專利名稱：：一種hbv基因的核苷酸突變位點(diǎn)的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于基因組學(xué)和分子生物學(xué)中有機(jī)生物分子領(lǐng)域，具體而言涉及HBV基因的核苷酸突變位點(diǎn)的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
：自然界大多數(shù)生物體的遺傳信息均包含在脫氧核糖核酸(DNA)中，人類全基因組中30億個(gè)堿基，約4萬個(gè)基因，分布在23對(duì)染色體上。每個(gè)基因通過轉(zhuǎn)錄、翻譯，編碼特異的蛋白質(zhì)，調(diào)控生物體內(nèi)特定的生化反應(yīng)，發(fā)揮特異的生物學(xué)功能。DNA序列的改變，即基因突變，會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能的改變或缺失，進(jìn)而引起相關(guān)的遺傳疾病。基因突變包括DNA分子中發(fā)生堿基對(duì)的插入、缺失和改變(點(diǎn)突變)。研究表明許多疾病的發(fā)生，如血友病、地中海貧血、杜氏型肌營(yíng)養(yǎng)不良、亨廷頓舞蹈癥、老年癡呆癥、糖尿病、肥胖癥、心血管疾病以及自身免疫等3000多個(gè)疾病與基因突變密切相關(guān)。另外，近年來人們逐漸認(rèn)識(shí)到癌癥的發(fā)生發(fā)展也是基因累積突變的結(jié)果。在人類基因組中，約90%的差異是以單個(gè)核苷酸的差異體現(xiàn)出來的，主要由單個(gè)堿基的轉(zhuǎn)換(transition)或顛換(transversion)所引起，這樣的差異位點(diǎn)稱作單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)。在人群中，這種變異的發(fā)生頻率至少要大于1%，否則被認(rèn)為是點(diǎn)突變。SNP位點(diǎn)大多數(shù)為雙態(tài)，即在一個(gè)位點(diǎn)上僅有兩種表現(xiàn)形式，并且在人類基因組中廣泛存在，平均每500-1000個(gè)堿基對(duì)中就有1個(gè)，估計(jì)其總數(shù)可達(dá)300萬個(gè)甚至更多。這些差異極有可能是造成個(gè)體差異的遺傳因素，因此發(fā)現(xiàn)這些位點(diǎn)可廣泛地應(yīng)用于遺傳標(biāo)記的研究、評(píng)估個(gè)體遺傳關(guān)系、評(píng)估物種進(jìn)化等研究領(lǐng)域。目前檢測(cè)SNP和基因突變的方法有許多種，如直接PCR測(cè)序、RFLP、基因芯片和熒光定量PCR等。其中，直接PCR測(cè)序最不敏感，只有耐藥突變株達(dá)到20%以上才能被檢測(cè)到；也不適用于大規(guī)模篩選；RFLP分析只能檢測(cè)出在病毒總體中大于5%的突變株，但是對(duì)于每個(gè)感興趣的突變，必須特別設(shè)計(jì)單獨(dú)的核酸內(nèi)切酶。針對(duì)某些突變的特異性內(nèi)切酶可能并不存在，因此RFLP分析并不適用于所有的突變?；蛐酒夹g(shù)利用寡核苷酸微點(diǎn)陣，可以檢測(cè)新發(fā)現(xiàn)的突變，但這種方法代價(jià)昂貴，沒有得到廣泛應(yīng)用。總之，上述這些方法不是費(fèi)時(shí)費(fèi)力，靈敏度低，準(zhǔn)確度低，就是成本高，不適合大規(guī)模篩查。乙型肝炎病毒(HBV)及其基因全球有超過350萬人患有慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染，每年由于感染HBV死亡的人數(shù)有50萬到120萬，而約有75%的乙肝患者在亞洲。我國(guó)是HBV感染高發(fā)區(qū)，因此對(duì)乙肝的治療刻不容緩。乙肝病毒是一種易高度變異的病毒，在其逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制過程中因RNA聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶缺乏校正功能，可發(fā)生一個(gè)或多個(gè)核苷酸的變異。HBV-DNA可以在慢性持續(xù)性感染過程中自然變異，也可以在免疫壓力下發(fā)生變異，甚至在各種抗病毒治療藥物誘導(dǎo)下變異。近年來，核苷類藥物已成為乙型肝炎治療的主要方法之一，目前最常用的核苷類藥物是拉米夫定(LAM)、阿德福韋(ADV)、恩替卡韋(ENT)和替比夫定(LdT)。由于HBV病毒復(fù)制能力極強(qiáng)，因此也極易產(chǎn)生耐藥，而一旦耐藥可能會(huì)有爆發(fā)性肝炎的危險(xiǎn)。因此對(duì)這四種核苷類藥物耐藥突變的檢測(cè)應(yīng)該有更加重要的臨床意義。HBV基因的核苷酸突變位點(diǎn)的質(zhì)譜檢測(cè)目前本領(lǐng)域中已有使用質(zhì)譜分析進(jìn)行核苷酸突變位點(diǎn)檢測(cè)的方法，但是在現(xiàn)有的方法中通常只是針對(duì)單個(gè)突變基因型進(jìn)行檢測(cè)，即每次質(zhì)譜僅能檢測(cè)單個(gè)位點(diǎn)的單個(gè)突變型。由于質(zhì)譜分析成本較高，而HBV基因的突變位點(diǎn)及突變形式又比較多，所以進(jìn)行多位點(diǎn)和多突變型的檢測(cè)方法成本很高，操作程序也相應(yīng)地繁瑣復(fù)雜，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。因此，本領(lǐng)域中亟需新的檢測(cè)HBV基因的核苷酸突變位點(diǎn)的方法，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)HBV基因的多個(gè)核苷酸突變位點(diǎn)和突變型的快速而簡(jiǎn)便的檢測(cè)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種HBV基因的核苷酸突變位點(diǎn)的檢測(cè)方法，旨在解決現(xiàn)有HBV基因的核苷酸突變位點(diǎn)的檢測(cè)方法效率較低而成本較高的問題。在本發(fā)明的第一方面，提供了一種HBV病毒的核苷酸突變位點(diǎn)的檢測(cè)方法，包括如下步驟(1)針對(duì)待檢核苷酸序列的突變位點(diǎn)，并確定突變位點(diǎn)在待檢序列中的位置；(2)根據(jù)突變位點(diǎn)的位置和基因型設(shè)計(jì)擴(kuò)增一對(duì)引物和至少一條延伸引物，其中擴(kuò)增引物的長(zhǎng)度為30-50bp，其5'端各含lObp的tag;延伸引物的長(zhǎng)度為17-28bp，并且其3'末端堿基與突變位點(diǎn)3'端相鄰的堿基完全匹配；(3)通過PCR擴(kuò)增，獲得含有所述突變位點(diǎn)的靶序列擴(kuò)增產(chǎn)物；(4)通過SAP酶處理，除去所述擴(kuò)增產(chǎn)物中含有的dNTPs;(5)通過延伸反應(yīng)，在延伸引物的3'端連接一個(gè)堿基，且該堿基與突變位點(diǎn)上的堿基互補(bǔ)，延伸反應(yīng)所使用的原料是以擴(kuò)大分子量差異為目的進(jìn)行過質(zhì)量修飾的四種ddNTP分子；(6)采用樹脂純化延伸反應(yīng)產(chǎn)物；(7)將純化后的產(chǎn)物與芯片基質(zhì)共結(jié)晶，將該晶體放入質(zhì)譜儀的真空管，然后用瞬時(shí)納秒強(qiáng)激光激發(fā)進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，確定突變的基因型。其中所述步驟(2)所使用的擴(kuò)增引物對(duì)為具有下列序列的多核苷酸的組合SEQIDNO:1禾PSEQIDNO:2，或SEQIDNO:1禾PSEQIDNO:3;并且其中所述步驟(5)所使用的延伸引物包括具有SEQIDN0:4至SEQIDNO:12任一項(xiàng)所示序列的多核苷酸的一種或多種。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所使用的延伸引物還包括具有SEQIDNO:13至SEQIDN0:16任一項(xiàng)所示序列的多核苷酸的一種或多種。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，使用本發(fā)明的方法檢測(cè)的核苷酸突變位點(diǎn)為乙肝病毒逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)中的180、181、184、202、204、236和250位點(diǎn)中的一種或幾種。