專利名稱：用于改進的核酸擴增的聚陰離子的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及模板依賴性聚合酶催化的引物延伸反應(如聚合酶鏈反應
(PCR))領域，。更確切地說，本發(fā)明提供進行熱啟動PCR的新方法， 其特征在于，通過在擴增反應之前加入規(guī)定的聚陰離子來避免非特異性引物 二聚體擴增。
背景技術：
核酸擴增(尤其是PCR)的一個主要問題在于非特異性擴增產物的生 成。在很多情況下，這歸因于實際的熱循環(huán)程序本身之前的非特異性寡核苷 酸引導(priming)和隨后的引物延伸事件(event),因為熱穩(wěn)定DNA聚 合酶在環(huán)境溫度下也有適度的活性。例如，經常觀察到由于最后偶然發(fā)生的 引物二聚和隨后的延伸而產生的擴增產物。為了克服這個問題，本領域眾所
周知進行所謂的"熱啟動"PCR,其中將對于擴增反應必需的一種成分或者 從反應混合物中分離，或者保持失活狀態(tài)直至反應混合物的溫度第一次升 高。因為聚合酶不能在這些條件下起作用，所以在引物能非特異性結合的期 間不發(fā)生引物延伸。為了達到這個效果，應用以下幾種方法
a) DNA聚合酶的物理分離
物理分離例如可通過固體蠟形成的屏障來實現(xiàn)，固體蠟形成的屏障把含 有DNA聚合酶的部分和含有大多數其它試劑的部分分隔。首次加熱步驟中， 蠟自動熔融，各流體部分混合(Chou，Q.等人，Nucleic Acids Res 20 (1992) 1717-23， US 5,411,876 )?；蛘?，在擴增反應前使DNA聚合酶親合固定在固 體栽體上，并僅通過熱介導釋放將其釋放到反應混合物中(Nilsson, J.等人， Biotechniques 22 (1997) 744-51 )。然而，兩種方法都是費時的，且不便操 作。
b) DNA聚合酶的化學修飾
對于這種熱啟動PCR,通過化學〗務飾〗吏DNA聚合酶可逆地失活。更確
4切地，將熱不穩(wěn)定保護基團引入到TaqDNA聚合酶中，這使酶在室溫下失 活(US 5,773,258 )。在PCR預處理步驟中于高溫下除去這些保護基團，以 使酶變成有活性的。例如可通過使檸康酐或烏頭酐(Aconitric Anhydride ) 與酶的賴氨酸殘基偶合來獲得這種熱不穩(wěn)定修飾(US 5,677,152 )。帶有此 類修飾的酶同時是市售的，如Amplitaq Gold ( Motetti， T.等人， Biotechniques 25 (1998)716-22 )或FastStart DNA聚合酶(Roche Molecular Biochemicals )。然而，保護基團的引入是一種化學反應，它可任意發(fā)生在 酶的所有空間可用(sterically available)的賴氨酸殘基。所以，化學修飾酶 制備的可再現(xiàn)性和質量可變化，幾乎不能控制。
c) DNA聚合酶的重組修飾
已通過基因工程制備Taq聚合酶的冷敏感突變體。這些突變體與野生 型酶的差別在于它們缺少N端(US 6,241,557 )。與天然或野生型重組Taq 聚合酶相反，這些突變體在低于35X:時完全沒有活性，所以在一些情況下 可用于進行熱啟動PCR。然而，N端截短的冷敏感突變體形式需要低鹽緩 沖劑條件，與野生型酶相比具有較低的持續(xù)合成能力，所以只能用于短的目 標核酸的擴增。另外，由于截短形式缺乏5，-3，核酸外切酶活性，它不能用 于基于TaqMan檢測i殳計(TaqMan detection format )的實時PCR( real time PCR)實驗。
d) 通過核酸添加劑抑制DNA聚合酶 已證實通過添加短雙鏈DNA片段來抑制非特異性退火引物(annealed
primers)的延伸(Kainz， P.等人,Biotechniques 28 (2000) 278-82)。在這 種情況下，引物延伸在低于短雙鏈DNA片段的熔點溫度下受抑制，但是與 竟爭劑(competitor) DNA本身的序列無關。然而，尚不知，竟爭劑DNA 過剩至何種程度會影響核酸擴增反應的產率。
或者，可以使用具有形成確定二級結構的特定序列的寡核苷酸適配體。 此類適配體因其與DNA聚合酶具有很高的親合性，已利用SELEX技術選 擇(US 5,693,502， Lin， Y.和Jayasena, S" D" J. Mol. Biol. 271(1997) 100-11)。在實際的熱循環(huán)過程本身之前，此類適配體于擴增混合物中的存 在又導致了結合DNA聚合酶的高親合性，隨后形成對該酶活性的熱不穩(wěn)定抑制(US 6,020,130)。然而，由于該選擇過程，目前所有可用的適配體只 能用于與一種特定DNA聚合酶種類結合。
e) TaqDNA抗體
實現(xiàn)對Taq DNA聚合酶的熱不穩(wěn)定抑制的一種另選途徑是添加用于 (raised ).抗純化酶的單克隆抗體(Kellogg， D" E.等人，Biotechniques 16 (1994) 1134-7; Sharkey, D" J.等人,Biotechnology (N Y) 12 (1994) 506-9 )。 像寡核普酸適配體一樣，抗體在環(huán)境溫度下以抑制方式通過高親合性結合 Taq DNA聚合酶(US 5,338,671 )。復合物在熱循環(huán)過程本身之前，在預熱 步驟中分解?？偟膩碚f，這導致擴增中明顯費時的延伸，應用快速熱循環(huán)的 規(guī)程(protocols)尤其如此(WO 97/46706)。
