苗的方法， 其特征在于，所述制苗用細(xì)胞為豬睪丸細(xì)胞系ST、豬腎細(xì)胞系PK15或豬腎細(xì)胞系IBRS-2。
10. —種豬瘟細(xì)胞活疫苗，其特征在于，所述豬瘟細(xì)胞活疫苗通過權(quán)利要求1 7之一 所述的方法得到。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種利用生物反應(yīng)器生產(chǎn)豬瘟細(xì)胞活疫苗的方法及其豬瘟細(xì)胞活疫苗產(chǎn)品，該方法包括如下步驟將生物反應(yīng)器和微載體經(jīng)消毒后接種所述制苗用細(xì)胞，并加入細(xì)胞生長液進(jìn)行培養(yǎng)。將生物反應(yīng)器接種所述含豬瘟兔化弱毒毒種的維持液，繼續(xù)培養(yǎng)。接毒后1～3日或流加方式收獲得到的細(xì)胞培養(yǎng)毒液；再加入穩(wěn)定劑和抗生素，經(jīng)冷凍真空干燥得到豬瘟細(xì)胞活疫苗；本發(fā)明使細(xì)胞密度大大增加，病毒濃度極大提高；疫苗效價(jià)提高，副反應(yīng)減小；降低勞動強(qiáng)度，減少生產(chǎn)成本；疫苗生產(chǎn)可監(jiān)控性提高；保證產(chǎn)品質(zhì)量均一穩(wěn)定。利用本發(fā)明生產(chǎn)的豬瘟細(xì)胞活疫苗安全性好、免疫效力高，對豬瘟強(qiáng)毒攻擊具有較好的免疫保護(hù)作用。
文檔編號C12R1/93GK101695571SQ20091019331
公開日2010年4月21日 申請日期2009年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月26日
發(fā)明者任向陽, 劉秋燕, 司徒劍謀, 吳文福, 周澤標(biāo), 岑小清, 張木輝, 張毓金, 林旭野, 游啟有 申請人:廣東永順生物制藥有限公司;