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，使用本發(fā)明的方法檢測(cè)的核苷酸突變位點(diǎn)的突變?yōu)閞tL180M、rtA181V、rtA181T、rtT184G、rtS2021、rtM204V、rtM2041、rtN236T和rtM250V中的一種或幾種。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明方法還包括在反應(yīng)中設(shè)置陽性對(duì)照和陰性對(duì)照，所述陽性對(duì)照為含有1000拷貝/mlHBVDNA的血清，所述陰性對(duì)照為不含有HBVDNA的血清。另外，本發(fā)明還提供了用于上述檢測(cè)方法的特異性引物和引物組合，以及該引物和引物組合用于檢測(cè)HBV基因的核苷酸突變位點(diǎn)的用途。使用本發(fā)明的方法以及引物的組合，可以同時(shí)檢測(cè)HBV基因的多個(gè)核苷酸突變位點(diǎn)和多種突變型，也就是在一次質(zhì)譜分析中檢測(cè)HBV基因的多個(gè)核苷酸突變位點(diǎn)和多種突變型，從而極大地提高了檢測(cè)效率，簡(jiǎn)化了操作程序，還節(jié)約了時(shí)間和成本。圖1A為本發(fā)明實(shí)施例1中，所得到的陰性對(duì)照A1的質(zhì)譜圖；圖IB為本發(fā)明實(shí)施例1中，所得到的待測(cè)樣本B1的質(zhì)譜圖；圖IC是本發(fā)明實(shí)施例1中，所得到的待測(cè)樣本Cl的質(zhì)譜圖；圖2A為本發(fā)明實(shí)施例2中，所得到的待測(cè)樣品A2的質(zhì)譜圖；圖2B為本發(fā)明實(shí)施例2中，所得到的待測(cè)樣本B2的質(zhì)譜圖；圖2C是本發(fā)明實(shí)施例2中，所得到的待測(cè)樣本C2的質(zhì)譜圖；圖2D為本發(fā)明實(shí)施例2中，所得到的待測(cè)樣本D2的質(zhì)譜圖；圖2E是本發(fā)明實(shí)施例2中，所得到的待測(cè)樣本E2的質(zhì)譜圖；圖3A為本發(fā)明實(shí)施例3中，所得到的待測(cè)樣本A3的質(zhì)譜圖；圖3B至3E分別為圖3A的局部放大圖，其中圖3B為本發(fā)明實(shí)施例3中，檢測(cè)180位點(diǎn)的質(zhì)譜圖圖3C為本發(fā)明實(shí)施例3中，檢測(cè)204位點(diǎn)的質(zhì)譜圖；圖3D為本發(fā)明實(shí)施例3中，檢測(cè)250位點(diǎn)的質(zhì)譜圖；圖3E為本發(fā)明實(shí)施例3中，檢測(cè)184位點(diǎn)的質(zhì)譜圖。圖4中各圖為本發(fā)明實(shí)施例4中，所得到的各樣本的質(zhì)譜圖；其中圖4A表示rtL180M分析結(jié)果圖；圖4B表示rtAlglT分析結(jié)果圖；圖4C表示rtA181V分析結(jié)果圖；圖4D-4E表示rtT184G分析結(jié)果圖；圖4F表示rtS2021分析結(jié)果圖；圖4G表示rtM204V分析結(jié)果圖；圖4H-4I表示rtM204I分析結(jié)果圖；圖4J表示rtN236T分析結(jié)果圖；圖4K表示rtM250V分析結(jié)果圖。圖5為本發(fā)明的實(shí)施例4中，使用延伸引物236、181#1#1、181#2#1、202同時(shí)對(duì)測(cè)試樣本進(jìn)行檢測(cè)的質(zhì)譜結(jié)果。圖6為使用延伸引物181#1#2、181#2#2、204#1、184#2同時(shí)對(duì)測(cè)試樣本進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果。具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供了一種核苷酸突變位點(diǎn)的檢測(cè)方法，包括如下步驟(1)針對(duì)待檢核苷酸序列的突變位點(diǎn)，確定突變位點(diǎn)在待檢序列中的位置；(2)根據(jù)突變位點(diǎn)的位置和基因型設(shè)計(jì)擴(kuò)增一對(duì)引物和至少一條延伸引物，其中擴(kuò)增引物的長(zhǎng)度為30-50bp，其5'端各含10bp的tag;延伸引物的長(zhǎng)度為17-28bp，并且其3'末端堿基與突變位點(diǎn)3'端相鄰的堿基完全匹配；(3)通過PCR擴(kuò)增，獲得含有所述突變位點(diǎn)的靶序列擴(kuò)增產(chǎn)物；(4)通過SAP酶處理，除去所述擴(kuò)增產(chǎn)物中含有的dNTPs;(5)通過延伸反應(yīng)，在延伸引物的3'端連接一個(gè)堿基，且該堿基與突變位點(diǎn)上的堿基互補(bǔ)，延伸反應(yīng)所使用的原料是以擴(kuò)大分子量差異為目的進(jìn)行過質(zhì)量修飾的四種ddNTP分子；(6)采用樹脂純化延伸反應(yīng)產(chǎn)物；(7)將純化后的產(chǎn)物與芯片基質(zhì)共結(jié)晶，將該晶體放入質(zhì)譜儀的真空管，然后用瞬時(shí)納秒強(qiáng)激光激發(fā)進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，確定突變的基因型。其中所述步驟(2)所使用的擴(kuò)增引物對(duì)為具有下列序列的多核苷酸的組合SEQIDNO:1禾PSEQIDNO:2，或SEQIDNO:1禾PSEQIDNO:3;其特征還在于，所述步驟(5)所使用的延伸引物包括具有SEQIDNO:4至SEQIDNO:12任一項(xiàng)所示序列的多核苷酸的一種或多種。下面具體描述本發(fā)明的多個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，應(yīng)該理解的是，這些實(shí)施方案旨在詳細(xì)說明本發(fā)明，并不在任何方面構(gòu)成對(duì)本發(fā)明范圍的限制。，頓,點(diǎn)白勺石角g在本發(fā)明方法的步驟(1)中，針對(duì)待檢核苷酸序列可能存在的突變位點(diǎn)，確定突變位點(diǎn)在待檢序列中的位置。在人類基因組中，約90%的差異是以單個(gè)核苷酸的差異體現(xiàn)出來的，主要由單個(gè)堿基的轉(zhuǎn)換(transition)或顛換(transversion)所引起，這樣的差異位點(diǎn)稱作單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)。在人群中，這種變異的發(fā)生頻率至少要大于1%，否則被認(rèn)為是點(diǎn)突變。SNP位點(diǎn)大多數(shù)為雙態(tài)，即在一個(gè)位點(diǎn)上僅有兩種表現(xiàn)形式，并且在人類基因組中廣泛存在，平均每500-1000個(gè)堿基對(duì)中就有1個(gè)，估計(jì)其總數(shù)可達(dá)300萬個(gè)甚至更多。以乙肝病毒(HBV)為例，乙肝病毒是一種易高度變異的病毒，在其逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制過程中因RNA聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶缺乏校正功能，可發(fā)生一個(gè)或多個(gè)核苷酸的變異。HBV-DNA可以在慢性持續(xù)性感染過程中自然變異，也可以在免疫壓力下發(fā)生變異，甚至在各種抗病毒治療藥物誘導(dǎo)下變異。近年來，核苷類藥物已成為乙型肝炎治療的主要方法之一，目前最常用的核苷類藥物是拉米夫定(LAM)、阿德福韋(ADV)、恩替卡韋(ENT)和替比夫定(LdT)。由于HBV病毒復(fù)制能力極強(qiáng)，因此也極易產(chǎn)生耐藥，而一旦耐藥可能會(huì)有爆發(fā)性肝炎的危險(xiǎn)。因此對(duì)這四種核苷類藥物耐藥突變的檢測(cè)應(yīng)該有更加重要的臨床意義。目前發(fā)現(xiàn)HBV基因耐藥突變位點(diǎn)主要集中于其逆轉(zhuǎn)錄酶(rt)區(qū)域，可包括以下突變r(jià)tL180M、rtA181V、rtA181T、rtT184G、rtS202I、rtM204V、rtM204I、rtN236T和rtM250V，在本發(fā)明的方法中可以對(duì)上述位點(diǎn)的一種或幾種進(jìn)行檢測(cè)。