專利名稱：一種介導萬古霉素耐藥的基因及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學技術領域，涉及一種介導萬古霉素耐藥的基因，具體涉及一 種引起屎腸球菌(Enterococcus faeciura )對萬古霉素耐藥的新基因的DNA序列及其 用途。
背景技術：
腸球菌屬(Enterococcus spp.)是人類腸道以及泌尿生殖道正常菌群的一部分，也 可作為條件致病菌引起人體多種臟器組織的感染，腸球菌引起的感染中以尿路感染最 為常見，亦可引起腹腔、盆腔、傷口感染以及敗血癥、心內膜炎等嚴重感染。據有關 報道，近年來腸球菌感染呈增多趨勢，業(yè)已成為醫(yī)院感染的主要病原菌之一，在引起 敗血癥等血流感染的病原菌中占居第三位。腸球菌屬細菌，主要包括糞腸球菌 (Enterococcus faecalis )和屎腸球菌。由于腸球菌尤其屎腸球菌對多種臨床常用抗 菌藥物固有耐藥，僅對氨芐西林、青霉素、氨基糖苷類以及萬古霉素等位數不多的抗 菌藥物敏感，萬古霉素耐藥腸球菌(vancomycin- resistant enterococcus, VRE)的 出現與廣泛傳播，更增加了治療此類細菌感染的難度，故VRE已成當前為最受關注耐 藥菌之一。
萬古霉素作用機制是以高親和力結合到敏感細菌細胞壁肽聚糖前體末端的D-丙氨 酰-D-丙氨酸(D-Ala-D-Ala)，阻斷構成細菌細胞壁的高分子肽聚糖合成，導致細胞壁 缺損而殺滅細菌。VRE的耐藥機制主要與萬古霉素結合靶位改變有關，根據其耐藥基因
(ra/^ ra/7￡; ra/ ( )的不同分為VanA VanE及VanG六個基因型。目前對vanA型耐 藥機制的研究較為透徹，ra/^基因編碼蛋白是催化二肽D-丙氨酰-D-乳酸
(D-Ala-D-Lac)生成的D-Ala: D-Lac連接酶，其產物可替代正常肽聚糖五肽前體中 的D-Ala-D-Ala，此新的五肽前體與萬古霉素親和力極低，從而使細菌產生對萬古霉素 的耐藥。
研究揭示了 VanB型、VanD型的作用機制與VanA型相似。VanC型耐藥基因編碼蛋 白可催化D-Ala-D-Ser的合成，減少含D-Ala-D-Ala的肽聚糖前體形成，導致細菌對萬古霉素低水平耐藥，VanC基因根據序列可分為3個亞型ra/ C-l、 ra/ C-2以及ra/^-3， 其中ray C-2以及ra/7C-3具有很高的同源性。VanE型、VanG型VRE在耐藥表型以及耐 藥機制可能與VanC型相似，此類耐藥相對K朋A ra/7萬及ra/W介導的高水平耐藥而言 危害性相對小些。
由于腸球菌屬細菌體外培養(yǎng)營養(yǎng)要求高，培養(yǎng)條件較苛刻，故常規(guī)體外藥敏檢測 不穩(wěn)定，我國長期以來耐萬古霉素腸球菌臨床分離率不高可能與此有關。隨著常規(guī)方 法的改進及PCR及基因芯片等分子生物學新方法的應用，近年VRE的檢出率逐年增多。 現有技術的PCR及基因芯片等以耐藥基因為檢測靶位的分子生物學檢測方法具有方便、 快捷及特異性高等優(yōu)點，但此類方法的建立需要以已知耐藥基因的DNA序列為前提， 一些新的耐藥基因常常因無DNA序列而無法被檢測，導致感染病例的漏診、誤治，造 成嚴重后果。新的耐藥基因可為耐藥菌感染的防治提供潛在的作用靶位，因此，發(fā)現 新的耐藥基因并建立相應的檢測方法對此類感染的防治具有重要意義。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種介導萬古霉素耐藥的基因，具體涉及一種引起屎腸球菌 (Enterococcus faecium )對萬古霉素耐藥的基因。
本發(fā)明所述的萬古霉素耐藥的基因具有SEQ ID. 1的核苷酸序列，其編碼的蛋白具 有SEQID.2的氨基酸序列。所述核苷酸序列，它包括所述DNA序列的互補序列、轉錄 形成的mRNA，以及以分子生物學檢測為目的的人工合成序列。
本發(fā)明的進一步目的是提供所述的基因的用途。
本發(fā)明在腸球菌常規(guī)藥敏檢測的基礎上，通過生物信息學和分子生物學技術，確 定了上述SEQID. 1的可導致屎腸球菌對萬古霉素耐藥的新基因；由于采用現有技術 的VanA、 VanB、 VanC、 VanD及VanG型特異性PCR引物無法檢測到本發(fā)明所述的該基 因序列，常造成在此類VRE感染的診斷中漏診現象。
本發(fā)明提供了與該耐藥基因的核苷酸序列相應的PCR引物與探針，可用于建立新 的PCR和基因芯片檢測方法，進行該新耐藥基因的快速診斷。
