專(zhuān)利名稱：：用于生產(chǎn)目的物質(zhì)的禽細(xì)胞系的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)禽類(lèi)細(xì)胞系，特別是禽干細(xì)胞的方法，包含逐步或全部撤消生長(zhǎng)因子、血清和/或詞養(yǎng)菌苔。該自主建立的細(xì)胞系是能在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中無(wú)限增殖的黏附或非黏附性細(xì)胞。本發(fā)明還涉及源于特別利于生產(chǎn)疫苗和目的物質(zhì)的細(xì)胞系的細(xì)胞。
背景技術(shù)：
：干細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)可區(qū)分為源于胚胎，胚胎的部分或甚至成體組織的細(xì)胞。表達(dá)干細(xì)胞被認(rèn)為是源于胚胎或成體的多能性細(xì)胞，有自我更新的能力，且能產(chǎn)生特定的分化細(xì)胞。換句話說(shuō)，干細(xì)胞是源于任何能在培養(yǎng)過(guò)程中無(wú)限分裂且產(chǎn)生與母細(xì)胞具有同樣增殖和分化能力的子細(xì)胞的非癌細(xì)胞。這些分離細(xì)胞顯示了特定的形態(tài)學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)特征。也可以區(qū)分以下概念一胚胎干細(xì)胞(CES細(xì)胞)，是從培養(yǎng)的全部或部分較早期胚胎(囊胚期)中獲得的具有典型特征的干細(xì)胞。這些CES細(xì)胞在體外表現(xiàn)出干細(xì)胞的所有特性，體內(nèi)，在對(duì)胚胎的形態(tài)發(fā)生及以任何形式被再植入無(wú)論何種胚胎時(shí)參與幼植體的移地發(fā)育中表現(xiàn)出獨(dú)特的能力。一體干細(xì)胞(SSC)，在體外培養(yǎng)時(shí)具有干細(xì)胞的全部特征，但與CES細(xì)胞不同，在植入胚胎后沒(méi)有在體內(nèi)形成生殖腺的潛力。他們僅是對(duì)胚胎中成體組織的形態(tài)發(fā)生有貢獻(xiàn)。與已經(jīng)分化的起始細(xì)胞不同，干細(xì)胞沒(méi)有顯出易于鑒定特征的形態(tài)學(xué)分化狀態(tài)(成纖維細(xì)胞，脂肪細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，等)，但顯出可被鑒定的增殖或非分化狀態(tài)。這些狀態(tài)導(dǎo)致細(xì)胞不同的行為，如體外的快速增殖，典型的形態(tài)學(xué)特征，不同分子標(biāo)記的出現(xiàn)，對(duì)生長(zhǎng)因子的5不同需求及對(duì)誘導(dǎo)分化的特定刺激的應(yīng)答能力。它們對(duì)于復(fù)制衰老期，大部分已分化的起始細(xì)胞的臨界時(shí)期并不敏感，包括如成纖維細(xì)胞。為了在體外較長(zhǎng)時(shí)期地維持禽干細(xì)胞，有必要觀察如Pain等，1996;US6，114,168和EP787180中所述的特定培養(yǎng)和維持的條件。在體外充分的培養(yǎng)基和生長(zhǎng)因子條件下培養(yǎng)的起始細(xì)胞只能進(jìn)行數(shù)次傳代的增殖。該類(lèi)細(xì)胞可從解離的組織或組織的部分直接獲得。傳代的次數(shù)高度依賴于所選動(dòng)物種類(lèi)，組織來(lái)源，供體器官的年齡，等。大多情形下，體外觀察到細(xì)胞增殖逐步變緩，然后停止增殖。該靜息常與復(fù)制衰老相應(yīng)，稱為海弗利克極限。該靜息被認(rèn)為是真分子鐘活動(dòng)的結(jié)果，其中端粒的長(zhǎng)度被認(rèn)為是一種關(guān)鍵組分。端粒是位于染色體末端的重復(fù)序列。重復(fù)核苷酸結(jié)構(gòu)變短是DNA半保留模式復(fù)制的結(jié)果。當(dāng)控制在染色體末端添加重復(fù)序列的端粒酶缺乏時(shí)，隨著端粒的大小，細(xì)胞到達(dá)一個(gè)非回復(fù)性的點(diǎn)，過(guò)該點(diǎn)時(shí)，一種至今未知的活化控制細(xì)胞周期相關(guān)基因的分子機(jī)制啟動(dòng)。細(xì)胞被認(rèn)為阻斷在G1分裂期且停止增殖。在細(xì)胞周期的負(fù)調(diào)控中涉及多種因素，如各種周期蛋白，特定激酶，RB和p53蛋白，特定轉(zhuǎn)錄因子，如E2F和其他多種因子(mdm2，BTG，p21，等)。相反，端粒酶被看作是細(xì)胞永生化的中心因素，因?yàn)樗S持端粒的長(zhǎng)度且使細(xì)胞對(duì)于因連續(xù)分裂造成的丟失不敏感。在發(fā)育的器官中及器官的生命期，僅一些細(xì)胞，包括某些淋巴細(xì)胞，顯示出端粒酶的永久表達(dá)。這種活性也正是干細(xì)胞的一種特性，無(wú)論在成體(SSC)水平還是幼體發(fā)生水平。這種端粒酶活性的表達(dá)、維持表達(dá)及"喚醒的"表達(dá)的特征也是與體外維持生長(zhǎng)細(xì)胞的永生化特點(diǎn)相聯(lián)系的。至今，許多癌細(xì)胞也檢測(cè)出端粒酶活性呈陽(yáng)性。該活性被認(rèn)為是造成腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)具有不受控的增殖能力的原因。所有情況下，端粒酶活性都是干細(xì)胞特征、生殖系譜系及細(xì)胞成為永生化的能力的極好標(biāo)記。因而，使用兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)端粒酶活性和端粒長(zhǎng)度。在相對(duì)于許多實(shí)驗(yàn)室中流程和結(jié)果都已很有效而要全面而很簡(jiǎn)潔的建立過(guò)程中，細(xì)胞系的建立將按兩種途徑進(jìn)行一種由非誘導(dǎo)性的內(nèi)在遺傳性損傷導(dǎo)致的自發(fā)式建立，以及一種通過(guò)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒或其他方法如化學(xué)試劑，輻射，UV(紫外線)照射，等誘導(dǎo)的觸發(fā)式建立。在哺乳動(dòng)物中，例如，嚙齒類(lèi)動(dòng)物(大鼠，小鼠，等)細(xì)胞系的建立認(rèn)為是非常容易的自發(fā)性的；而另一方面，不考慮組織來(lái)源的人細(xì)胞系建立的情形就很不相同(Smith和Pereira-Smkh，1996)。因此，當(dāng)非常想從上述禽干細(xì)胞中獲得細(xì)胞系而用于在體外大量生產(chǎn)目的物質(zhì)時(shí)，問(wèn)題就在于能否在經(jīng)濟(jì)的培養(yǎng)基中維持細(xì)胞培養(yǎng)而避免如細(xì)胞分化和衰老的障礙。在禽類(lèi)水平，一般認(rèn)為原代細(xì)胞的建立是罕見(jiàn)的，甚至幾乎不存在的事件。唯一值得注意的已公開(kāi)的例外是DF-1細(xì)胞系，通過(guò)永生化得到的，自發(fā)性的雞成纖維細(xì)胞系(Foster,等，1991;專(zhuān)利US5,672,485,ATCCNo.CRL12203)。在該細(xì)胞系水平，最近的文章提及觀察到的去調(diào)控的首要組分(Kim，等，2001a;Kim，等，2001b)。在永生化過(guò)程中，第一個(gè)導(dǎo)致正在增殖的細(xì)胞到達(dá)海弗利克極限的步驟依細(xì)胞類(lèi)型介于10和50傳代數(shù)之間。然后第一個(gè)自發(fā)突變事件發(fā)生，使細(xì)胞通過(guò)第一個(gè)靜息期，該事件常影響p53和pRb基因等。因而細(xì)胞繼續(xù)增殖至第二個(gè)靜息期出現(xiàn),該時(shí)期通常通過(guò)新的其他基因的突變和經(jīng)常可被觀察到的端粒酶激活所引發(fā)。