引物設(shè)計(jì)在本發(fā)明方法的步驟(2)中，根據(jù)突變位點(diǎn)的位置設(shè)計(jì)引物，其中包括一對(duì)擴(kuò)增引物，每條引物長(zhǎng)度為30-50bp，其5'端各含10bp的tag;以及延伸引物，其長(zhǎng)度為17-28bp，并且其3'末端堿基與突變位點(diǎn)3'端相鄰的堿基完全匹配。作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式，所述延伸引物的3'末端至少有9個(gè)核苷酸與所述突變位點(diǎn)3'端相鄰的核苷酸完全匹配。作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，上述步驟(2)還可以包括按照引物間，引物與擴(kuò)增產(chǎn)物/延伸產(chǎn)物間不形成二聚體，引物自身不形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，以及引物與模板間不發(fā)生錯(cuò)配的原則設(shè)計(jì)引物。用于質(zhì)譜檢測(cè)的延伸引物按照下列原則設(shè)計(jì)每條延伸引物的分子量相互間的差別要大于30Da，各延伸引物與各延伸產(chǎn)物之間的分子量差異不小于9Da，延伸引物與延伸產(chǎn)物的分子量要在4500-8500Da之間。將多個(gè)檢測(cè)位點(diǎn)的擴(kuò)增引物與擴(kuò)增引物混合，延伸引物與延伸引物混合。這樣可以同時(shí)檢測(cè)多個(gè)非連續(xù)的SNP位點(diǎn)，提高了效率，節(jié)省了成本。作為本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，還可以將連續(xù)多個(gè)突變位點(diǎn)標(biāo)記在同一條核苷酸序列上，且共用一對(duì)擴(kuò)增引物，兩端的突變位點(diǎn)采取向左右兩側(cè)設(shè)計(jì)，左側(cè)突變位點(diǎn)的延伸引物采取正向設(shè)計(jì)，右側(cè)突變位點(diǎn)的延伸引物采取反向設(shè)計(jì)；位于中間的突變位點(diǎn)的延伸引物有多條，且包含其上游的突變位點(diǎn)可能存在的所有核苷酸情況。這樣，可以同時(shí)檢測(cè)連續(xù)突變的多個(gè)位點(diǎn)，節(jié)省了成本，縮短了周期，提高了效率。具體來講，可以采用如下方法設(shè)計(jì)連續(xù)多個(gè)突變位點(diǎn)的引物若所述左側(cè)突變位點(diǎn)為Snpl，中間的突變位點(diǎn)為Snp2，右側(cè)突變位點(diǎn)為Snp3，Snpl/Snp2/Snp3所在序列為......TCAGCGATAT[C/T]C[G/A][T/G]AATTCGTACGATGATCGCTAGA......，貝USnpl[C/T]，右側(cè)SNP位點(diǎn)，正向設(shè)計(jì)，延伸引物為......TCAGCGATATSnp3[T/G]，左側(cè)SNP位點(diǎn)，反向設(shè)計(jì)，延伸引物為......TACGAATTSnp2[G/A]，中間SNP位點(diǎn)，簡(jiǎn)并引物，延伸引物為......AGCGATATCC和......AGCGATATTC。PCR擴(kuò)增在本方法的步驟(3)中，對(duì)目的片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)的條件為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，在本發(fā)明的實(shí)施例中也詳細(xì)描述了示例性的反應(yīng)條件。并且根據(jù)所使用的本發(fā)明引物的具體序列，對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)的條件進(jìn)行一定的變化或優(yōu)化也在本領(lǐng)域技術(shù)人員能力范圍之內(nèi)。在本發(fā)明的擴(kuò)增步驟中，使用的擴(kuò)增引物對(duì)選自具有SEQIDNO:1和SEQIDNO:2或SEQIDNO:1和SEQIDNO:3所示序列的多核苷酸的組合。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法還包括在反應(yīng)中設(shè)置陽性對(duì)照和陰性對(duì)照，所述陽性對(duì)照為含有1000拷貝/mlHBVDNA的血清，所述陰性對(duì)照為不含有HBVDNA的血清，將對(duì)照樣本與待測(cè)樣本按照相同的反應(yīng)過程進(jìn)行反應(yīng)和測(cè)試，可以驗(yàn)證該次檢測(cè)的有效性。SAP酶處理在本發(fā)明方法的步驟(4)中，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行SAP酶(蟲下堿性磷酸酶)處理，除去所述擴(kuò)增產(chǎn)物中含有的dNTP，可以將未反應(yīng)的dNTP去磷酸化，阻止其參與到后續(xù)反應(yīng)中，以確保延伸反應(yīng)時(shí)只延伸一個(gè)堿基。延伸反應(yīng)在本發(fā)明方法的步驟(5)中，對(duì)經(jīng)過SAP處理的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行延伸反應(yīng)，在延伸反應(yīng)中使用本發(fā)明的延伸引物，所得到的延伸產(chǎn)物與延伸引物的區(qū)別僅在于其3'端多了一個(gè)堿基(ddNTP)。延伸反應(yīng)所使用的原料是經(jīng)過質(zhì)量修飾的ddNTP，它既保證了延伸反應(yīng)只連接一個(gè)堿基，又能使整個(gè)系統(tǒng)的分辨率提高。在本發(fā)明的方法中使用經(jīng)過質(zhì)量修飾的ddNTP，進(jìn)行質(zhì)量修飾的主要目的是為了使各延伸產(chǎn)物之間的分子量差距加大，從而提高后續(xù)的質(zhì)譜分析的分辨率。對(duì)ddNTP進(jìn)行質(zhì)量修飾的方法是已知的。7作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式，四種ddNTP為購自美國(guó)Sequenom公司的市售產(chǎn)品，其分子量分別是ddATP，271.2Da，ddTTP327.1Da，ddCTP247.2Da，和ddGTP287.2Da;其中分子量差異在16Da以上。在本發(fā)明的方法中，所使用的延伸引物包括具有SEQIDNO:4至SEQIDNO:12任一項(xiàng)所示序列的多核苷酸的一種或多種。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所使用的延伸引物還包括具有SEQIDN0:13至SEQIDN0:16任一項(xiàng)所示序列的多核苷酸的一種或多種。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，在9微升的反應(yīng)體系中進(jìn)行延伸反應(yīng)，可以根據(jù)待檢測(cè)的位點(diǎn)而使用一種延伸引物或多種的延伸引物的組合，在反應(yīng)體系中可能含有的各種延伸引物的濃度如下表1所示。表1:延伸反應(yīng)中所用的延伸引物的濃度<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>應(yīng)該說明的是，在具體的延伸反應(yīng)中可以使用上表所示引物的一種或多種，如果使用其中的幾種引物，則所述引物在反應(yīng)體系中的濃度如上表1所示。但是本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，延伸引物的濃度并不是延伸反應(yīng)的關(guān)鍵因素，完全可以對(duì)上表所示的引物濃度做出各種改變或變化，也同樣能夠?qū)崿F(xiàn)延伸反應(yīng)。J1H謹(jǐn)斤在本發(fā)明方法的步驟(7)中，對(duì)經(jīng)過純化的延伸產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)譜分析，從而確定各延伸產(chǎn)物的分子量。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，質(zhì)譜儀選擇基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)。