專利名稱：稀有人參皂甙ih-901的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種稀有人參皂甙IH-901的制備方法。
背景技術(shù)：
現(xiàn)代藥理研究表明，人參發(fā)揮抗腫瘤作用的最終活性物質(zhì)不是天然人 參皂甙如人參皂甙Rth、 Rb2、 Rb3、 Rc、 Rd等，而是其一系列腸道菌群的作 用下所產(chǎn)生的代謝物，即天然人參皂甙只是抗腫瘤天然前體藥物，人參皂 戒腸道菌代謝產(chǎn)物才是抗肺瘤活性本質(zhì)或活性實(shí)體。人參皂甙的代謝研究 發(fā)現(xiàn)，其中，人參皂甙腸道菌代謝物20-0-P-D-吡喃葡萄糖苷-20(S)-原 人參二醇(簡(jiǎn)稱稀有人參急戒IH-901， Ml或Compound K)是天然二醇組人 參皂戒如Rbi、 Rth等口服后由腸道細(xì)菌所分泌的糖苷酶選擇性水解C-3位糖 配體所得的最終主要代謝產(chǎn)物，是人參皂甙抗腫瘤作用的最終主要活性形 式之一。而且大量有關(guān)天然人參皂甙與IH-901的代謝關(guān)系研究不斷證實(shí)， 一些含量較高、極性較大的二醇組皂甙均能通過腸道菌代謝最終降解為 IH-901被機(jī)體吸收。
稀有人參皂甙IH-901屬二醇組皂甙，在天然的人參中不存在，是其他 二醇組人參皂戒在人腸道內(nèi)的降解代謝產(chǎn)物。近年來諸多研究表明人參的 許多生物學(xué)活性都是由該化合物引起的，特別是在抗腫瘤、抗衰老，抗炎 癥等方面都體現(xiàn)良好的藥效。目前其研究的熱點(diǎn)集中體現(xiàn)在IH-901化合物 的大規(guī)模制備和生物活性深入研究?jī)蓚€(gè)方面，我國(guó)對(duì)該化合物的研究尚處 于起步階段，未見系統(tǒng)研究報(bào)道。由于IH-901為體內(nèi)代謝產(chǎn)物，故無毒， 研究表明具有廣泛的抗腫瘤活性，迄今，稀有人參皂甙IH-901的臨床價(jià)值 已引起各國(guó)高度重視，并成為各大制藥公司研究的熱點(diǎn)。
IH-901將是一個(gè)很有前途的抗肺瘤藥物，未來將相繼以保健品及國(guó)家 新藥形式陸續(xù)上市，稀有人參皂甙項(xiàng)目在21世紀(jì)生物醫(yī)藥及生物健康品具 有前瞻性、稀缺性以及需求巨大性，國(guó)際國(guó)內(nèi)市場(chǎng)對(duì)其需求有著巨大的潛 力。目前稀有人參皂甙IH-901由于其價(jià)格昂貴，市場(chǎng)上含量在99%以上價(jià)格達(dá)1000萬元/公斤，而人參皂戒僅800元/公斤，難以被胂瘤病人使用，因此 稀有人參皂甙IH-901的生產(chǎn)方法備受關(guān)注。
由于人參皂甙四環(huán)三萜母核結(jié)構(gòu)上3位和20位糖苷鍵的特異性，決定 了 IH-901只能由溫和的生物轉(zhuǎn)化方法獲得，而常用的酸或^5威水解方法是行 不通的。目前，生物轉(zhuǎn)化方法通常包括微生物發(fā)酵和酶轉(zhuǎn)化兩種主要方法。
微生物發(fā)酵法制備所用的微生物主要是腸道厭氧菌，而其他微生物的 研究比較少。腸道厭氧菌發(fā)酵最初是以人排泄物中的總菌物進(jìn)行發(fā)酵，后 來研究篩選單一腸道菌來轉(zhuǎn)化，如采用腸道乳酸菌轉(zhuǎn)化二醇型皂苷制備CK, 發(fā)現(xiàn)運(yùn)用^//V^^s"er/wz /z /"/yz 〃/Z7 KK-1和A c力oerKK-2共發(fā)酵轉(zhuǎn)4匕 Rbl時(shí)效果最好，轉(zhuǎn)化率達(dá)到41%左右，但腸道菌多為厭氧菌，培養(yǎng)條件苛 刻，培養(yǎng)基成本高。另有研究篩選原始土壤微生物來降解人參皂苷，但酶 解能力低下，目的產(chǎn)物收率不高，須通過優(yōu)化發(fā)酵條件和菌種誘變等方法 來提高轉(zhuǎn)化能力。中科院大連化學(xué)物理研究所申請(qǐng)發(fā)明專利用黑曲霉酶解 人參皂苷制備稀有低極性人參皂苷的方法，所用黑曲霉菌是將各種來源的 黑曲霉菌轉(zhuǎn)入含有人參皂甙的培養(yǎng)基中，經(jīng)傳代培養(yǎng)、馴化、篩選得到的 能夠酵解產(chǎn)生稀有人參皂戒及戒元的菌抹。目前在微生物發(fā)酵制備方面并 沒有適用大規(guī)3莫制備的成熟的方法或工藝。
