專利名稱：豬繁殖與呼吸綜合征病毒m蛋白ctl細(xì)胞表位及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種細(xì)胞表位的識別和鑒定，尤其涉及豬繁殖與呼吸綜合征病毒M蛋 白CTL細(xì)胞表位的識別和鑒定，本發(fā)明還涉及表達(dá)M蛋白的WR株牛痘病毒的重組病毒，屬 于豬繁殖與呼吸綜合征的防制領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)引起的豬的一種高度傳染病，又稱"豬藍(lán)耳病"。本病以妊娠母豬的繁殖障 礙(后期流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎、弱胎)及各種年齡豬特別是仔豬的呼吸道疾病(間質(zhì)性肺 炎)為特征。1987年在美國中西部首先發(fā)現(xiàn)該病，1991年7月由荷蘭中央獸醫(yī)研究所首次 分離出豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)，并命名為Lelystadvirus (Lv)，其后在加拿大、 德、法、荷蘭、英、西班牙、比利時、澳大利亞、日本、菲律賓等國家發(fā)生，曾被稱為"豬神秘 病"(Swine mystery disease, SMD)、"豬藍(lán)耳病"(Blue-ear disease)、豬不孕與呼吸綜合 征(SIRS)。 1992國際獸疫局在國際專家研討會上采用豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)這一名 稱。同年，國際獸疫局(0IE)將該病列為B類傳染病。20世紀(jì)90年代以來，PRRSV幾乎已 傳播到世界上所有養(yǎng)豬的國家，成為危害規(guī)模化養(yǎng)豬業(yè)的重要傳染病，嚴(yán)重阻礙了世界養(yǎng) 豬業(yè)的發(fā)展。 我國于1996年首次分離到PRRSV，并將其命名為CH-la株，屬于北美洲型。自分離 到首株P(guān)RRSV以來，該病已嚴(yán)重阻礙了我國養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。尤其是2006年5月以來，在我 國南方由變異的高致病性PRRSV引發(fā)的以高熱、高發(fā)病率和高死亡率為特征的豬傳染病， 對我國養(yǎng)豬業(yè)特別是養(yǎng)豬業(yè)比較發(fā)達(dá)的省份造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前雖有商品化的弱 毒疫苗和滅活苗被用于該病的防制。但由于PRRSV的變異與重組、病毒的ADE特性以及其 主要侵害免疫系統(tǒng)[而且還可以造成感染豬群的持續(xù)感染等因素，致使現(xiàn)有疫苗難以有效 控制該病的發(fā)生。對于病毒傳染性疾病，只有在搞清楚其發(fā)病機(jī)制與免疫機(jī)制的基礎(chǔ)上，才 能更加有效地開展預(yù)防與治療研究工作。關(guān)于PRRS的免疫機(jī)制，目前尚缺乏系統(tǒng)的了解。 很長時間以來，有不少學(xué)者認(rèn)為體液免疫在防制PRRS方面發(fā)揮主要作用，這在一定程度上 促使了有關(guān)PRRS的體液免疫的研究，也為預(yù)防和控制該病的發(fā)生起到了積極的作用。而有 關(guān)該病細(xì)胞免疫方面的研究不過深入，這導(dǎo)致我們對PRRS的免疫機(jī)制缺乏全面了解。
對于大多數(shù)病毒性疾病，細(xì)胞免疫在清除病毒感染方面的作用不容忽視。細(xì)胞毒 性淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)是機(jī)體有效控制各種病毒感染及抗腫瘤、抗移 植物的免疫細(xì)胞之一。在病毒感染時，MHC I類分子限制的抗原特異性CTL反應(yīng)是清除病 毒、控制病毒復(fù)制和擴(kuò)散的主要機(jī)制。對大多數(shù)病毒性疾病來說，體液免疫與細(xì)胞免疫在清 除病毒感染過程中是相輔相成不可或缺的。研究證實(shí)，PRRSV感染后可以誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生體液 免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答，尤其是近來的研究表明，細(xì)胞免疫在清除機(jī)體PRRSV感染方面 可能起著更重要的作用，這為我們進(jìn)一步開展研究PRRS的細(xì)胞免疫機(jī)制提供了理論依據(jù)。
M蛋白是PRRSV的膜基質(zhì)蛋白，也是北美洲和歐洲株結(jié)構(gòu)蛋白中最為保守的蛋白。 并且該蛋白具有較強(qiáng)的免疫原性，可誘導(dǎo)產(chǎn)生一定的中和抗體和特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答，而 且其與GP5蛋白誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)可能與感染豬清除體內(nèi)PRRSV有關(guān)。張治濤等人研究表明， 重組腺病毒表達(dá)的M蛋白、GP5及其二者的融合蛋白對豬具有較強(qiáng)的免疫效力。這些資料 均表明，PRRSV M蛋白在PRRSV與機(jī)體相互作用的過程中扮演著十分重要的角色。
CTL細(xì)胞表位是指胞內(nèi)抗原經(jīng)抗原遞呈細(xì)胞(APC)加工后與主要組織相容性復(fù)合 體(MHC)I類分子結(jié)合，并共同被特異性遞呈給T細(xì)胞受體(TCR)從而引起CTL免疫應(yīng)答的 短肽。確定CTL細(xì)胞表位對于研究病毒感染的細(xì)胞免疫機(jī)制、發(fā)病機(jī)制、免疫應(yīng)答機(jī)制以及 研制多肽疫苗和基因疫苗等具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明之一是提供一株重組牛痘病毒，該重組牛痘病毒含有PRRSV M基因；
本發(fā)明之二是識別和鑒定豬繁殖與呼吸綜合征病毒M蛋白的CTL細(xì)胞表位；
本發(fā)明上述目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的 —株重組牛痘病毒，其微生物保藏號是CGMCC NO. 3206 ;分類命名為痘病毒；保 藏時間是2009年7月23日；保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心； 保藏地址北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所。
—種構(gòu)建上述重組牛痘病毒的方法，包括以下步驟將豬繁殖與呼吸綜合征病毒