4所述的檢測用引物為
NvanF: 5， -GGGCTGCGAT ATTCAAAGHTC-3; NvanR: 5， -GCACACCCGACCTCACAVCC-3，， 所述的探針為
TanMan探針5， FAM - TTCGGCGGTTTGTATGGACAAATCAC-3， TAMERA; 其中的通用芯片檢測探針為
NH2-poly (T) 10- GGCTCTGAYATTCAAAGYTCNGYRRTTTGYATGGA;
其中的特異芯片檢測探針為
NH廠poly (T) 10- CACTGGCATATATTATTGCGAA。
本發(fā)明的技術方案通過下述步驟
1) 采用常規(guī)鑒定藥敏檢測方法獲得萬古霉素耐藥臨床分離株(Efm-HS0661)，該 菌株己于2008年1月31日保藏，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微 生物中心(CGMCC),北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學院微生物研究所，100101，保藏 編號為CGMCC No. 2370，分類命名屎腸球菌Enterococcus faecium 。
2) 采用萬古霉素耐藥基因通用引物vanF: 5， -GGGCTGCGATATTCMAGCTC-3及 vanR: 5， -GCACACCCGACCTCACAGC-3，(專利申請?zhí)?00410067356.3)，進行PCR擴 增有預期的294bp大小條帶；以vanA及vanB基因特異探針vanAN: 5， -NH2-poly (T) 16-GCGCGTTCAGGCTCATC-3，和vanBN: 5， -NH2-poly (T) 16-GCGGGCATCGCCGTTC-3，(專 利申請?zhí)?00410067356. 3)的耐藥基因檢測芯片對屎腸球菌中的vanA及vanB基因 進行檢測，未發(fā)現vanA及vanB基因存在；
3) 通過對上述294bp大小PCR擴增產物的測序分析，得到一段與己知的萬古霉素 耐藥基因序列(vanA基因登錄號X56895; vanB基因登錄號AF192329; vanD基因登 錄號AB183866; vanG基因登錄號DQ212986)不同的核苷酸序列，進一步通過已知DNA片段兩翼序列測序及生物信息學分析，獲得本發(fā)明的、大小為1032bp的SEQ ID. 1 的完整基因序列。
所獲得的該基因序列為未見報道的新的萬古霉素耐藥腸球菌的耐藥決定基因，可 制備PCR擴增及基因芯片診斷探針的檢測序列，用于耐萬古霉素腸球菌感染的臨床診 斷。
本發(fā)明經實踐檢測顯示能特異、靈敏地檢出萬古霉素耐藥新基因，為臨床實踐提 供了一種新的耐藥菌的檢測靶位，并提供了 Real-time PCR檢測攜帶萬古霉素耐藥新 基因腸球菌的方法和基因芯片檢測攜帶萬古霉素耐藥新基因腸球菌的方法，所述的檢 測方法具有快速、準確，操作簡便等優(yōu)點。


圖1是采用萬古霉素耐藥基因通用引物擴增獲得的PCR擴增產物電泳圖譜， 其中，l.為vanA陽性對照菌株的擴增產物；2.為vanB陽性對照菌株的擴增產物；
3.為新的萬古霉素耐藥基因陽性臨床菌株Efm-HS0661的擴增產物；4.為萬古霉素耐藥
基因陰性標準菌株ATCC29212的擴增產物；M.為DL2000 marker條帶大小自上而下分
別為2000bp、 1000bp、 750bp、 500bp、 250bp及100bp。
圖2是采用萬古霉素耐藥基因通用引物擴增獲得的新基因部分序列原始測序圖譜。 圖3是用Blast在線軟件對本發(fā)明萬古霉素耐藥新基因序列SEQ ID. 1與GenBank
中序列的比對分析結果。
圖4是Real-time PCR方法檢測萬古霉素耐藥新基因的擴增曲線。 圖5是基因芯片雜交結果，
其中，A.為芯片的探針位置示意圖，第一排為通用探針，第二排為新基因特異探 針；B.萬古霉素耐藥新基因陽性菌株的雜交結果；C.為vanA陽性菌株的芯片雜交結 果；D.為vanB陽性菌株的芯片雜交結果。
具體實施例方式
實施例l