而參照腸內(nèi)菌代謝原理，酶轉(zhuǎn)化法制備是利用酶作為催化劑實(shí)現(xiàn)化學(xué) 轉(zhuǎn)化的過程，是酶制劑對(duì)外源性底物進(jìn)行結(jié)構(gòu)性修飾所發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)， 酶及酶體系能將許多天然化合物轉(zhuǎn)化為具有較高生物活性的物質(zhì)，酶法轉(zhuǎn) 化法的優(yōu)點(diǎn)在于流程短、專一性強(qiáng)、產(chǎn)物易分離純化。用于制備的酶大部 分是工業(yè)酶制劑， 一般采用具有酶解糖苷鍵的酶，如柚皮苷酶、果膠酶、 纖維素酶、蝸牛酶以及乳糖酶等。國(guó)內(nèi)學(xué)者利用P-葡萄糖香酶對(duì)三七莖葉 總皂苷進(jìn)行轉(zhuǎn)化，取得較好的轉(zhuǎn)化效果。也有從具有轉(zhuǎn)化活性的菌林中分 離專一性更強(qiáng)的轉(zhuǎn)化酶，如從食用微生物5/77cTo^cfer/咖sp. Int57和 ^ 77cto&"er/湖sp. SJ32中提取的粗酶，可轉(zhuǎn)化Rb2和Rc成Rd和F"進(jìn)而 轉(zhuǎn)化成終產(chǎn)物人參皂戒IH-901,從人腸道菌/^ o^ &c"r/i/邁K-60分離純 化的葡萄糖苷酶，亦能直接轉(zhuǎn)化Rth生成稀有人參皂戒CK。但這些方法也存 在酶的用量大、來源困難、底物成分較高等缺點(diǎn)，所以上述方法也尚無法 應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。酶轉(zhuǎn)化法選擇性強(qiáng)、 一般產(chǎn)物也便于提取分離，工藝研究控制方便，該制備法更有利于規(guī)模化制備，其研究關(guān)鍵在于獲得廉價(jià) 而有高效專 一 的工業(yè)酶制劑。
隨著天然人參皂戒類化合物腸道代謝研究的深入，研究表明腸道菌代 謝降解人參皂武其作用的并不是菌體本身，而是腸道菌分泌的生物酶，代 謝的實(shí)質(zhì)是酶對(duì)天然人參皂甙的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了生物修飾或改造，而生成直接
體現(xiàn)生物活性的代謝產(chǎn)物。參照腸道菌代謝機(jī)理，目前IH-901制備方法主 要有微生物發(fā)酵法和酶法轉(zhuǎn)化法兩種方法。微生物發(fā)酵法由于發(fā)酵的培養(yǎng) 條件苛刻，培養(yǎng)成本高，而且發(fā)酵也需要尋找到具高效的菌體，尚無法滿 足工業(yè)化生產(chǎn)需要。生物的方法酶解轉(zhuǎn)化制備，由于酶解反應(yīng)溫和，條件 易于控制，加之酶的選擇性、專屬性，只作用于特殊結(jié)構(gòu)的固定位置，對(duì) 其它的結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型沒有影響，而且人參皂戒20位的糖苷4建在酸性介質(zhì) 中的穩(wěn)定性低于3位糖苷鍵，并且空間阻礙作用使得酶水解20位的糖苷鍵活 力很低，因此，酶轉(zhuǎn)化法成為目前采用的主要制備方法。實(shí)現(xiàn)恥溪化生產(chǎn) 的體外酶法轉(zhuǎn)化制備關(guān)鍵是篩選到來源廣泛、成本低、高效專一性的生物 酶，以及利用廉價(jià)的酶轉(zhuǎn)化原材料，建立可適用于工業(yè)化工藝。目前據(jù)研 究才艮道，國(guó)內(nèi)外有酶法轉(zhuǎn)化中國(guó)人參、高麗參、西洋參或三七等為稀有人 參皂甙IH-901的工藝研究和文獻(xiàn)報(bào)道，但是這些方法大多存在酶的來源困 難、原料成本高等缺點(diǎn)，尚無法應(yīng)用于規(guī)^莫化制備或工業(yè)化生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種以單一皂甙為底物，酶的來源豐富、原料成 本低的稀有人參皂戒IH-901的制備方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣的稀有人參皂甙IH-901的制備方法，通過 如下方案實(shí)現(xiàn)將l單位質(zhì)量單體人參皂甙Rbl、 0. 5-l單位質(zhì)量國(guó)產(chǎn)的蝸 牛酶和1單位體積pH=3-5的緩沖溶液混合均勻，于30-45。C下保溫8-14小 時(shí)之后，^使可將單體人參皂戒Rbl完全轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物稀有人參皂武IH-901。
