專利名稱：：一種造血干祖細(xì)胞的培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種造血干祖細(xì)胞的培養(yǎng)方法，尤其涉及一種采用藻酸鹽三維培養(yǎng)系統(tǒng)體外擴(kuò)增人臍血造血干祖細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
：目前體外擴(kuò)增人造血干祖細(xì)胞的常規(guī)培養(yǎng)體系是將取自骨髓、外周血或臍血的單個(gè)核細(xì)胞或純化的CD34+細(xì)胞以單個(gè)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的形式培養(yǎng)于培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中。造血干細(xì)胞通常處于相對(duì)休眠的惰性狀態(tài)，常規(guī)培養(yǎng)體系細(xì)胞培養(yǎng)液中需加入較大劑量的多種細(xì)胞因子的組合來(lái)刺激造血干細(xì)胞進(jìn)入增殖周期，以誘導(dǎo)細(xì)胞分裂擴(kuò)增。研究顯示，大劑量的細(xì)胞因子對(duì)造血干細(xì)胞是過(guò)于強(qiáng)烈的刺激信號(hào)，由此導(dǎo)致的結(jié)果是擴(kuò)增后的細(xì)胞被誘導(dǎo)分化成熟，喪失了造血干細(xì)胞自我更新和重建造血的潛能，導(dǎo)致擴(kuò)增以后的細(xì)胞無(wú)法維持長(zhǎng)期造血(Rice,A.，F(xiàn)lemraing,C.，Case,J.,eta丄[J].BoneMarrowTransplant,1999，23(3):211-20)。臨床實(shí)踐需要，體外擴(kuò)增人臍血造血干祖細(xì)胞的方法應(yīng)是簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、安全而有效的。已報(bào)道的用于造血干祖細(xì)胞擴(kuò)增的細(xì)胞因子有很多種，最為多見的是SCF、TP0、FL、GM-CSF、EP0、IL-3和IL-6等，在多種的細(xì)胞因子中，SCF、TPO和FL是對(duì)造血干祖細(xì)胞擴(kuò)增最為關(guān)鍵的細(xì)胞因子(Hofmeister，C.C.,Zhang，J.，Knight,K.L.,a7.[J].BoneMarrowTransplant,2007，39(1):11-23.Bhatia,M.，Wang,J.C.，Kapp,U.,"a丄[J].ProcNatlAcadSciUSA,1997，94(10):5320-5.Murray,L.J.,Young,J.C.,Osborne,L.J.,eta丄[J].ExpHeraatol,1999,27(6):1019—28.Gammaitoni,L.,Bruno,S.，Sanavio，F(xiàn).,a丄[J].ExpHematol,2003，31(3):261—70.)。常規(guī)二維培養(yǎng)系統(tǒng)中，此三種細(xì)胞因子用于造血干祖細(xì)胞擴(kuò)增時(shí)的使用濃度在5(T300ng/ml(Luens，K.M.,Travis,M.A.,Chen,B.P,,"a丄[J].Blood,1998，491(4):1206—15.Piacibello,W.，Sanavio,F.,Garetto，L.,eta丄[J].Leukemia,1998,12(5):718-27.Fietz,T.,erdel，W.E.，Rieder，H.,"a丄[J].BoneMarrowTransplant,1999，23(11):1109-15.Drouet，M.，Herodin,F,，Norol,F.,a7.[J].StemCells,2001，19(5):436-42.Ryu，K.H.,Shin,H.Y.，Ahn，H.S.,a丄Haematologica,2004，89(5):606—7.Levac,K.,Karanu,F.,andBhatia,M.[J].Haematologica,2005,90(2):166-72.)。在實(shí)驗(yàn)研究中，常需要多種細(xì)胞因子聯(lián)合應(yīng)用，稱為細(xì)胞因子雞尾酒(cytokinescocktail)。由于細(xì)胞因子非常昂貴，用于擴(kuò)增造血干祖細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞因子種類使用的越多，劑量使用的越高，則擴(kuò)增的成本就越高。改變體外培養(yǎng)方式是擴(kuò)增造血干祖細(xì)胞的效率的策略之一。在成體體內(nèi)，造血干細(xì)胞生存于骨髓微環(huán)境中。在骨髓微環(huán)境里，造血干細(xì)胞與造血干細(xì)胞之間，造血干細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞之間，造血干細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間都有相互的接觸并互相作用。這種互相作用，是維持造血干細(xì)胞自我更新和重建造血能力的因素之一(Verfaillie,CM.[J].NatImmunol,2002,3(4):314-7.)。因此，將單個(gè)核細(xì)胞或純化CD34+細(xì)胞培養(yǎng)于模擬骨髓微環(huán)境的培養(yǎng)體系中有可能提高擴(kuò)增造血干祖細(xì)胞的效率。三維(3dimentional，3D)培養(yǎng)體系由此被設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增造血干祖細(xì)胞。三維培養(yǎng)體系是應(yīng)用各種材質(zhì)為基質(zhì)，建立三維微網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的培養(yǎng)基質(zhì)，而細(xì)胞就被培養(yǎng)在三維微網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中生長(zhǎng)。有報(bào)道將純化CD34+細(xì)胞放置入預(yù)先制造的膠原或"Cytomatrix"三維培養(yǎng)體系中(Ehring，B.,Biber，K.,Upton,T.M.,efa7,[J].Cytother鄰y,2003,5(6):490-9.Kim,H.S.,Lim,J.B.,Min，Y.H.,eta,[J].IntJHematol，2003，78(2):126-32.)培養(yǎng)，取得一定的擴(kuò)增造血干祖細(xì)胞的效果。但是現(xiàn)有技術(shù)所述的預(yù)制的三維培養(yǎng)體系無(wú)法保證足夠的孔徑和間隙讓所有所加入的細(xì)胞都能進(jìn)入三維培養(yǎng)基質(zhì)內(nèi)。藻酸鹽成分來(lái)自于褐藻，是線性單鏈多聚體，含有4)-D-甘露糖醛酸(ma畫ronicacid，M)殘基和a-(1—4)-L-古羅糖醛酸(guluronicacid,G)殘基。藻酸鹽凝膠微球形成的微網(wǎng)架結(jié)構(gòu)的孔徑為5-200納米，可以允許大分子蛋白質(zhì)和其他成分以及氣體滲透和交換，從而為包裝在其內(nèi)的細(xì)胞提供培養(yǎng)液內(nèi)的所有營(yíng)養(yǎng)成分、各種細(xì)胞因子，并保證氧氣和二氧化碳的交換。當(dāng)鈣離子被螯合劑螯合(如枸櫞酸鹽)，藻酸鹽微球即能從固體狀態(tài)重新回復(fù)到液態(tài)狀態(tài)，釋放并回收包裝在內(nèi)的細(xì)胞?；谝陨咸匦?，相當(dāng)長(zhǎng)一段時(shí)間以來(lái)，被用作食品工業(yè)凝膠基質(zhì)和口服藥物外包膜，是一種對(duì)人體十分安全的材料。藻酸鹽三維系統(tǒng)此前被用于其他多種細(xì)胞的培養(yǎng)，但是主要著眼于貼壁生長(zhǎng)方式的細(xì)胞，尚未有用于擴(kuò)增人造血干細(xì)胞的報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種造血干祖細(xì)胞的培養(yǎng)方法，尤其涉及一種藻酸鹽三維培養(yǎng)系統(tǒng)體外擴(kuò)增人臍血造血干祖細(xì)胞的方法。本發(fā)明釆用三維靜止培養(yǎng)系統(tǒng)、三維旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)系統(tǒng)擴(kuò)增人臍血單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)造血干祖細(xì)胞,并與傳統(tǒng)二維培養(yǎng)系統(tǒng)的擴(kuò)增效果作比較，為體外擴(kuò)增人臍血造血干祖細(xì)胞提高造血干祖細(xì)胞的移植效率提供一種新的方法。