采用常規(guī)的鑒定及藥敏方法獲得具有萬古霉素耐藥表型的屎腸球菌(Efm-HS0661,保藏編號CGMCC No. 2370 )，采用萬古霉素耐藥基因通用引物vanF:5， -GGGCTGCGATATTCAAAGCTC-3; vanR: 5， -GCACACCCGACCTCACAGC-3，(專利申請?zhí)?00410067356. 3)進行PCR擴增有預期的294bp大小條帶(圖1);以vanA及vanB基因特異探針vanAN: 5， -NH2-poly (T) 16-GCGCGTTCAGGCTCATC-3，和vanBN:5， -NH2-poly (T) 16-GCGGGCATCGCCGTTC-3，(專利申請?zhí)?00410067356.3)的耐藥基因檢測芯片進行檢測，未發(fā)現所述的2種基因存在；通過對PCR產物的測序分析獲得了與已知萬古霉素耐藥基因不同的核苷酸序列(圖2)，進一步采用TaKaRaGenomeWalking Kit (大連寶生物公司)進行PCR產物兩翼序列測序及生物信息學分析，獲得了一個1032bp大小的完整的SEQ ID. 1的基因序列；采用NCBI數據庫的Blast在線核苷酸分析軟件進行比對，該基因與源自腸球菌的萬古霉素耐藥基因同源性為82%，與源自其它菌種的萬古霉素耐藥基因的同源性最高者為90% (圖3)，確定該基因序列是一種新的萬古霉素耐藥基因。
實施例2
采用DNAStar生物信息學分析軟件，將新基因序列與其它萬古霉素耐藥基因vanA(基因登錄號X56895) 、 vanB (基因登錄號AF192329) 、 vanD (基因登錄號AB183866)及vanG (基因登錄號DQ212986)進行序列比對，明確了所述的新基因特有的序列，并根據新基因序列與已知耐藥基因的序列差異，對萬古霉素耐藥基因通用引物vanF: 5，-GGGCTGCGATATTCAAAGCTC-3及vanR: 5，-GCACACCCGACCTCACAGC-3'進行優(yōu)化，在引物的3'端引入了簡并堿基，優(yōu)化后的通用引物為NvanF:5，-GGGCTGCGATATTCAAAGHTC-3:及NvanR: 5,-GCACACCCGACCTCACAVCC-3，0
根據上述新基因中位于通用引物NvanF和NvanR間的一段特有序列設計了TaqMan探針5'FAM-TTCGG CGGTTTGTATGGACAAATCAC-3'TAMERA，建立萬古霉素耐藥新基因的Real-time PCR檢測方法。所述的PCR反應體系50nl包括2xTaqPCRMix (天根生化科技有限公司)25nl,上游引物vanF (25pM) l[U，下游引物vanR (25nM) lpl， TaqMan探針(lOpM) lpl ，樣品模板5pl,雙蒸水17^1。 PCR擴增條件預變性94。C5min; 94°C 30sec， 50°C 30sec, 72°C 45sec (50個循環(huán))。PCR擴增結果曲線(圖4)顯示了攜帶新基因的標本均出現熒光信號對數增強的擴增曲線，而攜帶vanA、 vanB基因的標本，以及沒有攜帶萬古霉素耐藥基因的腸球菌標準株(ATCC29212)則無熒光信號對數增強的擴增曲線。通過對樣品模板的梯度稀釋，方法的檢測低限為103CFU。采用所建立的方法從11株分離自上海的萬古霉素耐藥腸球菌中檢出5株攜帶本發(fā)明新基因的菌株。檢測結果證實，本發(fā)明的新基因序列可用于建立Real-time PCR檢測方法，并能特異、靈敏地檢出萬古霉素耐藥新基因。
實施例3
參照《耐藥菌檢測芯片及其制備方法和應用方法》(專利申請?zhí)?00410067356. 3)，采用Cy-5熒光素標記萬古霉素耐藥下游引物vanR的5'端，與上游引物vanR組合擴增含ra"A ra;^及新萬古霉素耐藥基因的樣品，得到的PCR產物可標記Cy-5熒光素；根據ra/^及本發(fā)明新基因共有保守序列設計萬古霉素耐藥基因寡核苷酸通用芯片檢測探針NH2-poly (T) 10- GGCTGYGAYATTCAAAGYTCNGYRRTTTGYATGGA，根據本發(fā)明萬古霉素耐藥新基因特有序列設計寡核苷酸特異芯片檢測探針NH2-poly (T) 10-CACTGGCATATATTATTGCGAA(探針的核苷酸序列按5， 〉3，方向排列；5，端添加poly(T)10以減少雜交時的空間位阻；通過5'端NH2修飾以便與醛基修飾的芯片片基結合，將通用探針點在芯片矩陣的第一批，作為定位信號，新基因特異檢測探針點在矩陣的第二排，每種探針有4個重復，形成矩陣示意圖(圖5A)。雜交結果顯示，含ra/7/l或ra;^基因樣品的擴增產物可與相應的探針發(fā)生雜交，僅在通用探針出現雜交信號(圖5C、5D)，而含新耐藥基因樣品的擴增產物通用探針及特異探針均出現雜交信號(圖5B)。結果證實，本發(fā)明的新基因序列能用于設計探針建立基因芯片檢測方法，為快速診斷萬古霉素耐藥腸球菌感染提供檢測耙位。
