專利名稱：高產(chǎn)聚-β-羥丁酸的巨大芽孢桿菌Bm-10菌株及其篩選方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)醫(yī)學(xué)及生活領(lǐng)域，尤其涉及一種高產(chǎn)聚-β-羥丁酸(PHB)的 巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)Bm-10菌株及其用途。
背景技術(shù)：
聚-β-羥丁酸(PHB)是細(xì)胞內(nèi)的一類生物聚酯，其力學(xué)性質(zhì)與一些熱塑性材料如 聚丙烯相似，并且可以被微生物完全降解，因而被稱之為“生物可降解塑料”，是真正的環(huán)境 友好型產(chǎn)品。研究生物可降解塑料來替代化學(xué)合成塑料可以幫助我們解決塑料污染問題， 節(jié)約能源，實(shí)現(xiàn)資源與環(huán)境的可持續(xù)發(fā)展。PHB是微生物在碳、氮等營養(yǎng)失衡的條件下合成 的碳源與能源的高分子儲存物(分子量50000 1000000)。作為微生物合成的可降解材 料，PHB除了具有與化學(xué)合成高分子相似的理化性質(zhì)，還具有一般化學(xué)合成高分子所沒有 的性質(zhì)如光學(xué)活性、低透氧性、抗紫外輻射、生物可降解性、生物相容性、壓電性和抗凝血性 等，在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、環(huán)保、食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域具有十分廣闊的應(yīng)用前景。如在醫(yī)療領(lǐng)域，PHB可 以作為藥物基質(zhì)植入人體，以控制藥物的釋放，且最終降解產(chǎn)物為β -羥基丁酸，沒有任何 毒副作用。自發(fā)現(xiàn)生物體內(nèi)可以積累PHB以來，國內(nèi)外許多研究者致力于PHB的研究。英國、 日本、加拿大、美國等已實(shí)現(xiàn)了 PHB的工業(yè)化生產(chǎn)。國內(nèi)PHB的研究起步較晚，但也取得了 一定的成果。中科院微生物所、山東大學(xué)、清華大學(xué)等在PHB的研究方面已經(jīng)取得了一些研 究成果和進(jìn)展。但總的來說相對于化學(xué)合成塑料，PHB的生產(chǎn)成本仍然較高，約為傳統(tǒng)塑料 生產(chǎn)成本的數(shù)倍至十幾倍。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對市場上對可降解塑料需求的日益增長，而現(xiàn)有技術(shù)中利用微生物法生 產(chǎn)可降解塑料菌種產(chǎn)量低、成本高等問題。本發(fā)明的一個目的是提供高產(chǎn)聚羥丁酸的 巨大芽孢桿菌Bm-IO菌株，該菌株從污泥中篩選獲得，可用于PHB的微生物制備。本發(fā)明另 外的一個目的是提供上述的巨大芽孢桿菌Bm-IO菌株的用途。為了實(shí)現(xiàn)上述的第一個目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案高產(chǎn)聚-β -羥丁酸的巨大芽孢桿菌Bm-IO菌株，高產(chǎn)聚-β -羥丁酸的巨大芽 孢桿菌Bm-IO菌株的保藏號為CCTCC NO :M209131，保藏單位為中國典型培養(yǎng)物保藏中 心，保藏地址為中國武漢武漢大學(xué)，保藏日期為2009年6月25日，分類命名為巨大芽 孢桿菌Bm-IO Bacillus megaterium Bm-10。該菌株菌落乳白色不透明，圓形，較大、直徑 約3 6mm，表面光滑，邊緣整齊，無特殊氣味。顯微鏡觀察細(xì)胞呈桿狀或近橢圓形桿狀， 粗大，長度約3 5 μ m，寬度約1. 2 1. 5 μ m ；趨于扭曲的短鏈；周生鞭毛，具運(yùn)動性；革 蘭氏染色陽性。16S rDNA電泳和測序分析結(jié)果表明，其長度為1513bp，與巨大芽孢桿菌 (B. megaterium)菌株的同源性達(dá)99. 7 %。鑒定該菌株為巨大芽孢桿菌(B. megaterium)。對該菌體內(nèi)的PHB通過蘇丹黑染色進(jìn)行初步定性定量測定，細(xì)胞內(nèi)含量較多。上述的高產(chǎn)聚- β -羥丁酸的巨大芽孢桿菌Bm-IO菌株的篩選方法如下取0. 2g 土壤，加入5mL蒸餾水，85°C加熱15min，進(jìn)行10—1 10_4梯度稀釋，選擇10_2濃度IOOyL 涂布牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板，30°C培養(yǎng)24h，出現(xiàn)圓形乳白色菌落；挑取單菌落，進(jìn)一步 分離、純化后，獲得菌株。