本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)本發(fā)明中，選取對(duì)造血干祖細(xì)胞最為關(guān)鍵的SCF、TPO和FL這三種細(xì)胞因子聯(lián)合應(yīng)用來(lái)支持臍血單個(gè)核細(xì)胞中造血干祖細(xì)胞的擴(kuò)增，不加用其他細(xì)胞因子，以盡可能減少培養(yǎng)系統(tǒng)的成本，與傳統(tǒng)二維培養(yǎng)體系所使用細(xì)胞因子濃度相比，本方法采用更為低的濃度。本發(fā)明中，采用包裝在藻酸鹽微球內(nèi)的人臍血單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)于傳統(tǒng)的培養(yǎng)皿中(三維靜止培養(yǎng)系統(tǒng))和旋轉(zhuǎn)的生物反應(yīng)器容器(美國(guó)Synthecon公司)內(nèi)(三維旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)系統(tǒng))，觀察臍血單個(gè)核細(xì)胞包裝于藻酸鹽微球內(nèi)后在旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)系統(tǒng)的擴(kuò)增效果。結(jié)果表明，常規(guī)二維培養(yǎng)系統(tǒng)中，在低濃度細(xì)胞因子水平，人臍血單個(gè)核細(xì)胞無(wú)法得到數(shù)量上的擴(kuò)增，而CD34+細(xì)胞更是明顯的減少；而本發(fā)明在低濃度細(xì)胞因子水平的支持下，培養(yǎng)在三維藻酸鹽靜止系統(tǒng)的人臍血單個(gè)核細(xì)胞卻已得到擴(kuò)增，而在旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)的三維藻酸鹽微球內(nèi)的臍血單個(gè)核細(xì)胞在更低濃度的細(xì)胞因子支持下能取得程度相仿的擴(kuò)增；在細(xì)胞總數(shù)擴(kuò)增的同時(shí)，CD34+細(xì)胞的比例增長(zhǎng)的更為明顯。本發(fā)明中，采用評(píng)價(jià)造血干細(xì)胞最為可靠的N0D/SCID小鼠移植模型評(píng)價(jià)經(jīng)過(guò)培養(yǎng)后的人臍血單個(gè)核細(xì)胞中的造血干細(xì)胞，結(jié)果顯示三維培養(yǎng)系統(tǒng)擴(kuò)增的臍血單個(gè)核細(xì)胞在移植細(xì)胞總數(shù)更低時(shí)卻得到了更好的重建造血能力，提示經(jīng)三維系統(tǒng)培養(yǎng)擴(kuò)增后的人臍血單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)的干細(xì)胞數(shù)量更多。本發(fā)明所述的藻酸鹽三維培養(yǎng)系統(tǒng)，將細(xì)胞包裝在三維微球內(nèi)，能拉近細(xì)胞與細(xì)胞之間的距離，加強(qiáng)細(xì)胞之間的相互作用，使得在低濃度和更低濃度的支持下，反而取得了更好的體外擴(kuò)增體內(nèi)重建造血的效果。顯現(xiàn)出藻酸鹽三維微球培養(yǎng)系統(tǒng)在擴(kuò)增人臍血單個(gè)核細(xì)胞和其中的造血干祖細(xì)胞的明顯優(yōu)勢(shì)。本發(fā)明的三維培養(yǎng)系統(tǒng)中，用藻酸鹽溶液包裝細(xì)胞以及釋放回收細(xì)胞的操作過(guò)程簡(jiǎn)單快捷。本發(fā)明中，通過(guò)造血克隆形成實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)造血干細(xì)胞在體外培養(yǎng)過(guò)程中向不同系列分化的造血能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)三維靜止培養(yǎng)系統(tǒng)和三維旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)后的人臍血單個(gè)核細(xì)胞的粒巨系造血克隆數(shù)均較培養(yǎng)前明顯增加，與二維培養(yǎng)系統(tǒng)比較亦明顯增加。同樣的，移植了擴(kuò)增后人臍血單個(gè)核細(xì)胞的小鼠的脾細(xì)胞和骨髓細(xì)胞的人源性粒巨系克隆的形成能力，顯示三維培養(yǎng)組在移植的細(xì)胞數(shù)明顯低于二維培養(yǎng)組，而三維組的人源性粒巨系克隆形成能力亦明顯增加。本發(fā)明所述的藻酸鹽三維微球培養(yǎng)體系擴(kuò)增人臍血單個(gè)核細(xì)胞的方法具備簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、安全而有效的特點(diǎn)。通過(guò)改變?nèi)四氀獑蝹€(gè)核細(xì)胞體外培養(yǎng)的環(huán)境，運(yùn)用三維藻酸鹽包裝細(xì)胞進(jìn)行靜止或旋轉(zhuǎn)狀態(tài)的培養(yǎng)，能達(dá)到理想的擴(kuò)增人臍血造血干祖細(xì)胞的效果，具有臨床應(yīng)用的前景。圖1是培養(yǎng)于60mra培養(yǎng)皿中的藻酸鹽微球，顯示了通過(guò)27-g針頭滴入lOOmMCaCl2溶液中形成的藻酸鹽-細(xì)胞微球直徑為1.5~2.5mra，右下方為標(biāo)尺標(biāo)示。圖2是三維靜止培養(yǎng)體系擴(kuò)增人臍血單個(gè)核細(xì)胞數(shù)量的不同細(xì)胞因子濃度下細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)，圖中細(xì)胞數(shù)量增長(zhǎng)曲線顯示低濃度細(xì)胞因子組和中濃度細(xì)胞因子組的細(xì)胞數(shù)隨培養(yǎng)時(shí)間增加而增加，無(wú)細(xì)胞因子組和極低劑量細(xì)胞因子組的細(xì)胞總數(shù)與培養(yǎng)前相比無(wú)明顯增加，低濃度細(xì)胞因子組細(xì)胞總數(shù)增加最為理想。圖3是三維靜止培養(yǎng)系統(tǒng)，低濃度細(xì)胞因子組藻酸鹽微球內(nèi)造血細(xì)胞克隆，圖中顯示，自第6天起，藻酸鹽微球內(nèi)出現(xiàn)可見的造血細(xì)胞小克隆，造血克隆隨著培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到第9天、第12天而逐漸增多并增大，白色箭頭指示微球中的造血克隆，圖中左下角示顯微鏡放大倍數(shù)，右下角標(biāo)示標(biāo)尺。圖4是三維旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)體系擴(kuò)增人臍血單個(gè)核細(xì)胞數(shù)量的不同細(xì)胞因子濃度下細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)，圖中細(xì)胞數(shù)量增長(zhǎng)倍數(shù)曲線顯示無(wú)細(xì)胞因子組的細(xì)胞總數(shù)與培養(yǎng)前相比無(wú)明顯增加，低濃度細(xì)胞因子組的細(xì)胞數(shù)隨培養(yǎng)時(shí)間增加而增加，極低濃度細(xì)胞因子組細(xì)胞平均擴(kuò)增在第6天時(shí)達(dá)到最高峰，至培養(yǎng)第9天、第12天，低濃度細(xì)胞因子組和極低濃度細(xì)胞因子組細(xì)胞總數(shù)增加已無(wú)明顯差異。圖5是三維旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)系統(tǒng)，極低濃度細(xì)胞因子組藻酸鹽微球內(nèi)造血細(xì)胞克隆，圖中顯示，與三維靜止培養(yǎng)系統(tǒng)低濃度細(xì)胞因子組相仿，自第6天起，藻酸鹽微球內(nèi)出現(xiàn)可見的造血細(xì)胞小克隆，造血克隆隨著培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到第9天、第12天而逐漸增多并增大，白色箭頭指示微球中的造血克隆，圖中左下角示顯微鏡放大倍數(shù)，右下角標(biāo)示標(biāo)尺。圖6是三維藻酸鹽微球內(nèi)包裝細(xì)胞密度對(duì)人臍血單個(gè)核細(xì)胞擴(kuò)增的影響，單個(gè)微球內(nèi)包裝有20000~25000個(gè)細(xì)胞的在三維靜止培養(yǎng)系統(tǒng)低濃度細(xì)胞因子培養(yǎng)下，細(xì)胞數(shù)隨培養(yǎng)時(shí)間而明顯增長(zhǎng)，其余各組細(xì)胞數(shù)增長(zhǎng)不明顯。圖7是包裝細(xì)胞加入明膠對(duì)人臍血單個(gè)核細(xì)胞擴(kuò)增的影響，包裝細(xì)胞時(shí)加入明膠與不加入明膠細(xì)胞增殖倍數(shù)無(wú)明顯差異。圖8是不同培養(yǎng)系統(tǒng)擴(kuò)增人臍血單個(gè)核細(xì)胞。