8SEQUENCE USTING
<110>復旦大學附屬華山醫(yī)院
<120> —種介導萬古霉素耐藥的基因及其用途
<130> 11
<160> 2
<170> Patentln version 3.1
<210> 1
<211> 1032
<212> DNA
<213>萬古霉素
<400> 1
atgaatagat tgaaaatagc catcctgttt gggggttgct cagaagagca taatgtatcg 60gtaaaatcag cggcagagat tgccaacaac attgatatag gaaaatatga acca3t3tac 120atcggaataa cccaatctgg cgtttggaaa acatgcgaaa aaccatgtat 3g3ttgggat 180aatgaacact gtcgctcggc agtactttct ccggataaaa aaatgcatgg gttgcttatt 240atgcaagata aaggatatca aatacagcgt atagatgtag tcttttcagt gttgcacgga 300a33tcgggtg asgacggcgc c3tac3agg3 ttatttgsat tgtctggt3t accttatgta 360gg卿gata ttoaaagttc ggcgg卿atggacaaat cactggcata tattattgcg 420aaaaacgctg gcatagctac tcctgaattt caggtca世ataaagacga taagccagcg 480gcagattcgt ttacctatcc cgtttttgtt aagccagcac gttcaggttc ctcctatggt 540gtgaataaag ttaatagtgc ggatgaattg gactccgcaa ttgacttggc aagacaatat 600gacagcaaaa tcctaattga gcagggtgtt ttaggttatg aggtcggttg tgccgtattg 660ggaaacagtt tcgacttgat tgttggtgaa gtggatcaaa tcagactgca acacggtatt 720tttcgtattc atcaggaagc cgagccgg33 aaaggttctg aaaacgcaac tataaccgtt 780cccgcagaac tatcggcsga ggagcgagaa cggataaaag asgcggcaaa aaatatatat 840aaggcgctcg ggtgtagagg tctttctcgt gttgatatgt他acaaga taacggccgc 900attgtactaa atgaagtcaa taccatgcct ggtttcacgt catacagccg ttatccacgt 960atgatggtct cagcaggtat aacaattccc ga3ctgattg 3ccatctgat tgtattagct 1020gtaaaggagtga 1032<211> 343<212> PRT<213>萬古霉素<400> 2
Met Asn Arg Leu Lys lie Ala lie Leu Phe Gly Gly Cys Ser Glu Glu15 10 15
His Asn Val Ser Val Lys Ser Ala Ala Glu lie Ala Asn Asn lie Asp20 25 30
lie Gly Lys Tyr Glu Pro lie Tyr lie Gly lie Thr Gin Ser Gly Val
35 40 45
Trp Lys Thr Cys Glu Lys Pro Cys lie Asp Trp Asp Asn Glu His Cys
50 55 60
Arg Ser Ala Val Leu Ser Pro Asp Lys Lys Met His Gly Leu Leu lie65 70 75 80
Met Gin Asp Lys Gly Tyr Gin He Gin Arg lie Asp Val Val Phe Ser
85 90 95
Val Leu His Gly Lys Ser Gly Glu Asp Gly Ala lie Gin Gly Leu Phe100 105 110
