專利名稱:人胰島素及類似物在甲醇酵母中的雙啟動子表達和制備的制作方法
技術領域:
本發(fā)明涉及生物領域,具體的說,涉及人胰島素及其類似物在含雙重啟動子的甲 醇酵母中的表達和重組制備,包括相關表達載體和工程細胞的構建、重組人胰島素及其類 似物的表達和純化。
背景技術:
胰島素是由胰島β細胞受內源性或外源性物質如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰 高血糖素等的激動而分泌的一種蛋白質激素。胰島β細胞先合成前胰島素原,經專一性 蛋白酶作用形成胰島素。成熟胰島素分子由A、B兩個肽鏈組成。不同種族動物(人、牛、 羊、豬等)的胰島素功能大體相同,氨基酸序列稍有差異。成熟人胰島素(Insulin Human) A鏈有21個氨基酸,B鏈有30個氨基酸,共51個氨基酸,分子量約6000道爾頓。其中 A7 (Cys) -B7 (Cys)、A20 (Cys) -B19 (Cys)四個半胱氨酸中的巰基形成兩對鏈間二硫鍵,使A、 B兩鏈連接起來。此外,A鏈中A6 (Cys)與All (Cys)鏈內也存在一對二硫鍵,破壞二硫鍵既 能使胰島素的生物活性全部喪失。糖尿病(DM,Diabetes Mellitus)是一種胰腺功能病變的代謝疾病,特點是慢性高 血糖,伴隨因胰島素ansulin)分泌及/或作用缺陷引起糖、脂肪和蛋白質代謝紊亂。糖尿 病的病因由遺傳和環(huán)境因素相互作用而引起的臨床綜合癥(慢性、全身性、代謝性疾病); 是由于人體內胰島素絕對或相對缺乏所致,以高血糖為主要特征;是一種終生疾病。他可以 涉及全身各個系統(tǒng),甚至誘發(fā)許多致命性并發(fā)癥,嚴重影響人的勞動能力,并威脅人的生命 安全。隨著世界人口的老齡化,糖尿病已成為一種常見病、多發(fā)病。目前已成為繼癌癥、心 腦血管病之后,第三大威脅人類生命的疾病。胰島素是最有效的糖尿病治療藥物。對于I型糖尿病患者而言,胰島素是惟一的 治療藥物。此外,有30% 40%的II型糖尿病患者最終必需使用胰島素。胰島素的需求 量非常大,據國際糖尿病聯(lián)盟(IDF)有關統(tǒng)計表明,在二十世紀八十年代中期,糖尿病患者 總量在3000萬左右,至九十年代中期十年間,已增長4倍達到1. 2億。2007年全球約2. 46 億人患糖尿病,每年新增糖尿病人數700萬人。若不采取任何措施,到2025年全世界糖尿 病患者將增加到3. 8億,將占到世界成年人口的7. (Facts and Figures =Diabetes and Cardiovascular Disease)。1921年多倫多大學的兩位研究人員Frederick Banting和Charles Best,第一次 從動物的胰腺中提取出胰島素,從而開啟了人類用胰島素治療糖尿病的歷史。但動物胰島 素對人來說屬于異源蛋白,有較強的免疫原性,易出現(xiàn)過敏反應和注射部位脂肪萎縮,長期 應用可能產生抗體,導致療效降低。隨著生物技術的發(fā)展,重組人胰島素開發(fā)成功。1982年,Eli Lilly公司采用基因工程技術生產的重組人胰島素(Humulin R(rapid)andHumulin N(NPH))正式在美國上市。至今,上市的重組人胰島素及其類似物達 數種,包括普通、短效、超短效以及中長效胰島素。從批準臨床應用的重組人胰島素及其類 似物以及正在研發(fā)的重組人胰島素及其類似物來看,其表達宿主系統(tǒng)包括大腸桿菌、酵母、4哺乳動物細胞以及植物油體等,其中以大腸桿菌和釀酒酵母占主要。由于糖尿病病人使用 重組胰島素的總量逐年增加,且需要長期注射治療,因此如何更有效地解決重組人胰島素 及類似物的高效表達,低成本制備仍具有重大的開發(fā)和應用價值。目前通過基因工程技術生產的已被批準進入臨床應用的重組人胰島素及其類似 物主要有普通胰島素(Human hsulin,大腸桿菌表達系統(tǒng)生產)、賴脯胰島素(lispro大 腸桿菌表達系統(tǒng)生產)、地特胰島素(Detemir,酵母(Saccharomyces cerevisiae)表達系 統(tǒng)生產)、甘精胰島素(Glargine,大腸桿菌表達系統(tǒng)表達生產)、門冬胰島素(aspart,酵母 (Saccharomycescerevisiae)表達系統(tǒng)生產)、格魯辛胰島素(glulisine,大腸桿菌表達系 統(tǒng)生產)。本發(fā)明綜合現(xiàn)有重組人胰島素及類似物的結構及工藝過程生產(CN101291952A ;; USPat. 7091032 ;US Pat. 5395922 ;US Pat. 5618913 ;US Pat. 10524036 ;US Pat. 9955259 Xie Tet, al. Prep Biochem Biotechnol. 