專利名稱：一種華貴櫛孔扇貝橙黃殼色分子標(biāo)記及其鑒定方法和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及水生生物基因工程領(lǐng)域，具體涉及貝類殼色分子標(biāo)記和遺傳鑒定技
術(shù)，尤其涉及一種華貴櫛孔扇貝橙黃殼色分子標(biāo)記及其鑒定方法和試劑盒。
背景技術(shù)：
在漫長的人類歷史中，人們常常著迷于貝殼絢麗的色彩和豐富的形態(tài)。殼色的
多態(tài)性往往與許多其他的生物學(xué)特征有著緊密的聯(lián)系，例如生物化學(xué)特性、遺傳特征、遺
傳漂變、定向選擇、頻率制約選擇等(Jones et al. ， 1977 ;Legates and Warwick, 1990 ;
Hedegaard et al. ， 2006)，因此，這一特性也一直吸引著生物學(xué)家的關(guān)注。 根據(jù)許多實(shí)驗(yàn)的交叉數(shù)據(jù)顯示，軟體動(dòng)物的殼色變化是遵循遺傳學(xué)規(guī)律的(David
and Leslie, 1977 ;Kraeuter et al. ， 1984 ;Adamkewicz and Castagna， 1988)。 關(guān)于殼色
多態(tài)性的研究報(bào)告指出，殼色的基本遺傳原理相對(duì)比較簡單，殼色的多態(tài)是由一或兩個(gè)顯
性位點(diǎn)所控制(I騰s and Haley， 1977 ;Palmer， 1985 ;Ekendahl and Joha騰sson， 1997 ; Yusa，2004)，而更加精細(xì)的多態(tài)表型則可能由相對(duì)更復(fù)雜的遺傳系統(tǒng)所控制(Peignon et al. ，1995 ;Winkler et al. ， 2001)。 海灣扇貝、牡蠣、鮑和馬氏珠母貝的殼色作為一個(gè)可見的遺傳標(biāo)記已經(jīng)應(yīng)用于遺 傳育種中。Gary等(1980)對(duì)貽貝Mytilus edulis不同殼色群體進(jìn)行雜交實(shí)驗(yàn)，形成的分離 家系的研究中，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)群體間的殼色多態(tài)性存在相當(dāng)頻率的差異，并且在不同群體間棕 色個(gè)體比藍(lán)色個(gè)體要小10 20%。日本馬氏珠母貝Pinctada fucata martensii的殼色 有褐色(最常見)、紅色、黃色和白色四種，野生和養(yǎng)殖群體里白色貝非常稀少，曾在一些自 交群體里發(fā)現(xiàn)過白色個(gè)體(Wada， 1986a， 1986b)。白殼色性狀有可能是由隱性基因控制的。 鄭懷平等(2003)建立了不同殼色海灣扇貝Argopecten purpuratus家系，并在此基礎(chǔ)上獲 得了部分紅殼色海灣扇貝，通過自交、雜交和定向選育方法培育出不同顏色的海灣扇貝，建 立了海灣扇貝"殼色_數(shù)量性狀復(fù)合選擇和自交_定向選育_小群體平衡"的育種模式。
有關(guān)貝類殼色的研究主要是關(guān)于其多態(tài)性的或培育新品種，殼色性狀相關(guān)的分子 標(biāo)記的研究還非常少，Qin等(2007a， 2007b)采用AFLP分子標(biāo)記，構(gòu)建了海灣扇貝的殼色 連鎖遺傳圖譜，有助于研究殼色遺傳的理論依據(jù)，并且有助于通過選擇育種得到特定的殼 色品種。 華貴櫛孔扇貝(Chlamys nobilis)是一種被熟知的擁有豐富亮麗殼色的重要海洋 水產(chǎn)貝類。其主要?dú)ど辛咙S色、橙黃色、黃褐色、淺紫褐色、紫色、赭色、淡紅色等。而在養(yǎng) 殖生產(chǎn)中，殼色性狀時(shí)常是一項(xiàng)重要的選育指標(biāo)。不同的殼色的扇貝在商品市場上的價(jià)格 也有差異，顏色漂亮的往往能有更高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。然而，有關(guān)扇貝華貴櫛孔扇貝殼色特異分 子標(biāo)記及其遺傳鑒定的分子生物學(xué)技術(shù)，目前國內(nèi)外都未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種華貴櫛孔扇貝橙黃殼色分子標(biāo) 記。 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種利用上述華貴櫛孔扇貝殼色分子標(biāo)記鑒定華 貴櫛孔扇貝殼色的方法。 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種華貴櫛孔扇貝遺傳鑒定試劑盒。
本發(fā)明的上述目的是通過如下方案予以實(shí)現(xiàn)的 —種華貴櫛孔扇貝橙黃殼色分子標(biāo)記，該分子標(biāo)記的核苷酸序列如SEQID NO :1 所示。 上述華貴櫛孔扇貝橙黃殼色分子標(biāo)記的篩選方法采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所常用的