f) US 5,985,619公開了使用熱啟動抗體進行PCR的具體實施方式
，其
中除Taq聚合酶外，向擴增混合物中加入諸如來自大腸桿菌的核 酸外切酶HI作為補充物，以便消化非特異性引物二聚體中間體。 如上述/^開的，核酸外切酶III識別雙鏈DNA作為底物，例如， 靶標/引物雜交或靶標/引物延伸產物雜交。通過切割3，端脫氧核苷 酸殘基的5，末端處的磷酸二酯鍵來進行消化。因為這種核酸外切 酶在環(huán)境溫度下是活化的，所以所有非特異性退火引物和引物延 伸產物都被消化。在一些實施方式中，這甚至造成擴增反應的特 異性增強。然而依賴預孵育時間的對非特異引物的消化可導致引 物濃度大量、不受控制的降低，這反過來可影響擴增反應本身。 單獨使用或與外切核酸酶結合使用修飾的引物 EP 0 799 888和GB 2 293 238公開了向PCR反應物中加入3，保護 (blocked)的寡核苷酸。由于3，端的保護，這些寡核苷酸不能充當引物。
對受保護的寡核苷酸進行設計，以與PCR引物竟爭或與PCR引物相互作用，
這造成非特異產物的減少。
另一種另選方法(alternative)是在PCR反應混合物中組合4吏用硫代
磷酸寡核苷酸(phosphorothioate oligonucleotide )引物和核酸外切酶III( EP
0 744 470)。這種情況下，通常接受雙鏈DNA以及單鏈DNA底物的3，核
二聚體的雙鏈體人工產物，以及繼續(xù)降解(carryover)擴增子，但不降解單鏈擴增引物。相似地，已提出使用帶有堿基修飾 的3，端的引物和通過大腸桿菌核酸外切酶IV進行模板依賴性去修飾 (removal) ( US 5,792,607 )。
EP 1 275 735提出了總體思想的具體實施方式
。它的說明書公開了用于 進行核酸擴增反應的組合物，其包含(i)熱穩(wěn)定DNA聚合酶，(ii)熱 穩(wěn)定3，-5，核酸外切酶，和(iii)至少一種用于核酸擴增的引物，其具有不被 所述熱穩(wěn)定DNA聚合酶延伸的修飾的3，端殘基；還公開了使用這種組合物 進行PCR反應的方法。
然而，所公開的另選方法的主要缺點在于，對每一次PCR反應均需要 修飾的引物，這導致對于每一單獨分析的成本需求增加。
g) 其它PCR添加劑
本領域已知其它有機添加劑(如DMSO、甜菜堿和甲酰胺)(WO 99/46400; Hengen， P.， N.， Trends Biochem Sci 22(1997) 225-6; Chakrabarti, R.和Schutt， C" E" Nucleic Acids Res 29 (2001) 2377-81 )導致富含GC片段 擴增的提高，而不是防止引物二聚體的形成。類似地，肝素(h印arin)推 測通過除去蛋白質(如組蛋白)來使染色體DNA可用來促進體外發(fā)生的連 綴轉錄(Hildebrand， C"等人,Biochimica et Biopysica Acta 477(1977) 295-311 )。
還已知，單鏈結合蛋白(US 5,449,603 )或tRNA ( Sturzenbaum， S.， R.， Biotechniques 27 (1999) 50-2 )的添加導致這些添加劑與引物的非共價結合。 在PCR期間，這種結合在加熱時被破壞。也已發(fā)現(xiàn)，DNA解旋酶的添加防 止引物的隨機退火(Kaboev, O" K.等人，Bioorg Khim 25 (1999) 398-400 )。 此外，為了抑制聚合酶在低溫下的活性，在數種情況下可使用多聚谷氨酸鹽 (polyglutamate ) (WO 00/68411 )。
h) 此外已知，聚陰離子型聚合酶抑制劑可以根據所應用的孵育溫度控
制熱穩(wěn)定DNA聚合酶的活性。US 6,667， 165公開了熱啟動實施方 式，其特征在于，在低于40X:的溫度下形成失活的聚合酶-抑制劑 復合物。在40t:和55X:之間，抑制劑與模板DNA竟爭結合到Taq 聚合酶，然而在超過551C的溫度下，抑制劑從聚合酶的活性位點
7被置換。然而，當使用較低退火溫度的引物時，抑制劑傾向于減 少可得產物的產率。鎂螯合
由于長期以來，已知熱穩(wěn)定聚合酶只有在Mg"陽離子的存在才具有活 性，因此為了避免錯誤引導或非特異(unspecifying)引物延伸，嘗試在熱 循環(huán)規(guī)程開始前進行鎂螯合。如US 6,403,341中所公開的，在擴增反應開始 時Mg"可以沉淀物的形式存在，從而不可用。在第一輪熱循環(huán)期間， 一旦 溫度升高，沉淀物溶解，MgW在頭3個循環(huán)中變得完全可用。這種溶液已證 實相當實用，并能提供良好的熱啟動結果。另一方面，這種溶液不允許制備 含有除了引物和目標核酸以外的所有試劑的反應混合物(mastermixes ), 引物和目標核酸對進行核酸擴增反應是必需的。結果，分析間(inter 一 assay ) 數據再現(xiàn)性和數據比較是復雜的。此外，還公開了為了產生所需的熱啟動效 果，向擴增溶液中加入Mg2+結合肽(PCT/EP2007/001585 )。

發(fā)明內容
考慮到現(xiàn)有技術概況，本發(fā)明的一個目的在于提供用于熱啟動PCR的 改進的另選組合物和方法，其允許不僅在擴增過程本身之前，而且在熱循環(huán) 過程中抑制非特異性引導和引物延伸。更確切地說，本發(fā)明的一個目的在于 提供用于熱啟動PCR的另選組合物和方法，其中不發(fā)生非特異性退火引物 的延伸。