該飛行時(shí)間質(zhì)譜基因分型系統(tǒng)的反應(yīng)體系為非雜交依賴性，不存在潛在的雜交錯(cuò)配干擾，也不需要引入各種標(biāo)記物，因而準(zhǔn)確性高。在所述方法中，將純化產(chǎn)物與芯片基質(zhì)共結(jié)晶，將該晶體放入質(zhì)譜儀的真空管，然后用瞬時(shí)納秒強(qiáng)激光激發(fā)，由于基質(zhì)分子經(jīng)輻射吸收能量，導(dǎo)致能量蓄積并迅速產(chǎn)熱，從而使基質(zhì)晶體升華，核酸分子就會(huì)解吸附并轉(zhuǎn)變?yōu)閬喎€(wěn)態(tài)離子，產(chǎn)生的離子多為單電荷離子，這些單電荷離子在加速電場(chǎng)中獲得相同的動(dòng)能，進(jìn)而在一非電場(chǎng)漂移區(qū)內(nèi)按照其質(zhì)荷比率加以分離，在真空小管中飛行到達(dá)檢測(cè)器。這樣，采用質(zhì)譜儀檢測(cè)待檢測(cè)突變位點(diǎn)不僅方便，而且靈敏度高、準(zhǔn)確性高。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明采用基質(zhì)輔助激光解吸附/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，在質(zhì)譜技術(shù)中使用的試劑耗材相對(duì)簡(jiǎn)單且穩(wěn)定，不需要熒光染料、特殊的酶等價(jià)格昂貴的試劑，反應(yīng)可以在微量體系中進(jìn)行，減少樣品和各種消耗品的使用。由于質(zhì)譜技術(shù)直接檢測(cè)DNA的分子量(質(zhì)荷比)，直接確定堿基的類型，不需要經(jīng)過任何形式的信號(hào)轉(zhuǎn)換，理論上只要有一個(gè)拷貝的SNP片斷被擴(kuò)增即可識(shí)別，杜絕了假陰性發(fā)生的可能。此外質(zhì)譜技術(shù)還有自動(dòng)化、高通量檢測(cè)特點(diǎn)。質(zhì)譜技術(shù)與多引物延伸技術(shù)相結(jié)合，可以在一個(gè)反應(yīng)體系中同時(shí)檢測(cè)多個(gè)突變位點(diǎn)，PCR反應(yīng)可以在微量體系中進(jìn)行，結(jié)合DNA自動(dòng)提取設(shè)備、多重PCR引物設(shè)計(jì)軟件及數(shù)據(jù)分析軟件，大大減輕了工作量，提高了檢測(cè)通量。為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及下述實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。實(shí)施例1:檢測(cè)乙肝病毒逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)180位密碼子的基因型(1)設(shè)計(jì)擴(kuò)增乙肝病毒逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)180位密碼子的引物乙型肝炎病毒(h印atitisBvirus,I-tBV)感染是嚴(yán)重的世界性衛(wèi)生問題，每年約有近百萬人死于乙肝病毒感染引起的各類疾病。目前治療乙肝的藥物主要是核酸類似物，包括拉米夫定、阿德福韋酯、恩替卡韋等，這類藥物在病毒DNA復(fù)制過程中替代正常dNTP，從而導(dǎo)致DNA合成終止。然而，長(zhǎng)期服用某種藥物會(huì)導(dǎo)致耐藥性的產(chǎn)生，不僅達(dá)不到治療的目的，反而導(dǎo)致反彈。如果對(duì)乙肝患者體內(nèi)的耐藥變異進(jìn)行研究，即可揭示人群中不同個(gè)體對(duì)相同藥物的敏感性差異的根本原因，也有助于研究者篩選更合適的藥物。其中，乙肝病毒基因組逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)180位密碼子C/TTG變成ATG，使得氨基酸由亮氨酸變?yōu)榧琢虬彼?L180M)，從而產(chǎn)生對(duì)抗病毒藥物拉米夫定的耐藥性。對(duì)于該突變位點(diǎn)的質(zhì)譜檢測(cè)，首先根據(jù)乙肝病毒基因組的序列(NCBI登錄號(hào)NC_003977)，設(shè)計(jì)一對(duì)PCR引物和一條延伸引物，擴(kuò)增引物為上游5，-acgttggatgAAGATTCCTATGGGAGTGGG-3，(SEQIDN0:1);下游5，-acgttggatgAGCCCTACGAACCACTGAAC-3';(SEQIDNO:2);9延伸引物命名為引物180，序列為5'-GCCTCAGTCCGTTTCTC-3'(SEQIDNO:4)。其中，小寫字母部分表示10bp的tag。(2)擴(kuò)增含有乙肝病毒逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)180位密碼子的片段PCR反應(yīng)片段長(zhǎng)度大小為101bp，反應(yīng)體系為5iil，其中含有4mMMg2+，1X緩沖液，100nM擴(kuò)增引物，500iiMdNTP，0.5UHottarTaq酶(除擴(kuò)增引物外，其余均購自美國(guó)Sequenom公司)；反應(yīng)條件95。C15min;45個(gè)循環(huán)(94°C20s，56°C30s，72°Clmin);72。C3min。PCR反應(yīng)后，乙肝病毒基因組DNA中帶有突變位點(diǎn)的核苷酸序列的拷貝數(shù)得到了放大。反應(yīng)完成后的純化產(chǎn)物可在4t:保存數(shù)天，也可在_201:保存數(shù)周，也可直接用于后續(xù)的SAP處理。(3)SAP處理PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)過SAP處理，去除多余的dNTPs。具體的SAP反應(yīng)體系1XSAP緩沖液和0.5USAP酶(購自Fermentas公司)；反應(yīng)總體積為7ii1(2ii1SAP+5ii1PCR產(chǎn)物)。反應(yīng)條件為37°C40min，85°C5min。SAP為蝦堿磷酸酶，可以將未反應(yīng)的dNTP去磷酸化，阻止其參與到后續(xù)反應(yīng)中，以確保延伸反應(yīng)時(shí)只延伸一個(gè)堿基。反應(yīng)完成后的純化產(chǎn)物可在4t:保存數(shù)天，也可在-201:保存數(shù)周，也可直接用于后續(xù)的延伸反應(yīng)。(4)延伸反應(yīng)延伸反應(yīng)后得到一個(gè)片段大小為18bp的產(chǎn)物，它與延伸引物(17bp)的區(qū)別僅在于3'端多了一個(gè)堿基。延伸反應(yīng)所使用的原料是經(jīng)過質(zhì)量修飾的ddNTP，它既保證了延伸反應(yīng)只連接一個(gè)堿基，又能使整個(gè)系統(tǒng)的分辨率提高。延伸反應(yīng)體系為9iU，緩沖液、ddNTPs(質(zhì)量經(jīng)過修飾)、iPLEX酶(均購自美國(guó)Sequenom公司)、延伸引物等各種試劑的反應(yīng)濃度因反應(yīng)次數(shù)的不同而不同(其中所使用的延伸引物180的濃度如表1所示)，反應(yīng)總體積為9iil(2iil延伸反應(yīng)混合物+7ii1SAP處理產(chǎn)物)。反應(yīng)條件94°C30s;40個(gè)循環(huán)[94°C5s，5個(gè)小循環(huán)(52°C5s，8(TC5s)]，72°C3min。反應(yīng)完成后的延伸產(chǎn)物可在4°C保存數(shù)天，也可在_201:保存數(shù)周，也可直接用于后續(xù)的樹脂純化。[OO98](5)樹脂純化在延伸反應(yīng)的產(chǎn)物中加入6mg樹脂(購自美國(guó)Sequenom公司，型號(hào)08040)，上下顛倒30min。經(jīng)過本步反應(yīng)，樹脂將充分與反應(yīng)體系中的陽離子結(jié)合，從而使反應(yīng)體系脫鹽。反應(yīng)完成后的純化產(chǎn)物可在4t:保存數(shù)天，也可在_201:保存數(shù)周，也可4000rpm離心5min后取上清直接用于質(zhì)譜檢測(cè)。(6)質(zhì)譜檢測(cè)純化后的產(chǎn)物與芯片基質(zhì)共結(jié)晶，將該晶體放入Sequenom質(zhì)譜儀的真空管中，然后用瞬時(shí)納秒強(qiáng)激光激發(fā)，進(jìn)行MALDI-TOF-MS分析。