AFLP分析方法，包括如下步驟 (1)華貴櫛孔扇貝基因組DNA的制備； (2)采用AFLP分析方法對(duì)步驟(1)制備的基因組DNA進(jìn)行分析 對(duì)步驟(1)制備所得DNA模板依次進(jìn)行酶切、連接、預(yù)擴(kuò)增、選擇性擴(kuò)增和電泳分
析； 本發(fā)明的AFLP分析方法采用本領(lǐng)域技術(shù)人員的常規(guī)操作，該分析方法中涉及到 的酶切采用常用的EcoRI和Msel雙酶切；本發(fā)明采用AFLP分析方法是引物設(shè)計(jì)的常規(guī)方 法，涉及一系列用于預(yù)擴(kuò)增和選擇性擴(kuò)增的引物，最后篩選出一組引物E-AAG和M-CAA，發(fā) 現(xiàn)該組引物的電泳結(jié)果中，出現(xiàn)了華貴櫛孔扇貝橙黃殼色特異性片段；
(3)根據(jù)上述電泳分析結(jié)果，引物E-AAG和M-CAA組合擴(kuò)增出一個(gè)橙黃殼色特異的 DNA片段，長度為176bp，將該片段切膠回收，采用常規(guī)克隆手段制備陽性克隆送交測序，結(jié) 果得出該橙黃殼色特異的DNA片段其核苷酸序列如SEQ ID NO:l所示。
利用BLASTn軟件在GenBank數(shù)據(jù)庫中對(duì)上述獲得的橙黃殼色特異的DNA片段進(jìn) 行同源性搜索，結(jié)果表明并無同源序列存在，說明這1個(gè)序列為華貴櫛孔扇貝的新序列，該 橙黃殼色特異的DNA片段僅僅存在于橙黃殼色樣品中，在其余顏色的樣品中不存在，因此 該橙黃殼色特異的DNA片段(核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示)可作為華貴櫛孔扇貝橙黃 殼色分子標(biāo)記。 上述華貴櫛孔扇貝橙黃殼色分子標(biāo)記可用于華貴櫛孔扇貝殼色的遺傳鑒定，從而 對(duì)華貴櫛孔扇貝進(jìn)行遺傳育種。 本發(fā)明人根據(jù)核苷酸序列如SEQ ID NO : 1所示的貴櫛孔扇貝橙黃殼色特異性DNA 片段，設(shè)計(jì)出一對(duì)特異性引物，利用該引物可以對(duì)華貴櫛孔扇貝殼色進(jìn)行遺傳鑒定，所述特 異性引物為 引物l，其核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示;
引物2，其核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示。 —種利用本發(fā)明華貴櫛孔扇貝橙黃殼色分子標(biāo)記對(duì)華貴櫛孔扇貝殼色進(jìn)行遺傳 鑒定的方法，該鑒定方法包括如下步驟
(1)提取待測樣品基因組DNA ; (2)采用引物l(其核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示)和引物2(其核苷酸序列如 SEQ ID N0:3所示)，對(duì)步驟(1)提取的待測樣品基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，若擴(kuò)增結(jié)果產(chǎn)
4生了 142bp的序列如SEQ ID NO:l所示的特異DNA片段，則說明待測樣品為遺傳上的橙黃 殼色個(gè)體，如果沒有特異的DNA片段則認(rèn)為是遺傳上的非橙黃殼色個(gè)體，從而實(shí)現(xiàn)了華貴 櫛孔扇貝殼色的遺傳鑒定。 上述鑒定方法中，PCR反應(yīng)體系以及反應(yīng)條件可采用市售的PCR試劑盒，均可實(shí)現(xiàn) 本發(fā)明；PCR反應(yīng)體系優(yōu)選含有1. 5mM MgCl2、200iiM dNTPs、引物10. 5 ii M、引物20. 5 ii M、 1. Oil L基因組DNA和O. 03U/ii L ExTaq DNA聚合酶；PCR反應(yīng)條件優(yōu)選95°C 30s，66°C 20s， 72°C 15s，總共35個(gè)循環(huán)。 根據(jù)上述鑒定方法，還可以制備對(duì)華貴櫛孔扇貝進(jìn)行遺傳鑒定的鑒定試劑盒，鑒定 試劑盒中含有引物1和引物2，引物1的核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示，引物2的核苷酸序 列如SEQ ID N0:3所示，試劑盒中的其他物質(zhì)可參考常規(guī)PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系的組成進(jìn)行搭配， 根據(jù)最終的擴(kuò)增產(chǎn)物是否含有142bp的特異性目的片段，即可對(duì)待測樣品進(jìn)行快速鑒定。