2008 ;38 (3) :308-17 ;Mansur M, et. al., Biotechnol Lett. 2005Mar ;27 (5) :339-45. ;Ding JG, et.al. , Acta Biochim Biophys Sin(Shanghai). 2005 Apr ;37 (4) :234-40 ;Kjeldsen Τ, Pettersson AF. Protein Expr Purif. 2003 Feb ;27 (2) :331-7. ;Wang Y, et.al.,Sheng WuHua Xue Yu Sheng Wu Wu Li Xue Bao (Shanghai). 1999 ;31 (5) :587-589 ;Kjeldsen Τ, et.al. , Biotechnol Genet Eng Rev. 2001 ;18 :89-121. ;Kjeldsen T,et.al.,J Biol Chem. 2002 May24 ;277 (21) :18245-8. Epub 2002 Mar 28. ;Kjeldsen Τ. Appl Microbiol Biotechnol. 2000S?。?4 (3) :277-86.; Kjeldsen T et. al. , Biotechnol Appl Biochem. 1999 Feb ;29 (Pt 1) :79-86. ;ShinCS, et.al. , Biotechnol Prog. 1997 May-Jun ; 13(3) :249-57. ;Kjeldsen Τ, et. al. , Protein Expr Purif. 1997 Apr ;9 (3) :331-6. ;Zhang Y, et. al. , Sci China C Life Sci.1996Jun ; 39(3) :225-33. ;Kozlov DG,et. al.,Yeast. 1995Jun 30 ;11 (8) :713-24. ;Thim L,et. al., FEBS Lett. 1987Feb 23 ;212(2) :307-12. ;Cousens LS, et. al. , Gene. 1987 ;61 (3) 265-75. ;Stepien PP, et. al.,Gene. 1983 Oct ;24 (2-3) :289-97),結合現(xiàn)代基因工程重組 技術,提供了一種在甲醇酵母中雙重誘導高效表達體系制備重組人胰島素及其類似物的方 法,包括相關雙重表達載體和工程細胞的構建、優(yōu)化的發(fā)酵工藝和高效的純化工藝,從而能 有效地降低重組人胰島素及其類似物的生產成本。
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種在甲醇酵母中雙重誘導高效表達體系制備重組人胰島 素及其類似物的方法。本專利所述的人胰島素及其類似物具有如下氨基酸序列的特征α 鏈=Giveqcctsicslyqlenycx1β 鏈 tvnqhlcgshlvealylvcgergffyi^ya其中1)當\為氨基酸N時,X2為氨基酸R、K、D、P中任何一種,Y1為氨基酸K,P,E中 任何一種,Z1為氨基酸T ;2)或當\為氨基酸N時,X2Y1為氨基酸I3K,其中τγ氨基酸缺失;3)或當&為氨基酸G時,X2Y1為氨基酸PK,Z1為氨基酸TRR。
4)優(yōu)選如下氨基酸序列
權利要求
1.人胰島素及其類似物在含雙重啟動子的甲醇酵母中的表達和重組制備。
2.權利要求1所述的人胰島素及其類似物,其特征在于,所述人胰島素及其類似物具 有如下氨基酸序列A 鏈=Giveqcctsicslyqlenycx1B 鏈FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYT)(2YA 其中1)當\為氨基酸N時,X2為氨基酸R、K、D、P中任何一種,Y1為氨基酸K,P,E中任何 一種,Z1為氨基酸T ;2)或當\為氨基酸N時,X2Y1為氨基酸PK,其中τγ氨基酸缺失;3)或當&為氨基酸G時,X2Y1為氨基酸PK,Z1為氨基酸TRR。
3.權利要求1所述的含雙重啟動子的甲醇酵母表達,其特征在于,采用基因工程重組 技術,將權利要求2中的相應人胰島素及其類似物的氨基酸序列以單鏈的形式構建含AOX 和GAP啟動子的重組甲醇酵母分泌表達體系,具有如下結構式S-B-L-A 式中S為引導肽,其氨基酸序列為EAEAEFR或EAEFR或EFR ; B為相對應的權利要求2中人胰島素及其類似物的B鏈氨基酸序列; A為相對應的權利要求2中人胰島素及其類似物的A鏈氨基酸序列; L為連接肽,連接人胰島素及其類似物的B鏈和A鏈。
4.權利要求3中所述的連接肽,其特征在于,連接肽的長度為6 20個氨基酸序列, 其中至少含有3個酸性氨基酸(Asp或Glu),第一位和最后一位氨基酸必須為堿性氨基酸 (Lys 或和 Arg)。