M基因克隆到pSCll上得到重組牛痘病毒轉(zhuǎn)移載體pSCll-PRRSV-M ;將WR株牛痘病毒液稀 釋后接種于TK—143細(xì)胞，37t:感作1 2h ;將轉(zhuǎn)移重組質(zhì)粒pSCll-PRRSV-M在脂質(zhì)體的介 導(dǎo)下轉(zhuǎn)染到已感染病毒的單層TK—143細(xì)胞上；篩選，鑒定，得到重組病毒rWR-PRRSV-M。
在動物機(jī)體受到病毒感染時，由MHC I類分子限制的抗原特異性CTL反應(yīng)是清除 病毒、控制病毒復(fù)制和擴(kuò)散的主要機(jī)制[6]。 CTL表位一般是由8-11個氨基酸構(gòu)成，其在CTL 免疫應(yīng)答過程中扮演著十分重要的角色，其決定了 CTL特異性殺傷效應(yīng)。因此，CTL表位的 鑒定具有重要意義。 本發(fā)明利用預(yù)測合成的短肽對免疫小鼠的脾淋巴細(xì)胞進(jìn)行體外剌激，然后利用 細(xì)胞內(nèi)胞內(nèi)因子染色法(Intracellular cytokine staining, ICS)與酶聯(lián)斑點(diǎn)免疫法 (Enzyme-link Immunospot Assay,ELISP0T)兩種實(shí)驗(yàn)方法檢測IFN-y分泌情況。結(jié)果表 明，小鼠脾淋巴細(xì)胞經(jīng)PMA+Ionomycin組合物及K93FITSRCRL和F57GMTFVHF兩條短肽剌激 后，可以檢測到分泌IFN- y的CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞，而經(jīng)不相關(guān)肽和其它短肽剌激后沒有檢 測到分泌IFN-y的T淋巴細(xì)胞。這說明在陽性對照與陰性對照成立的條件下，K^FITSRCRL 和F57GMTFVHF兩條短肽均能剌激記憶性CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞，使其增值并分泌IFN- y ，因 此，可確認(rèn)K93FITSRCRL和F57GYMTFVHF兩條肽段即為PRRSV M蛋白針對BALB/c小鼠的CTL 表位。 考慮到鑒定CTL表位對實(shí)驗(yàn)動物模型及其生物安全級別均有較高的要求及實(shí)驗(yàn) 條件，本發(fā)明最終選用SPF級近交系BALB/c小鼠作為動物模型。由于PRRSV不感染小鼠， 本發(fā)明在構(gòu)建DNA疫苗的同時又構(gòu)建了表達(dá)PRRSV M蛋白的牛痘重組病毒。在此基礎(chǔ)上采 用Priming-Boosting策略免疫小鼠，這樣不僅增強(qiáng)了免疫效果，也為Priming-Boosting策 略的免疫效果提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。鑒于單一的CTL表位預(yù)測方法的原理及側(cè)重點(diǎn)不同，本發(fā)明利用SYFPEITHI、 BIMAS、 PREDBALB/e三種常用的生物信息學(xué)預(yù)測方法同時對PRRSV M蛋白 氨基酸序列進(jìn)行預(yù)測，然后篩選并化學(xué)合成短肽，這樣不僅提高了準(zhǔn)確率，也節(jié)省了人力物 力。 目前用于鑒定CTL表位的實(shí)驗(yàn)方法有很多，主要包括51Cr釋放法、熒光測定 法、有限稀釋法(Limiting dilution analysis, LDA) 、 MHC 1/肽四聚體技術(shù)(MHC 1/ p印tidetetr咖er)、細(xì)胞內(nèi)胞內(nèi)因子染色法(Intracellular cytokine staining, ICS)、酶 聯(lián)斑點(diǎn)免疫法(Enzyme-link Immunospot Assay, ELISP0T)。鑒定CTL表位的一個主要指 標(biāo)就是分泌IFN- y的CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞的數(shù)量，因此本發(fā)明將免疫鼠的脾淋巴細(xì)胞用短 肽進(jìn)行體外剌激，然后利用PerCP標(biāo)記的土撥鼠抗小鼠CD3e抗體、PE標(biāo)記的大鼠抗小鼠 CD8a抗體及FITC標(biāo)記的大鼠抗小鼠的IFN-y抗體進(jìn)行三色熒光染色，具體原理是以總T 淋巴細(xì)胞(CD3+T淋巴細(xì)胞)設(shè)門，然后圈定CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞，在此基礎(chǔ)上直接檢測分泌 IFN- y的CD8+T淋巴的數(shù)量，這樣就能從單個CD8+T淋巴細(xì)胞水平上來反映細(xì)胞因子的分泌 情況，試驗(yàn)結(jié)果更加直接可靠。為驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果的可靠性，本發(fā)明又進(jìn)行了 ELISPOT實(shí)驗(yàn)。 對于本發(fā)明而言，該實(shí)驗(yàn)檢測的是所有分泌IFN- y的T淋巴細(xì)胞，而ICS是檢測特異性分 泌IFN-y的CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞，將這兩種方法結(jié)合在一起，這樣通過兩種實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一致 性更能說明鑒定結(jié)果的可靠性。 腿C分子在小鼠上被稱為H-2分子，因而H-2即代表了小鼠的腿C復(fù)合體，其基因 位于小鼠第17號染色體上。其中經(jīng)典的H-2I類基因包括H-2K、 H-2D和H_2L三個亞類。 對BALB/c小鼠來說，編碼H-2分子的等位基因?yàn)閐，故BALB/c小鼠的H_2I類分子就包括 H-2Kd、H-2Dd和H-2Ld三個亞類。本發(fā)明鑒定出了兩個CTL表位，其中K93FITSRCRL為H_2Kd 限制性的CTL表位，而F57GMTFVHF為H_2Dd限制性的CTL表位。即PRRSV M存在一個H_2Kd 限制性的CTL表位和一個H-2Dd限制性的CTL表位。 PRRSV給世界養(yǎng)豬業(yè)造成的危害越來越引起人們的重視，各國學(xué)者也紛紛在為有 效的預(yù)防控制該病而努力。全面了解PRRSV的免疫機(jī)制，尤其是對細(xì)胞免疫機(jī)制的認(rèn)識是 有效防控該病的基礎(chǔ)。本發(fā)明首次利用小鼠這一動物模型鑒定PRRSVCTL表位，將為進(jìn)一步 闡明該病免疫機(jī)制奠定基礎(chǔ)。