上述緩沖溶液為磷酸檸檬S吏緩沖溶液或醋酸水溶液。
采用上述方案后，本發(fā)明的稀有人參皂甙IH-901的制備方法，以單體 人參皂甙Rbl為反應(yīng)底物，反應(yīng)的酶為廉價(jià)的國(guó)產(chǎn)蝸牛酶，反應(yīng)后的體系 中除緩沖體系的成分外，反應(yīng)底物單體人參皂戒Rbl被完全轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物稀有人參皂甙IH-901,后續(xù)的產(chǎn)物提取非常簡(jiǎn)單。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明 的制備方法，由于采用單一底物和廉^f介的國(guó)產(chǎn)蝸牛酶，具有酶的來源豐富、 原料成本低，以及反應(yīng)結(jié)束后體系中成分簡(jiǎn)單有利于產(chǎn)物提取等優(yōu)點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例一
本發(fā)明的稀有人參皂甙IH-901的制備方法，通過如下方案實(shí)現(xiàn)
① 精確吸取100微升單體人參皂甙Rbl (含1毫克單體人參皂甙Rbl ) 于無菌的反應(yīng)管內(nèi)，加入1毫克國(guó)產(chǎn)的蝸牛酶和1毫升pH=3的磷酸檸檬酸 緩沖溶液；
② 將單體人參皂戒Rbl、蝸牛酶和磷酸檸檬酸緩沖溶液混合均勻，于 30。C恒溫水浴14小時(shí)，反應(yīng)底物單體人參皂甙Rbl被完全轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物稀有 人參皂甙IH-901,反應(yīng)結(jié)束后的體系中除緩沖體系的成分外，只剩下產(chǎn)物 稀有人參皂甙IH-901。
實(shí)施例二
本發(fā)明的稀有人參皂甙IH-901的制備方法，通過如下方案實(shí)現(xiàn)
① 精確吸取1000微升單體人參皂甙Rbl(含10毫克單體人參皂甙Rbl ) 于無菌的反應(yīng)管內(nèi)，加入5毫克國(guó)產(chǎn)的蝸牛酶和10毫升pH=4的醋酸水溶 液^
② 將單體人參急戒Rbl、蝸牛酶和醋酸水溶液混合均勻，于37。C恒溫 水浴11小時(shí)，反應(yīng)底物單體人參皂戒Rbl ;故完全轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物稀有人參皂甙 IH-901,反應(yīng)結(jié)束后的體系中除緩沖體系的成分外，只剩下產(chǎn)物稀有人參 皂戒IH-901。
實(shí)施例三
本發(fā)明的稀有人參皂甙IH-901的制備方法，通過如下方案實(shí)現(xiàn)
①精確吸取100微升單體人參皂甙Rbl (含1毫克單體人參皂甙Rbl)
于無菌的反應(yīng)管內(nèi)，加入0. 6毫克國(guó)產(chǎn)的蝸牛酶和1毫升pH=5的磷酸^f寧檬
酸緩沖溶液；
6②將單體人參急戒Rbl、蝸牛酶和磷酸檸檬酸緩沖溶液混合均勻，于 45。C恒溫水浴8小時(shí)，反應(yīng)底物單體人參皂甙Rbl纟皮完全轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物稀有 人參皂甙IH-901,反應(yīng)結(jié)束后的體系中除緩沖體系的成分外，只剩下產(chǎn)物 稀有人參皂戒IH-901。
提取與鑒定過程
① 終止反應(yīng)，加入反應(yīng)物1/2體積的正丁醇萃取兩次，合并正丁醇層；
② 用毛細(xì)管吸取少量，點(diǎn)樣于珪膠板上(使用前在110。C下活化90分 鐘)，冷風(fēng)吹干；
③ 置于盛有展開劑的燒杯內(nèi)，以IH-901標(biāo)準(zhǔn)品和Rbl標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照， 以氯仿曱醇7jc=65: 35: 10為展開劑展開；
④ 待展開劑的前沿離硅膠板頂部l厘米左右，取出，揮干溶劑，均勻 噴10%石克酸一 乙醇溶液的顯色劑；
在105。C加熱IO分鐘顯色鑒定。 相關(guān)試劑的配制方法
1、 展開劑
氯仿曱醇水=65: 35: 10 (下層) 正丁醇乙酸乙酯水=4: 1: 5 (上層) 氯仿乙酸乙酯甲醇水=15: 40: 20: IO(下層) 上層、下層是指溶液配制混合均勻靜置后分層，展開劑使用的是上層 或下層，其余的棄去。
2、 石克酸一乙醇顯色劑 石克酸乙醇=1: 10。