上述鑒定試劑盒也可以配套跟隨一個(gè)陽性對(duì)照品，將擴(kuò)增結(jié)果和陽性對(duì)照的PCR 擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，如果待測樣品與陽性對(duì)照一樣在142bp處出現(xiàn)目的片段，則說明該待 測樣品為遺傳上的橙黃殼色個(gè)體，如果待測樣品沒有出現(xiàn)142bp的目的片段，則說明待測 樣品為遺傳上的非橙黃色個(gè)體。 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果 1.本發(fā)明通過AFLP分析方法得到一條華貴櫛孔扇貝橙黃殼色分子標(biāo)記，該分子 標(biāo)記特異性高，可用于貝殼殼色的遺傳鑒定，且鑒定結(jié)果準(zhǔn)確率可高達(dá)100% ;
2.利用本發(fā)明的橙黃殼色分子標(biāo)記以及鑒定方法，可以對(duì)華貴櫛孔扇貝進(jìn)行遺傳 育種分析，找到所需的橙黃殼色個(gè)體，從而實(shí)現(xiàn)較高的商業(yè)價(jià)值； 3.本發(fā)明提供的鑒定試劑盒可通過引物1和引物2，從大量樣品中PCR擴(kuò)增篩選 出所需個(gè)體，簡化了選擇育種的操作。


圖1為華貴櫛孔扇貝橙黃殼色個(gè)體的AFLP引物組合(E-ACC/M-CTC)的擴(kuò)增電泳 圖譜； 圖2為華貴櫛孔扇貝紫色殼色個(gè)體的AFLP引物組合(E-ACC/M-CTC)的擴(kuò)增電泳 圖譜； 圖3為實(shí)施例2中華貴櫛孔扇貝橙黃殼色個(gè)體的擴(kuò)增電泳結(jié)果圖； 圖4為實(shí)施例2中華貴櫛孔扇貝紫色殼色個(gè)體的擴(kuò)增電泳結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步地描述，但具體實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任 何限定。 實(shí)施例1華貴櫛孔扇貝橙黃殼色分子標(biāo)記的制備 本實(shí)施例的華貴櫛孔扇貝橙黃殼色分子標(biāo)記其制備方法包括如下幾個(gè)步驟 (1)華貴櫛孔扇貝基因組DNA的提取； (2)華貴櫛孔扇貝基因組DNA的AFLP分析； (3)特異性DNA片段的獲得及測序。
上述三個(gè)步驟的詳細(xì)操作如下
(1)華貴櫛孔扇貝基因組DNA的提取 選擇40個(gè)華貴柿孔扇貝橙黃殼色個(gè)體和40個(gè)華貴柿孔扇貝紫色殼色個(gè)體，總共 80個(gè)樣品分別采用QIAGEN QIAamp DNA Mini Kit試劑盒(Germany)提取基因組DNA，提取 方法參考試劑盒說明書。 (2)華貴櫛孔扇貝基因組DNA的AFLP分析 基因組DNA的AFLP分析采用本領(lǐng)域技術(shù)人員的常規(guī)操作，主要分為如下4步
a.酶切和連接 首先將lOOng基因組DNA用EcoRI (0. 125 ii L， 20U/ ii L)和Msel (0. 25 ii L， 10U/ iiL)酶切(20iiL反應(yīng)體系)，37。C溫育6h，70。C處理20min ;之后再加入5iiL連接混合 液，連接混合液包括0. liiL T4DNA連接酶(400U/iiL)、0. 5iiL NE Buffer 2(10X)、 0.025 iiL BSA(10mg/mL) 、1. 25ii L ATP (lOOmmol/L) 、 EcoRIadapter (5pmol/L)禾口 Mselad即ter(50pmol/L)各O. 5ii L， 16。C溫育10h， 72。C處理20min ;酶切和連接操作中所涉 及到的試劑均為市售。
b.預(yù)擴(kuò)增 將上述連接產(chǎn)物用預(yù)擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)體系為20 ii L :10XPCR緩 沖液2 ii L、2mmol/L dNTPs 2 ii L、25mmol/L MgCl2 1. 2 ii L、 EcoRI預(yù)擴(kuò)弓|物(10 ii mol/L) 0. 6 ii L、 Msel預(yù)擴(kuò)引物(10iimol/L)0. 6ii L、Taq酶(5U/iiL)0. 25 ii L和連接產(chǎn)物lyL，PCR反應(yīng)程 序?yàn)?4°C 30s，53。C 30s，72。C 60s， 30個(gè)循環(huán)。
c.選擇性擴(kuò)增 將上述預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物用去離子超純水稀釋IO倍后作為選擇性擴(kuò)增的模板，反應(yīng) 體系為20ii L :2. OmM MgCl2，200iiM dNTPs， 0. 5 ii M選擇性引物，1. Oii LDNA禾P 0. 06U/ii L ExTaq酶(Takara， J即an)。擴(kuò)增條件為94。C，30s ;60。C，30s ;72。C，60s，30個(gè)循環(huán)。