圖1PRRSV M基因RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果；M :DL2000DNAmarker ;1 :PRRSV M基因的PCR 產(chǎn)物；2:陰性對照。 圖2小鼠泛素基因RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果；M :DL2000DNA Marker ;1 :小鼠泛素基因PCR 產(chǎn)物；2:陰性對照。 圖3PRRSV M蛋白的SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)結(jié)果；M :蛋白分子量marker ;1 :純化的重組 PRRSVM。 圖4PRRSV-M蛋白的Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果；M :預(yù)染色的蛋白分子量marke ;1 :重 組PRRSVM。 圖5蛋白標(biāo)準(zhǔn)品BSA濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。 圖6重組質(zhì)粒pVAXl-M的Xba I酶切鑒定；M :DL15000DNA Marker ;2 :pVAXl-M/Xba I。
圖7重組質(zhì)粒pVAXl-U-M的BamHI和EcoR I酶切鑒定；1 :DL15000DNAMarke ; 3pVAXl-U-M/BamH I禾P EcoR。 圖8pVAXl-M和pVAXl-U-M轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞后IFA鑒定結(jié)果；A :pVAXl-M ;B : pVAXl-U-M ;C :pVAXl。 圖9重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSCll-PRRSV-M的構(gòu)建。 圖lO重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSCll-PRRSV-M連接方向鑒定；M :DL2000DNA marker ;1，2，3 : 正向連接；3 :反向連接。 圖11重組牛痘病毒rWR-PRRSV-M感染；TK—143細(xì)胞后出現(xiàn)藍(lán)色蝕斑。 圖12重組牛痘病毒rWR-PRRSV-M的基因組鑒定；M :DL2000DNA marker ; 1 ， 2 :
rWR-PRRSV-M的PCR產(chǎn)物；3 :WR株牛痘病毒。 圖13rWR-PRRSV-M的Western blot結(jié)果；FM :預(yù)染色的蛋白分子量marke ; 1 : rWR-PRRSV-M ;2 :WR株牛痘病毒。 圖14rWR-PRRSV-M感染BHK-21細(xì)胞后IFA鑒定結(jié)果；A :rWR-PRRSV-M ;B :WR株牛
痘病毒。 圖15按照prime-boost策略免疫小鼠后，ELISA抗體水平檢測結(jié)果。 圖16剌激后小鼠脾淋巴細(xì)胞流式檢測結(jié)果。 圖17剌激后小鼠脾淋巴細(xì)胞流式檢測數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果。 圖18酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會隨著描述而 更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù) 人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式 進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
實(shí)驗(yàn)例
1材料與方法 1.1.1實(shí)驗(yàn)材料PRRSV CH-la株、PRRSV陽性血清、PRRSV陰性血清、抗PRRSVM蛋 白單抗由中國農(nóng)科院哈爾濱獸醫(yī)研究所豬病研究室惠贈；WR株牛痘病毒、重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒 pSCll、 BHK-21細(xì)胞、TK—143細(xì)胞及各種E. coli感受態(tài)細(xì)胞均由本所人畜共患病課題組步 志高研究員惠贈。 1. 1. 2主要試劑pVAXl質(zhì)粒、Lipofectamine 2000Reagent購自Invitrogen公 司；pGEX-6p-l質(zhì)粒購自Pharmacia公司。各種限制性內(nèi)切酶、連接酶、反轉(zhuǎn)錄酶、Taq酶、 Pyrobest酶、pMD18_T Vector、 DNA Marker均購自TaKaRa公司；質(zhì)粒小量抽提試劑盒、 膠回收小量試劑盒購自上海華舜生物試劑有限公司；RNeasy MiniKit、 QIAquick PCR Purification Kit、 EndoFree Plasmid Maxi Kit購自QIAGEN公司；蛋白Marker購自 Fermentas公司；EZ-S印111 Mouse IX Lymphocyte S印aratio騰di咖購自達(dá)科為生物技術(shù) 有限公司；BRADFORD法測定蛋白質(zhì)濃度試劑盒購自上海碧云天生物試劑有限公司；FITC標(biāo) 記的兔抗豬IgG抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記兔抗 豬IgG抗體、佛波醇酯(PMA)、婁諾霉素(Ionomycin)、布雷菲爾德菌素(Brefeldin A)、皂苷
6(saponin)購自SIGMA公司；胎牛血清購自GIBC0BRL公司；FACSCalibur流式細(xì)胞儀、FITC 標(biāo)記的大鼠抗小鼠的IFN- y抗體；PE標(biāo)記的大鼠抗小鼠CD8a抗體、PerCP標(biāo)記的土撥鼠 抗小鼠CD3e抗體、ELISPOT Set、 AEC Substrate Set購自BD公司；HPLC純化多肽(純度 > 98% )由中科亞光生物科技有限公司合成；實(shí)驗(yàn)所使用的引物均由Invitrogen公司合 成；不相關(guān)肽為雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)N蛋白T細(xì)胞表位肽N71—78(WRRQARYK)，由上海 吉爾生化有限公司合并由本實(shí)驗(yàn)室保存。 1. 1. 3實(shí)驗(yàn)動物SPF級BALB/C小鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物有限公司，所有實(shí) 驗(yàn)小鼠均在SPF隔離器內(nèi)飼養(yǎng)。
1. 2方法 1. 2. 1PRRSV M基因與小鼠Ub基因的克隆 用^6&37@11!11 Kit提取PRRSV CH_la株與小鼠脾臟的總RNA，用隨機(jī)引物 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，兩目的片段的擴(kuò)增條件均為95°C 5min;94°C 30s， 55°C 45s，72°C lmin，35個循環(huán)；72。C延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、膠回收后與 pMD18-TVector連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞JM109。經(jīng)質(zhì)粒抽提、PCR鑒定正確后測 序，鑒定正確的重組質(zhì)粒分別命名為pMD-M、 pMD-U。