在禽類(lèi)水平，一般認(rèn)為永生化原代細(xì)胞的建立是幾乎不存在的事件。相應(yīng)地，通過(guò)培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞，一般直接從腫瘤的活組織檢査得到，已獲得大量細(xì)胞系。該體外獲得事實(shí)上是體內(nèi)某些基因損傷的結(jié)果，這種損傷是造成腫瘤出現(xiàn)的原因。提供一個(gè)成纖維細(xì)胞系SB-CEV-1的例子，是從動(dòng)物的內(nèi)臟腫瘤培養(yǎng)物中分離得到的(ATCCNo.CRL10497，USpn5，846,527)。通過(guò)大量存在的已被鑒定，分離和在分子水平被特征鑒定的禽類(lèi)病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒來(lái)達(dá)到這目的是非常便利的。由于它們直接或間接的行為常是致癌的(病毒內(nèi)在致癌蛋白的整合，表達(dá)過(guò)程中轉(zhuǎn)化內(nèi)在基因的活化)，這些病毒引起腫瘤和損害；因而從培養(yǎng)的受感染的動(dòng)物器官中獲得處于不同分化譜系的細(xì)胞系是可能的。體內(nèi)分離的病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒在體外的用途已得到新的發(fā)展。這被認(rèn)為是取之不盡的—成淋巴細(xì)胞系DT40和DT95，由禽白血病病毒(ALV)而獲得，其中myc位點(diǎn)被活化(Baba等，1985,ATCCNO.CRL2111，CRL2112)，一火雞成淋巴細(xì)胞系MDTC-RP19，用馬立克氏病病毒建立(USNo.4,388,298，ATCCNo.8135),—成淋巴細(xì)胞系ConA-Cl，用REV病毒(網(wǎng)狀內(nèi)皮病毒，ATCCNo.12135,USNo.5,691,200)建立，一骨髓單核細(xì)胞系BM2，用MH2病毒建立(Liu等，1977，USpn5，388,680)，一及用不同病毒獲得的造血細(xì)胞系整個(gè)系列，o促紅細(xì)胞系HD4(6C2)，由AEV病毒獲得o單核細(xì)胞系HDll(Beug等，1979),由MC29病毒獲得o粒細(xì)胞系HD13(Golay等，1988)，由E26病毒獲得o混合造血細(xì)胞系IID57(Metz和Graf,1991)，也由E26病毒獲得。然而，在此類(lèi)轉(zhuǎn)化方式中問(wèn)題在于獲得生產(chǎn)病毒和攜帶所用病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒活化基因組的細(xì)胞。這些活化和病毒性的存在是它們?cè)诠I(yè)應(yīng)用上的阻遏，作為目的病毒的復(fù)制支持物或用于在優(yōu)化的安全條件下特定蛋白質(zhì)的生產(chǎn)。另外一種過(guò)表達(dá)致癌基因，永生化的基因(腺病毒E1A基因，多形瘤SV40"大T"基因，等)或基因片段的方式也使得從已分化的原代細(xì)胞獲得細(xì)胞系成為可能。這些組分可通過(guò)簡(jiǎn)單的能表達(dá)永生化部分的載體轉(zhuǎn)染而導(dǎo)入細(xì)胞，但也可通過(guò)已經(jīng)過(guò)遺傳修飾而用于表達(dá)永生化組分的病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒來(lái)導(dǎo)入。永生化組分的來(lái)源可以是禽類(lèi)的或其他的，病毒性的或其他的。事實(shí)上禽細(xì)胞的定向可與起始病毒相聯(lián)系或可被修飾。順便舉個(gè)例子，鴨成纖維細(xì)胞系TDF-2A即是通過(guò)導(dǎo)入一永生化基因及抗細(xì)胞凋亡基因而獲得(Guilhot等，1993，專(zhuān)利US6，255，108)。其他方法也也已發(fā)展，如p53的過(guò)表達(dá)(Foster等，USpn5，830，723)。另外，相應(yīng)于不同給藥模式，化學(xué)致癌物質(zhì)對(duì)動(dòng)物的直接作用也是可行的，尤其，獲得一QT6和QT35細(xì)胞系，為鵪鴉成纖維細(xì)胞(Moscovici等，1997，ATCCNo.CRL1708)，一雞肝細(xì)胞系LMH(Kawaguchi等，1989，ATCCNo.CRL2117)，—雞成纖維細(xì)胞系CHCC-OU2(ATCCNo.CRL12302，USpn5,989,805)。表達(dá)永生化事件理解為表示各種作用，如—能誘導(dǎo)細(xì)胞生理上改變和/或突變的氧化，熱，或化學(xué)應(yīng)激作用，一細(xì)胞生理中特定基因產(chǎn)物的作用，如某些永生化基因(致癌基因，細(xì)胞周期基因，抗細(xì)胞凋亡基因，等)，一通過(guò)抑癌基因，細(xì)胞凋亡基因，腫瘤抑制基因，抑裂殖基因的功能性重組或鈍化的靶向性破壞，導(dǎo)致細(xì)胞周期或細(xì)胞生理的功能性撤消，一通過(guò)功能性靜息對(duì)裂殖基因的控制，等，—射線作用(UV，Y，X，等)，—化學(xué)誘變劑的作用(損傷DNA的物質(zhì)，類(lèi)似生長(zhǎng)因子的物質(zhì)，等)，一各種獨(dú)立作用的聯(lián)合作用
發(fā)明內(nèi)容中，已發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)因子、血清和/或詞養(yǎng)菌苔的撤消導(dǎo)致干細(xì)胞群體的分離，尤其是體干細(xì)胞，能在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中無(wú)限生長(zhǎng)。另外，除了促紅細(xì)胞干細(xì)胞，大部分為非黏附性細(xì)胞，由上述現(xiàn)有技術(shù)獲得的大部分細(xì)胞(成纖維細(xì)胞，肝細(xì)胞，等)，顯示出黏附性表型?，F(xiàn)今，作為病毒復(fù)制支持物的細(xì)胞工業(yè)化用途，傾向于非黏附性細(xì)胞。該表型在因減少操作而避免用于細(xì)胞解離的蛋白水解酶的使用及體外培養(yǎng)非黏附性細(xì)胞而達(dá)到的高密度方面都是有利的。本發(fā)明描述了細(xì)胞系的生產(chǎn)，能成為自發(fā)的非黏附性細(xì)胞及該非黏附性通過(guò)撤消飼養(yǎng)菌苔獲得。由于在懸浮液中的生長(zhǎng)，這些細(xì)胞系非常適合于在生物反應(yīng)器中生產(chǎn)目的物質(zhì)的工業(yè)用途。除了在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的特點(diǎn)外，發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞系允許某些病毒的復(fù)制，產(chǎn)生比用目前的方法獲得的等量甚至更高產(chǎn)量的病毒，使得這些細(xì)胞系尤其利于疫苗的大量生產(chǎn)。
發(fā)明內(nèi)容因此，一方面，本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)禽細(xì)胞系的方法，其特征在于它包括以下步驟來(lái)表示a)在包含所有因子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)禽細(xì)胞以使它們生長(zhǎng)及飼養(yǎng)菌苔的鈍化。b)通過(guò)改變培養(yǎng)基以獲得逐步或全部去除所述因子、血清和/或詞養(yǎng)菌苔的培養(yǎng)基來(lái)傳代，c)建立能在缺少外源性生長(zhǎng)因子，血清和/或鈍化的飼養(yǎng)菌苔的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中增殖的黏附性或非黏附性細(xì)胞系