圖9是流式細(xì)胞儀檢測(cè)臍血單個(gè)核細(xì)胞中CD34+細(xì)胞比例，Day0:細(xì)胞培養(yǎng)以前的臍血單個(gè)核細(xì)胞；Day12-2D:常規(guī)二維培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)12天回收的細(xì)胞；Day12-3Dstatic:三維靜止培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)12天回收的細(xì)胞；Day12-3DRWV:三維旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)12天回收的細(xì)胞圖10是二維與三維培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)人臍血單個(gè)核細(xì)胞前后造血克隆形成細(xì)胞數(shù)。圖11是NOD-SICD小鼠移植人臍血單個(gè)核細(xì)胞模型，小鼠外周血人源性CD45+細(xì)胞比例，圖中第一排為移植后第4周，第二排為移植后第6周，第三排為移植后第8周。實(shí)驗(yàn)以Y射線照射對(duì)照組數(shù)據(jù)設(shè)零。圖12是NOD-SCID小鼠移植經(jīng)培養(yǎng)人臍血單個(gè)核細(xì)胞后8周，脾細(xì)胞和骨髓細(xì)胞中人源性造血克隆形成細(xì)胞數(shù)。為了便于理解，以下將通過(guò)具體的實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地描述。需要特別指出的是，這些描述僅僅是示例性的描述，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明范圍的限制。具體實(shí)施方式實(shí)施例l①實(shí)驗(yàn)材料(1)人臍血單個(gè)核細(xì)胞分離單個(gè)核細(xì)胞分離液Ficoll-PaquePLUS,Amersh柳BiosciencesAB，SwedenPBSsGibco,InvitrogenO.歸CD(A)-PBS:枸櫞酸鈉2g,枸櫞酸0.8g，葡萄糖2.23g溶于1LPBS中，Ph調(diào)至7.2,0.22ixm過(guò)濾除菌。一次性集血袋上海輸血科技公司(2)藻酸鹽三維系統(tǒng)包裝與細(xì)胞回收藻酸鈉(alginatesodium):Sigma-Aldrich,USA明膠(gelatin):Sigma-Aldrich，USA溶解緩沖液(Dissolutionbuffer):50mM枸櫞酸鈉,0.45%NaCl,lOmMHEPES，pH調(diào)至7.2，0.22ixm過(guò)濾除菌。培養(yǎng)液IMDM(Iscove'sModifiedDulbecco'sMedium)，GibcoIrwitrogen，月臺(tái)牛血清(fetalbovineserum,FBS):GibcoInvitrogen細(xì)胞因子SCF(stemcellfactor):重組人SCF，R&DsystemTP0(thro油opoietin):重組人TPO，R&DsystemsFL(Fit-3-ligand):重組人FL，R&Dsystems(4)流式細(xì)胞儀檢測(cè)PE標(biāo)記鼠抗人CD34單克隆抗體BDBiosciencesPE標(biāo)記鼠同型抗體BDBiosciencesPerCP標(biāo)記鼠抗人CD45單克隆抗體BDBiosciencesACK緩沖液KHC031.0g/L，EDTA-二鈉0.0168g/L，NH4C14.415g/L(5)克隆形成實(shí)驗(yàn)(Colonyformingcellassay,CFCassay)人源性克隆形成實(shí)驗(yàn)半固體培養(yǎng)基MethocultGFH4435,StemCellTechnologies;Vancouver,Canada。該培養(yǎng)基為IMDM培養(yǎng)基，含1%甲基纖維素(4000cps)，30%FBS，1%牛血清白蛋白，10—4M2-巰基乙醇，2raML-谷氨酰胺，以及下列人源性細(xì)胞因子50ng/mlvSCF，20ng/mLgranulocyte/macrophage-colonystimulatorfactor(GM-CSF),20ng/mLinterleukin-3(IL-3)，20ng/mLIL-6,20ng/mLgranulocyte-colonystimulatorfactor(G-CSF),and3U/mLErythropoietin(EP0)。②主要實(shí)驗(yàn)儀器細(xì)胞培養(yǎng)箱PrecisionScientificC02Incubator旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)儀Synthecon，Boston,TX，USAY射線輻照儀Gammacell1000Elite,MDSNordion，Canada離心機(jī)sEppendorfcentrifuge5804③實(shí)驗(yàn)步驟與方法(1)人臍血單個(gè)核細(xì)胞分離收集人臍血樣本采集取離體胎盤置高，臍靜脈采集臍血。臍血依重力流入含ACD(B)或CPD2B抗凝劑的一次性使用血液采集袋(上海輸血技術(shù)公司)中。所有供者捐贈(zèng)前簽署知情同意書。分離單個(gè)核細(xì)胞前，臍血樣本始終保存于4'C的環(huán)境中。人臍血單個(gè)核細(xì)胞分離新鮮臍血在采集后6個(gè)小時(shí)之內(nèi)進(jìn)行單個(gè)核細(xì)胞的分離。分離臍血單個(gè)核細(xì)胞采取Fico11-PaquePLUS密度梯度離心法。新鮮抗凝臍血與0.6%ACD(A)-PBS以1:l稀釋，2800g離心15分鐘，緩慢加速緩慢減速，棄上清，收集富白細(xì)胞層。富白細(xì)胞層混勾，再以0.6%ACD(A)-PBS1:1稀釋，仔細(xì)鋪于Fico11-PaquePLUS細(xì)胞分離液上，注意不破壞交界層。20'C溫度下700g離心20分鐘，緩慢加速緩慢減速，仔細(xì)吸取單個(gè)核細(xì)胞層，以0.6WACD(A)-PBS洗滌細(xì)胞兩次(200g，5分鐘)，IMDM洗細(xì)胞一次(200g，5分鐘)，計(jì)數(shù)有核細(xì)胞數(shù)量。采集后的臍血單個(gè)核細(xì)胞直接用于培養(yǎng)，或重懸于1(^DMS0-40%FBS-IMDM凍存液，冷凍保存于液氮中以備后續(xù)培養(yǎng)。(2)藻酸鹽三維微球臍血單個(gè)核細(xì)胞包裝及回收臍血單個(gè)核細(xì)胞包裝于藻酸鹽三維微球新鮮或解凍后的臍血單個(gè)核細(xì)胞重懸于1.1%藻酸鹽溶液或1.1%藻酸鹽-0.1%明膠溶液，混勻。單個(gè)核細(xì)胞-藻酸鹽溶液混合物通過(guò)27-g針頭逐滴滴入100mM氯化鈣溶液中，固態(tài)微球即刻形成，于氯化鈣溶液中旋轉(zhuǎn)6至10分鐘以使微球硬化成型。PBS洗微球三次，然后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)液中，置于培養(yǎng)皿中(三維靜止培養(yǎng)體系)或RWV容器中(三維旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)體系)培養(yǎng)。臍血單個(gè)核細(xì)胞釋放與回收包裝于藻酸鹽微球內(nèi)的細(xì)胞可以通過(guò)使用溶解緩沖液釋放和回收。藻酸鹽微球置于溶解緩沖液中緩速旋轉(zhuǎn)10分鐘后即可充分溶均為200g離心5分鐘，加入培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。(3)細(xì)胞培養(yǎng)三維靜止培養(yǎng)系統(tǒng)其中，包裝后的三維藻酸鹽人臍血單個(gè)核細(xì)胞微球培養(yǎng)于靜止的培養(yǎng)皿中。細(xì)胞培養(yǎng)液為15%FBS-IMDM，加入下列細(xì)胞因子組合stemcellfactor(SCF,10-50ng/ml，R&Dsystems),flt-3-ligand(FL,5-20ng/ml，R&Dsystems),和thrombopoietin(TPO，5-20ng/ml,R&Dsystems)，置37。C，5%0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。對(duì)三維靜止培養(yǎng)系統(tǒng)細(xì)胞因子組合合適的濃度進(jìn)行選擇，培養(yǎng)過(guò)程中每三天半量換液，加入全量細(xì)胞因子。包裝后即刻(day0)與培養(yǎng)的第3、6、9、12天各回收30個(gè)微球內(nèi)的細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)。以包裝后即刻回收的細(xì)胞為基數(shù)l，計(jì)算培養(yǎng)后第3、6、9、12天細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)。培養(yǎng)第12天回收其余所有微球內(nèi)的細(xì)胞，檢測(cè)CD34陽(yáng)性細(xì)胞比例，接種人克隆形成實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基，并準(zhǔn)備移植給N0D/SCID小鼠。