在第一方面中，本發(fā)明提供化合物，其包含以下結構 [X x - (CH2) m 4酸基(phosphate ) - Yy ] n 其特征在于， 3《m < 6，
每個x和y彼此獨立地為0或1，
每個X和Y彼此獨立地為選自如下的實體(entity):核苷殘基、(脫 氧-)核苷殘基、衍生的核苷或(脫氧-)核苷殘基和核苷或(脫氧-)核苷類 似物，
條件是針對每個[X x - (CH2)m -磷酸基-Yy j單元獨立地選擇每個
8m、 x和y，進一步的條件是末端X也可為-OH基或磷酸基，進一步的條件 是末端Y也可為-H或(CH2)m-OH基。
在第二個方面中，本發(fā)明涉及組合物，其包含
-如上所公開的化合物
-DNA聚合酶，以及
國脫氧寡核苷酸。
在第三個方面中，本發(fā)明涉及組合物，其包含:
-如上所公開的化合物
誦DNA聚合酶，以及
-三辨酸脫氧寡核普(desoxy - oligonucleoside triphosphates )。 在具體實施方式
中，所述組合物進一步包含隨機5-8聚體寡核苷酸 (randomized 5 - 8mer oligonucleotide )，其特征在于，所述寡核苷酸包含
具有有機疏7Jc部分的修飾(a modification with an organic hydrophobic
moiety )。
在笫四個方面中，本發(fā)明提供試劑盒，其包含 -如上所公開的化合物 -DNA聚合酶，以及 -脫氧寡核苷酸。
在第五個方面中，本發(fā)明提供試劑盒，其包含 -如上所公開的化合物 -DNA聚合酶，以及 -三磷酸脫氧寡核苷。
在具體實施方式
中，所述試劑盒進一步包含隨機5-8聚體寡核苷酸，其 特征在于，所述寡核苷酸包含具有有機疏水部分的修飾。 在第六方面中，本發(fā)明提供包括如下步驟的方法 -提供含有核酸的樣品 -提供如上所公開的組合物， -至少提供第一寡核苷酸引物， -進行聚合酶催化的引物延伸反應。在一種實施方式中，所述核酸為DNA。在另一種實施方式中，所述核 酸是RNA，其中所述DNA聚合酶含有逆轉錄酶活性。
在具體實施方式
中，所述聚合酶是熱穩(wěn)定聚合酶，對所述反應進行實時 監(jiān)測。隨后可進行解鏈曲線分析。


圖1示出了各種量的目標DNA在各種量的化合物X40的存在下的PCR 擴增(實施例2)
第1至6泳道不存在添加劑下的對照反應，分別含有50ng、 25 ng、 10 ng、 5 ng、 1 ng、 0 ng模板DNA。
第7至12泳道_X40_ (0.3 mM)存在下的PCR反應，分別含有50 ng、 25 ng、 10 ng、 5 ng、 1 ng、 0 ng模板DNA。
第13至18泳道—X40— (0.15 mM)存在下的PCR反應，分別含有50 ng、 25 ng、 10 ng、 5 ng、 1 ng、 0 ng模板DNA。
第19至24泳道—X40_ (0.075 mM)存在下的PCR反應，分別含有50 ng、 25 ng、 10 ng、 5 ng、 1 ng、 0 ng模板DNA。
第25至30泳道_X40_ (0.0375 mM)存在下的PCR反應，分別含有 50ng、 25ng、 10 ng、 5 ng、 1 ng、 0 ng模板DNA。
第31至36泳道_X40_ (0.018 mM)存在下的PCR反應，分別含有50 ng、 25 ng、 10 ng、 5 ng、 1 ng、 0 ng模板DNA。
圖2示出了 RT-PCR之后的解鏈曲線分析(實施例5)
_a:存在一X40一下進行第一鏈cDNA合成，不存在_乂40_下進行后續(xù)的 PCR，
_b:存在一乂40_下進行第一鏈cDNA合成，存在一X4(^下進行后續(xù)的 PCR，
—c:不存在一乂40_下進行第一鏈cDNA合成，不存在一X40—下進行后續(xù) 的PCR，
畫d:不存在—X40—下進行第一鏈cDNA合成，存在—X40JT進行后續(xù)的 PCR，
具體實施例方式
本發(fā)明提供用于進行特異性提高的引物延伸反應的新的改進溶液。具體 來說，本發(fā)明提供用于進行特異性提高的核酸擴增反應的新的改進溶液。所 謂的熱啟動效應有效抑制不需要的引物延伸。不需要的引物延伸由偶然雜交 事件引起，其中引物至少部分雜交至核酸樣品中的任何序列，其與核酸靶標 的實際引物結合位點不同。
根據本發(fā)明的化合物
本發(fā)明提供包含如下結構的化合物 [X x- (CH2) m ~#酸基- Yy I n 其特征在于， 3<m《6，
每個x和y彼此獨立地為0或1，
每個X和Y彼此獨立地為可光度測量的實體，
條件是針對每個[X x - (CH2) m 4酸基-Yy ]單元獨立地選擇每個m、 x和y，進一步的條件是末端X也可為-OH基或磷酸基，進一步的條件是末 端Y也可為-H或Cm-OH基。
已將本發(fā)明的化合物設計，以在低溫下充當MgS+離子的可逆結合伴侶 (binding partner)。相比之下，所述化合物似乎對結合DNA聚合酶不具 有合理的親和性。在BIAcore儀器上所進行的旨在確定Taq聚合酶對數種 具有本發(fā)明結構的固定化合物的結合率的各個實驗未能顯示任何可測的特 異性結合親和性。