判定標(biāo)準(zhǔn)如下如果沒有發(fā)生耐藥突變，延伸產(chǎn)物的質(zhì)譜結(jié)果為5'-GCCTCAGTCCGTTTCTCC-3'或5'-GCCTCAGTCCGTTTCTCT-3'，分子量分別為5335.5Da和5415.4Da;如果發(fā)生耐藥突變，延伸產(chǎn)物的質(zhì)譜結(jié)果為5'-GCCTCAGTCCGTTTCTCA-3'，分子量為5359.5Da。檢測(cè)結(jié)果如下其中樣本1A為陰性對(duì)照樣本，樣本1B和1C為待測(cè)樣本。對(duì)于陰性對(duì)照樣本1A，由于其沒有發(fā)生耐藥突變，因此延伸產(chǎn)物的分子量為5415.4Da(見圖1A);對(duì)于樣本1B，質(zhì)10譜檢測(cè)到的分子量為5359.5Da，可以確定樣本lB發(fā)生了耐藥突變(見圖1B);對(duì)于樣本1C，質(zhì)譜圖上出現(xiàn)了兩個(gè)峰，分別在5359.5Da和5415.4Da，可以推斷該樣本中存在野生株和突變株(見圖1C)。實(shí)施例2:檢測(cè)乙肝病毒逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)181位密碼子的基因型(1)設(shè)計(jì)擴(kuò)增乙肝病毒逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)181位密碼子的引物乙肝病毒基因組逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)181位密碼子GCT變成GTT或ACT，使得氨基酸由丙氨酸變?yōu)槔i氨酸或蘇氨酸(A181V/T)，從而產(chǎn)生對(duì)抗病毒藥物阿德福韋酯的耐藥性。對(duì)于該突變位點(diǎn)的質(zhì)譜檢領(lǐng)"根據(jù)乙肝病毒基因組的序列(NCBI登錄號(hào)NC_003977)，設(shè)計(jì)一對(duì)擴(kuò)增引物和5條延伸引物，擴(kuò)增引物為上游5，-acgttggatgAAGATTCCTATGGGAGTGGG-3，(SEQIDNO:1);下游5，-acgttggatgAGCCCTACGAACCACTGAAC-3，；(SEQIDNO:2);其中，小寫字母部分表示10bp的tag。由于181位點(diǎn)的上游180位點(diǎn)也容易發(fā)生突變，即C/TTG也會(huì)變成ATG，而下游184位點(diǎn)也會(huì)發(fā)生突變，由ACT變成GGT，所以針對(duì)181密碼子的第一個(gè)堿基設(shè)計(jì)了3條簡(jiǎn)并延伸引物，分別為181#1#1:5'-TCAGTCCGTTTCTCTTG-3'(SEQIDNO:5);181#1#2:5'-TCAGTCCGTTTCTCCTG-3，(SEQIDNO:6);禾口181#1#3:5'-TCAGTCCGTTTCTCATG-3'(SEQIDNO:7)。針對(duì)其第二個(gè)密碼子設(shè)計(jì)了2條簡(jiǎn)并延伸引物，分別為181#2#1:5，-ATGGCACTAGTAAACTGA-3'(SEQIDNO:8);禾口181#2#2:5'-TGGCACTACCAAACTGA-3(SEQIDNO:9)。(2)擴(kuò)增含有乙肝病毒逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)181位密碼子的片段PCR反應(yīng)片段長(zhǎng)度大小為98bp，反應(yīng)體系為5iil，其中含有4mMMg2+，1X緩沖液，100nM擴(kuò)增引物，500iiMdNTP，O.5UHotstarTaq酶(除擴(kuò)增引物外，其余均購自美國(guó)Sequenom公司)；反應(yīng)條件95。C15min;45個(gè)循環(huán)(94。C20s，56。C30s，72。Clmin);72°C3min。PCR反應(yīng)后，乙肝病毒基因組DNA中帶有突變位點(diǎn)的核苷酸序列的拷貝數(shù)得到了放大。反應(yīng)完成后的純化產(chǎn)物可在4t:保存數(shù)天，也可在-2(TC保存數(shù)周，也可直接用于后續(xù)的SAP處理。(3)SAP酶處理PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)過SAP處理，去除多余的dNTPs。具體的SAP反應(yīng)體系1XSAP緩沖液和0.5USAP酶(購自Fermentas公司)，反應(yīng)總體積為7ii1(2ii1SAP+5ii1PCR產(chǎn)物)。反應(yīng)條件為37°C40min，85°C5min。SAP為蝦堿磷酸酶，可以將未反應(yīng)的dNTP去磷酸化，阻止其參與到后續(xù)反應(yīng)中，以確保延伸反應(yīng)時(shí)只延伸一個(gè)堿基。反應(yīng)完成后的純化產(chǎn)物可在4t:保存數(shù)天，也可在_201:保存數(shù)周，也可直接用于后續(xù)的延伸反應(yīng)。(4)延伸反應(yīng)延伸反應(yīng)后得到一個(gè)片段大小為18bp的產(chǎn)物，它與延伸引物的區(qū)別僅在于3'端多了一個(gè)堿基。延伸反應(yīng)所使用的原料是經(jīng)過質(zhì)量修飾的ddNTP，它既保證了延伸反應(yīng)只連接一個(gè)堿基，又能使整個(gè)系統(tǒng)的分辨率提高。延伸反應(yīng)體系為9ii1，緩沖液、ddNTPs(質(zhì)量經(jīng)過修飾)、iPLEX酶(均購自美國(guó)Sequenom公司)、延伸引物等各種試劑的反應(yīng)濃度因反應(yīng)次數(shù)的不同而不同(其中所使用的各延伸引物的濃度如表l所示)，反應(yīng)總體積為9iil(2iU延伸反應(yīng)混合物+7iUSAP處理產(chǎn)物)。反應(yīng)條件94t:30s;40個(gè)循環(huán)[94°C5s，5個(gè)小循環(huán)(52°C5s，8(TC5s)]，72°C3min。反應(yīng)完成后的延伸產(chǎn)物可在4"保存數(shù)天，也可在-2(TC保存數(shù)周，也可直接用于后續(xù)的樹脂純化。(5)樹脂純化在延伸反應(yīng)的產(chǎn)物中加入6mg樹脂(購自美國(guó)Sequenom公司，型號(hào)08040)，上下顛倒30min。經(jīng)過本步反應(yīng)，樹脂將充分與反應(yīng)體系中的陽離子結(jié)合，從而使反應(yīng)體系脫鹽。反應(yīng)完成后的純化產(chǎn)物可在4t:保存數(shù)天，也可在_201:保存數(shù)周，也可4000rpm離心5min后取上清直接用于質(zhì)譜檢測(cè)。(6)質(zhì)譜檢測(cè)純化后的產(chǎn)物與芯片基質(zhì)共結(jié)晶，將該晶體放入Sequenom質(zhì)譜儀的真空管中，然后用瞬時(shí)納秒強(qiáng)激光激發(fā)，進(jìn)行MALDI-TOF-MS分析。分型結(jié)果依據(jù)分子量來判定，標(biāo)準(zhǔn)如下181#1#1，野生型為5405.5Da，突變型為5389.5Da;181#1#2，野生型為5390.5Da，突變型為5374.5Da;181#1#3，野生型為5414.6Da，突變型為5398.5Da;181#2#1，野生型為5818.8Da，突變型為5802.8Da;181#2#2，野生型為5450.6Da，突變型為5434.6Da。檢測(cè)結(jié)果如下樣本2A、2B、2C、2D和2E為臨床待測(cè)樣本。樣本2A，由181#1#1檢測(cè)到野生型和突變型，因此延伸產(chǎn)物的分子量分別為5405.5Da禾口5389.5Da(見圖2A);樣本2B，由181#1#2檢測(cè)到野生型和突變型，因此延伸產(chǎn)物的分子量分別為5390.5Da和5374.5Da(見圖2B);樣本2C，由181#1#3檢測(cè)到野生型和突變型，因此延伸產(chǎn)物的分子量分別為5414.6Da和5398.5Da(見圖2C);樣本2D，由181#2#1檢測(cè)到野生型和突變型，因此延伸產(chǎn)物的分子量分別為5818.8Da和5802.8Da(見圖2D);樣本2E，由181#2#2檢測(cè)到突變型，因此延伸產(chǎn)物的分子量為5434.6Da(見圖2E)。實(shí)施例3:同時(shí)檢測(cè)乙肝病毒逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)180、204、250和184位密碼子的基因型(1)設(shè)計(jì)擴(kuò)增乙肝病毒逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)180、204、250和184位密碼子的引物乙肝病毒基因組逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)180位密碼子TTG或CTG可突變成ATG，204位密碼子ATG可突變成ATT，250位密碼子ATG可突變成GTG，以及184位密碼子ACT可突變成GCT，從而產(chǎn)生抗病毒藥物耐藥性。