發(fā)明內(nèi)容中，"細(xì)胞系的建立"的表示理解為維持細(xì)胞在體外相當(dāng)長(zhǎng)時(shí)期的培養(yǎng)。有利地，步驟c)中獲得的細(xì)胞系來(lái)源的細(xì)胞能增殖至少50天，100天，150天，300天，或優(yōu)選地至少600天。600天并不是一種時(shí)間限制，因?yàn)楂@得的細(xì)胞系在更長(zhǎng)時(shí)間后依然存活。因次，這些細(xì)胞系被認(rèn)為能在無(wú)外源生長(zhǎng)因子，血清和/或鈍化的飼養(yǎng)菌苔的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中無(wú)限增殖。"細(xì)胞系"的表示理解為任何能在體外培養(yǎng)中無(wú)限增殖且保持或多或少同樣的形態(tài)學(xué)和表型特征的細(xì)胞群體。根據(jù)本發(fā)明細(xì)胞系來(lái)源的細(xì)胞為禽干細(xì)胞，尤其是禽體干細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的干細(xì)胞能用于獲得分化的細(xì)胞系。事實(shí)上，這些干細(xì)胞具有多能性特點(diǎn)，就是說(shuō)具有誘導(dǎo)入多種分化途徑的潛能，能被各種特定標(biāo)記表征。這些細(xì)胞可以是前體細(xì)胞，對(duì)應(yīng)于成體或胚胎組織中相對(duì)干細(xì)胞而言的部分己分化的細(xì)胞，且能分裂和產(chǎn)生更多的分化細(xì)胞。"分化的細(xì)胞"的表示理解為任何成體或胚胎組織的特定細(xì)胞，具有特定的標(biāo)記或執(zhí)行特定的生理學(xué)功能。在本發(fā)明的另一特定方面，特別是細(xì)胞系建立過(guò)程中獲得的特定分離物來(lái)源的特定分離物或克隆中，干細(xì)胞貢獻(xiàn)于生殖系的形成是可能的。這種情況下，這些以細(xì)胞系建立的干細(xì)胞被認(rèn)為是胚胎干細(xì)胞。當(dāng)然，上述提及的方法使得獲得從建立的細(xì)胞系中獲得的細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞克隆成為可能。這些克隆是在遺傳學(xué)上與通過(guò)分裂來(lái)源的細(xì)胞等同的細(xì)胞。在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種上述定義的方法，其中所建立的細(xì)胞系是在缺少鈍化飼養(yǎng)菌苔時(shí)增殖的黏附性干細(xì)胞。在這一點(diǎn)上，在上述提及的方法中，步驟b)包括培養(yǎng)基組分的撤消(單撤消生長(zhǎng)因子或單撤消血清或先生長(zhǎng)因子后血清或相反，先血清后生長(zhǎng)因子)。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種上述定義的方法，其中其中所建立的細(xì)胞系是在無(wú)外源生長(zhǎng)因子培養(yǎng)基的懸液中增殖的非黏附性干細(xì)胞。在這一點(diǎn)上，在上述提及的方法中，步驟b)包括飼養(yǎng)菌苔的逐步或全部撤消，然后培養(yǎng)基其他組分的選擇性撤消(生長(zhǎng)因子和血清)。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種上述定義的方法，其中其中所建立的細(xì)胞系是在無(wú)血清的培養(yǎng)基懸液中增殖的非黏附性干細(xì)胞(無(wú)血清培養(yǎng)基)。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種上述定義的方法，其中其中所建立的細(xì)胞系是在無(wú)外源生長(zhǎng)因子和血清的培養(yǎng)基懸液中增殖的非黏附性干細(xì)胞。在另一選擇中，步驟b)包括生長(zhǎng)因子的逐步或全部撤消，隨之為選擇性的血清的逐步撤消。在另一選擇中，步驟b)包括生長(zhǎng)因子和/或血清的逐步或全部撤消，隨之為選擇性的飼養(yǎng)菌苔的撤消。另外，所建立的細(xì)胞系可以是在血清減少的培養(yǎng)基，特別是無(wú)血清培養(yǎng)基中增殖的細(xì)胞。表述血清減少理解為在整個(gè)時(shí)期的血清濃度的逐漸降低。該方法允許克隆的選擇，其適應(yīng)新的，漸漸苛刻的環(huán)境直到獲得能在血清減少的培養(yǎng)基或徹底無(wú)血清的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的穩(wěn)定細(xì)胞系。上述提及的方法還可以額外包含一步驟，其中，步驟C)獲得的細(xì)胞在培養(yǎng)基中經(jīng)過(guò)用于大規(guī)模生產(chǎn)的選擇以獲得適合意于人或動(dòng)物治療的疫苗生產(chǎn)的克隆。本發(fā)明中相應(yīng)的細(xì)胞具有至少一種以下特征一高的核質(zhì)比，一內(nèi)源性堿性磷酸酶活性，一內(nèi)源性端粒酶活性，—與選自抗體SSEA-1(TECOl)，SSEA-3，和EMA-1組的特定抗體的反應(yīng)性。'優(yōu)選地，本發(fā)明的細(xì)胞具有以上所有特征。在另一方面，本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)禽細(xì)胞系的方法，如上所述，步驟C)獲得的細(xì)胞系來(lái)源的細(xì)胞為了在體外更好的利用而受到修飾，如更長(zhǎng)生命時(shí)期或生長(zhǎng)密度的延伸或選擇性地更低的營(yíng)養(yǎng)需求。有利地，從建立的細(xì)胞系中來(lái)源的細(xì)胞受到修飾以生產(chǎn)目的物質(zhì)，尤其是目的多肽，抗體，或減毒的病毒。所述細(xì)胞可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員所能得到的技術(shù)進(jìn)行修飾，尤其是同源的，直接的和/或條件性的重組(Cre-lox或FLP-FRT系統(tǒng))，其通過(guò)任何載體，質(zhì)粒，尤其是目的逆轉(zhuǎn)錄病毒的轉(zhuǎn)化。步驟a)中使用的培養(yǎng)基包括至少一種因子，選自細(xì)胞因子，尤其是LIF，IL-ll，IL-6，IL畫(huà)6R，CNTF，制瘤素和其他因子，如SCF，IGF-1禾口bFGF。另外，步驟a)中使用的鈍化詞養(yǎng)菌苔優(yōu)選地由成纖維細(xì)胞，包括作為細(xì)胞系建立的鼠成纖維細(xì)胞組成。這些成纖維細(xì)胞中，特別是STO細(xì)胞，其受到或沒(méi)受到修飾或表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染(Pain等，1996)。該方法中，步驟a)所用細(xì)胞通過(guò)懸浮細(xì)胞獲得，該懸浮細(xì)胞從包含至少一種細(xì)胞因子，b-FGF，和SCF的培養(yǎng)基中受精卵的胚層盤(pán)中獲得。所述細(xì)胞接種入飼養(yǎng)細(xì)胞的菌苔中，孵育，然后收集。步驟b)包括步驟a)中加入培養(yǎng)基的每種生長(zhǎng)因子的逐步撤消，尤其是細(xì)胞因子、b-FGF和SCF，包含在新的至少無(wú)一種所述因子的培養(yǎng)基中的一次傳代，及重復(fù)進(jìn)行各種連續(xù)的傳代直至培養(yǎng)基無(wú)所有所述因子。逐步撤消的表示理解為培養(yǎng)基中逐個(gè)因子的去除。選擇性地，可以進(jìn)行劇烈和全部的撤消，就是說(shuō)一下去除所有所述因子。因此，步驟b)中的撤消包含逐漸降低一種或多種因子的濃度或者直接在無(wú)一種或多種因子的培養(yǎng)基或無(wú)所有所述因子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)禽干細(xì)胞。步驟b)也包括血清的撤消。