1. 2. 2PRRSV-M蛋白的截短表達(dá)、純化及Western blot分析 由于M蛋白在體外表達(dá)系統(tǒng)中難以表達(dá)，在設(shè)計引物(表l)PRRSV-M-JD-F、 PRRSV-M-JD-R時將氨基端疏水性較強(qiáng)氨基酸殘基去掉。以重組質(zhì)粒pMD-M為模板PCR擴(kuò)增 截短后的M基因，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化、酶切、膠回收后與經(jīng)同樣處理的pGEX-6P-l載體連接，連 接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5a ，經(jīng)質(zhì)粒抽提、PCR、酶切鑒定正確后測序，鑒定正確的重組質(zhì) 粒命名pGEX-M。將pGEX-M轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞，IPTG (終濃度為0. 8mM)誘 導(dǎo)培養(yǎng)4 6h，收集菌體沉淀進(jìn)行超聲破碎。包涵體用含0. 6%十二烷基肌氨酸鈉鹽(SKL) 緩沖液進(jìn)行緩慢溶解后，加入終濃度為0. 2%的PEG 4000與終濃度為1. 0mM氧化型谷胱甘 肽及還原型谷胱甘肽進(jìn)行復(fù)性。然后利用GST純化試劑盒進(jìn)行純化。將純化后的蛋白進(jìn)行 Westernblot與SDS-PAGE分析，以同樣條件處理的pGEX-6P-l空載體為對照。
1. 2. 3PRRSV-M蛋白的濃度測定 將蛋白純化后使用Bradford法測定蛋白濃度。即將蛋白標(biāo)準(zhǔn)樣品(BSA)稀釋至 終濃度為0. 5mg/mL ;然后將蛋白標(biāo)準(zhǔn)樣品(BSA)按0 y L、 1 y L、2 y L、4 y L、8 y L、 12 y L、 16 ii L、20 y L分別加到96孔ELISA板中，同時加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液補(bǔ)足到20 y L ;然后相應(yīng)體積 的待測樣品到96孔ELISA板中，同樣加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液補(bǔ)足到20 ii L ;各孔加入200 y L G250 染色液，室溫靜置3 5分鐘；測定波長為595nm處的吸光值并使用Microsoft Office Excel (2003)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算待測樣品中的蛋白濃度。
1. 2. 4Ub基因與PRRSV M的融合 利用S0E技術(shù)將Ub基因與M基因進(jìn)行融合，根據(jù)融合原理針對PRRSV-M設(shè)計上下 游弓I物PRRSV-M-Ub-F、 PRRSV-M-Ub-R (表1)。以上述構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pMD-M與pMD-U 為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對PRRSV-M與Ub的擴(kuò)增產(chǎn)物分別進(jìn)行膠回收，以回收產(chǎn)物為模板，以 Ub基因的上游引物與PRRSV-M基因的下游引物進(jìn)行PCR，反應(yīng)條件為95°C 5min ;94°C 30s ; 63. 5°C 45s ;72°C lmin，35個循環(huán)；72。C延伸10min。融合產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、膠回收后 與pMD18-T Vector連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞JM109。經(jīng)質(zhì)粒抽提、PCR鑒定正確后測序，鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pMD-U-M。 1. 2. 5真核表達(dá)質(zhì)粒pVAXl-M與pVAXl-U-M的構(gòu)建 以重組質(zhì)粒pMD-M、 pMD-U-M為模板，分別以引物(見表1)PRRSV_M_F、 PRRSV-M-R 與PRRSV-M-Ub-F、PRRSV-M-Ub-R亞克隆M基因與Ub_M融合基因，對其產(chǎn)物進(jìn)行純化、酶切、 膠回收后與經(jīng)同樣處理的pVAXl載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5 a ，經(jīng)質(zhì)粒抽提， PCR、酶切鑒定正確后測序，鑒定正確的重組質(zhì)粒分別命名為pVAXl-M、 pVAXl-U-M。
1. 2. 6表達(dá)產(chǎn)物的間接免疫熒光(IFA)實(shí)驗(yàn) 按照Lipofectamine 2000說明書進(jìn)行操作，即在轉(zhuǎn)染前一天將BHK-21細(xì)胞用無 抗生素的DMEM培養(yǎng)液以0. 5 2xl05Cel 1 s/孔接種24孔細(xì)胞培養(yǎng)板；24h后，將純化的陽性 重組質(zhì)粒pVAXl-M、 pVAXl-U-M與空質(zhì)粒pVAXl在脂質(zhì)體的介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染到長成80% 90% 的單層BHK-21細(xì)胞上(質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量為0. 8 g) 。 48h后冷丙酮固定30min，PBST洗滌三次， 用含有1 % BSA的PBS封閉2h ;PBST洗滌三次，加入一抗(抗PRRSV陽性血清)，37。C作用 2h ;PBST洗滌三次，接著加入FITC標(biāo)記的兔抗豬的二抗，37t:作用2h ;PBST洗滌三次，于熒 光顯微鏡下觀察和拍照。 1. 2. 7重組牛痘病毒轉(zhuǎn)移載體pSCll-PRRSV-M的構(gòu)建 以上述構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pMD-M為模板，以引物pSCll-M-F、 pSCll-M-R(表1) 進(jìn)行PCR，反應(yīng)條件為95 °C 5min ;94 °C 30s ;60。C 45s ;72 °C lmin，35個循環(huán)；72。C延伸 10min。 PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、酶切、膠回收后與經(jīng)同樣處理的重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSC11 連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞JM109。質(zhì)粒抽提后，進(jìn)行目的片段的連接方向鑒定， 即使用引物P7. 5-F與pSCll-M-R進(jìn)行PCR，反應(yīng)條件為95°C 5min ;94°C 30s ;55°C 30s ; 72°C lmin，35個循環(huán)；72。C延伸10min。 PCR鑒定方向正確后測序，構(gòu)建正確的重組質(zhì)粒命 名為pSCll-PRRSV-M。