對(duì)于這些突變位點(diǎn)的質(zhì)譜檢測(cè)，根據(jù)乙肝病毒基因組的序列(NCBI登錄號(hào)NC_003977)，設(shè)計(jì)1對(duì)擴(kuò)增引物和4條延伸引物，擴(kuò)增引物為上游5，-acgttggatgAAGATTCCTATGGGAGTGGG-3，(SEQIDNO:1);下游5'-acgttggatgACCCCAACTTCCAATTACAT-3，(SEQIDNO:3);其中，小寫字母部分表示lObp的tag。4條延伸引物分別對(duì)應(yīng)4個(gè)檢測(cè)位點(diǎn)，引物序列如下180位點(diǎn)5，-GCCTCAGTCCGTTTCTC-3，(SEQIDNO:4);204位點(diǎn)5，-CCCCCAATACCACATCATC-3，(SEQIDNO:10);250位點(diǎn)5，-GGGCTACTCCCTTAACTTC-3'(SEQIDNO:11);禾口184位點(diǎn)5，-ACTGAACAAATGGCACTAC-3'(SEQIDNO:12)。(2)擴(kuò)增含有乙肝病毒逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)181位密碼子的片段PCR反應(yīng)片段長(zhǎng)度大小為293bp，反應(yīng)體系為5iil，其中含有4mMMg2+，lX緩沖液，100nM擴(kuò)增引物，500iiMdNTP，O.5UHotstarTaq酶(除擴(kuò)增引物外，其余均購自美國(guó)Sequenom公司)；反應(yīng)條件95。C15min;45個(gè)循環(huán)(94°C20s，56。C30s，72。Clmin);72。C3min。PCR反應(yīng)后，乙肝病毒基因組DNA中帶有突變位點(diǎn)的核苷酸序列的拷貝數(shù)得到了放大。反應(yīng)完成后的純化產(chǎn)物可在4t:保存數(shù)天，也可在_201:保存數(shù)周，也可直接用于后續(xù)的SAP處理。(3)SAP酶處理PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)過SAP處理，去除多余的dNTPs。具體的SAP反應(yīng)體系1XSAP緩沖液和0.5USAP酶(購自Fermentas公司)，反應(yīng)總體積為7ii1(2ii1SAP+5ii1PCR產(chǎn)物)。反應(yīng)條件為37°C40min，85°C5min。SAP為蝦堿磷酸酶，可以將未反應(yīng)的dNTP去磷酸化，阻止其參與到后續(xù)反應(yīng)中，以確保延伸反應(yīng)時(shí)只延伸一個(gè)堿基。反應(yīng)完成后的純化產(chǎn)物可在4t:保存數(shù)天，也可在_201:保存數(shù)周，也可直接用于后續(xù)的延伸反應(yīng)。(4)延伸反應(yīng)延伸反應(yīng)后得到4個(gè)片段大小為18-29bp的產(chǎn)物，它與延伸引物的區(qū)別僅在于3'端多了一個(gè)堿基。延伸反應(yīng)所使用的原料是經(jīng)過質(zhì)量修飾的ddNTP，它既保證了延伸反應(yīng)只連接一個(gè)堿基，又能使整個(gè)系統(tǒng)的分辨率提高。延伸反應(yīng)體系為9ii1，緩沖液、ddNTPs(質(zhì)量經(jīng)過修飾)、iPLEX酶(均購自美國(guó)Sequenom公司)、延伸引物等各種試劑的反應(yīng)濃度因反應(yīng)次數(shù)的不同而不同(其中所使用的各延伸引物的濃度如表1所示)，反應(yīng)總體積為9iil(2iU延伸反應(yīng)混合物+7iUSAP處理產(chǎn)物)。反應(yīng)條件94t:30s;40個(gè)循環(huán)[94°C5s，5個(gè)小循環(huán)(52°C5s，80°C5s)]，72°C3min。反應(yīng)完成后的延伸產(chǎn)物可在4"保存數(shù)天，也可在-2(TC保存數(shù)周，也可直接用于后續(xù)的樹脂純化。[OH7](5)樹脂純化在延伸反應(yīng)的產(chǎn)物中加入6mg樹脂(購自美國(guó)Sequenom公司，型號(hào)08040)，上下顛倒30min。經(jīng)過本步反應(yīng)，樹脂將充分與反應(yīng)體系中的陽離子結(jié)合，從而使反應(yīng)體系脫鹽。反應(yīng)完成后的純化產(chǎn)物可在4t:保存數(shù)天，也可在_201:保存數(shù)周，也可4000rpm離心5min后取上清直接用于質(zhì)譜檢測(cè)。(6)質(zhì)譜檢測(cè)純化后的產(chǎn)物與芯片基質(zhì)共結(jié)晶，將該晶體放入Sequenom質(zhì)譜儀的真空管中，然后用瞬時(shí)納秒強(qiáng)激光激發(fā)，進(jìn)行MALDI-TOF-MS分析。分型結(jié)果依據(jù)分子量來判定，標(biāo)準(zhǔn)如下180位密碼子，野生型為5335.5Da，突變型為5359.5Da;204位密碼子，野生型為5868.9Da，突變型為5892.9Da;250位密碼子，野生型為5985.9Da，突變型為6001.9Da;184位密碼子，野生型為6116.9Da，突變型為6037.0Da。檢測(cè)結(jié)果如下樣本3A為臨床待測(cè)樣本。從圖中可以看出，通過這一次反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)了4個(gè)位點(diǎn)同時(shí)檢測(cè)(圖3A)。其中檢測(cè)到180位點(diǎn)為野生型，分子量為5335.5Da(圖3B);204位點(diǎn)為野生型，分子量為5868.9Da(圖3C);250位點(diǎn)為野生型，分子量為5985.9Da(圖3D);184位點(diǎn)為突變型，分子量為6037.ODa(圖3E)。實(shí)施例4:同時(shí)檢測(cè)乙肝病毒逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)的180、181、184、202、204、236和250位點(diǎn)的基因型在本實(shí)施例中，通過使用本發(fā)明的特異性引物，可以同時(shí)檢測(cè)乙肝病毒逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)中的rtL180M、rtA181V、rtA181T、rtT184G、rtS2021、rtM204V、rtM2041、rtN236T和rtM250V中的一種或幾種突變。(1)引物設(shè)計(jì)根據(jù)乙肝病毒基因組的序列(NCBI登錄號(hào)NCJ)03977)，設(shè)計(jì)了一對(duì)擴(kuò)增引物，該擴(kuò)增引物3'位置與基因組序列有12個(gè)堿基的完全匹配，且該擴(kuò)增引物帶了IO個(gè)堿基acgttggatg的標(biāo)簽序列；同時(shí)還設(shè)計(jì)了12條延伸引物，這些延伸引物的長(zhǎng)度為17-28堿基，并與突變位點(diǎn)的3'端的至少9個(gè)堿基完全匹配；所述延伸引物與延伸產(chǎn)物之間，各個(gè)型別的延伸產(chǎn)物間的分子量差異不小于9Da。擴(kuò)增引物經(jīng)過PAGE純化，延伸引物經(jīng)過HPLC純化。所使用的擴(kuò)增引物為上游5，-acgttggatgAAGATTCCTATGGGAGTGGG-3，(SEQIDN0:1);下游5，-acgttggatgAGCCCTACGAACCACTGAAC-3，；(SEQIDNO:2);其中，小寫字母部分表示10bp的tag。所用的延伸弓I物的序列參見表2表2:延伸引物的名稱和序列<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>(2)PCR擴(kuò)增隨機(jī)選擇了11個(gè)臨床血清樣本(分別命名為4A至4K)，分別從血清中提取DNA進(jìn)行測(cè)試，同時(shí)還在反應(yīng)中設(shè)置陽性對(duì)照和陰性對(duì)照，陽性對(duì)照為含有1000拷貝/mlHBVDNA的血清，陰性對(duì)照為不含有HBVDNA的血清。