在這點(diǎn)上，撤消是逐漸的，通過(guò)在每次傳代時(shí)降低血清濃度，例如從10%過(guò)渡到7.5%，然后3.75%和2%，趨向于0。％(無(wú)血清培養(yǎng)基)。選擇性地，可以進(jìn)行更快的撤消。步驟b)還包括飼養(yǎng)菌苔的撤消。飼養(yǎng)菌苔的撤消也是逐漸的，通過(guò)在每次傳代時(shí)減少鈍化的飼養(yǎng)細(xì)胞數(shù)目。選擇性地，可進(jìn)行更快的撤消。當(dāng)然，撤消的順序可以變化。例如，可以先撤消生長(zhǎng)因子后撤消飼養(yǎng)菌苔。因此，另一方面，本發(fā)明涉及可從上面提及的方法獲得的所建立的細(xì)胞系和細(xì)胞系來(lái)源的細(xì)胞，所述細(xì)胞能在無(wú)外源生長(zhǎng)因子、血清和/或詞養(yǎng)菌苔的培養(yǎng)基中增殖至少50天，100天，150天，300天，或優(yōu)選地至少600天。這些細(xì)胞系和從中來(lái)源的細(xì)胞能在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中增殖至少50天，100天，150天，300天，或優(yōu)選地至少600天，尤其在如補(bǔ)充了本領(lǐng)域技術(shù)人員常用的各種添加物的DMEM，GMEM，HamF12或McCoy培養(yǎng)基中。在添加物中，值得注意的是非必需氨基酸，維生素，和丙酮酸鈉鹽。本發(fā)明還涉及來(lái)源于上面所述細(xì)胞系的細(xì)胞系和細(xì)胞，鑒定為禽干細(xì)胞，尤其是禽體干細(xì)胞或禽胚胎干細(xì)胞。這些干細(xì)胞在缺少鈍化的飼養(yǎng)菌苔中增殖時(shí)，是黏附性的。選擇性地，這些干細(xì)胞是非黏附性的，且在上述基礎(chǔ)培養(yǎng)基懸液中增殖。這些細(xì)胞也鑒定為具有至少一種以下特征一高的核質(zhì)比，一內(nèi)源性堿性磷酸酶活性，一內(nèi)源性端粒酶活性，一與選自抗體SSEA-1(TEC01)，SSEA-3，和EMA-1組的特定抗體的反應(yīng)性。有利地，這些細(xì)胞受到遺傳性修飾以用于目的物質(zhì)的生產(chǎn)，尤其是目的多肽，抗體或減毒病毒。所述細(xì)胞能支持例如活的或減毒病毒的復(fù)制，尤其是選自腺病毒，嗜肝DNA病毒，皰疹病毒，正粘病毒，乳頭多瘤空泡病毒，副粘病毒，小RNA病毒，痘病毒呼腸孤病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒組的病毒。優(yōu)選地，在這些細(xì)胞中復(fù)制的病毒屬于正粘病毒家族，尤其是流感病毒，或副粘病毒家族，尤其是麻疹病毒，腮腺炎病毒，風(fēng)疹病毒。因此，本發(fā)明涉及如上所述細(xì)胞系，源于所述細(xì)胞系的細(xì)胞及由經(jīng)過(guò)遺傳修飾的細(xì)胞而獲得的細(xì)胞系。優(yōu)選地，本發(fā)明涉及如上所述方法的步驟c)來(lái)源的細(xì)胞系，鑒定為禽干細(xì)胞，其能在無(wú)外源生長(zhǎng)因子，減少血清或無(wú)血清和/或飼養(yǎng)菌苔的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中無(wú)限生長(zhǎng)。本發(fā)明的另一方面，步驟C)結(jié)束而獲得的細(xì)胞可能受到了遺傳修飾。本發(fā)明還涉及細(xì)胞培養(yǎng)物，包括源于如上所述細(xì)胞系的細(xì)胞，尤其是禽干細(xì)胞或禽胚胎干細(xì)胞，以及無(wú)外源生長(zhǎng)因子，減少血清或無(wú)血清和/或鈍化的飼養(yǎng)菌苔的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。在另一方面，本發(fā)明涉及所述細(xì)胞系和細(xì)胞在目的物質(zhì)生產(chǎn)上的應(yīng)用，尤其是治療性目的蛋白，及活的或減毒病毒的復(fù)制上的應(yīng)用，尤其是選自腺病毒，嗜肝DNA病毒，皰疹病毒，正粘病毒，乳頭多瘤空泡病毒，副粘病毒，小RNA病毒，痘病毒，呼腸孤病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒組的病毒。優(yōu)選地，如上所述的細(xì)胞系和細(xì)胞用于屬于正粘病毒家族病毒的生產(chǎn)，尤其是流感病毒，及屬于副粘病毒家族病毒的生產(chǎn)，尤其是麻疹病毒，腮腺炎病毒，風(fēng)疹病毒。用于支持活的或減毒病毒復(fù)制的這些細(xì)胞系和細(xì)胞也可以，導(dǎo)入完成病毒整個(gè)病毒性周期的必要組分，例如，在細(xì)胞表面病毒受體的過(guò)表達(dá)。在說(shuō)明書(shū)其余部分，參考文獻(xiàn)將置于圖的圖例說(shuō)明之后。圖l-3:本發(fā)明細(xì)胞系的生長(zhǎng)曲線(撤消血清(圖2)和撤消詞養(yǎng)菌苔(圖3))。圖4:顯示禽干細(xì)胞典型形態(tài)學(xué)的照片N:細(xì)胞核，n:核仁和C:細(xì)胞質(zhì)(S86N99分離株，X40放大率，照片用SonyCyber-shot數(shù)碼相機(jī)拍攝)圖5:顯示黏附性的和在懸液中的禽干細(xì)胞堿性磷酸酶活性的照片固定后(0.1%甲醛/0.5%戊二醛，4°C，30分鐘)，細(xì)胞用1XPBS漂洗兩次，37。C在NBT/BCIP(氮藍(lán)四唑0.375mg/ml，5-溴-4-氯-3-口引哚-磷酸0.188mg/ml，0.1MTrispH9.5，0.05MMgcl2，O.lMNacl)溶液中孵育10到30分鐘。1XPBS沖洗終止反應(yīng)，然后拍照。14圖5A—例示了在黏附性細(xì)胞系S86N45p87中內(nèi)源性堿性磷酸酶活性的典型紫色，該細(xì)胞系在無(wú)飼養(yǎng)菌苔或生長(zhǎng)因子中培養(yǎng)(X40放大率，SonyCyber-shot數(shù)碼相機(jī))。圖5B—例示了在懸浮液中維持8次傳代的EB14細(xì)胞系中內(nèi)源性堿性磷酸酶活性的典型紫色，該細(xì)胞系來(lái)源于S86N45細(xì)胞，在無(wú)飼養(yǎng)菌苔或生長(zhǎng)因子的懸液中培養(yǎng)(X20放大率，SonyCyber-shot數(shù)碼相機(jī))。具體實(shí)施例方式實(shí)施例l:使用的活材料的各種來(lái)源細(xì)胞系的建立在很大程度上常與細(xì)胞材料的遺傳本性相聯(lián)系。因此，在嚙齒類(lèi)動(dòng)物例子中，相應(yīng)很少有遺傳基礎(chǔ)適用于胚胎干細(xì)胞ES細(xì)胞的生產(chǎn)，而常涉及近交系動(dòng)物的概念。在禽類(lèi)動(dòng)物的情形下，由于歷史性原因，很難獲得近交系動(dòng)物，由于有商業(yè)品系選擇的來(lái)源，恰好可避免近交。雞蛋是本發(fā)明中培養(yǎng)的細(xì)胞的起始來(lái)源。優(yōu)選地，雞蛋使用未孵育的，但是數(shù)小時(shí)的孵育對(duì)于獲得胚胎發(fā)育的第一階段可能是必需的。獲得的細(xì)胞來(lái)源于不同的雞品系。在所用的品系中，值得注意的有S86N品系，一株計(jì)劃用于具有質(zhì)量標(biāo)簽雛雞的生產(chǎn)的商業(yè)品系，CNRs，計(jì)劃用于具有質(zhì)量標(biāo)簽雛雞的生產(chǎn)的品系，Marens，一在遺傳學(xué)上和表型上得到很好地鑒定的地方品系，WhiteLeghoms，一多用于生產(chǎn)作為消耗的雞蛋和實(shí)驗(yàn)室研究的參照系的品系，等。后面的品系中，各種來(lái)源都得到檢測(cè)，包括某雞蛋(叫做Vola)，其從Lohmann(德國(guó))的WhiteLeghorns品系獲得，作為在非常特定的健康安全條件下保存的"SPF"(無(wú)特定病原)雞蛋。從各種品系獲得大量細(xì)胞分離物，提示了方法的全面特征。