表IPCR擴(kuò)增引物設(shè)計
8引物序列限制性位點(diǎn)和連接子
PRRSV-M-FCCC4w4GC7TAGCATGGGGTCGTCTCTAGA倫證
PRRSV匿M-RCCGCTCG^GCTATTT GGCATATTTGACA'勘及I
Ub-FTCAG04rcCGCCGCCGCCATGCAGATTTTCGTG扁
Ub-RGG^GCCTG0404AQCACCTCTCAGGCGAAGGAC
PRRSV匿M匿Ub -FrCTCO G(7CTCCATGGGGTCGTCTCTA
PRRSV-M-Ub-RCCC0^77rCTATTTGGCATATTTGACAAGGTT
PRRSV-M-JD-FCCG0147TCATGGGAGTGTACTCGGCC ATAG'
PRRSV-M-JD匿RCCGCTC04GCTATTTGGCATATTTGAC勘I
pSCll-M-FATAGrc04CGCCGCCGCCATGGGGTCGTCTCTAGM
pSCll-M-RGCCGrC04CCTATTTGGCATATTTGACAAGGTTTAC緒
P7.5-FGCACGGTAAGGAAGTAGAAT 引物Ub-F和pSCll-M-F的黑體字是Kozak序列；引物Ub-R的下劃線部分代表所設(shè)計的突變位點(diǎn)，斜體字部分是連接子序列。
1. 2. 8病毒重組 病毒重組前一天用含有終濃度為25 g/mL的5'-溴-2'-脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)[20]的MEM培養(yǎng)液將TK—143細(xì)胞以0. 5 2X105cellS/孔接種6孔細(xì)胞培養(yǎng)板。次日，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%時，將WR株痘病毒液(M. 0. I = 1)以10倍梯度稀釋后接種于TK—143細(xì)胞，37。C感作l 2h。按照Lipofectamine 2000說明書進(jìn)行操作，將純化的轉(zhuǎn)移重組質(zhì)粒pSCll-PRRSV-M在脂質(zhì)體的介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染到已感染病毒的單層TK—143細(xì)胞上(質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量為2. 0 g)。將細(xì)胞于37t:培養(yǎng)并觀察細(xì)胞病變(CPE)，待CPE達(dá)到80%時收毒。
1. 2. 9重組病毒rWR-PRRSV-M的篩選 在終濃度為25 ii g/mL的BrdU的壓力下，將感染轉(zhuǎn)染后的培養(yǎng)物在TK—143細(xì)胞上盲傳2 3代，至細(xì)胞稍圓縮，但不形成蝕斑時，在Hela細(xì)胞上做蝕斑實(shí)驗(yàn)純化病毒(X-gal染色)2 3代至沒有可見的非重組病毒斑(白斑)。即取盲傳擴(kuò)增的病毒液接種Hela單層細(xì)胞，37t:感作2h后棄掉病毒液，加入含1%低熔點(diǎn)瓊脂糖的DMEM營養(yǎng)瓊脂，培養(yǎng)24 48h，待出現(xiàn)典型的CPE時，再覆蓋一層含250 ii g/mLX-gal的DMEM營養(yǎng)瓊脂，繼續(xù)培養(yǎng)12 24h后挑取藍(lán)斑，進(jìn)行新一輪的蝕斑純化，共進(jìn)行5輪蝕斑純化。篩選純化的重組病毒命名為rWR-PRRSV-M。 1. 2. 10rWR-PRRSV-M基因組中PRRSV M基因的PCR鑒定 將純化的rWR-PRRSV-M感染TK—143細(xì)胞，培養(yǎng)后收取病毒液，用堿裂解方法提病毒DNA進(jìn)行PCR鑒定。即收取病毒培養(yǎng)液437. 5 y L，然后加入適量蛋白酶K(終濃度為500iig/mL)與10% SDS(終濃度為1 % ) ， 37。C水浴30min ;加入酚/氯仿抽提，4"離心后取上層水相并加入1/10體積的3M NaAC(pH5. 2) 、2倍體積的冷乙醇，-2(TC放置過夜；4"離心后取適量上清，加入O. 5mL無水乙醇，-2(TC放置3h ;4。C離心15min，沉淀用20 y L滅菌去離子水溶解；取病毒DNA 1 ii L做PCR鑒定，反應(yīng)條件為95。C 5min ;94。C 30s ;55。C 30s ; 72°C lmin，35個循環(huán)；72。C延伸10min。
1. 2. llrWR-PRRSV-M的間接免疫熒光 在病毒感染前一天將BHK-21細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)液以每孔0. 5 2xl05cells接種 24孔細(xì)胞培養(yǎng)板；24h后，將rWR-PRRSV-M以M. 0. I為0. 01的感染量接種細(xì)胞，待細(xì)胞出現(xiàn) 明顯CPE時，棄去培養(yǎng)液，用PBS冼兩次；用90%乙醇固定30min， PBST沖洗5 10min，用 含有1 % BSA的PBS封閉2h ;PBST洗滌三次，加入一抗(原核表達(dá)PRRSV M蛋白純化后免 疫小鼠所制備的血清)，37t:作用2h ;PBST洗滌三次，接著加入FITC標(biāo)記的兔抗鼠的二抗， 37t:作用2h ;PBST洗滌三次，于熒光顯微鏡下觀察和拍照。
1. 2. 12質(zhì)粒DNA的制備與小鼠免疫 用EndoFree Plasmid Maxi Kit純化質(zhì)粒DNA后，用Prime-boost策略對SPF級 BALB/c進(jìn)行肌肉免疫。即將6-8周齡的BALB/c小鼠隨機(jī)分成4組(30只/組)。分別肌 肉注射免疫pVAXl、pVAXl-M、pVAXl-U-M，免疫量為100 y g/只，共免疫4次，每次間隔3周。 四次免疫后一周使用M. 0. I約為0. 1的量進(jìn)行腹腔加強(qiáng)免疫，同時空載體組使用WR株牛 痘病毒進(jìn)行免疫。分別在二免、三免、四免、加強(qiáng)免疫后一周(即一免疫后第28d、49d、70d、 84d)分離血清進(jìn)行ELISA抗體水平檢測。