PCR反應(yīng)片段長(zhǎng)度大小為273bp，反應(yīng)體系為5iil，其中含有4mMMg2+，lX緩沖液，100nM擴(kuò)增引物，500iiMdNTP，O.5UHotstarTaq酶(除擴(kuò)增引物外，其余均購自美國(guó)Sequenom公司)；反應(yīng)條件95。C15min;45個(gè)循環(huán)(94°C20s，56°C30s，72。Clmin);72°C3min。PCR反應(yīng)后，乙肝病毒基因組DNA中帶有突變位點(diǎn)的核苷酸序列的拷貝數(shù)得到了放大。反應(yīng)完成后的純化產(chǎn)物可在4t:保存數(shù)天，也可在_201:保存數(shù)周，也可直接用于后續(xù)的SAP處理。(3)SAP處理PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)過SAP處理，去除多余的dNTPs。具體的SAP反應(yīng)體系1XSAP緩沖液和0.5USAP酶(購自Fermentas公司)，反應(yīng)總體積為7ii1(2ii1SAP+5ii1PCR產(chǎn)物)。反應(yīng)條件為37°C°C40min，85°C5min。SAP為蝦堿磷酸酶，可以將未反應(yīng)的dNTP去磷酸化，阻止其參與到后續(xù)反應(yīng)中，以確保延伸反應(yīng)時(shí)只延伸一個(gè)堿基。反應(yīng)完成后的純化產(chǎn)物可在4t:保存數(shù)天，也可在-201:保存數(shù)周，也可直接用于后續(xù)的延伸反應(yīng)。(4)延伸反應(yīng)延伸反應(yīng)后得到ll個(gè)片段大小為18-29bp的產(chǎn)物，它與延伸引物的區(qū)別僅在于3'端多了一個(gè)堿基。延伸反應(yīng)所使用的原料是經(jīng)過質(zhì)量修飾的ddNTP，它既保證了延伸反應(yīng)只連接一個(gè)堿基，又能使整個(gè)系統(tǒng)的分辨率提高。延伸反應(yīng)體系為9ii1，緩沖液、ddNTPs(質(zhì)量經(jīng)過修飾)、iPLEX酶(均購自美國(guó)Sequenom公司)、延伸引物等各種試劑的反應(yīng)濃度因反應(yīng)次數(shù)的不同而不同，反應(yīng)總體積為9iil(2iil延伸反應(yīng)混合物+7ii1SAP處理產(chǎn)物)(所使用的各延伸引物的濃度見表l)。反應(yīng)條件94。C30s;40個(gè)循環(huán)[94。C5s，5個(gè)小循環(huán)(52。C5s，80。C5s)]，72。C3min。反應(yīng)完成后的延伸產(chǎn)物可在4。C保存數(shù)天，也可在_20°C保存數(shù)周，也可直接用于后續(xù)的樹脂純化。在本實(shí)施例中，還使用了如下所述的各引物組合進(jìn)行延伸反應(yīng)和隨后的質(zhì)譜測(cè)序(l)將180、204、250、184組合用于一個(gè)延伸反應(yīng)體系并將反應(yīng)產(chǎn)物同時(shí)置于質(zhì)譜儀的一個(gè)well中進(jìn)行檢測(cè)；(2)將236、181#1#1、181#2#1、202組合用于一個(gè)延伸反應(yīng)體系并將反應(yīng)產(chǎn)物同時(shí)置于質(zhì)譜儀的一個(gè)well中進(jìn)行檢測(cè)；(3)將181#1#2、181#2#2、204#1、184#2組合用于一個(gè)延伸反應(yīng)體系并將反應(yīng)產(chǎn)物同時(shí)置于質(zhì)譜儀的一個(gè)well中進(jìn)行檢測(cè)。(5)采用樹脂純化延伸反應(yīng)產(chǎn)物。在延伸反應(yīng)的產(chǎn)物中加入6mg樹脂(購自美國(guó)Sequenom公司，型號(hào)08040)，上下顛倒30min。經(jīng)過本步反應(yīng)，樹脂將充分與反應(yīng)體系中的陽離子結(jié)合，從而使反應(yīng)體系脫鹽。反應(yīng)完成后的純化產(chǎn)物可在4t:保存數(shù)天，也可在_201:保存數(shù)周，也可4000rpm離心5min后取上清直接用于質(zhì)譜檢測(cè)。(6)質(zhì)譜檢測(cè)純化后的產(chǎn)物與芯片基質(zhì)共結(jié)晶，將該晶體放入Sequenom質(zhì)譜儀的真空管中，然后用瞬時(shí)納秒強(qiáng)激光激發(fā)，進(jìn)行MALDI-TOF-MS分析。從而確定待檢測(cè)HBV基因耐藥突變位點(diǎn)的基因型。15質(zhì)譜檢測(cè)的結(jié)果見圖4A-4K和圖5樣本4A，4B，4C，4D，4E，4F，4G，4H，4I，4J，4K為臨床待測(cè)樣本，樣本4A，由180檢測(cè)到野生型和突變型，因此延伸產(chǎn)物的分子量分別為5415.4Da和5359.5Da(見圖4A);樣本4B，由181#1#1檢測(cè)到野生型和突變型，因此延伸產(chǎn)物的分子量分別為5405.5Da和5389.5Da(見圖4B);樣本4C，由181#2#1檢測(cè)到野生型和突變型，因此延伸產(chǎn)物的分子量分別為5818.8Da和5802.8Da(見圖4C);樣本4D，由184#1檢測(cè)到突變型，因此延伸產(chǎn)物的分子量為6116.9Da(見圖4D);樣本4E，由184#2檢測(cè)到突變型，因此延伸產(chǎn)物的分子量為5747.8Da(見圖4E);樣本4F，由202檢測(cè)到野生型和突變型，因此延伸產(chǎn)物的分子量分別為5767.7Da禾口5807.6Da(見圖4F);樣本4G，由204#1檢測(cè)到野生型和突變型，因此延伸產(chǎn)物的分子量分別為5972.8Da和5892.9(見圖4G);樣本4H，由204檢測(cè)到野生型和突變型，因此延伸產(chǎn)物的分子量分別為5868.9Da禾口5908.9Da(見圖4H);樣本41，由204檢測(cè)到野生型和突變型，因此延伸產(chǎn)物的分子量分別為5868.9Da和5892.9(見圖41);樣本4J，由236檢測(cè)到突變型，因此延伸產(chǎn)物的分子量分別為6512.2Da(見圖4J);樣本4K，由250檢測(cè)到野生型和突變型，因此延伸產(chǎn)物的分子量分別為5985.9Da和6001.9Da(見圖4K).圖5為使用延伸引物236、181#1#1、181#2#1、202同時(shí)對(duì)測(cè)試樣本進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果。對(duì)樣本的檢測(cè)結(jié)果顯示，所述樣本的181#1#1位點(diǎn)的延伸產(chǎn)物分子量為5405.5Da，因此該位點(diǎn)為野生型，；181#2#1位點(diǎn)的延伸產(chǎn)物分子量為5818.8Da，因此該位點(diǎn)為野生型；202位點(diǎn)的延伸產(chǎn)物分子量為5767.7Da，因此該位點(diǎn)為野生型；236位點(diǎn)的延伸產(chǎn)物分子量為6536.2Da，因此該位點(diǎn)為野生型。圖6為使用延伸引物181#1#2、181#2#2、204#1、184#2同時(shí)對(duì)測(cè)試樣本進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果。對(duì)樣本的檢測(cè)結(jié)果顯示，所述樣本的181#1#2位點(diǎn)的延伸產(chǎn)物分子量為5390.5Da，因此該位點(diǎn)為野生型，；181#2#2位點(diǎn)的延伸產(chǎn)物分子量為5450.6Da，因此該位點(diǎn)為野生型；204#1位點(diǎn)的延伸產(chǎn)物分子量為5972.8Da，因此該位點(diǎn)為野生型；184#2位點(diǎn)的延伸產(chǎn)物分子量為5787.8Da，因此該位點(diǎn)為野生型。從上述結(jié)果可以看出，使用本發(fā)明的方法和引物檢測(cè)HBV病毒的耐藥性突變位點(diǎn)，可以在一次質(zhì)譜檢測(cè)中同時(shí)檢測(cè)多個(gè)突變位點(diǎn)的多種突變型，這與現(xiàn)有技術(shù)相比，極大地提高了檢測(cè)效率，并降低了檢測(cè)成本。以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選和具體的實(shí)施方案，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。