d.電泳 選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物采用6%聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染的方法來檢測，觀察80個(gè)樣 品電泳圖上條帶的分布情況，電泳圖如圖1和圖2所示，其中早$為兩個(gè)親本個(gè)體，其他為 子代個(gè)體。 通過對(duì)比觀察圖1和圖2可以看出，E-AAG/M-CAA的引物組合擴(kuò)增出一條橙黃殼 色特異的DNA片段，長度為176bp，將此片段命名為Blfl76，該特異的DNA片段只在橙黃殼 色個(gè)體中出現(xiàn)，而在紫色個(gè)體中不出現(xiàn)，可作為橙黃殼色特異的DNA標(biāo)記。
(3)特異性DNA片段的獲得及測序
a.特異性DNA片段的回收 采用QIAEX II Gel Extraction Kit (QIAGEN， Germany)從變性聚丙烯酰胺凝膠中 將上述橙黃殼色特異的DNA片段電泳條帶進(jìn)行回收、純化；本步驟的操作按照試劑盒說明 書進(jìn)行即可。 b.特異性DNA片段的克隆 采用本領(lǐng)域技術(shù)人員的常規(guī)操作對(duì)上述切膠回收的DNA進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化和陽性克 隆篩選，最終獲得6個(gè)含有目標(biāo)片段的克隆進(jìn)行測序。
c.特異性DNA片段的測序
將上述6個(gè)陽性克隆，采用ABI 3730序列分析儀進(jìn)行橙黃殼色特異DNA片段的序 列分析，獲得華貴櫛孔扇貝橙黃殼色特異分子標(biāo)記，其核苷酸序列如SEQ ID NO:l所示。
利用BLASTn軟件在GenBank數(shù)據(jù)庫中對(duì)該標(biāo)記進(jìn)行同源性搜索，結(jié)果表明并無同 源序列存在，說明本實(shí)施例制備得到的特異性DNA片段(其核苷酸序列如SEQ ID NO:l所 示)為華貴櫛孔扇貝的新序列。 實(shí)施例2華貴櫛孔扇貝橙黃殼色特異分子標(biāo)記的應(yīng)用 本實(shí)施例選擇30個(gè)華貴柿孔扇貝橙黃殼色個(gè)體和30個(gè)華貴柿孔扇貝紫色殼色個(gè) 體，總共60個(gè)作為試驗(yàn)樣品，采用實(shí)施例1制備得到的華貴櫛孔扇貝橙黃殼色特異分子標(biāo) 記對(duì)這60個(gè)貝殼進(jìn)行遺傳鑒定，具體包括如下步驟
1.基因組DNA的提取60個(gè)貝殼樣品的基因組DNA提取QIAGEN QIAamp DNA Mini Kit試劑盒 (Germany)，操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。
2. PCR擴(kuò)增 根據(jù)實(shí)施例1制備所得華貴櫛孔扇貝橙黃殼色特異分子標(biāo)記(核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示)，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物用于遺傳鑒定
引物l，其核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示；
引物2，其核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示。 PCR擴(kuò)增體系為總體系為20 ii L， 1. 5mM MgCl2、200 ii M dNTPs、引物E-AAG 0. 5 ii M、弓|物M-CAA 0. 5 ii M、 1. 0 ii L模版(基因組DNA)禾卩0. 03U/ ii LExTaq DNA polymerase(Taka:ra， Japan)。 PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件95。C 30s，66。C 20s，72。C 15s ;總共35個(gè)循環(huán)。 采用上述PCR擴(kuò)增體系以及反應(yīng)條件對(duì)60個(gè)樣品分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物擴(kuò)
增產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。 從圖3和圖4中可以看出30個(gè)橙黃殼色個(gè)體都能擴(kuò)增得到長度為142bp目的片 段，而30個(gè)紫色個(gè)體都未擴(kuò)增得到該目的片段。 將30個(gè)橙黃殼色個(gè)體擴(kuò)增得到的目的片段分別進(jìn)行常規(guī)的切膠回收、純化、連接 和轉(zhuǎn)化等操作，最終得到的陽性克隆送交測序，測序結(jié)果30個(gè)橙黃殼色個(gè)體得到的目的片 段，其核苷酸序列與SEQ ID NO :1 —致。 由上述試驗(yàn)結(jié)果可以得出，本發(fā)明的華貴櫛孔扇貝橙黃殼色特異分子標(biāo)記具有較 高的準(zhǔn)確率，利用該分子標(biāo)記對(duì)華貴櫛孔扇貝進(jìn)行殼色的遺傳鑒定，其準(zhǔn)確率可達(dá)100%。 一種華貴櫛孔扇貝橙黃殼色分子標(biāo)記及其鑒定方法和應(yīng)用序列表