1. 2. 13ELISA抗體水平的檢測與分析 以上述原核截短表達(dá)、純化的PRRSV M蛋白為檢測抗原，陽性對照的檢測抗原為紫 外滅活后的全病毒(紫外線照射25分鐘)。按常規(guī)方法建立間接ELISA法，首先通過方陣 滴定實(shí)驗(yàn)來確定抗原包被濃度與血清稀釋濃度，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步確定酶標(biāo)二抗的稀釋 度以確定最佳工作濃度，建立ELISA方法。同時用方差分析F檢驗(yàn)-雙樣本方差分析試驗(yàn) 結(jié)果，P < 0. 05為差異顯著，P < 0. 01為差異極顯著。1. 2. 14CTL表位的預(yù)測、篩選及合成
使用SYFPEITHI、 BIMAS、 PREDBALB/c三種生物信息學(xué)預(yù)測方法對PRRSV M蛋白進(jìn)行 CTL表位預(yù)測。然后根據(jù)預(yù)測分?jǐn)?shù)進(jìn)行篩選并化學(xué)合成(見表2)。
表2化學(xué)合成的短肽
生物信息學(xué)方法
SYFPEITHI BIMAS PREDBALB'C
多肽 結(jié)合評^_#肽 結(jié)合評分 多肽 結(jié)合評分
K93FITSRCRLBS=23K93FITSRCRLBS=230《000
T25YTPVMIYABS=24T25YTPVMIYABS=72.000KmFITSRCRLBS=9.70
S12TAPQKVLLBS=20S12TAPQKVLLBS=57.600T25YTPVMIYABS=5.3
S140TTVNGTLVBS=19SM0TTVNGTLVBS=14.400S12TAPQKVLLBS=6.J0
TM6LVPGLKGLBS=19T146LVPGLKGLBS=115.200S 140TTVNGTLVBS=6.10
A21FSITYTPVBS=18A21FSITYTPVBS:345扁T146LVPGLKGLBS=9.10
H-2KdR4。LLGLLHLLBS=18R4oLLGLLHLLBS=96.00A21FSITYTPVBS= 9.54
L34KVSRGRLLBS=17L34KVSRGRLLBS=9.600R4。LLGLLHLLBS=7.80
H^FQSTNRVABS=17HMF(3STNRVABS=28.800L34KVSRGRLLBS=5.64
C,02LLGRKYILBS=17C,02LLGRKYILBS=96.00H64FQSTNRVABS=5.64
Q16KVLLAFSIBS=16L162KVSRGRLLBS=11.520C102LLGRKYILBS=7.84
L162KVSRGRLLBS=16L162KVSRGRLLBS=0.012L162KVSRGRLLBS=5.80
S23ITYTPVMIBS=14S23ITYTPVMIBS=48.000L162KVSRGRLL S23ITYTPVMIBS=6.10 BS=8.50
Y26TPVMIYALBS=20.000Y26TPVMIYALBS=9.82
F57GYMTFVHFBS=7.200F57GYMTFVHFBS=10.00
T13APQKVLLABS=12.000T13APQKVIiABS=8.58
H-2Dd(31MGVVNLVKYBS=2.000Q164GVVNLVKYBS=9.40
F122HPIAANDNBS=2.400F122HPIAANDNBS=9.20
P138GSTTVNGTBS=0.200P13SGSTTVNGTBS=9.20
A14PQKVLLAFBS=24A14PQKVLLAFBS-450細(xì)A14PQKVLLAFBS=9.38
V 8PGLKGLVLBS=24V148PGLKGLVLBS=150.000V148PGLKGLVLBS=9.50
DUSTAPQKVLBS=20DuSTAPCJKVLBS=25.000DUSTAPQKVLBS= 7.50
H-2LdY86SAIETWKFBS=20Y貼SAIETWKFBS=50.000YS6SAIETWKFBS=7.50
EU7SAAGFHPIBS=20EU7SAAGFHPISS=6.500EU7SAAGFHPIBS=4.70
T鄰SRCRLCLLBS=19T96SRCRLCLLBS=7.500T96SRCRLCLLBS=7.60
G139STTVNGTLBS=18G13!)STTVNGTLBS=25.000G139STTVNGTLBS=7.40
F22SITYTPVMBS=15F22SITYTPVMBS=25.000F22SITYTPVMBS=7.00 1. 2. 15小鼠脾淋巴細(xì)胞的制備、體外刺激及流式檢測 加強(qiáng)免疫后對小鼠實(shí)施安樂死后無菌采取脾臟，并將其剪碎研磨后使用EZ-S印tm 小鼠的淋巴細(xì)胞分離液分離脾淋巴細(xì)胞，對細(xì)胞計數(shù)后使用完全1640培養(yǎng)液將淋巴細(xì)胞 重懸，按106cellS/孔加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。然后加入終濃度為20p g/ml短肽進(jìn)行 剌激，用PMA與Ionomycin復(fù)合物刺激的細(xì)胞孔為陽性對照，不相關(guān)肽刺激的細(xì)胞孔與不加 任何剌激物的細(xì)胞孔為陰性對照。37°C ， 5% C02培養(yǎng)2 3h后加入Brefeldin A進(jìn)行阻 斷，然后繼續(xù)培養(yǎng)6 8h。完畢后4"，250Xg離心10min，棄培養(yǎng)液加入PBS/NaN3(含有 0.09%NaN3)洗一遍；加入l : 100稀釋的PE標(biāo)記的大鼠抗小鼠CD8a抗體與1 : 200PerCP 標(biāo)記的土撥鼠抗小鼠CD3e抗體，4°C ，避光染色30min ;完畢后4°C ， 250 X g離心10min，棄抗 體稀釋液加入PBS/NaN3洗2遍；1%多聚甲醛4"固定20min ;4。C，500Xg離心10min，棄 固定液加入PBS/NaN3洗2遍；加入1 %皂素室溫避光透膜20min ;4。C，500Xg離心10min，棄透膜液；加入l : 200FITC標(biāo)記的大鼠抗小鼠的IFN-Y抗體，4t:，避光染色30min ;完畢 后4°C ， 500 X g離心10min，棄抗體稀釋液加入PBS/NaN3洗2遍；PBS/NaN3重懸細(xì)胞，上機(jī) 檢測分析，并運(yùn)用方差分析統(tǒng)計數(shù)據(jù)。
1. 2. 16酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(ELISPOT) 按照ELISPOT Set說明書進(jìn)行，即先將捕獲抗體以5 y g/mL的終濃度4。C包被過 夜；24h后用含有10% FBS的1640培養(yǎng)液室溫封閉2h ;將小鼠脾淋巴細(xì)胞按5X 105Cells/ 孔加到檢測孔中，同時加入短肽、陽性剌激物、陰性剌激物(同流式檢測試驗(yàn))，371:，5% C02培養(yǎng)24h ;棄掉細(xì)胞并洗滌，加入終濃度為2 ii g/rnL的檢測抗體，室溫2h ;棄掉檢測抗 體并洗滌，加入酶標(biāo)親和素，室溫lh ;棄掉酶標(biāo)親和素并洗滌，加入AEC底物顯色液室溫作 用30min ;棄掉底物顯色液并洗滌，然后上機(jī)讀板并運(yùn)用方差分析統(tǒng)計數(shù)據(jù)。