三維旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)系統(tǒng)在三維旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)系統(tǒng)里，包裝后的藻酸鹽三維臍血單個(gè)核細(xì)胞微球培養(yǎng)于RWV10ml容器內(nèi)，安裝于NASA旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)生物反應(yīng)器，置培養(yǎng)箱內(nèi)，37°C，5%0)2培養(yǎng)。旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器設(shè)定轉(zhuǎn)速17rpm,可使微球懸浮于培養(yǎng)液中。培養(yǎng)液成分及細(xì)胞因子如上述。同上述，對(duì)三維旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)系統(tǒng)擴(kuò)增人臍血造血干祖細(xì)胞所需細(xì)胞因子組合的合適濃度進(jìn)行選擇研究。細(xì)胞計(jì)數(shù)、CD34+細(xì)胞檢測(cè)、人克隆形成實(shí)驗(yàn)接種和N0D/SCID小鼠移植同上。常規(guī)二維培養(yǎng)系統(tǒng)二維培養(yǎng)系統(tǒng)作為三維培養(yǎng)系統(tǒng)的對(duì)照，臍血單個(gè)核細(xì)胞直接培養(yǎng)于培養(yǎng)皿中，細(xì)胞呈懸浮生長(zhǎng)模式，細(xì)胞培養(yǎng)液同上，本發(fā)明中，所用的細(xì)胞因子組合的濃度為三維培養(yǎng)系統(tǒng)優(yōu)化后的濃度。每三天半量換液，并加入全量細(xì)胞因子。細(xì)胞初始(第0天)培養(yǎng)密度為2X10Vral。培養(yǎng)后第3、6、9、12天臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)，細(xì)胞數(shù)超過(guò)lX107ml時(shí)重新接種細(xì)胞密度為2X107ml。以第0天細(xì)胞數(shù)為基數(shù)l，計(jì)算第3、6、9、12天細(xì)胞增殖倍數(shù)。培養(yǎng)第12天回收所有細(xì)胞，檢測(cè)CD34陽(yáng)性細(xì)胞比例，接種人克隆形成實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基，準(zhǔn)備NOD/SCID小鼠移植。(4)造血干祖細(xì)胞檢測(cè)流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD34+細(xì)胞取培養(yǎng)前(day0)臍血單個(gè)核細(xì)胞，于培養(yǎng)第12天(day12)收集三維培養(yǎng)系統(tǒng)釋放回收細(xì)胞及二維培養(yǎng)系統(tǒng)細(xì)胞各1~2X105，2%FBS-PBS洗一次，加入PE標(biāo)記CD34單抗10u1，4。C避光放置30~40分鐘，2%FBS-PBS洗一次，加入200"12%FBS-PBS重懸細(xì)胞，加入4%多聚甲醛200p1(終濃度2%)，行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)設(shè)加入小鼠同型單克隆抗體，處理過(guò)程相同的同型對(duì)照?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)(Colonyformingcellassay,CFC):分別取培養(yǎng)前(day0)臍血單個(gè)核細(xì)胞和培養(yǎng)第12天三維及二維培養(yǎng)系統(tǒng)回收細(xì)胞，重懸于2%FBS-IMDM，調(diào)整細(xì)胞至12X10Vml。取分裝凍存Methocult培養(yǎng)基(3ral/支)37。C水浴鍋解凍，加入細(xì)胞懸液300ul，混勻，靜置5分鐘除去氣泡。3ml注射器16-g針頭吸取1.lml細(xì)胞-培養(yǎng)基混合物緩慢注入一個(gè)35mra培養(yǎng)皿中，每個(gè)樣本設(shè)2個(gè)重復(fù)培養(yǎng)皿，置飽和濕度、37'C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1214天。倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)大于50個(gè)的細(xì)胞克隆(紅系克隆BFU-E，粒巨系克隆CFU-G/GM)，計(jì)算每105細(xì)胞內(nèi)紅系和粒巨系克隆數(shù)。(5)NOD/SCID小鼠異種移植模型NOD/SCID小鼠分組和移植NOD/SCID小鼠購(gòu)自香港中文大學(xué)，飼養(yǎng)于獨(dú)立無(wú)菌籠內(nèi)，飼以高溫消毒無(wú)菌飲食，所有對(duì)小鼠的操作于超凈臺(tái)內(nèi)完成。移植模型設(shè)4組①y射線照射對(duì)照組3只小鼠，僅照射y射線，不移植任何細(xì)胞；②二維培養(yǎng)組(2D):6只小鼠，y射線照射后移植二維培養(yǎng)系統(tǒng)下培養(yǎng)第12天收集的細(xì)胞；③三維靜止培養(yǎng)組(3Dstatic):6只小鼠，y射線照射后移植三維靜止培養(yǎng)系統(tǒng)下培養(yǎng)第12天收集的細(xì)胞；轉(zhuǎn)培養(yǎng)組(3DRWV):5只小鼠，y射線照射后移植三維旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)系統(tǒng)下培養(yǎng)第12天收集的細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)取6-8周雌性N0D/SCID小鼠，300-350cGy亞致死量全身照射一次。收集移植用人臍血單個(gè)核細(xì)胞，重懸于200iil5%FBS-IMDM。照射后24小時(shí)內(nèi)經(jīng)小鼠尾靜脈注射經(jīng)培養(yǎng)的人臍血單個(gè)核細(xì)胞。移植后第4、6周，小鼠剪尾尖取血，流式細(xì)胞儀檢測(cè)小鼠外周血人源性CD45+細(xì)胞比例。移植后第8周，小鼠摘眼球取血，流式細(xì)胞儀檢測(cè)小鼠外周血人源性CD45+細(xì)胞比例，頸椎脫臼法處死小鼠，取小鼠脾細(xì)胞及骨髓細(xì)胞，接種于人源性CFC培養(yǎng)基內(nèi)，檢測(cè)人源性造血克隆形成能力。N0D/SCID小鼠外周血人源性CD45+細(xì)胞檢測(cè)第4、6、8周采集的小鼠外周血經(jīng)EDTA抗凝，取50u1抗凝全血，加入鼠抗人CD45單抗1，4'C避光放置3040分鐘，加4mlACK緩沖液37。C水浴15分鐘，20(Jg離心5分鐘，2%FBS-PBS洗2次，加入200u12%FBS-PBS重懸細(xì)胞，加入4免多聚甲醛200ul(終濃度2%)，行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。以Y射線照射組小鼠細(xì)胞為對(duì)照組計(jì)算人CD45+細(xì)胞數(shù)，以人源性CD45+細(xì)胞〉W為移植成功。N0D/SCID小鼠人源性造血克隆形成實(shí)驗(yàn)取小鼠脾臟置于15%FBS-IMDM中研磨，70ym濾網(wǎng)濾出脾臟細(xì)胞，ACK緩沖液溶去混雜紅細(xì)胞，15%FBS-IMDM洗滌兩次。取小鼠雙側(cè)股骨，剪去頭端，lml15%FBS-IMDM沖洗出骨髓細(xì)胞，70ura濾網(wǎng)過(guò)濾，ACK緩沖液溶去混雜紅細(xì)胞，15%FBS-IMDM洗滌兩次。所取得小鼠脾細(xì)胞和骨髓細(xì)胞加5ml15%FBS-IMDM培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)移至60mm培養(yǎng)皿中，37'C、5%002靜置4-8小時(shí)。吸取懸浮細(xì)胞并計(jì)數(shù)。細(xì)胞重懸于2%FBS-IMDM,調(diào)整細(xì)胞至廣2X107ml。取分裝凍存Methocult培養(yǎng)基(3ml/支)37'C水浴鍋解凍，加入細(xì)胞懸液300ul，混勻，靜置5分鐘除去氣泡，3ml注射器16-g針頭吸取1.lml細(xì)胞-培養(yǎng)基混合物緩慢注入一個(gè)35mm培養(yǎng)皿中，每個(gè)樣本設(shè)2個(gè)重復(fù)培養(yǎng)皿，置飽和濕度、37'C、5%Ca培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14天。倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)大于50個(gè)的細(xì)胞克隆(紅系克隆BFU-E，粒巨系克隆CFU-G/GM)，計(jì)算每106細(xì)胞內(nèi)紅系和粒巨系克隆數(shù)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以SD土SEM表示。