實(shí)施例2:黏附性細(xì)胞的生產(chǎn)和建立打開(kāi)雞蛋，打開(kāi)時(shí)蛋黃與蛋清分離。胚胎從蛋黃直接或借助巴斯德移液管，或借助小的吸收性濾紙(Whatmann3M濾紙)而移除，預(yù)先借助穿孔器以穿孔環(huán)形式裁剪。穿孔的直徑約5mm。這些環(huán)在烘箱干熱滅菌約30分鐘。小的紙環(huán)置于蛋黃表面而居胚胎中間，其使得胚胎被紙環(huán)圍起來(lái)。接著借助小剪刀裁剪，然后整個(gè)移除物置于陪替氏15培養(yǎng)皿中，裝滿PBS或生理鹽水。由紙環(huán)帶走的胚胎純化于培養(yǎng)基中剩余的蛋黃和胚盤(pán)，因而無(wú)卵黃磷蛋白，用巴斯德移液管收集。兩種情形下，胚胎置于含有生理培養(yǎng)基的試管中(1XPBS，Tris葡萄糖，培養(yǎng)基，等)。然后胚胎被機(jī)械解離，接種到設(shè)定的培養(yǎng)基中"飼養(yǎng)層"上。在為培養(yǎng)優(yōu)選的條件中，對(duì)于以MacCoy培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加起始濃度為12-8%的胎牛血清，1%非必需氨基酸，1%商業(yè)來(lái)源的維生素混合物，終濃度為lmM的丙酮酸鈉鹽，終濃度為0.2mM的P-巰基乙醇，終濃度為2.9mM的谷氨酸，抗生素混合物包含終濃度為10ng/ml的慶大霉素，終濃度為100U/ml的青霉素和終濃度為100lig/ml的鏈霉素的培養(yǎng)基設(shè)定對(duì)照。細(xì)胞第一次傳代后很快，不再向培養(yǎng)基加入抗生素混合物。很快的表示理解為通常在起始的3-5次傳代后。也可加入核苷混合物，其制備如上所述(Pain等，1996)。在同樣條件下受檢測(cè)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，得出相近結(jié)果的為HamF12，GMEM和DMEM培養(yǎng)基，后者加入終濃度為8mg/L的生物素。作為對(duì)照，MacCoy培養(yǎng)基中生物素濃度為0.2mg/L，HamF12中為0.0073mg/L及商業(yè)化DMEM和GMEM培養(yǎng)基中為0。加入培養(yǎng)基的生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子是優(yōu)選的重組生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子，包括終濃度為lng/ml的鼠SCF，終濃度為l-5ng/ml的IGF-1，終濃度為lng/ml的CNTF，終濃度為lng/ml的IL-6，終濃度為0.5ng/ml至lng/ml的可溶性IL-6受體。在一些實(shí)驗(yàn)中，首次傳代時(shí)可加入一些其他的因子。例如在3或10代時(shí)，可加入終濃度為lng/ml的bFGF和終濃度為lng/ml的IL-ll。在培養(yǎng)基中鈍化的"飼養(yǎng)層"上進(jìn)行接種，其由鼠成纖維細(xì)胞系，STO細(xì)胞組成。在一些情況下，細(xì)胞用能在STO細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)生長(zhǎng)因子，如禽SCF的簡(jiǎn)單表達(dá)載體轉(zhuǎn)染。因此，"飼養(yǎng)層"生產(chǎn)可溶性和/或結(jié)合在細(xì)胞質(zhì)膜上的形式的生長(zhǎng)因子。在細(xì)胞直接起始接種如培養(yǎng)基后，依據(jù)觀察的原始細(xì)胞的黏附率，培養(yǎng)基在第二天部分改變，然后在隨后的天數(shù)部分或完全改變。依這種情形4-7天后，起始培養(yǎng)物被分離并轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)皿，在同樣的起始培養(yǎng)基鈍化的飼養(yǎng)層上。3-5次傳代后，細(xì)胞在鈍化的STO細(xì)胞飼養(yǎng)層上培養(yǎng)，其未轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)染了編碼抗抗生素物質(zhì)的表達(dá)載體，如抗新霉素，潮霉素，嘌呤霉素等的抗性基因。約20代后，細(xì)胞逐步減少生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子。逐步撤消的表示理解為從培養(yǎng)基中逐個(gè)去除因子。因此，一次傳代時(shí)，SCF首先被完全去除，然后，2次或3次傳代后，去除IGF-1。若細(xì)胞未顯示出形態(tài)學(xué)的變化或平均增殖率的改變，則其他的因子，如CNTF和IL-6被去除。該撤消也可是快速的。這種情形中所有因子一起去除。細(xì)胞受到觀察且若增殖率改變則只在數(shù)天后傳代。后者解決方法通常是熟練應(yīng)用的。各種分離物因而獲得且維持很長(zhǎng)時(shí)期。很長(zhǎng)時(shí)期的表示理解為數(shù)星期順序的時(shí)期，至少50天，優(yōu)選地大于200-400天的時(shí)期，在時(shí)間上無(wú)限制。觀察到超過(guò)600天的時(shí)期。不管所用的支持物，所有黏附性細(xì)胞都用蛋白裂解酶解離，如鏈霉蛋白酶，膠原蛋白酶，中性蛋白酶，胰蛋白酶，等。優(yōu)選地，使用細(xì)菌性來(lái)源的蛋白裂解酶以避免任何潛在的動(dòng)物來(lái)源的污染。這些細(xì)胞具有胚胎干細(xì)胞的特征，作為例子，如圖4的照片等例示的特定形態(tài)學(xué)特征，小體積，大的細(xì)胞核質(zhì)比，至少有一個(gè)清晰可見(jiàn)核仁的細(xì)胞核及非常少的細(xì)胞質(zhì)。這些細(xì)胞可以通過(guò)以小的或緊或松的聚集體生長(zhǎng)來(lái)鑒定。這些黏附性和非黏附性細(xì)胞對(duì)一些抗體顯示出交叉反應(yīng)，如上述Pain等，1996.及專(zhuān)利US6，114,168和EP787180中提及的。內(nèi)源性端粒酶活性也得到顯示且是在這些細(xì)胞的"干"本性中的一種重要因素。獲得不同分離物的細(xì)胞且維持長(zhǎng)的時(shí)期。<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>應(yīng)當(dāng)指出，術(shù)語(yǔ)"靜息"并不對(duì)應(yīng)于細(xì)胞增殖的結(jié)束，而是實(shí)驗(yàn)者對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)的有意的靜息。子代n的數(shù)目由公式X^2"或X為細(xì)胞的理論累積數(shù)目獲得。該細(xì)胞數(shù)是有效的，因細(xì)胞可在每次傳代和接種時(shí)計(jì)數(shù)。因此，整個(gè)培養(yǎng)歷程是有效的。實(shí)施例3:細(xì)胞的傳代干細(xì)胞的一種特征，在特殊的體干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞中，就是它們?cè)隗w外相當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)的增殖能力。為了繁殖和傳代細(xì)胞，傳代前幾小時(shí)培養(yǎng)基被改換并且用新鮮的培養(yǎng)基替代。圖1中的曲線例示了細(xì)胞生長(zhǎng)和建立的示意圖。實(shí)施例4:倍增時(shí)間和平均分裂時(shí)間用培養(yǎng)建立的細(xì)胞系和上述實(shí)施例中提及的細(xì)胞系起始培養(yǎng)，可以計(jì)算出平均分裂時(shí)間。在所有獲得的獨(dú)立分離物中，連續(xù)傳代過(guò)程中增殖速率緩慢增長(zhǎng)，因此導(dǎo)致在建立細(xì)胞系過(guò)程中平均分裂時(shí)間的變化。