2實(shí)驗(yàn)結(jié)果 2. 1PRRSV M基因及小鼠Ub基因的擴(kuò)增、克隆及鑒定 應(yīng)用RT-PCR方法從PRRSV CH-la株與小鼠脾臟的總RNA中分別擴(kuò)增出了大小約 為546bp與258bp左右的特異性片段(圖1、圖2)，與預(yù)期大小相符。
2. 2PRRSV M蛋白的截短表達(dá)、純化及其免疫活性檢測 將重組質(zhì)粒pGEX-M轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞，以終濃度為0. 8mMIPTG 進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)4 6h，菌體誘導(dǎo)培養(yǎng)物經(jīng)超聲波破碎后進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果獲得了大小約 為36KDa的PRRSV-M蛋白，然后對按照上述的方法對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化，并對純化產(chǎn)物進(jìn)行 SDS-PAGE與Western blot實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，在大約36KDa處均出現(xiàn)了 PRRSV M蛋白的條 帶。這說明本研究獲得了較純的PRRSV M蛋白(圖3)，并且所獲得的目的蛋白具有較強(qiáng)的 免疫原性(圖4)。 2. 3重組質(zhì)粒pGEX-M表達(dá)PRRSV M蛋白濃度測定 表3蛋白標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的濃度(mg/mL)00.0250.050.10.20.30.40.5
OD59500.03930.08180.13770.26030.3640.48070.5803 空白調(diào)零后，純化蛋白的0D595的值為0. 4493，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和標(biāo)準(zhǔn)方程計算得 純化蛋白液的濃度大約為0. 419mg/mL(圖5)。將純化蛋白加甘油到50%，分裝后-S(TC保存。 2. 4真核重組質(zhì)pVAXl-M、 pVAXl-U-M的構(gòu)建 陽性重組質(zhì)粒pVAXl-M經(jīng)Xbal酶切后獲得了大小分別約為3000bp、534bp的兩條 帶(圖6);而pVAXl-U-M分別經(jīng)BamH I與EcoR I酶切后獲得了大小約為765bp、3000bp的 兩條帶。條帶大小均與預(yù)期相符(圖7)。
2. 5表達(dá)產(chǎn)物的間接免疫熒光(IFA)實(shí)驗(yàn)IFA實(shí)驗(yàn)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞后，IFA實(shí)驗(yàn)表明pVAXl-M、pVAXl-U_M在真核細(xì)胞內(nèi)
能夠進(jìn)行有效的轉(zhuǎn)錄，并表達(dá)目的蛋白(圖8)。 2. 6重組牛痘病毒轉(zhuǎn)移載體pSCl l-PRRSV-M的構(gòu)建 以上述構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pMD-M為模板，以引物(見表l)pSCll-M-F、 pSCll-M-R進(jìn)行PCR。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、酶切、膠回收后與經(jīng)同樣處理的重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSC11 連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞JM109。質(zhì)粒抽提后，進(jìn)行正反方向鑒定，PCR擴(kuò)增得到了 大小約為5S0bp的特異性條帶，鑒定正確的重組質(zhì)粒命名pSCll-PRRSV-M(圖9，圖10)。
2. 7rWR-PRRSV-M的篩選及基因組的PCR鑒定 將重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSCl l-PRRSV-M轉(zhuǎn)染至已感染W(wǎng)R株痘病毒的TK—143細(xì)胞， pSCll-PRRSV-M與野毒W(wǎng)R株發(fā)生同源重組，重組牛痘病毒帶有LacZ基因，在含X-gal的營 養(yǎng)瓊脂上產(chǎn)生藍(lán)色蝕斑(圖11)，而野毒對照無藍(lán)色蝕斑(圖略)；通過連續(xù)5輪藍(lán)斑篩選、 純化后的rWR-PRRSV-M形成的蝕斑均為藍(lán)色。將純化的重組病毒rWR-PRRSV-M感染TK—143 細(xì)胞后，收取病毒液用堿裂解方法提病毒DNA進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果表明PRRSV-M基因準(zhǔn)確重 組到牛痘病毒W(wǎng)R株基因組中(圖12)。
2. 8rWR-PRRSV-M的Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果 待感染rWR-PRRSV-M的BHK-21CPE達(dá)到90 %時，收集細(xì)胞進(jìn)行裂解，然后進(jìn)行 Western blot實(shí)驗(yàn)，用同樣處理的野毒感染的BHK-21作為對照。結(jié)果表明，rWR-PRRSV-M 感染的細(xì)胞樣品在約19kDa處出現(xiàn)了反應(yīng)條帶，而野毒感染的細(xì)胞樣品則沒有相應(yīng)條帶出 現(xiàn)(圖13)。這說明，rWR-PRRSV-M在感染的細(xì)胞內(nèi)成功表達(dá)了 PRRSV M蛋白，并且所表達(dá) 的蛋白保持了良好的免疫原性。 2. 9重組病毒rWR-PRRSV-M的間接免疫熒光結(jié)果將rWR-PRRSV-M以M. 0. I為0. 01的感染量接種BHK-21細(xì)胞，待細(xì)胞出現(xiàn)明顯CPE 時，進(jìn)行IFA實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明rWR-PRRSV-M在BHK-21細(xì)胞內(nèi)成功表達(dá)了 PRRSVM蛋白。