兩組間比較采用t檢驗(yàn)，組間差異采用方差分析。P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果顯示,1.三維藻酸鹽微球內(nèi)人臍血單個(gè)核細(xì)胞的包裝和釋放回收實(shí)驗(yàn)中，人臍血單個(gè)核細(xì)胞重懸于1.1%藻酸鹽溶液或1.1%藻酸鹽-0.1%明膠溶液中，通過(guò)27-g的針頭逐滴滴入lOOmMCaCl2溶液中形成細(xì)胞-藻酸鹽微球。lml細(xì)胞-藻酸鹽溶液混合物平均可以形成176個(gè)微球(范圍135~200beads/ml)。微球呈圓球形和水滴形，直徑1.5~2.5咖(圖1)。包裝細(xì)胞單用藻酸鹽溶液可以形成的微球數(shù)為173±21beads/ml,包裝用藻酸鹽-明膠溶液可以形成的微球數(shù)為185±12beads/ml，兩組比較結(jié)果顯示是否加入明膠對(duì)形成的微球數(shù)無(wú)明顯影響(p〉0.05)。在一個(gè)微球內(nèi)包裝的細(xì)胞數(shù)不同對(duì)形成的微球數(shù)無(wú)明顯影響(表1)。包裝完成的藻酸鹽微球在15%FBS-IMDM培養(yǎng)液中可以保持穩(wěn)定狀態(tài)超過(guò)3個(gè)月。使用溶解緩沖液可以溶解藻酸鹽微球，釋放包裝在其中的細(xì)胞。在這部分實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)檢測(cè)lml溶解緩沖液10分鐘時(shí)間內(nèi)最高可以溶解83個(gè)微球。表1.細(xì)胞包裝密度對(duì)形成藻酸鹽微球數(shù)的影響。(n=9)~單個(gè)藻酸鹽微球內(nèi)包裝的細(xì)胞數(shù)形成的藻酸鹽微球數(shù)(beads/ml)各組間差異p>0.05。2.三維培養(yǎng)體系培養(yǎng)條件優(yōu)化2.1.擴(kuò)增人臍血單個(gè)核細(xì)胞所需細(xì)胞因子濃度本發(fā)明中，三種培養(yǎng)體系均應(yīng)用了3種細(xì)胞因子的組合SCF、TPO和FL。根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的在擴(kuò)增人造血干祖細(xì)胞時(shí)細(xì)胞因子使用的濃度，本實(shí)驗(yàn)中，對(duì)下列四組細(xì)胞因子濃度做了評(píng)價(jià)1)中濃度細(xì)胞因子組(med-CKgroup):15%FBS-IMDM內(nèi)加入SCF50ng/ml，TPO10000200002500030000450006000025ng/ml，F(xiàn)L20ng/ml;2)低濃度細(xì)胞因子組(low-CKgroup):15%FBS-IMDM內(nèi)加入SCF20ng/ml，TPO10ng/ml，F(xiàn)LlOng/ml;3)極低濃度細(xì)胞因子組(xlow-CKgroup):15%FBS-IMDM內(nèi)加入SCF10ng/ml，TPO5ng/ml，F(xiàn)L5ng/ml;4)無(wú)細(xì)胞因子組(no-CKgroup):僅使用15%FBS-IMDM培養(yǎng)液培養(yǎng)微臍血單個(gè)核細(xì)胞。在三維靜止培養(yǎng)系統(tǒng)中，檢測(cè)了以上4種不同濃度的細(xì)胞因子組合對(duì)包裝在藻酸鹽微球中的人臍血單個(gè)核細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)增的效果。結(jié)果顯示在三維靜止培養(yǎng)體系中，低濃度細(xì)胞因子組和中濃度細(xì)胞因子組的細(xì)胞總數(shù)均有明顯擴(kuò)增，而以低濃度細(xì)胞因子組的細(xì)胞擴(kuò)增的最為理想(圖2)。包裝在藻酸鹽微球中的臍血單個(gè)核細(xì)胞在低濃度細(xì)胞因子聯(lián)合支持下，于培養(yǎng)的第3天起表現(xiàn)出細(xì)胞數(shù)量的增加，第6天起顯微鏡檢可見細(xì)胞克隆出現(xiàn)，細(xì)胞克隆的數(shù)量及大小隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而增加增大(圖3)，回收到的細(xì)胞總數(shù)亦隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而增加(表2)。在無(wú)細(xì)胞因子組和極低細(xì)胞因子組未能觀察到微球內(nèi)有細(xì)胞克隆出現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示在三維靜止培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)，低濃度細(xì)胞因子組為培養(yǎng)擴(kuò)增人臍血單個(gè)核細(xì)胞的較適宜的細(xì)胞因子濃度。表2.不同細(xì)胞因子濃度組對(duì)藻酸鹽三維微球內(nèi)包裝的人臍血單個(gè)核細(xì)胞總數(shù)擴(kuò)增倍數(shù)的影響。(n=18)細(xì)胞因子濃度day0day3day6day9day12無(wú)細(xì)胞因子組12.050±0.5361.558±0.2041.406±0.2681.326±0.316極低濃度組11.804±0.251U23±0.2031.779±0.2901.500±0.186低濃度組13.603±0.389*4.551±0.333*5.478±0.516*5.887±0.723*中濃度組12.756±0.8973.259±U513.569±U42*3.357±1.119**與無(wú)細(xì)胞因子組比較，；^0.05;與常規(guī)傳統(tǒng)培養(yǎng)系統(tǒng)相比，三維靜止培養(yǎng)系統(tǒng)僅需要低濃度的SCF、TPO和FL組合支持就可獲得較好的臍血單個(gè)核細(xì)胞擴(kuò)增的效果。在三維旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)，包裝在藻酸鹽微球內(nèi)在旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)容器內(nèi)豎直旋轉(zhuǎn)，細(xì)胞培養(yǎng)液和培養(yǎng)液內(nèi)的細(xì)胞因子可以得到充分的混合均勻分布，為培養(yǎng)在其內(nèi)的細(xì)胞提供更有效的養(yǎng)分和氣體交換。因此，根據(jù)三維靜止培養(yǎng)系統(tǒng)的結(jié)果，在三維旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)系統(tǒng)，測(cè)試了下述三個(gè)細(xì)胞因子濃度組對(duì)包裝在藻酸鹽三維微球中人臍血單個(gè)核細(xì)胞的擴(kuò)增的影響1)低濃度細(xì)胞因子組(low-CKgroup):15%FBS-IMDM內(nèi)加入SCF20ng/ml，TPO10ng/ml，F(xiàn)L10ng/ml:2)極低濃度細(xì)胞因子組(xlow-CKgroup):15%FBS-IMDM內(nèi)加入SCFlOng/ml,TPO5ng/ml，F(xiàn)L5ng/ml;3)無(wú)細(xì)胞因子組(no-CKgroup):僅使用15%FBS-IMDM培養(yǎng)液培養(yǎng)微球內(nèi)臍血單個(gè)核細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，三維旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)條件下，在極低濃度細(xì)胞因子組和低濃度細(xì)胞因子組，均可見到微球內(nèi)有造血克隆生成(圖5)。臍血單個(gè)核細(xì)胞在極低濃度細(xì)胞因子組和低濃度細(xì)胞因子組均可以得到明顯擴(kuò)增，與無(wú)細(xì)胞因子組相比有明顯差異，與第O天時(shí)相比均有明顯增加(p值均小于0.05)。極低濃度細(xì)胞因子組細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)于培養(yǎng)第3、6天較低濃度細(xì)胞因子培養(yǎng)組略高，至培養(yǎng)第9、12天與低濃度細(xì)胞因子培養(yǎng)組擴(kuò)增倍數(shù)相似。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，兩組在第3、6、9、12的細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)無(wú)明顯差異(p值均大于0.10)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示在三維旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)，極低濃度細(xì)胞因子組為培養(yǎng)擴(kuò)增人臍血單個(gè)核細(xì)胞的較適宜的細(xì)胞因子濃度。