在黏附階段，細(xì)胞最初接種于一個(gè)非活化的飼養(yǎng)菌苔上，然后以每個(gè)100mm培養(yǎng)皿1-2乂106個(gè)細(xì)胞的穩(wěn)定起始接種密度定期傳代。表2例示了3種已建立細(xì)胞系的倍增時(shí)間(d)和平均分裂時(shí)間(MDT以小時(shí)計(jì))作為培養(yǎng)時(shí)間的參數(shù)。發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞系建立過(guò)程中倍增時(shí)間降低。表2:以天數(shù)計(jì)的時(shí)期內(nèi)平均倍增時(shí)間d的建立由以下公式計(jì)算d=(1/Log2X(LogX2/XO)XI/(T2-T1)，其中X2和XI分別是T2和Tl時(shí)間內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)。該公式為在實(shí)施例1中子代數(shù)為N時(shí)用公式X二2"計(jì)算細(xì)胞數(shù)目的直接結(jié)果。平均分裂時(shí)間(MDT)為d除以24小時(shí)而獲得的小時(shí)數(shù)。*Valo細(xì)胞系在沒(méi)有詞養(yǎng)菌苔存在的塑料制品上建立細(xì)胞系的過(guò)程中進(jìn)行傳代。當(dāng)細(xì)胞重新適應(yīng)新的環(huán)境時(shí)，倍增時(shí)間先降低然后再增加。實(shí)施例5:對(duì)細(xì)胞系的增殖進(jìn)行血清水平上的控制在獲得這些細(xì)胞系時(shí)，所用的培養(yǎng)基為常規(guī)培養(yǎng)基，由基礎(chǔ)培養(yǎng)基(DMEM，GMEM，HamF12，McCoy，等)補(bǔ)充入不同的添加物如非必需氨基酸，維生素，和丙酮酸鈉鹽組成。該復(fù)合培養(yǎng)基包含胎牛血清，為培養(yǎng)過(guò)程中的中心組分，甚至一些不同來(lái)源的組分，包括植物組分，可被逐步使用。提出一種控制和使細(xì)胞適應(yīng)相對(duì)較低比例胎牛血清的方法。使得在低百分比血清的條件下(例如在S86N16細(xì)胞系例子中血清比例為2%)維持細(xì)胞高增殖(分裂時(shí)間〉1)成為可能。圖2所示曲線例示了對(duì)給定細(xì)胞類(lèi)型S86N16血清的相對(duì)減少量，倍增時(shí)間和平均分裂時(shí)間被計(jì)算出并顯示在表3中。應(yīng)當(dāng)指出，平均分裂時(shí)間的增加是血清相對(duì)減少的一種影響。在上述條件下培養(yǎng)一段時(shí)間后仍然可觀察到恢復(fù)期。這個(gè)時(shí)間保持低于24小時(shí)(d>l)，顯示了即便在血清濃度為2%，已經(jīng)相當(dāng)?shù)蜁r(shí)，細(xì)胞在工業(yè)時(shí)期的一種非常有利的增殖狀態(tài)。為了提高這個(gè)時(shí)間和進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)條件，改進(jìn)有關(guān)不同代謝物的利用應(yīng)當(dāng)被重視。表3:生長(zhǎng)條件10%7.5%3.75%2%d2.021.511.471.08MDT11.915.816.322.2實(shí)施例是在10%條件下p204和p179代之間，7.5%條件下p198和p176代之間，3.75%條件下p224和p201代之間，以及2%條件下p216和pl99代之間獲得的。實(shí)施例6:除去細(xì)胞的飼養(yǎng)菌苔19在初始培養(yǎng)條件下，為了得到如前所述的胚胎干細(xì)胞，菌苔對(duì)于非活化的細(xì)胞來(lái)說(shuō)顯得是必需的。在一定數(shù)量的傳代后，飼養(yǎng)菌苔顯得不再是必需的。只有"培養(yǎng)處理的"塑料制品顯得重要了。事實(shí)上，某些胚胎細(xì)胞的一種特征就是以黏附形式增殖。為了方便黏附細(xì)胞，所用的各種塑料制品材料被"培養(yǎng)"處理。在制造時(shí)他們經(jīng)過(guò)增加塑料制品表面電荷的處理，這些電荷促進(jìn)胞外基質(zhì)的黏附。相反，未經(jīng)處理的細(xì)胞培養(yǎng)塑料制品，常稱為細(xì)菌學(xué)品質(zhì)的塑料制品，是沒(méi)有經(jīng)過(guò)添加特定詞養(yǎng)菌苔的表面處理的。隨之，細(xì)胞的黏附通常非常困難，或甚至是不可能的，或?qū)е滦螒B(tài)學(xué)及行為學(xué)的改變，通常是很激烈的。兩種塑料制品品質(zhì)的區(qū)別使得依靠在不同制品上接種而獲得具有不同行為的細(xì)胞成為可能。逐步除去非活化"飼養(yǎng)層"的培養(yǎng)物使得在數(shù)次傳代后，獲得直接接種于"培養(yǎng)處理的"塑料制品的干細(xì)胞均一培養(yǎng)物成為可能。圖3中，以S86N16細(xì)胞系為例，顯示了在非活化"飼養(yǎng)層"存在和缺少的條件下細(xì)胞維持的對(duì)比生長(zhǎng)曲線。細(xì)胞的這種適應(yīng)是進(jìn)步的，使得不會(huì)失去原始維持在"飼養(yǎng)層"上細(xì)胞的干細(xì)胞特性。累進(jìn)的衍生物因此而得到。在塑料制品上增殖的細(xì)胞的獲得是撤消這個(gè)過(guò)程的一種實(shí)現(xiàn)。表4中，分裂時(shí)間顯示了細(xì)胞對(duì)環(huán)境的敏感度。在逐步撤消血清的情況下，在所述條件下數(shù)次傳代后，可獲得一種對(duì)細(xì)胞具有恢復(fù)效應(yīng)的適應(yīng)性。表4:<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>實(shí)施例是在3種條件下飼養(yǎng)細(xì)胞為1.2X106，0.5X106和0.3X106時(shí)p154和p131代之間及單有塑料制品的條件下p161和p139之間獲得的。實(shí)施例7:生長(zhǎng)因子中除去細(xì)胞在初始培養(yǎng)條件下，細(xì)胞因子的存在是必需的。可以圖示性地區(qū)分兩類(lèi)家族的因子細(xì)胞因子和營(yíng)養(yǎng)因子。此類(lèi)細(xì)胞因子主要是通過(guò)與gpl30蛋白相聯(lián)系的受體起作用的細(xì)胞因子。因此，LIF，IL-11，IL-6，CNTF，制瘤素和促心激素具有相似的作用模式，在對(duì)特定鏈的受體水平的招募以及與單體的或有時(shí)為異體的gpl30蛋白間的結(jié)合。有些情況下，與可溶性受體的結(jié)合，尤其是所述的如IL-6和CNTF的受體形式，使得提高可見(jiàn)的增殖效應(yīng)成為可能。已經(jīng)顯示至少添加一種此類(lèi)細(xì)胞因子對(duì)于獲得胚胎干細(xì)胞看來(lái)是必需的。營(yíng)養(yǎng)因子主要是SCF，IGF-l和bFGF，如前所述，在培養(yǎng)起始時(shí)經(jīng)常被使用。它們對(duì)于獲得和擴(kuò)增細(xì)胞也是必需的。通過(guò)逐步減少這些生長(zhǎng)因子，數(shù)次傳代后，可以獲得不需要外加的生長(zhǎng)因子而允許胚胎干細(xì)胞或體干細(xì)胞增殖的培養(yǎng)條件。用于鑒定這些細(xì)胞的不同標(biāo)記對(duì)于沒(méi)有生長(zhǎng)因子維系的細(xì)胞通常是陽(yáng)性的。實(shí)施例8:所用培養(yǎng)基的對(duì)比接種于不同的培養(yǎng)基，細(xì)胞不能在同樣的頻率獲得。對(duì)比培養(yǎng)基的組分使得鑒定其中一種特定組分變得困難?？瓷先ジ袷撬械慕M成使得細(xì)胞在生理上有進(jìn)步。之前的培養(yǎng)基中，HamF12培養(yǎng)基，McCoy培養(yǎng)基，DMEM培養(yǎng)基及添加了生物素的MEM培養(yǎng)基是值得注意的。