作為優(yōu)選，所述的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配方包括牛肉膏20g、蛋白胨5g、氯化鈉 5g、水 1L，pH 7. 2。為實(shí)現(xiàn)上述的第二個目的，本發(fā)明的高產(chǎn)聚_ β _羥丁酸的巨大芽孢桿菌Bm-IO菌 株用于聚-β-羥丁酸的制備。高產(chǎn)聚-β -羥丁酸的巨大芽孢桿菌Bm-IO菌株用于聚-β -羥丁酸的制備方法， 該方法包括以下的步驟①挑取適量菌種接入牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液中，30°C活化培養(yǎng)20 30h ；裝入牛肉 膏蛋白胨培養(yǎng)液，取培養(yǎng)的種子培養(yǎng)液，按4 10%的接種量接種后，30°C，200r/min,搖瓶 培養(yǎng)80 120h，可得PHB含量占菌體干重的45% 55%的巨大芽孢桿菌菌體；②將搖瓶所得培養(yǎng)液lOOOOr/min離心5min，收集菌體，無菌水洗滌3次后再用丙 酮洗滌一次，之后加氯仿與酒精的混合液提取PHB，然后40°C干燥后可得到白色沉淀即為 PHB。本發(fā)明由于采用了上述的技術(shù)方案，從污泥中篩選獲得高產(chǎn)聚羥丁酸的巨 大芽孢桿菌Bm-IO菌株，該菌株可用于PHB的微生物制備，解決了現(xiàn)有技術(shù)中利用微生物法 生產(chǎn)可降解塑料菌種產(chǎn)量低、成本高等問題。


圖1為本發(fā)明巨大芽孢桿菌(B.megateriunOBm-lO菌株形態(tài)特征圖。其中A為 菌落正面，B為菌落背面，C為菌體革蘭氏染色，D為菌體蘇丹黑染色。圖2為本發(fā)明巨大芽孢桿菌佤11^83{61^11111)8111-10菌株的163 rDNA電泳分析圖。圖3為巨大芽孢桿菌(B. megaterium) Bm-IO菌株生長和PHB產(chǎn)量圖。圖4為巨大芽孢桿菌(B. megaterium) Bm-IO菌體中提取的PHB粉末照片。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1從污泥中分離高產(chǎn)PHB的巨大芽孢桿菌Bm-IO菌株(一)培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基牛肉膏(20g)、蛋白胨(5g)、氯化鈉(5g)、水(1L)、pH 7.2。(二)方法采用梯度稀釋分離法。取0. 2g 土壤，加入5mL蒸餾水，85°C加熱15min，進(jìn)行梯度 稀釋(KT1 10_4)，選擇合適的濃度(10_2)100yL涂布牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板，30°C培養(yǎng) 24h，出現(xiàn)圓形乳白色菌落。挑取單菌落，進(jìn)一步分離、純化后，對所獲的菌株用蘇丹黑染色 法對PHB的進(jìn)行定性測定(圖ID所述)。選取含有PHB的菌株編號，置4°C冰箱中保存，備 用。用牛肉膏蛋白胨試管斜面進(jìn)行菌種活化傳代，菌株每4周轉(zhuǎn)接一次；菌種使用之前需先 活化。對選出的菌株進(jìn)行形態(tài)、生理生化和16S rDNA序列鑒定。
Bm-IO菌株菌落乳白色不透明，圓形，較大、直徑約3 6mm，表面光滑，邊緣整齊， 無特殊氣味(如圖1A，B)。顯微鏡觀察細(xì)胞呈桿狀或近橢圓形桿狀，粗大，長度約3 5 μ m， 寬度約1. 2 1. 5μπι ；趨于扭曲的短鏈；周生鞭毛，具運(yùn)動性；革蘭氏染色陽性(如圖1C)。 16S rDNA電泳和測序分析結(jié)果表明，其長度為1513bp，與巨大芽孢桿菌(B. megaterium)菌 株的同源性達(dá)99.7% (如圖2所示)。該菌株在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，30°C IOd條件下， 經(jīng)15代連續(xù)培養(yǎng)，其培養(yǎng)特征、形態(tài)特征和PHB產(chǎn)量均無明顯變化，表明該菌株的生物性狀 基本穩(wěn)定。實(shí)施例2巨大芽孢桿菌(B. megaterium) Bm-IO菌株用于PHB制備的方法( 一 )菌株巨大芽孢桿菌(B. megaterium) Bm-IO菌株，菌株的保藏號為CCTCC NO :M209131。(二)方法從活化的牛肉膏蛋白胨試管斜面培養(yǎng)基上挑取適量菌種接入牛肉膏蛋白胨培養(yǎng) 液中，30°C活化培養(yǎng)24h ；250mL三角瓶中裝入50mL牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液，取培養(yǎng)24h的種 子培養(yǎng)液，按8%的接種量接種后，30°C，200r/min,搖瓶培養(yǎng)96h，可得PHB含量占菌體干重 的45% 55%的巨大芽孢桿菌菌體(如圖3所示)。PHB提取和定量分析將搖瓶所得培養(yǎng)液lOOOOr/min離心5min，收集菌體。無菌 水洗滌3次后再用丙酮洗滌一次，之后加氯仿與酒精的混合液(氯仿酒精=2 1)提取 PHB，然后40°C干燥后可得到白色沉淀即為PHB(如圖4所示)，PHB在濃硫酸作用下解聚成 巴豆酸，在235nm處用紫外分光光度計(jì)測定其含量；精確定量采用氣相色譜法。