序列表〈110〉深圳華大基因科技有限公司〈120〉一種HBV基因的核苷酸突變位點(diǎn)的檢測(cè)方法〈130>CP1091109/CB〈160>16〈170>PatentInversion3.3〈210>1〈211>30〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>1acgttggatgaagattcctetgggagtggg30〈210>2〈211>30〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>2acgttggatgagccctacgaaccactgaac30<210>3〈211〉30〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>3acgttggatgaccccaacttccaattacat30〈210>4〈211>17〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>4gcctcagtccgtttctc17〈210>5〈211>17〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>5tcagtccgtttctcttg17〈210>6〈211>17〈212>DNA<213>人工序列<400>6tcagtccgtttctcctg17〈210>7〈211>17〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>7tcagtccgtttctcatg1717〈210>8〈211〉18〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>8atggcactagtaaactga18〈210>9〈211〉17〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>9tggcactaccaaactga17〈210>10〈211>19〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>10cccccaataccacatcatc19〈210>11〈211>19〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉11gggctactcccttaacttc19〈210>12〈211>19<212〉DNA〈213〉人工序列〈400>12actgaacaaatggcactac19〈210>13〈211>20〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>13gtctttgggtatacatttaa〈210>14〈211>18〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>14cccactgtttggctttca〈210>15〈211>19〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>15cccaataccacatcatcca〈210>16〈211>18〈212>醒<213>人工序列〈400>163ctg朋c朋3tggcacte權(quán)利要求一種HBV基因的核苷酸突變位點(diǎn)的檢測(cè)方法，包括如下步驟(1)針對(duì)待檢核苷酸序列的突變位點(diǎn)，確定突變位點(diǎn)在待檢序列中的位置；(2)根據(jù)突變位點(diǎn)的位置和基因型設(shè)計(jì)一對(duì)擴(kuò)增引物和至少一條延伸引物，其中，擴(kuò)增引物的長(zhǎng)度為30-50bp，其5’端各含10bp的tag；延伸引物的長(zhǎng)度為17-28bp，并且其3’末端堿基與突變位點(diǎn)3’端相鄰的堿基完全匹配；(3)使用所述擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得含有所述突變位點(diǎn)的靶序列擴(kuò)增產(chǎn)物；(4)通過SAP酶處理，除去所述擴(kuò)增產(chǎn)物中含有的dNTPs；(5)使用所述延伸引物進(jìn)行延伸反應(yīng)，在延伸引物的3’端連接一個(gè)堿基，且該堿基與突變位點(diǎn)上的堿基互補(bǔ)，延伸反應(yīng)所使用的原料是以擴(kuò)大分子量差異為目的進(jìn)行過質(zhì)量修飾的四種ddNTP分子；(6)采用樹脂純化延伸反應(yīng)產(chǎn)物；(7)將純化后的產(chǎn)物與芯片基質(zhì)共結(jié)晶，將該晶體放入質(zhì)譜儀的真空管，然后用瞬時(shí)納秒強(qiáng)激光激發(fā)進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，確定突變的基因型；其中所述步驟(2)所使用的擴(kuò)增引物對(duì)為具有下列序列的多核苷酸的組合SEQIDNO1和SEQIDNO2，或SEQIDNO1和SEQIDNO3；并且其中所述步驟(5)所使用的延伸引物包括具有SEQIDNO4至SEQIDNO12任一項(xiàng)所示序列的多核苷酸的一種或多種。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述步驟(5)中所使用的延伸引物還包括了具有SEQIDNO:13至SEQIDNO:16任一項(xiàng)所示序列的多核苷酸的一種或多種。3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述核苷酸突變位點(diǎn)為乙肝病毒逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)中的180、181、184、202、204、236和250位點(diǎn)中的一種或幾種。4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述核苷酸突變位點(diǎn)的突變?yōu)閞tL180M、rtA181V、rtA181T、rtT184G、rtS2021、rtM204V、rtM2041、rtN236T和rtM250V中的一種或幾種。5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述方法還包括在反應(yīng)中設(shè)置陽性對(duì)照和陰性對(duì)照，所述陽性對(duì)照為含有IOOO拷貝/mlHBVDNA的血清，所述陰性對(duì)照為不含有HBVDNA的血清。6.—種多核苷酸，具有SEQIDN0:1至SEQIDNO:16任一項(xiàng)所示的核苷酸序列。7.具有SEQIDNO:l至SEQIDNO:16任一項(xiàng)所示序列的多核苷酸用于檢測(cè)HBV基因的核苷酸突變位點(diǎn)的用途。8.—種用于HBV基因的核苷酸突變位點(diǎn)的檢測(cè)方法中的引物組合，包括選自具有SEQIDNO:1和SEQIDNO:2或SEQIDNO:1和SEQIDNO:3所示序列的一對(duì)多核苷酸作為擴(kuò)增引物，以及選自具有SEQIDNO:6至SEQIDNO:16任一項(xiàng)所示序列的一種或多種多核苷酸作為延伸引物。全文摘要本發(fā)明提供了一種檢測(cè)基因突變位點(diǎn)的方法，包括如下步驟(1)確定HBV基因逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)的耐藥突變位點(diǎn)；(2)根據(jù)這些突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)出擴(kuò)增引物和每個(gè)突變位點(diǎn)的延伸引物；(3)PCR擴(kuò)增；(4)SAP酶處理；(5)延伸反應(yīng)；(6)采用樹脂純化延伸反應(yīng)產(chǎn)物；(7)質(zhì)譜檢測(cè)，確定待檢測(cè)HBV基因耐藥位點(diǎn)。采用本發(fā)明提供的方法，解決了現(xiàn)有檢測(cè)方法靈敏度低、準(zhǔn)確率有限，以及通量低，成本高的問題。本發(fā)明還提供了檢測(cè)HBV基因的耐藥性突變位點(diǎn)的方法。此外，本發(fā)明還提供了用于上述方法的特異性引物及其用于上述檢測(cè)方法的用途。文檔編號(hào)C12R1/93GK101760566SQ200910178449公開日2010年6月30日申請(qǐng)日期2009年9月29日優(yōu)先權(quán)日2009年9月29日發(fā)明者劉興旺,華桑,葉葭,呂芳,吳平,喻爽,張俊青,張秀芝,易吉,易鑫,朱德琴,朱江陽,李國(guó)宏,李晶晶,楊玲,王威,田超,聶喜芳,韋清,高揚(yáng)申請(qǐng)人:深圳華大基因科技有限公司