一經溫度升高，Mg^離子再次釋放到溶液中。關于聚合酶催化的引物延 伸反應，眾所周知M^+離子濃度對反應的特異性和持續(xù)合成能力起至關重 要作用。因此，如果在聚合酶鏈反應開始時，通過與存在于樣品中的本發(fā)明 化合物進行時間依賴性非共價結合，將MgW離子可逆地從溶液中去除，則 產生所需的熱啟動效應在低溫下基于引物延伸的不需要的聚合酶活性受到 抑制，所述引物非特異性地與所述核酸樣品的錯誤目標區(qū)域結合。當Mg2+離子從本發(fā)明化合物中可逆釋放時，MgW離子的有效濃度再次增加，可發(fā)生 通過聚合酶的特異性引物延伸。
此外，由于以下事實在本發(fā)明化合物和MgS+之間以溫度依賴性方式 進行的結合是可逆的，所需的熱啟動效應不僅在聚合酶鏈反應開始時的第一 次溫度升高之前實現(xiàn)，而且在整個擴增規(guī)程期間的隨后的循環(huán)中的每次退火 階段(annealing phase )產生。
對于每個"[Xx-(CH2)m-磷酸基-Yy"單元，X和Y可不存在，或 代表可光度測量的實體。然而，為了使合成變得容易，優(yōu)選本發(fā)明化合物的 大部分或全部單元是相同的。此外，如果所有單元相同，那么當每個單元中 僅存在X或僅存在Y時，其是有利的。
根據本發(fā)明，本發(fā)明化合物優(yōu)選由30至60個所述單元組成。而為了產 生所需的熱啟動效應，需要至少30個單元，60個單元的上限使得本發(fā)明化 合物通過如下所公開的方法容易地合成。
本發(fā)明化合物具有可光度測量的實體，以便通過UV或可見光譜促進濃 度調節(jié)。因此，原則上，在標準寡核苷酸合成條件下是穩(wěn)定的，且具有大于 250nm的吸收的任何部分都是合適的。
這樣的可光度測量的實體優(yōu)選例如是(脫氧)-核苷殘基，例如脫氧腺 苷、脫氧鳥苷、脫氧胞嘧啶、脫氧胸苷或脫氧尿苷；或衍生的核苷酸殘基或 核苷酸類似物，在260nm的各個UV吸收測量中可檢測到所述實體的存在。
可光度測量的實體的其它實例可選自芳族基(aromates ),如二硝基 苯基或苯基5多芳族基(poly aromates ),如芘^或雜芳族基(heteroaromates )， 如吖啶和熒光或非熒光染料。例如，熒光素、羅丹明、噁嗪、花菁或偶氮染 料。
周此，在本發(fā)明的上下文中，X或Y彼此獨立地可不存在或為染料或 任選衍生的核苷。在其中X或Y代表所述化合物的內部實體(internal entities)的那些情況下，所述X和Y部分優(yōu)選為(脫氧-)核苷殘基，如， 脫氧腺苷、脫氧鳥苷、脫氧胞嘧啶、脫氧胸苷或脫氧尿苷。
在一個實施方式中，所述化合物包含以下結構 X-[(CH2)m 4酸基]n國Y其特征在于
3 < m "， 30<n"0, X為羥基或磷酸基，以及
Y為羥基或可光度測量的實體，如任選衍生的(脫氧-)核苷殘基。 優(yōu)選所有單元[(CH2)m 4酸基1是相同的。 在另一實施方式中，所述化合物包含以下結構 X-[ CH2)m 4酸基-Yn
其特征在于
3 < m < 6,
30<n<60,
X為羥基或磷酸基，以及
Y為羥基或可光度測量的實體，如任選衍生的(脫氧-)核苷殘基。 優(yōu)選所有單元-[(CH2)m 4酸基- Y]是相同的。 在又一實施方式中，所迷化合物包含以下結構是相同的。
不同單元的磷酸基之間的間距取決于C原子數目以及內部X或和Y部 分的存在與否。根據本發(fā)明，對所述間距進行選擇，以有效允許某種配合鍵 合，即， 一個Mg^離子和本發(fā)明化合物中存在的兩個鄰接的磷酸基部分之 間的非共價相互作用。
本發(fā)明化合物為聚陰離子，其主要表征為中心單元(CH2)m-磷酸基，其 中m是3和6之間的自然數，即，中心單元包含3至6個C原子，其定義 了兩個鄰接的磷酸基部分之間的最小間距的下限。
13然而，也證實有可能插入更多X或Y部分，其延伸連接磷酸基部分的 原子鏈的長度，籍此乍一看延伸所述部分之間的距離。然而，如實例中所示， X和Y部分的存在對Mg"離子的配合結合沒有負面影響。這最可能是因為 本發(fā)明化合物的空間撓性(sterical flexibility )。
本發(fā)明化合物可用標準亞磷酰胺(phosphoramidite )化學來合成，如 同用于本領域的寡核苷酸的化學合成。更確切地說，通過使用市售的含有受 保護的末端羥基部分的C原子接頭(linker)亞磷酰胺來實現(xiàn)(CH2)m-磷酸 基l單元的并入(incorporation)。通過使用市售的標準核苷亞磷酰胺來實 現(xiàn)作為可光度測量實體的核苷殘基的并入。使用常規(guī)的市售對照有孔玻璃顆 粒(Control Pored Glass Particles )作為原料。然后可根據標準方法切割出 本發(fā)明化合物，得到末端磷酸基或OH或末端核苷部分。
根據本發(fā)明的組合物
在第二個方面中，本發(fā)明涉及組合物，其包含 -如上所公開的化合物 誦DNA聚合酶，以及 -三磷酸脫氧寡核苷。 此類組合物特別有用于進行PCR擴增反應，因為避免了人工擴增產物 (如引物二聚體)的形成。
對本發(fā)明化合物的濃度進行選擇，以使PCR擴增反應的特異性和產率 最優(yōu)化。優(yōu)選地，本發(fā)明化合物的終濃度為低于O.lmM,以避免特異性目 標核酸擴增的任何抑制。同樣優(yōu)選地，本發(fā)明化合物的終濃度為超過 O.OlmM,以i更達到實質的熱啟動效應。