SEQUENCE LISTING 〈110〉中國科學(xué)院南海海洋研究所 〈120〉 一種華貴櫛孔扇貝橙黃殼色分子標(biāo)記及其鑒定方法和應(yīng)用
〈130〉
〈160>3 〈170>PatentIn version 3. 5
〈210>1
〈211>142
7
<212〉DNA〈213〉華貴櫛孔扇貝(Chlamys nobilis)〈400〉1agattccgca tggcattatc ctccgcgcac aggtgttggt atggaaccca aatetgctgt60atetategcg ctgtaattet ttgagatttg acacatttat gteccagtec ttcccacgtg120朋gctca朋t gacc朋ggtc tt142〈210〉2〈211〉23〈212〉DNA〈213〉人工合成〈400〉2aagaccttgg tcatttgagc ttc23〈210〉3〈211〉20〈212〉DNA〈213〉人工合成〈400〉3agattccgca tgg'cattetc20
權(quán)利要求
一種華貴櫛孔扇貝橙黃殼色分子標(biāo)記，該分子標(biāo)記的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。
2. 權(quán)利要求1所述華貴櫛孔扇貝橙黃殼色分子標(biāo)記在華貴櫛孔扇貝遺傳育種中的應(yīng)用。
3. —種利用權(quán)利要求1所述華貴櫛孔扇貝橙黃殼色分子標(biāo)記對(duì)華貴櫛孔扇貝進(jìn)行遺傳鑒定的鑒定方法，其特征在于該方法包括如下步驟(1) 待測樣品基因組DNA的制備；(2) 采用引物1和引物2對(duì)上述待測樣品基因組DNA進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增；弓l物1的核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示；弓l物2的核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示；(3) 根據(jù)上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中是否含有權(quán)利要求1所述的華貴櫛孔扇貝橙黃殼色分子標(biāo)記從而對(duì)待測樣品進(jìn)行鑒定。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述鑒定方法，其特征在于所述步驟(2)中，PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系含有1. 5mM MgCl2、200iiM dNTPs、0. 5 ii M引物1、0. 5 ii M引物2、 1. 0 ii L基因組DNA和0. 03U/ii L ExTaq DNA聚合酶。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述鑒定方法，其特征在于所述步驟(2)中，PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為95°C 30s，66。C 20s，72。C 15s，總共35個(gè)循環(huán)。
6. —種華貴櫛孔扇貝遺傳鑒定試劑盒，其特征在于該試劑盒包含引物1和引物2，所述引物1的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述引物2的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
全文摘要
本發(fā)明公開一種華貴櫛孔扇貝橙黃殼色分子標(biāo)記及其鑒定方法和試劑盒，該分子標(biāo)記的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。利用本發(fā)明的分子標(biāo)記可對(duì)華貴櫛孔扇貝進(jìn)行遺傳鑒定的鑒定方法，其步驟為先制備待測樣品基因組DNA，然后采用引物1和引物2對(duì)待測樣品基因組DNA進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物即可對(duì)待測樣品進(jìn)行鑒定。本發(fā)明通過AFLP分析方法得到一條特異性高的華貴櫛孔扇貝橙黃殼色分子標(biāo)記，用于貝殼殼色的遺傳鑒定，鑒定結(jié)果準(zhǔn)確率可高達(dá)100％，可實(shí)現(xiàn)對(duì)大量華貴櫛孔扇貝進(jìn)行遺傳育種分析，找到所需的橙黃殼色個(gè)體，從而實(shí)現(xiàn)較高的商業(yè)價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N15/11GK101712992SQ20091019254
公開日2010年5月26日 申請日期2009年9月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月22日
發(fā)明者何毛賢, 袁濤, 黃良民 申請人:中國科學(xué)院南海海洋研究所