表3不同細(xì)胞因子濃度組對(duì)三維旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)藻酸鹽三維微球內(nèi)包裝的人臍血單個(gè)核細(xì)胞總數(shù)擴(kuò)增倍數(shù)的影響。(n=18)細(xì)胞因子濃度day0day3day6day9day12無(wú)細(xì)胞因子組10.卯5±0.1741.408±0.3111.838±0.8940.950±0.175極低濃度組13.924±U17*4.759±0.971*3.776±0.5084.032±0.707**低濃度組12.425±0.831#3.128±0.589*#3.761±0,341#4.413±0.936*#與無(wú)細(xì)胞因子組比較，*:/7<0.05:**:pO.01;#示與極低濃度組;>0.12.2.藻酸鹽微球中包裝細(xì)胞的適宜密度本發(fā)明中，使用藻酸鹽包裝細(xì)胞時(shí)，首先需用藻酸鹽溶液重懸需包裝的細(xì)胞。根據(jù)重懸的細(xì)胞數(shù)量可以調(diào)節(jié)包裝在藻酸鹽微球內(nèi)的細(xì)胞密度。本發(fā)明測(cè)試了不同的細(xì)胞包裝密度對(duì)臍血單個(gè)核細(xì)胞擴(kuò)增的影響，確定最合適的細(xì)胞包裝密度。實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)了以下各組細(xì)胞包裝密度單個(gè)藻酸鹽微球內(nèi)包裝有5,000、10，000、20，000、25，000、30,000、45,000、60，000個(gè)臍血單個(gè)核細(xì)胞。包裝了細(xì)胞的微球培養(yǎng)在靜止系統(tǒng)內(nèi)，所用細(xì)胞因子濃度為低濃度組細(xì)胞因子。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示20，000和25，000細(xì)胞組的細(xì)胞隨培養(yǎng)時(shí)間而增長(zhǎng)，單個(gè)藻酸鹽微球內(nèi)包裝的細(xì)胞多于30，000個(gè)或少于10，000個(gè)，細(xì)胞的增長(zhǎng)均不明顯(圖6、表4)。lml1.1%藻酸鹽溶液內(nèi)重懸的臍血單個(gè)核細(xì)胞數(shù)為4~5X106，則包裝出來(lái)的單個(gè)藻酸鹽三維微球里細(xì)胞數(shù)在20，000~25,000范圍內(nèi)。表4.三維藻酸鹽微球內(nèi)不同包裝細(xì)胞密度組培養(yǎng)后細(xì)胞增長(zhǎng)倍數(shù)。(n-9)細(xì)胞密度(個(gè)/微球)day0day3day6day9day125,00010.663±0.0181.065±0.1150.473±0扁0.426±0.02310,00012.005±0.8551.519±0.3401.741±0.2681.525±0.41820,00013.397±0.3214.447±0.3975.259±0.5345.125±0.62325，13.182±0.7773.666±0.5864.630±0.8775.581±1.427>30，00011.906±0.3821.166±0.1861.384±0.1811.269±0.1432.3.包裝臍血單個(gè)核細(xì)胞的藻酸鹽溶液中加入明膠對(duì)細(xì)胞擴(kuò)增的影響明膠(gelatin)常用于包被培養(yǎng)皿加強(qiáng)培養(yǎng)細(xì)胞貼壁，明膠用于藻酸鹽的包裝見于包裝貼壁細(xì)胞。本發(fā)明評(píng)價(jià)了在藻酸鹽溶液中加入0.1%明膠與否對(duì)臍血單個(gè)核細(xì)胞擴(kuò)增的影響。人臍血單個(gè)核細(xì)胞分別被包裝于1.1%藻酸鹽和1.1%藻酸鹽-0.1%明膠，微球被培養(yǎng)于靜止培養(yǎng)皿中，所用細(xì)胞因子組濃度為低濃度組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示包裝細(xì)胞時(shí)加入明膠對(duì)擴(kuò)增臍血單個(gè)核細(xì)胞無(wú)明顯影響(見圖7、表5)。表S.包裝細(xì)胞藻酸鹽溶液加入與不加入O.P/。明膠細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)。(n=12)細(xì)胞包裝藻酸鹽溶液dayOday3day6day9day12不加入明膠(gelatin-)13.742±0.6874.458±0.5005.299±0.6846.027±1扁加入明膠(gelatin+)13.442±0.4194.658±0.5165.688±0.9065.723±U46各組間iX).05。18根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本發(fā)明確定了人臍血單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)于三維藻酸鹽納米培養(yǎng)系統(tǒng)的適宜條件1)細(xì)胞因子濃度a)三維靜止培養(yǎng)系統(tǒng)15%FBS-IMDM內(nèi)加入SCF20ng/ml，TPO10ng/ml，F(xiàn)L10ng/ml;b)三維旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)系統(tǒng)15%FBS-IMDM內(nèi)加入SCFlOng/ml,TPO5ng/ml,FL5ng/ml或15%FBS-IMDM內(nèi)加入SCF20ng/ml，TPO10ng/ml，F(xiàn)L10ng/ral，如考慮到經(jīng)濟(jì)學(xué)因素，則以15%FBS-IMDM內(nèi)加入SCF10ng/ral，TP05ng/ml，F(xiàn)L5ng/ml為更適宜條件。2)細(xì)胞包裝密度4~5乂106人臍血單個(gè)核細(xì)胞重懸于1ml1.1%藻酸鹽溶液，包裝后單個(gè)微球含20,000~25，000個(gè)細(xì)胞。3)包裝細(xì)胞使用1.1%藻酸鹽溶液。3.常規(guī)二維培養(yǎng)系統(tǒng)與三維培養(yǎng)系統(tǒng)擴(kuò)增人臍血單個(gè)核細(xì)胞數(shù)倍數(shù)按確定的人臍血單個(gè)核細(xì)胞包裝與藻酸鹽三維微球培養(yǎng)系統(tǒng)的適宜條件后，培養(yǎng)人臍血單個(gè)核細(xì)胞，比較三維靜止培養(yǎng)系統(tǒng)、三維旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)系統(tǒng)和常規(guī)二維培養(yǎng)系統(tǒng)下人臍血單個(gè)核細(xì)胞體外培養(yǎng)12天，細(xì)胞總數(shù)擴(kuò)增倍數(shù)，常規(guī)二維培養(yǎng)系統(tǒng)采用的細(xì)胞因子濃度為低濃度細(xì)胞因子組(SCF20ng/ml,TPO10ng/ml，F(xiàn)L10ng/ml)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在低濃度細(xì)胞因子支持下，常規(guī)二維培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)的人臍血單個(gè)核細(xì)胞總數(shù)在逐漸減少。三維培養(yǎng)系統(tǒng)下，培養(yǎng)第3天起，人臍血單個(gè)核細(xì)胞開始在藻酸鹽微球內(nèi)擴(kuò)增，細(xì)胞擴(kuò)增最多可達(dá)5.887土0.723倍。三維旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)系統(tǒng)下培養(yǎng)第3、6、12天細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)與三維靜止培養(yǎng)系統(tǒng)無(wú)明顯差異(見圖8、表6)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在低濃度的細(xì)胞因子培養(yǎng)支持下，常規(guī)二維培養(yǎng)體系無(wú)法使人臍血單個(gè)核細(xì)胞擴(kuò)增，而在三維靜止培養(yǎng)系統(tǒng)下即可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的明顯擴(kuò)增，而三維旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)系統(tǒng)在實(shí)現(xiàn)相仿的細(xì)胞擴(kuò)增時(shí)所需的細(xì)胞因子濃度則更低。表6.