DNA聚合酶一般可為能進行模板依賴性引物延伸反應的任何酶。此類 模板依賴性引物延伸反應可在所有部分雙鏈核酸雜交體(hybrids)上發(fā)生， 所述雜交體表征為具有游離3，羥基的引物核酸與具有單鏈5，突出端的模板 核酸雜交。然后模板依賴性聚合酶通過并入總是與在模板鏈內相對位置的核 苷酸互補的核苷酸殘基催化引物3，末端的延伸。該反應使用dNTP作為底 物，使焦磷酸鹽(酯)釋放。
在一種實施方式中，所迷DNA聚合酶是RNA模板依賴性聚合酶或其
14任何修飾型(modification)。此類酶通常稱為逆轉錄酶。其實例為AMV 逆轉錄酶或MMLV逆轉錄酶。具體而言，轉錄因子(transcriptor)逆轉錄 酶(Roche Applied Science目錄號03 531 317 001 )在本發(fā)明上下文中是適 用的酶。含有此類RNA依賴的DNA聚合酶的本發(fā)明組合物特別有用于制 備和分析型cDNA合成的所有類型和應用，尤其有用于2-步RT-PCR。
在另 一種實施方式中，所述DNA聚合酶是DNA模板依賴性DNA聚合 酶或其任何突變體或修飾型。 一個突出的實例是Klenow聚合酶(Roche Applied Science目錄號11 008 404 001 )。該DNA聚合酶優(yōu)選是熱穩(wěn)定DNA 聚合酶或其任何突變體或修飾型。 一個典型的實例是來自水生棲熱菌的Taq DNA聚合酶(Roche Applied Science目錄號11 647 679 001 )。所述DNA 依賴性DNA聚合酶可具有或可不具有3，-5，校正讀碼活性，如Pwo聚合酶 (Roche Applied Science目錄號11 644 947 001)。此夕卜，本發(fā)明的DNA 聚合酶組分可為具有和不具有校正讀碼活性的酶混合物，如展開高度保真性 系統(tǒng)(Expand High Fidelity system ) ( Roche Applied Science目錄號11 732 641 001 )。包含任何種類的熱穩(wěn)定聚合酶的本發(fā)明組合物特別有用于進行 聚合酶鏈反應(PCR)的各種制備或分析實施方式。
在又一種實施方式中，本發(fā)明的DNA聚合酶組分為具有額外的RNA 模板依賴性逆轉錄酶活性的熱穩(wěn)定DNA依賴性DNA聚合酶，如來自嗜熱 棲熱菌(Thermus thermophilus )的聚合酶(Roche Applied Science 目錄號 11 480 014 001 ),或RNA依賴性DNA聚合酶(即，逆轉錄酶)和熱穩(wěn)定 DNA依賴性DNA聚合酶的混合物。包含這些組分的本發(fā)明組合物特別有用 于進行一步RT-PCR分析。
三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)通常為dATP、 dCTP、 dGTP和dTTP的 混合物，然而，在一些具體情況下，可僅用3種或更少的不同種類的dNTP。 此外，此類dNTP可以任何方式被化學修飾，只要所述結構單元(building block)仍然能通過聚合酶并入新生多核苷酸鏈中。例如，所述修飾的核苷 酸化合物可在各個堿基部分帶有生物素或熒光化合物修飾。此外，dNTP混 合物的至少一個成員可被dNTP類似物(如7-脫氮-2-脫氧鳥苷三磷酸)部 分或完全取代。所述至少一個引物寡核苷酸通常為與目標核酸的特定區(qū)域完全或幾乎
完全互補的脫氧寡核苷酸。此外，所述引物部分必需有游離3，羥基，以便其 可通過DNA聚合酶延伸。就具體目的而言，此類引物可被化學修飾，例如， 內部修飾或在其5，端修飾。經常使用的修飾的實例是生物素標記、地高辛配 基(Digoxygenin)標記和熒光標記。此外，所述引物可包含修飾的核苷或 核苷類似物，其已知改善PCR結果，如等位基因特異性擴增中的例如4，修 飾的堿基或通用堿基如肌苷(inosin),以便擴增可在相同樣品中存在的不 同等位基因。
將如果熱穩(wěn)定DNA依賴性DNA聚合酶設計用于PCR反應，則本發(fā)明 組合物通常包含在相反方向與目標核酸的相反鏈雜交的兩個引物寡核苷酸， 該相反鏈與應得到擴增的目標序列鄰接。本發(fā)明組合物也有可能包含用于多 重PCR擴增的多對寡核苷酸PCR引物。
在一種具體實施方式
中，所述組合物進一步包含隨機5-8聚體寡核苷酸， 其特征為所述寡核苷酸包含具有機疏水部分的修飾。更確切而言，術語"隨 機寡核苷酸"意指寡核苷酸庫(a pool of oligonucleotides ),其序列代表4 種不同核苷酸殘基的或多或少相等的所有可能的組合。雖然已證實添加5聚 體(mer)以及添加8聚體具有所需熱啟動效應，但如果使用隨機六聚體寡 核苷酸，則其結果特別有利。可將濃度范圍為IO^iM和lmM之間，優(yōu)選25|aM 和400pM之間，最優(yōu)選濃度為約lOO^M的所述隨機的寡核苷酸加入至引物 延伸反應或PCR反應中。如果隨機的寡核苷酸具有不可延伸的3，末端，例
何寡核苷酸偶然雜交的情況下，這避免了通過聚合酶的不需要的延伸。
隨機寡核苷酸經有機疏水部分化學修飾。所述部分通常不干擾任何類型 的引物延伸反應。例如，此類有機疏水部分可選自由諸如以下縮聚芳環(huán)或雜 芳環(huán)組成的部分萘、蒽、菲、芘、蒽醌、啼唑菲咯啉、喹啉等，或選自芪 (stilbens),或選自類固醇，如膽固醇。此類疏水部分可凈皮諸如以下的較 小體積的(non bulky substituent)取代基取代氰基、甲氧基、甲基、硝 基和卣素，以及部分已知作為所謂的"帽，，以穩(wěn)定末端堿基對。Narayanan, S. 等人，Nucleic Acids Research 32(9) (2004) 2901-2911; Dogan， Z,等人，