以此類(lèi)分離物起始，適應(yīng)試驗(yàn)在這些不同的培養(yǎng)基上進(jìn)行。實(shí)施例9:非黏附性細(xì)胞的建立在干細(xì)胞的連續(xù)傳代時(shí)，直接高密度接種于細(xì)菌性培養(yǎng)皿中，使得在數(shù)次傳代后，獲得從培養(yǎng)基上分離的，在懸浮液中以小而規(guī)則的聚集體增殖的胚胎細(xì)胞成為可能。這種增殖可以持續(xù)多代，僅通過(guò)稀釋?zhuān)瑱C(jī)械分離而不使用蛋白水解酶。培養(yǎng)物的攪拌以常規(guī)進(jìn)行，但不代表獲得非黏附性細(xì)胞的區(qū)別性因素。就像黏附性細(xì)胞一樣，這些細(xì)胞有干細(xì)胞的典型形態(tài)學(xué)特征，如，小體積，大的細(xì)胞核質(zhì)比，至少有一個(gè)清晰可見(jiàn)核仁的細(xì)胞核及非常少的細(xì)胞質(zhì)。這些細(xì)胞可以通過(guò)以小的或緊或松的聚集體生長(zhǎng)來(lái)鑒定。這類(lèi)非黏附性細(xì)胞對(duì)一些抗體顯示出交叉反應(yīng)，如上述Pain等，1996.中提及的。這類(lèi)細(xì)胞也顯示出內(nèi)源性端粒酶活性為陽(yáng)性(如實(shí)施例10中提及的EB1，EB4和EB5細(xì)胞)。在非黏附性階段，細(xì)胞在不同培養(yǎng)基中顯示出高的增長(zhǎng)。起始的接種密度和非常有規(guī)律的新鮮培養(yǎng)基的供給使細(xì)胞達(dá)到可能超過(guò)121X106每毫升的高密度。表5概括了一些分離物的主要特征(親本細(xì)胞，制成懸液的原代細(xì)胞，在懸液中維持培養(yǎng)的天數(shù)，自發(fā)靜息生長(zhǎng)前所獲得的傳代數(shù)和子代數(shù))。應(yīng)當(dāng)指出，制成懸液的傳代細(xì)胞可從一種培養(yǎng)物到另一種而不同(見(jiàn)分離物EB1和EB14)，增殖效率也可不同(見(jiàn)分離物EB3和EB14)。表5:名稱親本細(xì)胞起始傳代數(shù)起始曰期天數(shù)傳代數(shù)子代數(shù)EB1S86N16plll20-01-200118441120EB3S86賜p11823-01-20013811740EB4S86N45p10025-09-2001441740EB5S86N45p畫(huà)25-09-2001441740EB14S86N45p8105-09-2002702465應(yīng)當(dāng)指出，術(shù)語(yǔ)"起始日期"與被置于非黏附性條件下的細(xì)胞一致。實(shí)施例10:所建立細(xì)胞的鑒定維持長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)的干細(xì)胞使用同樣的如前所述的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)鑒定(Pain等，1996)。因此，可以定期檢測(cè)內(nèi)源性堿性磷酸酶活性，圖5中照片例示了內(nèi)源性端粒酶活性和與特定抗體如抗體SSEA-1(TEC-01)和EMA-1的反應(yīng)性。在建立細(xì)胞中一個(gè)重要的標(biāo)準(zhǔn)就是端粒酶的存在。用TRAP檢測(cè)試劑盒(端粒酶PCR酶聯(lián)免疫反應(yīng)，羅氏)對(duì)在培養(yǎng)物中維持的細(xì)胞進(jìn)行各種不同的測(cè)驗(yàn)。在培養(yǎng)物中多次傳代后，細(xì)胞被檢測(cè)到呈陽(yáng)性。因此，端粒酶活性在S86N16細(xì)胞，S86N45細(xì)胞和以非黏附形式來(lái)源的EB1，EB4及EB5細(xì)胞中是可檢測(cè)的(見(jiàn)表6)。在原始培養(yǎng)物中維持的CEFs(雞胚胎成纖維細(xì)胞)細(xì)胞被認(rèn)為是陰性的。值0DO.2是試劑盒推薦的作為陰性閾值的臨界值。所有分析以等量的2000個(gè)細(xì)胞進(jìn)行。表6:不同細(xì)胞系在不同傳代數(shù)時(shí)的端粒酶活性測(cè)定細(xì)胞系傳代數(shù)端粒酶OD值S86腸p121.7<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>實(shí)施例ll:細(xì)胞的轉(zhuǎn)染和誘導(dǎo)維持長(zhǎng)時(shí)間生長(zhǎng)的干細(xì)胞用不同的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。已顯示禽類(lèi)干細(xì)胞可被轉(zhuǎn)染(Pain等，1996)。特定地，轉(zhuǎn)染非黏附性細(xì)胞且多種篩選系統(tǒng)使得鑒定穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞成為可能(細(xì)胞篩選，限制性稀釋?zhuān)?。遺傳修飾可以在干細(xì)胞的未分化階段進(jìn)行。一旦獲得遺傳修飾，細(xì)胞就自發(fā)的或通過(guò)添加分化誘導(dǎo)劑而誘導(dǎo)分化。這兒，可使用濃度為10—8-10'6摩爾/升的視黃酸，或終濃度為1%-2%的二甲基亞砜，或濃度為10'4-10'8摩爾/升的丁酸鈉，或終濃度為l-5ug/ml的佛波酯(TPA，PMA，等)或脂多糖(LPS)。在另一實(shí)施例中，細(xì)胞能在懸液中形成胚胎樣體，該胚胎樣體在細(xì)胞組建過(guò)程的解離或未解離后可黏附在塑料制品上。分化的細(xì)胞開(kāi)始增殖，但是長(zhǎng)期增殖的能力非常有限。通過(guò)對(duì)影響到細(xì)胞增殖的基因耙向性修飾，可以使得這些已分化細(xì)胞能長(zhǎng)時(shí)間增殖。實(shí)施例12:細(xì)胞的感染黏附性或非黏附性細(xì)胞可被不同的病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒包括禽類(lèi)病毒及逆轉(zhuǎn)錄病毒傳染。因此，此類(lèi)細(xì)胞可用作生產(chǎn)病毒材料的復(fù)制系統(tǒng)，依賴該病毒材料可用于生產(chǎn)活的，減毒的或鈍化的人和獸類(lèi)疫苗。在目的病毒中，所提及的病毒科有腺病毒(如，人腺病毒C，禽腺病毒A，羊腺病毒D，火雞腺病毒B)，圓環(huán)病毒(如，雞貧血病毒，CAV)，冠狀病毒(如，禽傳染性支氣管炎病毒(IBV))，黃病毒(如，黃熱病毒和丙型肝炎病毒)，嗜肝DNA病毒(如，乙型肝炎病毒和禽嗜肝DNA病毒，如鴨嗜肝DNA病毒)，皰疹病毒(如，禽皰疹病毒，HSV(單純皰疹病毒)和人皰疹病毒l、3、5型)，正粘病毒(如，流感病毒流感病毒A，流感病毒B，流感病毒C)，乳頭多瘤空泡病毒(如，多瘤病毒和非常特異的猴病毒40)，副粘病毒(如，麻疹病毒，腮腺炎病毒，風(fēng)疹病毒及呼吸道病毒和肺病毒，如人呼吸道合胞病毒和次肺病毒，如禽肺病毒)，小RNA病毒(如，脊髓灰質(zhì)炎病毒，甲型肝炎病毒及腦心肌炎病毒和口蹄疫病毒)，痘病毒(如，雞痘病毒，禽痘病毒，包括金絲雀痘病毒，燈芯草雀痘病毒，八哥痘病毒，鴿痘病毒，鸚鵡痘病毒，鵪鶉痘病毒，麻雀痘病毒，歐椋鳥(niǎo)痘病毒，火雞痘病毒)，呼腸孤病毒(如，輪狀病毒)，逆轉(zhuǎn)錄病毒(如，ALV禽白血病病毒，y逆轉(zhuǎn)錄病毒，如小鼠白血病病毒，慢病毒，如人免疫缺陷病毒l、2型)以及披膜病毒科，如風(fēng)疹病毒屬，特別如風(fēng)疹病毒。實(shí)施例13:病毒感染非黏附性禽細(xì)胞系(EB1)的方案EB1或EB14細(xì)胞接種入培養(yǎng)基，優(yōu)選MacCoy's5A，HAMF12或DMEM培養(yǎng)基，或任何其他的目的培養(yǎng)基，含5%血清，通常起始體積為50毫升，細(xì)胞濃度為0.2X10S個(gè)/毫升。細(xì)胞在39°C，二氧化碳濃度為7.5%條件下，通過(guò)攪拌維持生長(zhǎng)。