不同培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)人臍血單個(gè)核細(xì)胞，細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)(n=18)<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>與二維低濃度細(xì)胞因子組比較，p<0.05*S與三維靜止低濃度細(xì)胞因子組比較，p<0.054.常規(guī)二維培養(yǎng)系統(tǒng)與三維培養(yǎng)系統(tǒng)下人臍血單個(gè)核細(xì)胞中CD34+細(xì)胞的擴(kuò)增臨床實(shí)踐中常以CD34+細(xì)胞來(lái)評(píng)價(jià)移植物的造血干祖細(xì)胞比例。本發(fā)明中，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，從臍血分離(新鮮和解凍后)的單個(gè)核細(xì)胞中平均有2.60±0.52%的CD34+細(xì)胞。培養(yǎng)后，常規(guī)二維培養(yǎng)系統(tǒng)下培養(yǎng)第12天的回收的細(xì)胞中CD34+細(xì)胞比例下降到0.45±0.17%。三維靜止培養(yǎng)系統(tǒng)下第12天回收的細(xì)胞中CD34+細(xì)胞比例明顯增加，達(dá)到13.27±2.65%，三維旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)系統(tǒng)下第12天回收的細(xì)胞中CD34+細(xì)胞比例亦明顯增加至18.08±1.49%,與二維培養(yǎng)系統(tǒng)比較，p值均小于0.001。5.常規(guī)二維培養(yǎng)系統(tǒng)與三維培養(yǎng)系統(tǒng)下人臍血單個(gè)核細(xì)胞造血克隆形成實(shí)驗(yàn)分離獲得的人臍血單個(gè)核細(xì)胞(新鮮和解凍后)的紅系克隆形成細(xì)胞(BFU-E)為(1213.93±183.76)/105cell，粒巨系克隆形成細(xì)胞(CFU-G/GM)為(363.34±34,47)/105cell。經(jīng)過(guò)12天的培養(yǎng)后，二維與三維培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)的細(xì)胞其紅系克隆形成細(xì)胞均較培養(yǎng)以前明顯下降，二維與三維各培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)后細(xì)胞的紅系克隆形成細(xì)胞數(shù)之間無(wú)明顯差異。經(jīng)過(guò)12天培養(yǎng)后，二維培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)后的細(xì)胞其粒巨系克隆形成細(xì)胞數(shù)與培養(yǎng)以前相比無(wú)明顯差異，而三維培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)的細(xì)胞其粒巨系克隆形成細(xì)胞數(shù)均較培養(yǎng)以前明顯增加，其中以三維靜止培養(yǎng)系統(tǒng)的增加更為明顯。見圖10、表7。表7.二維與三維培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)人臍血單個(gè)核細(xì)胞前后造血克隆形成細(xì)胞數(shù)。(11=8)培養(yǎng)以前常規(guī)二維培養(yǎng)系統(tǒng)三維靜止培養(yǎng)系統(tǒng)(低濃度CK組)三維旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)系統(tǒng)(極低濃度CK組)三維旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)系統(tǒng)(低濃度CK組)BFU-E(/105ceH)CFU-G/GM(/10scell)1213.93±183.76363.34±34.47211.18±100.75*532.92±82.97186.2U80.il*3423.33±645.14**#121.76±38.43*1262.64±332.04**#62.50±42.50*1943.95±48.18**#*:與培養(yǎng)以前相比，/K0.05;**:與培養(yǎng)以前相比，/K0.01;#:與常規(guī)二維培養(yǎng)系統(tǒng)相比，"0.056.NOD-SCID小鼠移植模型6.1.NOD-SCID小鼠移植培養(yǎng)后人臍血單個(gè)核細(xì)胞NOD-SCID小鼠用于移植共分為4組，如前所述。移植人臍血單個(gè)核細(xì)胞數(shù)1)二維培養(yǎng)組移植二維培養(yǎng)系統(tǒng)低濃度細(xì)胞因子培養(yǎng)12天的細(xì)胞，平均每只小鼠移植單個(gè)核細(xì)胞數(shù)21.92士6.42X102)三維靜止培養(yǎng)組移植三維靜止培養(yǎng)系統(tǒng)低濃度細(xì)胞因子培養(yǎng)12天的細(xì)胞，平均每只小鼠移植單個(gè)核細(xì)胞數(shù)6.59土1.00X10、3)三維旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)組移植三維旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)系統(tǒng)極低濃度細(xì)胞因子培養(yǎng)12天的細(xì)胞，平均每只小鼠移植單個(gè)核細(xì)胞數(shù)4.17±0.27X106。移植第8周，各組小鼠存活率1)Y射線照射對(duì)照組2/3;2)二維培養(yǎng)組2/6;3)三維靜止培養(yǎng)組3/6;4)三維旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)組3/5。6.2.NOD-SCID小鼠移植后外周血人源性CD45+細(xì)胞比例由于流式細(xì)胞儀檢測(cè)小鼠外周血人源性CD45+細(xì)胞比例所用的單克隆抗體為小鼠源性，為去除鼠源性抗體和小鼠血細(xì)胞的非特異性結(jié)合導(dǎo)致的假陽(yáng)性，流式細(xì)胞儀檢測(cè)以Y射線照射對(duì)照組小鼠外周血為對(duì)照，計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組的人源性CD45+細(xì)胞比例。結(jié)果顯示二維和三維靜止、三維旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)組的小鼠外周血人源性CD45+細(xì)胞比例呈現(xiàn)統(tǒng)一的趨勢(shì):移植后第4周人源性CD45+細(xì)胞均大于1%，移植后第6周人源性CD45+細(xì)胞比例均較第4周時(shí)降低，移植后第8周人源性CD45+細(xì)胞比例再次升高，二維培養(yǎng)組平均2.94±0.49%，三維靜止培養(yǎng)組平均8.30±1.13%，三維旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)組平均11.35±2.06%。三維培養(yǎng)組小鼠外周血人源性CD45+細(xì)胞比例均較二維培養(yǎng)組明顯增高。而移植所用細(xì)胞數(shù)三維培養(yǎng)組遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于二維培養(yǎng)組(p<0.05)。6.3.NOD-SCID小鼠移植后脾細(xì)胞、骨髓細(xì)胞人源性造血克隆形成數(shù)N0D-SCID移植后第8周處死取脾細(xì)胞和骨髓細(xì)胞，所取得細(xì)胞經(jīng)前述貼壁過(guò)程去除貼壁細(xì)胞，將懸浮細(xì)胞接種于人源性克隆形成實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基，含人源性造血細(xì)胞因子。經(jīng)過(guò)兩周的培養(yǎng)，y射線照射對(duì)照組均未見任何造血集落集簇形成，顯微鏡下僅見單個(gè)細(xì)胞存在于半固體培養(yǎng)基中。這一結(jié)果說(shuō)明經(jīng)過(guò)貼壁過(guò)程可以去除分泌鼠源性造血細(xì)胞因子的細(xì)胞(如骨髓基質(zhì)細(xì)胞)，排除鼠源性造血干祖細(xì)胞在人源性造血克隆形成實(shí)驗(yàn)中生長(zhǎng)而導(dǎo)致的假陽(yáng)性結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，二維培養(yǎng)組和三維靜止培養(yǎng)組、三維旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)組小鼠的脾細(xì)胞和骨髓細(xì)胞于人源性克隆形成實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基中培養(yǎng)2周后，均可見到有造血克隆形成。