，也已證實其特別有利。在樣品核酸的任何區(qū)域的任Journal of the American Chemical Society 126(15) (2004) 4762-4763。
此類有機疏水部分最優(yōu)選為具有如下化學結構的任選取代的芘或任選 取代的芪
最優(yōu)選此類芘或芪附著在隨機寡核苷酸的5，端，其中這種寡核苷酸的5， 端具有如下結構
q
所述有機疏水部分可置于所迷隨機寡核苷酸的任何部分。然而優(yōu)選在所 述隨機寡核普酸的5，端引入所述修飾。其原因是根據本領域熟知的標準方法 可用亞磷酰胺化學與合適的末端亞磷酰胺將此類5，端修飾引入寡核苷酸，且 芘和芪亞磷酰胺是市售的。
隨機寡核苷酸可包含帶有修飾堿基的核堿基(nucleobase)類似物，如 7-脫氮類似物，如7-脫氮dG; 7-脫氮-8-氮雜類似物，如7-溴-7-脫氮-8-氮雜 -2-氨基dA;或取代的堿基，如丙炔基U、丙炔基C;或帶有修飾的糖的類 似物，如2，-曱氧基核糖；或鎖定糖(locked sugars )如在LNA中；或帶有 核糖類似物，如己糖醇和阿卓糖醇(altritol)。代替隨機化，使用通用堿基 (universal base ),如硝基吲咮或N8核糖基化-7脫氮-8-氮雜dA，然而優(yōu) 選僅在隨機寡核苷酸的一個位置使用通用堿基代替隨機寡核苷酸。核苷間磷 酸酉旨 (internucleoside phosphate ) 可#皮碌酸西旨才莫才以物 (phosphate mimetikmn)(如硫代磷酸酯或磷酸甲酯或氨基磷酸酯)取代。該隨機寡核
o=PIQ
o
17苷酸優(yōu)選具有一個疏水部分，但可另外,皮其他疏水部分取代，但對所述疏水部分彼此獨立地選擇。
總之，包含如上所公開的本發(fā)明聚陰離子化合物連同DNA依賴性熱穩(wěn)定DNA聚合酶，以及至少一對擴增引物的組合物特別有用于實施PCR擴增反應，其原因是所述聚陰離子的存在有效抑制在低于各個擴增引物的退火溫度的溫度下聚合酶催化的人工擴增產物(如引物二聚體)的形成，因此產生熱啟動效應。
如果如上所定義的任何組合物進一步包含目標核酸樣品，其也在本發(fā)明的范圍內。所迷樣品通常可例如含有基因組DNA或片段基因組DNA，以及DNA依賴性DNA聚合酶，或總細胞RNA或聚腺苷酸化(poly-A+RNA )RNA和RNA依賴性DNA聚合酶。
根據本發(fā)明的試劑盒
在一具體方面中，本發(fā)明還提供制備如上詳細公開的組合物的試劑盒。因此，本發(fā)明也涉及至少包含DNA聚合酶和具有如下結構的化合物的試劑n的化合物，其特征在于3^m《6， 30<n<60 ，每個x和y彼此獨立地為0或1,每個X和Y彼此獨立地為任何可光度測量的實體，條件是末端X也可為-OH基或磷酸基，進一步的條件是末端Y也可為需要加至所建立的PCR反應中的-OH基。任選地，隨機5-8聚體寡核苷酸表征為所述寡核苷酸包含具有機疏水部分的修飾，可加入該修飾，以便進一步最優(yōu)化所需熱啟動效應。
在PCR熱循環(huán)期間，通常需要將雙鏈DNA模板分離成單鏈的每個循環(huán)之前的變性時間足以從發(fā)明化合物中解離Mg"離子。因此，非特異性引物延伸不僅在PCR反應開始之前受到抑制，而且在整個完全熱循環(huán)過程中受到抑制。
此外，所述本發(fā)明化合物可根據本領域充分建立的標準氨基磷酸酯化學方法合成?？稍诤铣删哂袩o限撓性的本發(fā)明化合物過程中引入接頭亞磷酰胺
和核苷殘基。因此，與其它熱啟動溶液相比，本發(fā)明PCR添加劑的生產成本相當4氐。
此外，本發(fā)明的方法、組合物和試劑盒可一般用于任何種類的引物延伸、逆轉錄或PCR擴增，不管應制備、擴增、檢測或分析什么具體目標核酸序列。
實施例
實施例1
根據本發(fā)明的3種化合物的合成
_乂40_化合物含有8個IC3-磷酸基Is單元的化合物，每個單元被胸苷核苷中斷，在兩端均有另外的胸苷殘基。
_乂30_化合物含有6個[C3-磷酸基Is單元的化合物，每個單元被胸苷核苷中斷，在兩端均有另外的胸苷殘基。
、X20一化合物含有4個[CV磷酸基5單元的化合物，每個單元被胸苷核苷中斷，在兩端均有另外的胸苷殘基(未被本發(fā)明所要求的范圍涵蓋)，
在與寡核苷酸合成相似的條件下，在4倍10 jimol比例尺(scle)下在ABI 394合成儀中進行合成。用于標準合成的所有其它化學品得自GlenResearch。用市售的dT CPG作為支持材料dT亞磷酰胺(5，-二甲氧基三苯曱基-2，-脫氧胸苷，3，-[(2-氰基乙基)-(N，N-二異丙基)卜亞磷酰胺，間隔基亞磷酰胺C3 (3- U，4，-二甲氧基三苯甲基氧基)丙基-1-[(2-氰基乙基)-(N，N-二異丙基)卜亞磷酰胺)用于固相合成。
標準寡核苷酸合成規(guī)程用于合成。在室溫下將產物從支持物上用濃氨水切割2h。在MonoQ柱上通過IEX色譜純化粗制寡聚體(crude oligo )。色鐠緩沖液A: 10 mM NaOH水溶液，緩沖液B: 10mM NaOH 1 M NaCl水溶液。測量洗脫液在260nm處的UV吸收。得到含有所需全長產物的主要級分。通過透析去除鹽，通過使用旋轉蒸發(fā)儀去除溶劑。通過測量260nm處的吸收來調節(jié)濃度(根據標準程序計算消光系數)。實施例2
在各種濃度的X40存在下的PCR