5.權利要求3,4任一項所述連接肽,優(yōu)選序列為RDADDKR、REEAEAKR、 RDAEAEADRDR、RAAK, REEADDKR、REAEDKR、REEAEADDKR、DADDKR、 EEAEAKR、EAEDKR、DAEAEADRDR、AAK、EEADDKR、EEAEADDKR。
6.權利要求1,3任一項所述的甲醇酵母,其特征在于,所述甲醇酵母為畢赤酵母屬 (Pichia),或漢森酵母屬(Hansenula),或球擬酵母屬(Torulopsis),優(yōu)選畢赤酵母屬。
7.權利要求6所述的畢赤酵母,其特征在于,采用的宿主菌為GS115,或SMD116,或 X33,優(yōu)選 GS115。
8.權利要求3所述的重組甲醇酵母分泌表達系統(tǒng),其特征在于,所述甲醇酵母分泌表 達系統(tǒng)采用的含AOXl啟動子的表達載體,或含GAP啟動子的表達載體,或同一宿主細胞中 同時含AOXl啟動子和GAP啟動子的雙重表達載體;優(yōu)選同一宿主細胞中同時含AOXl啟動 子和GAP啟動子的雙重表達載體。
9.權利要求8所述的載體,其特征在于,含AOXl啟動子的載體為pPIC9K,含GAP啟動 子的載體為PGAPZ。
10.權利要求8所述同一宿主細胞中中同時含AOXl啟動子和GAP啟動子的人胰島素及 其類似物雙重表達載體的構建方法,其特征在于,包括如下步驟a)將權利要求2中相應的人胰島素及其類似物的DNA基因序列克隆到pPIC9K上的 WcoRI和NotI之間,構建以AXOl為啟動子α因子為分泌信號的重組質粒的酵母菌并進行表達篩選,命名為pPIC9K-INS ;b)將權利要求2中相應的人胰島素及其類似物的DNA基因序列克隆到pGAPZaA 上的EcoRI和NotI之間,構建以GAP啟動子α因子為分泌信號的重組質粒,命名為 pGAPZ α A-INS(INS代表人胰島素及其類似物的B鏈和A鏈的單鏈S-B-L-A前體⑶NA序 列);c)線性化pPIC9K-INS和pGAPZα A-INS質粒,分別轉化畢赤酵母宿主細胞GSl 15 ;d)利用含不同濃度G418或^ocin的平板分別單獨篩選含多拷貝重組質粒的酵母菌, 并進行表達篩選。篩選表達量高的分別命名為PPIC9K-INS/GS115和pGAPZ α A-INS/GS115 菌株;e)以pPIC9K-INS/GS115菌株制備感受態(tài),將pPGAPZaA_INS質粒用AvrII線性化后,轉 化pPIC9K-INS/GS115菌株中,用kocin或kocin/G418加壓篩選含雙啟動子的重組子,命 名為 pPIC9K-pGAPZ α A-INS/GS115 工程菌株;f)或以pGAPZα A-INS/GS115表達工程菌株制備感受態(tài),將pPIC9K_INS質粒用&icl線 性化后,轉化?64 2 0々-1賂/^115菌株中,用G418或G418/Zeocin加壓篩選含雙啟動子的 表達載體的重組子的酵母菌,命名為pGAPZ α A-pPIC9K-INS/GS115工程菌株。
11.權利要求1所述的重組人胰島素及其類似物的制備方法,其特征在于,含雙重啟動 子的工程菌株,經適合的生長培養(yǎng)和表達培養(yǎng),獲得分泌表達的目的蛋白。含目的蛋白的發(fā) 酵液通過常規(guī)的層析技術分離,獲得純度大于95%的目的蛋白。
12.權利要求11所述的適合的生長培養(yǎng)和表達培養(yǎng),其特征在于,生長培養(yǎng)時,溫度控 制在250C -30ρΗ控制在3-6,DO彡20% ;葡萄糖耗盡后,再限制性流加葡萄糖2-30小 時,然后再限制性流加甲醇,直到發(fā)酵結束。葡萄糖耗盡到發(fā)酵結束的整過過程溫度控制在 15°C _30°C,優(yōu)選22°C ;ρΗ用氨水控制在3-7,優(yōu)選4-6。
13.權利要求11所述的常規(guī)的層析技術,其特征在于,發(fā)酵液上清經超濾和前處理,再 經過陽離子或大孔樹脂或巰水層析分離,分離的目的蛋白再經蛋白酶酶切,酶切樣品再經 反相色譜分離純化,獲得高純度的人重組胰島素及其類似物,然后再結晶或冷凍干燥。
全文摘要
本發(fā)明公開了人胰島素及其類似物在含雙重啟動子甲醇酵母中的表達和高效制備方法,其特征為,通過在甲醇酵母宿主細胞中進行含雙重啟動子的表達載體和工程細胞的構建、優(yōu)化的發(fā)酵工藝和高效的純化工藝,制備重組人胰島素及其類似物,進而有效地降低重組人胰島素及其類似物的生產成本。
文檔編號C12R1/78GK102051372SQ20091019124
公開日2011年5月11日 申請日期2009年10月27日 優(yōu)先權日2009年10月27日
發(fā)明者張益 , 張繼蘭, 范開, 陳勇, 陳海容, 高劍坤 申請人:重慶富進生物醫(yī)藥有限公司