粒巨系克隆形成細(xì)胞數(shù)均表現(xiàn)為三維靜止培養(yǎng)組最高，三維旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)組與二維培養(yǎng)組相仿。三維旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)組和二維培養(yǎng)組的脾細(xì)胞均未見紅系克隆形成。骨髓細(xì)胞的紅系克隆形成細(xì)胞以二維培養(yǎng)組為最多。三維培養(yǎng)兩組間相仿。表8,NOD-SCID小鼠移植人臍血單個(gè)核細(xì)胞后人源性造血克隆形成實(shí)驗(yàn)造血克隆數(shù)脾細(xì)胞骨髓細(xì)胞(/106cell)BFU-ECFU-G/GMBFU誦ECFU-G/GMY射線照射對(duì)照組(control)常規(guī)二維培養(yǎng)系統(tǒng)(2D)三維靜止培養(yǎng)系統(tǒng)(3Dstatic)三維旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)系統(tǒng)(3DRWV)007.3±4.3*0013.9±6.7*52.7±39.7*13.1±9.5*0342.1±192.7*20.4±12.6*29.2±9.7*092.1±47.7*295.8±173.9*96.8±30.7**-與Y射線照射對(duì)照組相比，；^o.05;N0D-SCID小鼠移植模型結(jié)果顯示，經(jīng)培養(yǎng)后的人臍血單個(gè)核細(xì)胞可以在N0D-SCID小鼠體內(nèi)移植成活，并重建人源性的造血。三維靜止培養(yǎng)系統(tǒng)和三維旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)系統(tǒng)擴(kuò)增的人臍血單個(gè)核細(xì)胞移植細(xì)胞數(shù)量為106級(jí)別，常規(guī)二維培養(yǎng)系統(tǒng)移植的細(xì)胞數(shù)為107級(jí)別，相比較而言，移植后第8周，三維培養(yǎng)系統(tǒng)擴(kuò)增的細(xì)胞在小鼠體內(nèi)重建粒巨系集落能力強(qiáng)于二維系統(tǒng)，小鼠外周血人源性細(xì)胞比例亦明顯高于二維系統(tǒng)。2權(quán)利要求1、一種造血干祖細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征是采用藻酸鹽三維培養(yǎng)系統(tǒng)體外擴(kuò)增人臍血造血干祖細(xì)胞。2、按權(quán)利要求1所述的造血干祖細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征是所述的培養(yǎng)方法是通過(guò)改變?nèi)四氀獑蝹€(gè)核細(xì)胞體外培養(yǎng)的環(huán)境，用三維藻酸鹽包裝細(xì)胞進(jìn)行靜止或旋轉(zhuǎn)狀態(tài)的培養(yǎng)，擴(kuò)增人臍血造血干祖細(xì)胞，包括下述步驟1)選取SCF、TPO和FL三種細(xì)胞因子聯(lián)合應(yīng)用支持臍血單個(gè)核細(xì)胞中造血干祖細(xì)胞的擴(kuò)增，不加用其他細(xì)胞因子；2)將人臍血單個(gè)核細(xì)胞包裝在藻酸鹽微球內(nèi)分別培養(yǎng)于三維靜止培養(yǎng)系統(tǒng)或三維旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)系統(tǒng)，確定培養(yǎng)條件，觀察臍血單個(gè)核細(xì)胞的擴(kuò)增效果；3)采用NOD/SCID小鼠移植模型評(píng)價(jià)經(jīng)培養(yǎng)后的人臍血單個(gè)核細(xì)胞；4)通過(guò)造血克隆形成實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)造血干細(xì)胞在體外培養(yǎng)過(guò)程中向不同系列分化的造血能力。3、按權(quán)利要求2所述的造血干祖細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征是所述的人臍血單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)于三維藻酸鹽納米培養(yǎng)系統(tǒng)的條件是細(xì)胞因子濃度a)三維靜止培養(yǎng)系統(tǒng)15%FBS-IMDM內(nèi)加入SCF20ng/ml，TP010ng/ml,FL10ng/ml;b)三維旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)系統(tǒng)15%FBS-IMDM內(nèi)加入SCF10ng/ml，TP05ng/ml,FL5ng/tnl或15%FBS-IMDM內(nèi)加入SCF20ng/ml，TPO10ng/ml，F(xiàn)LlOng/ml;細(xì)胞包裝密度45xl(^人臍血單個(gè)核細(xì)胞重懸于lml1.1%藻酸鹽溶液，包裝后單個(gè)微球含20，000~25,000個(gè)細(xì)胞。4、按權(quán)利要求2所述的造血干祖細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征是所述的步驟l)的細(xì)胞因子使用濃度，以15%FBS-IMDM內(nèi)加入SCF20ng/ml，TP010ng/ml，F(xiàn)L10ng/ml為低濃度細(xì)胞因子組；以15%FBS-IMDM內(nèi)加入SCF10ng/ml，TP05ng/ml，F(xiàn)L5ng/ml為極低濃度細(xì)胞因子組。5、按權(quán)利要求2所述的造血干祖細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征是所述的步驟2)的三維旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)系統(tǒng)采用旋轉(zhuǎn)的生物反應(yīng)器容器。6、按權(quán)利要求2所述的造血千祖細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征是所述步驟3)的NOD/SCID小鼠異種移植模型評(píng)價(jià)造血干細(xì)胞的方法是，采用亞致死量照射，尾靜脈注射以移植培養(yǎng)后人源性臍血單個(gè)核細(xì)胞，移植后第8周評(píng)價(jià)小鼠外周血人源性血細(xì)胞、骨髓細(xì)胞和脾細(xì)胞人源性造血克隆形成能力，評(píng)價(jià)移植物中造血千細(xì)胞。7、按權(quán)利要求2所述的造血干祖細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征是所述步驟4)的造血克隆形成實(shí)驗(yàn)是，采用培養(yǎng)后的人臍血單個(gè)核細(xì)胞接種于半固體含各系列血細(xì)胞生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)基，經(jīng)14天培養(yǎng)評(píng)價(jià)形成的克隆，評(píng)價(jià)經(jīng)培養(yǎng)后人臍血造血干細(xì)胞繼續(xù)分化的能力。全文摘要本發(fā)明屬生物
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，涉及一種采用藻酸鹽三維培養(yǎng)系統(tǒng)體外擴(kuò)增人臍血造血干祖細(xì)胞的方法。本發(fā)明聯(lián)合應(yīng)用SCF、TPO和FL細(xì)胞因子支持臍血單個(gè)核細(xì)胞中造血干祖細(xì)胞的擴(kuò)增，不加用其他細(xì)胞因子，采用包裝在藻酸鹽微球內(nèi)的人臍血單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)于三維靜止培養(yǎng)系統(tǒng)和三維旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)系統(tǒng)，觀察臍血單個(gè)核細(xì)胞包裝于藻酸鹽微球內(nèi)后在旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)系統(tǒng)的擴(kuò)增效果。與常規(guī)二維系統(tǒng)比較，本發(fā)明在低濃度細(xì)胞因子培養(yǎng)條件下，細(xì)胞總數(shù)上升，CD34+細(xì)胞明顯增加；在三維培養(yǎng)體系擴(kuò)增的細(xì)胞其粒巨系克隆形成細(xì)胞亦明顯增多，移植NOD/SCID小鼠可在移植細(xì)胞總數(shù)少的情況下，在小鼠體內(nèi)更好植活，重建造血。文檔編號(hào)C12N5/08GK101597594SQ20091015102公開日2009年12月9日申請(qǐng)日期2009年6月26日優(yōu)先權(quán)日2009年2月3日發(fā)明者燕袁,毅謝申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院