在PCR中分析各種濃度的—X40—。在50nl體積含有50ng、 25 ng、 10ng、 5 ng或1 ng人基因組DNA; 30 mM Tris畫HCl， pH 8.6; 50 mM KC1; 1.5mM MgCl2; 0.4 引物(SEQ. ID. No: 1: CTG AGA ATC GGC AAG AGACC和SEQ. ID. No: 2 CTG CAC AGT AAT GCA TGC CG); 0.2 mM脫氧核苷酸和2.5單位的Taq DNA聚合酶中，在存在或不存在—X4(^下進行PCR反應。DNA在如下循環(huán)條件下擴增在下起始變性4分鐘；并在94匸下變性20秒，在62"C下退火30秒以及在72X:下延伸60秒，進行35個循環(huán)。在瓊脂糖凝膠上分離擴增產物，通過溴化乙錠染色顯現(xiàn)。結果顯示于圖1中。
不存在添加劑的對照反應顯示隨著目標濃度降低，引物二聚體的形成增加。在超過0.1mM一X4(^的高濃度的存在下，DNA合成受到抑制。在低于0.lmM或更低濃度的_乂40_的濃度下，引物二聚體的形成大大減少。
實施例3
在一X4(L、 一乂30_和_乂20_存在下的實時PCR
在實時PCR中分析—X40—、 —X30—和—X20」在存在_乂40_ ( 40pM或70jiM終濃度)、—X30— ( 70pM或100pM終濃度)、_X20—(在40|nM和100pM之間的各種濃度)或不存在添加劑的情況下進行PCR反應。反應物含有30ng、 3ng或0.3ng人基因組DNA; 50 mM Tris-HCl， pH 8.6; 0.2 mMCHAPS; 1 mM BigChap; 20 mM KC1; 3 mM MgCl2; 0.5 |nM每種引物(SEQ. ID. No: 3: GGA AGT ACA GCT CAG AGT TCT和SEQ. ID. No: 4:GAA TCT CCA TTC ATT CTC AAA AGG ACT); 0.2 mM脫氧核苷酸；1:20 000稀釋的SYBR Green (Molecular Probes)和2.4單位Taq DNA聚合酶。PCR在LightCycler 480儀器(Roche Applied Science目錄號05015 278 OOl)上以20 pi體積進行，具有如下循環(huán)條件在95t:下起始變性2分鐘；并在95X:下變性1秒，在65t:下退火5秒以及在72*€下延伸15秒，進行45個循環(huán)。按照制造商的說明書測量解鏈曲線圖形(melting profile):95t:下持續(xù)1秒，60X:下持續(xù)30秒，并連續(xù)加熱至95X:, 5個取數(acquisitions) /C。使用SybrGreen形式(modus)進行實時PCR檢測。解鏈曲線分析揭示，在不存在添加劑的情況下，形成具有較低解鏈溫度的第二產物。在_乂40_或_乂30一的存在下，非特異性產物的形成減少，而在_X20_ (不受本發(fā)明的范圍涵蓋)的存在下，沒有引起減少非特異性產物的形成。
實施例4
X40與芘封閉的六聚體(pyren capped hexamers )的組合作為RT-PCR用添加劑
在包含引物對的一步實時RT-PCR中，測試一X4(^與芘封閉的六聚體組合的效應，所述引物對除了特異性產物之外還產生一系列非特異性產物。
反應混合物由以下成分組成0.5 pM每種引物(SEQ. ID. No: 5: CCCTCT TCA CCC TGG CTA A和SEQ. ID. No: 6: ACC CTC TTC ACC CTGGCTA); 0.2^MdATP; 0.2 jiM dCTP; 0.2 dGTP; 0.6 dUTP; 30mM Tris畫HCl， pH 8.5; 30 mM KC1; 3 mM MgCl2; 0.1 mg/ml BSA; 0.01 %吐溫(Tween ) ; SYBR Green 1:20 000; 1.2 U Taq DNA聚合酶和0.6單位的轉錄因子逆轉錄酶(Roche Applied Science目錄號04 379 012 001)。X40以75jiM濃度加入。含有添加劑組合的分析混合物含有40pM X40和4(UiM芘封閉的六聚體。來自HeLa細胞的總RNA用作模板，其分別為lng、 100pg、 10pg和lpg。水用作無模板的對照。RT-PCR在LightCycler 480儀器(Roche Applied Science目錄號05 015 278 OOl)上以20 pi體積進行，具有如下循環(huán)條件在50t:下逆轉錄10分鐘，PCR在95"C下起始變性5分鐘；并在951C下變性IO秒，在57"C下退火10秒，在72"C下延伸13秒，進行45個循環(huán)。按照制造商的說明書測量解鏈曲線圖形95n下持續(xù)1秒，
40t:下持續(xù)10秒并連續(xù)加熱至95x:, 5個取數/x:。
在不存在添加劑下，生成很多非特異性PCR擴增產物。在一X4(t的存在下，該產物的數量顯著減少，而在_乂40一和芘封閉的六聚體組合存在下，僅形成一種特異性擴增產物。
實施例5
實時RT-PCR為了評估特異性增加是否也能在PCR擴增步驟之前的cDNA合成中觀察到，在與一步RT-PCR相近條件建立的反應中進行兩步RT-PCR實驗。四個反應平行進行
(a) 存在一X40一下進行第一鏈cDNA合成,不存在一X40一下進行后續(xù)PCR，
(b) 存在—X40—下進行第一鏈cDNA合成，存在_乂40_下進行后續(xù)PCR，