3、 Rbl標(biāo)準(zhǔn)品溶液
20毫克Rbl，加入10微升DMS0(二曱基亞砜)，加乙醇至2毫升，_20 "C冷凍保存。
4、 IH-901標(biāo)準(zhǔn)品溶液
20毫克IH-901,加入10微升DMSO (二曱基亞砜)，加乙醇至2毫升， 于-2(TC的溫度下冷凍保存。
5、 磷酸檸檬酸緩沖液pH0. 2mol/L0. lmol/L0. 2mol/L0. lmol/L
Na2HP04檸檬酸Na2HP04檸檬酸
(毫升)(毫升)(毫升)(毫升)
2. 20. 4010. 605. 210. 729. 28
2. 41. 2418. 765. 411. 158. 85
2. 62. 1817. 825. 611. 608.40
2. 83. 1716. 835. 812. 097. 91
3. 04. 1115. 896. 012. 637. 37
3. 24. 9415. 066.213. 226. 78
3. 45. 7014. 306. 413. 856. 15
3. 66. 4413. 566.614. 555.45
3. 87. 1012. 906. 815. 454. 55
4. 07. 7112. 297. 016. 473. 53
4. 28. 2811. 727. 217. 392. 61
4. 48. 8211. 187.418. 171. 83
4. 69. 3510. 657.618. 731. 27
4. 89. 8610. 147.819. 150. 85
5. 010. 309. 708. 019. 450. 55
Na2HP04分子量=14.98, 0.2 mol/L溶液為28. 40克/升。 Na2,-2H20分子量=178. 05， 0. 2 mol/L溶液含35. 01克/升。 C4H207 H20分子量=210.14， 0.1 mol/L溶液為21. 01克/升。
權(quán)利要求
1、稀有人參皂甙IH-901的制備方法，其特征在于通過如下方案實(shí)現(xiàn)將1單位質(zhì)量單體人參皂甙Rb1、0.5-1單位質(zhì)量國(guó)產(chǎn)的蝸牛酶和1單位體積pH＝3-5的緩沖溶液混合均勻，于30-45℃下保溫8-14小時(shí)之后，便可將單體人參皂甙Rb1完全轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物稀有人參皂甙IH-901。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的稀有人參皂戒IH-901的制備方法，其特征 在于上述緩沖溶液為磷酸檸檬酸緩沖溶液或醋酸水溶液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種稀有人參皂甙IH-901的制備方法，通過如下方案實(shí)現(xiàn)將1單位質(zhì)量單體人參皂甙Rb1、0.5-1單位質(zhì)量國(guó)產(chǎn)的蝸牛酶和1單位體積pH＝3-5的緩沖溶液混合均勻，于30-45℃下保溫8-14小時(shí)之后，便可將單體人參皂甙Rb1完全轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物稀有人參皂甙IH-901。本發(fā)明以單體人參皂甙Rb1為反應(yīng)底物，反應(yīng)的酶為廉價(jià)的國(guó)產(chǎn)蝸牛酶，反應(yīng)后的體系中除緩沖體系的成分外，反應(yīng)底物單體人參皂甙Rb1被完全轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物稀有人參皂甙IH-901，后續(xù)的產(chǎn)物提取非常簡(jiǎn)單。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的制備方法，由于采用單一底物和廉價(jià)的國(guó)產(chǎn)蝸牛酶，具有酶的來源豐富、原料成本低，以及反應(yīng)結(jié)束后體系中成分簡(jiǎn)單有利于產(chǎn)物提取等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12P33/20GK101671714SQ20091019315
公開日2010年3月17日 申請(qǐng)日期2009年10月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月13日
發(fā)明者毅 林 申請(qǐng)人:華僑大學(xué)