權(quán)利要求
高產(chǎn)聚 β 羥丁酸的巨大芽孢桿菌Bm 10菌株，其特征在于高產(chǎn)聚 β 羥丁酸的巨大芽孢桿菌Bm 10菌株的保藏號為CCTCC NOM209131。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高產(chǎn)聚_羥丁酸的巨大芽孢桿菌Bm-IO菌株其特征在 于該菌株菌落乳白色不透明，圓形，較大、直徑約3 6mm，表面光滑，邊緣整齊，無特殊氣 味；顯微鏡觀察細(xì)胞呈桿狀或近橢圓形桿狀，粗大，長度約3 5 μ m，寬度約1. 2 1. 5 μ m ； 趨于扭曲的短鏈；周生鞭毛，具運(yùn)動性；革 >蘭氏染色陽性；16S rDNA電泳和測序分析結(jié)果表 明，其長度為1513bp。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高產(chǎn)聚羥丁酸的巨大芽孢桿菌Bm-IO菌株的篩選方法， 其特征在于該方法如下取0. 2g 土壤，加入5mL蒸餾水，85°C加熱15min，進(jìn)行ICT1 10_4 梯度稀釋，選擇10_2濃度100 μ L涂布牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板，30°C培養(yǎng)24h，出現(xiàn)圓形乳 白色菌落；挑取單菌落，進(jìn)一步分離、純化后，獲得菌株。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的高產(chǎn)聚-β-羥丁酸的巨大芽孢桿菌Bm-IO菌株的篩選方法， 其特征在于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配方包括牛肉膏20g、蛋白胨5g、氯化鈉5g、水1L，pH 7. 2。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高產(chǎn)聚羥丁酸的巨大芽孢桿菌Bm-IO菌株用于 聚-β-羥丁酸的制備。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高產(chǎn)聚羥丁酸的巨大芽孢桿菌Bm-IO菌株用于 聚- β -羥丁酸的制備方法，其特征在于該方法包括以下的步驟①挑取適量菌種接入牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液中，30°C活化培養(yǎng)20 30h；裝入牛肉膏蛋 白胨培養(yǎng)液，取培養(yǎng)的種子培養(yǎng)液，按4 10%的接種量接種后，30°C，200r/min,搖瓶培養(yǎng) 80 120h，可得PHB含量占菌體干重的45% 55%的巨大芽孢桿菌菌體；②將搖瓶所得培養(yǎng)液lOOOOr/min離心5min，收集菌體，無菌水洗滌3次后再用丙酮洗 滌一次，之后加氯仿與酒精的混合液提取PHB，然后40°C干燥后可得到白色沉淀即為PHB。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)醫(yī)學(xué)及生活領(lǐng)域，尤其涉及一種高產(chǎn)聚-β-羥丁酸(PHB)的巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)Bm-10菌株及其用途。高產(chǎn)聚-β-羥丁酸的巨大芽孢桿菌Bm-10菌株，高產(chǎn)聚-β-羥丁酸的巨大芽孢桿菌Bm-10菌株的保藏號為CCTCC NoM209131。本發(fā)明從污泥中篩選獲得高產(chǎn)聚-β-羥丁酸的巨大芽孢桿菌Bm-10菌株，該菌株可用于PHB的微生物制備，解決了現(xiàn)有技術(shù)中利用微生物法生產(chǎn)可降解塑料菌種產(chǎn)量低、成本高等問題。
文檔編號C12N1/20GK101921714SQ20091010227
公開日2010年12月22日 申請日期2009年9月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月10日
發(fā)明者周琴, 蔣冬花 申請人:浙江師范大學(xué)