(c) 不存在一X40一下進行笫一鏈cDNA合成,不存在一X40一下進行后續(xù)PCR,
((1)不存在_乂40_下進行第一鏈€0 入合成，存在_乂40_下進行后續(xù)PCR。選擇G6PDH正向(SEQ. ID. NO: 7: GCA AAC AGA GTG AGCCCT TC)和G6PDH反向(SEQ. ID. NO: 8: GGG CAA AGA AGT CCTCCA G)作為當低量RNA存在于RT-PCR反應中時引起非特異性產物形成的引物對。cDNA在20 pi反應物中合成，所述反應物含有0.5 nM引物；0.6單位的轉錄因子(Roche Applied Sciences,目錄號03531317001); 30mM Tris.HCl, pH 8.6; 3mM MgCl2; 200 dATP; 200 dGTP， 200 jaMdCTP; 600 dUTP; 20 mM KC1; 0.2 mM CHAPSO; 1 mM BigChap;125 ng/ml T4基因32蛋白；最終稀釋倍數為1:20 000的SYBR Green和10 pg來自HeLa細胞的總RNA。制備兩種用于cDNA合成的樣品， 一種含有100 _X40_，另一種不含—X40一。反應物在50€下孵育IO分鐘，在95X:下孵育2分鐘，并在冰上冷凍。然后裂解(splitted)兩種反應物，隨后PCR在20nl反應體積中進行，使用如cDNA反應混合物中所述的相同緩沖液中的2 plcDNA反應混合物、0.5pM引物、1.2單位的Taq聚合酶，其中所述的反應混合物中存在或不存在額外的一X40J00pM終濃度。將四種不同的反應物在LightCycler⑧480儀器(Roche Applied Science目錄號05015 278 OOl)中在95X:下孵育2分鐘；并在95"C/10秒，60X:/10秒以及72X:/13秒，進行45個循環(huán)。按照制造商的說明書測定擴增產物的解鏈曲線圖形，如圖2a-d所示。在反應中，當cDNA合成和后續(xù)的PCR過程中存在一乂40_時(圖2b),僅形成一個代表單種產物的解鏈峰，具有所預期的熔點(melting point )。當在PCR過程中在不存在_乂40_下進行cDNA合成時(圖2c和2d)，生成具有與特異產物不同的解鏈溫度的樹種產物。甚至當_乂40一僅存在于cDNA合成過程中，但在后續(xù)的擴增過程中不存在(圖2a)時，也產生比完全不存在—X4(L好的結果。因此，這個結果顯示—X40一在PCRDNA擴增過程中以及在RNA逆轉錄過程中能抑制非特異性產物形成。序列表
〈110〉霍夫曼一拉羅奇有限公司
〈120>用于改進的核酸擴增的聚陰離子
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〈150〉 08015812<151> 2008-09-09
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權利要求
1、化合物，其包含如下結構[Xx-(CH2)m-磷酸基-Yy]n其特征在于3≤m≤6，30≤n≤60，每個x和y彼此獨立地為0或1，每個X和Y彼此獨立地為選自如下的實體核苷殘基、(脫氧-)核苷殘基、衍生的核苷或(脫氧-)核苷殘基和核苷或(脫氧-)核苷類似物，條件是針對每個[Xx-(CH2)m-磷酸基-Yy]單元獨立地選擇每個m、x和y，進一步的條件是末端X也可為-OH基或磷酸基，進一步的條件是末端Y也可為-H或(CH2)m-OH基。
2、 組合物，其包含-權利要求1所述的化合物， 國DNA聚合酶，以及 -脫氧寡核苷酸。
3、 根據權利要求2所述的組合物，其進一步包含隨機5-8聚體寡核苷 酸，其特征在于，所述寡核苷酸包含具有有機疏水部分的修飾。
4、 試劑盒，其包含-權利要求2-3所述的化合物或組合物， 國DNA聚合酶，以及 -脫氧寡核苷酸。
5、 根據權利要求4所述的試劑盒，其進一步包含隨機5-8聚體寡核苷 酸，其特征在于，所述寡核苷酸包含具有有機疏水部分的修飾。
6、 包括如下步驟的方法 -提供含有核酸的樣品，-提供權利要求3所述的組合物， -至少提供第一寡核苷酸引物，-進行聚合酶催化的引物延伸反應。
7、 根據權利要求6所述的方法，其中所述核酸為RNA，且其中所述 DNA聚合酶含有逆轉錄酶活性。
8、 根據權利要求6-7所述的方法，其中所述的聚合酶為熱穩(wěn)定聚合酶， 并對所述反應進行實時監(jiān)測。
9、 根據權利要求8所述的方法，其特征在于，對通過所述擴增生成的 擴增產物進行解鏈曲線分析。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含結構[Xx-(CH₂)m-磷酸基-Yy]n的新穎化合物，其特征在于3≤m≤6，30≤n≤60，每個x和y彼此獨立地為0或1，每個X和Y彼此獨立地為任意的可光度測量的實體，條件是末端X也可為-OH基或磷酸基，進一步的條件是末端Y也可為-OH基。這種化合物可用作基于核酸擴增的合適的熱啟動PCR添加劑。
文檔編號C12N15/11GK101671672SQ200910171180
公開日2010年3月17日 申請日期2009年9月8日 優(yōu)先權日2008年9月9日
發(fā)明者D·海因德爾, E·沃爾特, F·勞, R·科爾布, W·安肯鮑爾 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司