3-4天內(nèi)每天加入新鮮培養(yǎng)基，使細(xì)胞持續(xù)擴(kuò)大至終體積為100-250毫升，密度為l-3Xl()S個(gè)/收集懸液中的細(xì)胞，以約l,000轉(zhuǎn)/分離心IO分鐘。細(xì)胞團(tuán)塊以20-50毫升1XPBS(磷酸鹽緩沖液)重懸。然后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，離心而成團(tuán)的細(xì)胞以終濃度3-5Xl(^個(gè)/毫升置于無(wú)血清培養(yǎng)基中。以此準(zhǔn)備數(shù)管。蘇腳多浙微.已知滴度的病毒材料在37。C快速融解，以無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋至10X-1000X于最終感染所需濃度的滴度。病毒依照不同類(lèi)型，以m.o.i(感染復(fù)數(shù))為0.01-0.5感染細(xì)胞，包含向細(xì)胞團(tuán)塊加入介于0.1和%體積/體積的病毒懸液。病毒在優(yōu)化的溫度下孵育1小時(shí)，通常為33°C-37°C，再次離心，小心倒掉培養(yǎng)基。該步驟對(duì)于限制起始病毒在后續(xù)過(guò)程中的作用一般被認(rèn)為是必要的。一種可能就是不用再次離心而直接用含血清培養(yǎng)基(5%血清)稀釋細(xì)胞至終濃度為0.2-lXl()S個(gè)/毫升，然后再孵育。欲桌J:微潘應(yīng)，孵育2-4天后，依照病毒動(dòng)力學(xué)和某些病毒的潛在細(xì)胞病變效應(yīng)，收集含細(xì)胞及細(xì)胞碎片的培養(yǎng)基。由于病毒的性質(zhì)，只有細(xì)胞團(tuán)塊和上清是所需的，且含有病毒顆粒。收集的上清再次以2，500轉(zhuǎn)/分離心5-10分鐘，在純化顆粒前于-80'C保存。等量收集以進(jìn)行滴定。細(xì)胞團(tuán)塊置于5毫升無(wú)血清培養(yǎng)基中，超聲處理后以2，500轉(zhuǎn)/分離心5-10分鐘。獲得的上清于-80'C保存至純化和等量滴定時(shí)。在各種執(zhí)行條件下比較病毒的感染和生產(chǎn)能力。由于病毒的細(xì)胞病變效應(yīng)，通常用噬菌斑技術(shù)進(jìn)行滴定。實(shí)施例14:病毒感染黏附性禽細(xì)胞系(S86N45)的方案在感染進(jìn)入T150培養(yǎng)瓶之前，細(xì)胞以0.03-0.06乂106個(gè)/毫升的濃度接種入培養(yǎng)基培養(yǎng)48小時(shí)，優(yōu)選MacCoy's5A，HAMF12或DMEM培養(yǎng)基，或任何其他的目的培養(yǎng)基，含5%血清，。在39。C，二氧化碳濃度為7.5%條件下維持生長(zhǎng)。已知滴度的病毒材料在37'C快速融解，以無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋至10X-1000X于最終感染所需濃度的滴度。病毒依照不同類(lèi)型，以m.o.i(感染復(fù)數(shù))為0.01-0.5感染細(xì)胞，包含向細(xì)胞團(tuán)塊加入介于0.1和10%體積/體積的病毒懸液。感染一般在最少的無(wú)血清培養(yǎng)基中進(jìn)行(每個(gè)75cn^培養(yǎng)瓶中為5-10毫升)。病毒在優(yōu)化的溫度下孵育1小時(shí)，通常為33'C-37'C，培養(yǎng)瓶中加入20毫升5%的培養(yǎng)基。特定情形下，可用PBS沖洗細(xì)胞以除去可能附著在細(xì)胞上的病毒顆粒。在病毒引起細(xì)胞病變的情形下，感染后每天觀察細(xì)胞以監(jiān)控細(xì)胞噬菌斑，它指示感染的良好進(jìn)程。條，歡微.孵育2-4天后，依照病毒動(dòng)力學(xué)和某些病毒的潛在細(xì)胞病變效應(yīng)，收集含細(xì)胞及細(xì)胞碎片的培養(yǎng)基。由于病毒的性質(zhì)，只有細(xì)胞團(tuán)塊和上清是所需的，且含有病毒顆粒。收集的上清再次以2，500轉(zhuǎn)/分離心5-10分鐘，在純化顆粒前于-8(TC保存。等量收集以進(jìn)行滴定。細(xì)胞團(tuán)塊置于5毫升無(wú)血清培養(yǎng)基中，超聲處理后以2，500轉(zhuǎn)/分離心5-10分鐘。獲得的上清于-8(TC保存至純化和等量滴定時(shí)。在各種執(zhí)行條件下比較病毒的感染和生產(chǎn)能力。由于病毒的細(xì)胞病變效應(yīng)，通常用噬菌斑技術(shù)進(jìn)行滴定。實(shí)施例15:在非黏附性禽干細(xì)胞EB1細(xì)胞系中重組禽痘病毒的復(fù)制非黏附性干細(xì)胞EB1在138代時(shí)擴(kuò)大，接著以感染復(fù)數(shù)0.1感染生產(chǎn)目的蛋白的禽痘病毒。感染后，細(xì)胞在控制箱中維持生長(zhǎng)4天，期間感染持續(xù)進(jìn)行。在溶胞作用后，為了監(jiān)控上清和胞內(nèi)病毒的滴度差異，從第2天起，以及接下來(lái)的兩天，除去等分量的細(xì)胞。滴定以噬菌斑技術(shù)進(jìn)行。表7顯示了獲得的結(jié)果。結(jié)果表明，重組禽痘病毒在EB1干細(xì)胞中的復(fù)制是非常令人滿意的。因此，從培養(yǎng)到感染的進(jìn)程中感染滴度增強(qiáng)，在接種4天后達(dá)到最大值7.211/細(xì)胞(PFU:噬斑形成單位)。該滴度已至少與用同樣的重組禽痘病毒感染原始雞胚細(xì)胞所得到的病毒滴度相當(dāng)。該滴度可以用特定的培養(yǎng)條件和優(yōu)化的程序來(lái)提高。還應(yīng)當(dāng)指出，在更大規(guī)模的3升生物反應(yīng)器中，至少可以獲得同樣的感染滴度。表7:重組禽痘病毒在非黏附性EB1干細(xì)胞中的滴定動(dòng)力學(xué)取樣(感染后小時(shí))50小時(shí)74小時(shí)97小時(shí)細(xì)胞碎片(LogPFU/ml)6.406.375.99上清(LogPFU/ml)5.565.86.29總共(LogPFU/ml)5.785.946.3126P雨cell2.23.27.2參考文獻(xiàn)BabaT^V,HumphriesEIL(1985).Formationofatransformedfollicleisnecessarybutnotsufficientfordevelopmentofanavianleukosisvirus-inducedlymphoma.Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:213-216.BeugH,vonKirchbachA,DoderleinG，ConscienceJF,GrafT.(1979).Chickenhematopoieticcellstransformedbysevenstrainsofdefectiveavianleukemiavirusesdisplaythreedistinctphenotypesofdifferentiation.Cell18:375-390.GuilhotC，BenchaibiM,FlechonJE，SamarutJ.(1993).The12SadenoviralElAproteinimmortalizesaviancellsandinteractswiththeavianRBproduct.Oncogene8:619-624KawaguchiT，NomuraK,HirayamaY，KitagamaT.(1987).Establishmentandcharacterizationofachickenhepatocellularcarcinomacellline,L麗.CancerRes198747:4460-4464.KimH,YouS,FarrisJ.FosterLK，F(xiàn)osterDN.(2001).Post隱transcriptionalinact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