2. 10免疫后ELISA抗體水平檢測 方陣滴定實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，抗原包被濃度為0.5iig/mL，血清稀釋度為1 : 100 時，ELISA結(jié)果的P/N值最高，將上述抗原包被濃度和血清稀釋度定為本實(shí)驗(yàn)的工作濃度。 ELISA結(jié)果表明，二次免疫之后，重組質(zhì)粒pVAXl-M、 pVAXl-U-M均能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體，與 空載體組相比差異顯著(P < 0. 05)，但是抗體水平較低，且兩免疫組之間未見差異。三免之 后小鼠產(chǎn)生的抗體水平明顯升高，且兩免疫組之間差異顯著(P < 0. 05)，且質(zhì)粒免疫組與 空載體免疫組相比差異極顯著(P < 0. 01)。四免之后的抗體水平繼續(xù)升高，兩質(zhì)粒免疫組、 空載體免疫組之間差異極顯著(P < 0. 01)。而且在使用rWR-PRRSV-M剌激后，抗體水平再 次升高，兩質(zhì)粒免疫組之間差異顯著(P < 0. 05)，而空載體免疫組在使用WR株牛痘病毒剌 激后抗體水平無明顯變化。這進(jìn)一步說明本研究所構(gòu)建的質(zhì)粒DNA及重組病毒在免疫后均 能機(jī)體誘導(dǎo)良好的免疫反應(yīng)(見圖15)。
2. 11小鼠脾淋巴細(xì)胞的制備、體外剌激及流式檢測 小鼠脾淋巴細(xì)胞經(jīng)剌激物剌激后，流式檢測結(jié)果表明陽性對照組可見有明顯分泌 IFN- y的CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞。而且，經(jīng)短肽K93FITSRCRL與F57GMTFVHF剌激的細(xì)胞也見 有分泌IFN- y的CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞(組圖16)。同時對所有免疫小鼠的流式檢測結(jié)果進(jìn) 行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，結(jié)果表明經(jīng)短肽K93FITSRCRL、 F57GMTFVHF及PMA和IONO組合剌激的小鼠脾 淋巴細(xì)胞孔均能分泌IFN-y ，而不經(jīng)剌激的小鼠脾淋巴細(xì)胞與經(jīng)不相關(guān)肽剌激的小鼠脾淋 巴細(xì)胞卻檢測不到IFN- y 。這說明短肽K93FITSRCRL、 F57GMTFVHF均能有效的剌激記憶性 的CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞增殖分化并分泌IFN- y (圖17)。方差分析結(jié)果表明，小鼠脾淋巴細(xì) 胞經(jīng)短肽K93FITSRCRL、F57GYMTFVHF剌激后，分泌IFN- y的CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量與其它肽段所剌激的結(jié)果相比較差異極顯著(P < 0. 01)。
2. 12酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(ELISPOT) 分離小鼠脾淋巴細(xì)胞后，按照BD公司BDTMELISPOT SET說明書進(jìn)行酶聯(lián)免疫斑 點(diǎn)試驗(yàn)，以檢測IFN-Y的分泌細(xì)胞.從而進(jìn)一步驗(yàn)證CTL表位.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)短肽 K93FITSRCRL、 F57GYMTFVHF及PMA和Ionomycin組合剌激的小鼠脾淋巴細(xì)胞孔均能分泌 IFN-Y，而不經(jīng)剌激的小鼠脾淋巴細(xì)胞與經(jīng)不相關(guān)肽剌激的小鼠脾淋巴細(xì)胞卻檢測不到 IFN- Y (圖18)。方差分析結(jié)果表明，小鼠脾淋巴細(xì)胞經(jīng)短肽K93FITSRCRL、 F57GMTFVHF剌 激后的斑點(diǎn)統(tǒng)計結(jié)果與其它肽段所剌激的結(jié)果相比較差異極顯著(P < 0. 01)。
權(quán)利要求
一株重組牛痘病毒，其微生物保藏號是CGMCC NO.3206。
2. —種構(gòu)建權(quán)利要求1所述重組牛痘病毒的方法，包括以下步驟將豬繁殖與呼吸綜 合征病毒M基因克隆到pSCll上得到重組牛痘病毒轉(zhuǎn)移載體pSCll-PRRSV-M ;將WR株牛痘 病毒液稀釋后接種于TK—143細(xì)胞，37t:感作1 2h ;將轉(zhuǎn)移重組質(zhì)粒pSCll-PRRSV-M轉(zhuǎn)染 到已感染病毒的單層TK—143細(xì)胞上；篩選，鑒定，即得。
3. 權(quán)利要求1所述重組牛痘病毒在制備診斷、預(yù)防或治療豬繁殖與呼吸綜合征病毒藥 物中的用途。
4. 豬繁殖與呼吸綜合征病毒蛋白針對BALB/c小鼠的CTL細(xì)胞表位，其特征在于其氨 基酸序列分別為K93FITSRCRL、 F57GMTFVHF。
5. 權(quán)利要求4所述CTL細(xì)胞表位在制備診斷、預(yù)防或治療豬繁殖與呼吸綜合征病毒藥 物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了豬繁殖與呼吸綜合征病毒M蛋白CTL細(xì)胞表位及其應(yīng)用。本發(fā)明將豬繁殖與呼吸綜合征病毒CH-1a株M蛋白基因與小鼠泛素基因進(jìn)行融合并克隆構(gòu)建DNA疫苗，同時構(gòu)建了表達(dá)M蛋白的WR株牛痘病毒的重組病毒；按照Priming-Boosting策略免疫BALB/c小鼠，然后分離小鼠脾淋巴細(xì)胞，用生物信息學(xué)方法預(yù)測、合成的CTL短肽進(jìn)行體外培養(yǎng)刺激，借助流式細(xì)胞技術(shù)與酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)鑒定出K93FITSRCRL與F57GYMTFVHF兩個CTL表位，PRRSV M蛋白CTL表位的鑒定將為PRRS細(xì)胞免疫機(jī)制及新型表位肽疫苗的研究奠定一定的理論基礎(chǔ)，同時對PRRS防控技術(shù)的理論研究具有指導(dǎo)意義。
文檔編號C12Q1/70GK101696399SQ20091018031
公開日2010年4月21日 申請日期2009年10月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月22日
發(fā)明者劉霓紅, 吳東來, 張維軍, 楊濤, 林燕, 王群, 白宇, 童鐵鋼 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所;