Glu Leu Ser Gly lie Pro Tyr Val Gly Cys Asp lie Gin Ser Ser Ala
115 120 125
Val Cys Met Asp Lys Ser Leu Ala Tyr lie lie Ala Lys Asn Ala Gly
130 135 140
lie Ala Thr Pro Glu Phe Gin Val lie Tyr Lys Asp Asp Lys Pro Ala145 150 155 160
Ala Asp Ser Phe Thr Tyr Pro Val Phe Val Lys Pro Ala Arg Ser Gly
165 170 175
Ser Ser Tyr Gly Val Asn Lys Val Asn Ser Ala Asp Glu Leu Asp Ser180 185 190Ala lie Asp Leu Ala Arg Gin Tyr Asp Ser Lys lie Leu He Glu Gin
195 200 205
Gly Val Leu Gly Tyr Glu Val Gly Cys Ala Val Leu Gly Asn Ser Phe
210 215 220
Asp Leu lie Val Gly Glu Val Asp Gin lie Arg Leu Gin His Gly lie225 230 235 240
Phe Arg lie His Gin Glu Ala Glu Pro Glu Lys Gly Ser Glu Asn Ala
245 250 255
Thr lie Thr Val Pro Ala Glu Leu Ser Ala Glu Glu Arg Glu Arg lie
260 265 270
Lys Glu Ala Ala Lys Asn lie Tyr Lys Ala Leu Gly Cys Arg Gly Leu
275 280 285
Ser Arg Val Asp Met Phe Leu Gin Asp Asn Gly Arg lie Val Leu Asn
290 295 300
Glu Val Asn Thr Met Pro Gly Phe Thr Ser Tyr Ser Arg Tyr Pro Arg305 310 315 320
Met Met Val Ser Ala Gly lie Thr lie Pro Glu Leu lie Asp His Leu
325 330 335
lie Val Leu Ala Val Lys Glu340
權利要求
1、一種介導萬古霉素耐藥的基因，其特征是具有SEQ ID.1的核苷酸序列和它編碼的蛋白具有SEQ ID.2的氨基酸序列。
2、 按權利要求1所述的介導萬古霉素耐藥的基因，其特征是所述的核酸序列是 cDNA序列。
3、 按權利要求1所述的介導萬古霉素耐藥的基因和蛋白，其特征是所述的核酸 序列是mRNA序列。
4、 按權利要求1所述的介導萬古霉素耐藥的基因和蛋白，其特征是所述的核酸 序列是人工合成序列。
5、 權利要求1的介導萬古霉素耐藥的基因在制備診斷探針基因芯片中的用途。
6、 權利要求1的介導萬古霉素耐藥的基因在制備檢測耐萬古霉素腸球菌感染診 斷探針基因芯片中的用途。
7. —種攜帶對萬古霉素耐藥基因的屎腸球菌，其特征是所述球菌為屎腸球菌 Enterococcus faecium，保藏編號為CGMCC No. 2370，攜帶SEQID. l的核 苷酸序列。
全文摘要
本發(fā)明屬生物醫(yī)學技術領域，涉及一種介導萬古霉素耐藥的基因及其用途。本發(fā)明所述的耐藥的基因具有SEQ ID.1的核苷酸序列，其編碼的蛋白具有SEQ ID.2的氨基酸序列。所獲得的該基因序列為新的萬古霉素耐藥腸球菌的耐藥決定基因，可制備PCR擴增及基因芯片診斷探針的檢測序列，用于耐萬古霉素腸球菌感染的臨床診斷。本發(fā)明為臨床實踐提供了一種新的耐藥菌的檢測靶位，并提供了Real-timePCR檢測攜帶萬古霉素耐藥新基因腸球菌的方法和基因芯片檢測攜帶萬古霉素耐藥新基因腸球菌的方法，所述的檢測方法具有快速、準確，操作簡便等優(yōu)點。
文檔編號C12Q1/68GK101597613SQ200910151030
公開日2009年12月9日 申請日期2009年6月26日 優(yōu)先權日2008年7月11日
發(fā)明者楊 劉, 葉信予, 湜 吳, 張嬰元, 徐曉剛, 朱德妹, 林東昉, 王明貴, 胡付品, 燕 郭 申請人:復旦大學附屬華山醫(yī)院