專利名稱：雙拷貝β-甘露聚糖酶的基因工程菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及雙拷貝e -甘露聚糖酶的基因工程菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
甘露聚糖是植物半纖維素的重要組分，由3 -1, 4-D吡喃甘露糖連接而成的線狀 多糖。甘露聚糖具有高親水性，在單胃動(dòng)物的消化道內(nèi)大量吸水，增加了消化道內(nèi) 容物的粘度，抵抗胃腸的蠕動(dòng)，直接影響動(dòng)物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收。近年來， 隨著豆類產(chǎn)品(豆粕等)在動(dòng)物詞糧中的廣泛應(yīng)用，甘露聚糖的抗?fàn)I養(yǎng)作用也越來 越受到重視。2005年，我國(guó)大豆產(chǎn)量1800萬噸，進(jìn)口量為2300萬噸，其中，80% 以上用于飼料。豆粕中甘露聚糖的含量在2%以上。其降解主要依靠添加e-甘露聚 糖酶。近年來，隨著豆類產(chǎn)品(豆粕等)在詞糧中的廣泛應(yīng)用，甘露聚糖的抗?fàn)I養(yǎng) 問題也越來越受到重視，在飼料中添加酶制劑是解決這一問題的主要途徑。甘露聚 糖的完全酶解需要e-甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、葡糖苷酶、a-半乳糖苷酶 和脫乙酰酶的協(xié)同作用，其中0-甘露聚糖酶在飼料中的應(yīng)用比較廣泛。甘露聚 糖酶是一類能水解甘露聚糖的半纖維素酶類，廣泛存在于動(dòng)植物和微生物中。有報(bào) 道，在大豬飼料中添加e-甘露聚糖酶，可以提高平均日增重10%以上；在肉雞飼料 中添加0-甘露聚糖酶可以提高飼料的轉(zhuǎn)化率4%~6%，提高雞的抗病力，改善肉用雞 的健康狀況。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種雙拷貝3 -甘露聚糖酶的基因工程菌及其應(yīng)用。
本發(fā)明所提供的雙拷貝甘露聚糖酶的基因工程菌，命名為GS115-PIC-MA麗， 是將兩個(gè)拷貝的0 -甘露聚糖酶基因?qū)虢湍妇蝎@得的重組菌。
其中，所述P-甘露聚糖酶基因的核苷酸序列為GenBank DQ464114。所述酵母 菌為畢赤酵母GS115。
巴氏畢赤酵母。ic力fspasfan^) GS115-PIC-MA腿已于2009年04月23日保 藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC，地址北京市 朝陽區(qū)大屯路，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏編號(hào)為CGMCC No.3031。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種生產(chǎn)P -甘露聚糖酶的方法。本發(fā)明所提供的生產(chǎn)0 -甘露聚糖酶的方法，是用所述的重組菌發(fā)酵生產(chǎn)0 -甘 露聚糖酶。
其中，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基可為任何適合酵母生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，如BMGY培養(yǎng)基。 所述發(fā)酵過程中溶解氧飽和度第一次為100%時(shí)，流加25% (質(zhì)量百分含量)甘 油。所述發(fā)酵過程中溶解氧飽和度第二次為100%時(shí)，流加甘油與甲醇的混合物。所 述發(fā)酵過程中溶解氧飽和度為30%以上流加甘油與甲醇混合物；所述發(fā)酵過程中溶 解氧飽和度為30%以下，流加甘油。所述甘油與甲醇的混合物中，甘油與甲醇的的 質(zhì)量比為(6-9) :1。
本發(fā)明的方法生產(chǎn)的e-甘露聚糖酶具有比活性高、酸穩(wěn)定性好、催化pH值范 圍廣等優(yōu)點(diǎn)，適于用作豬、雞等單胃動(dòng)物的添加劑。


圖i為pcr擴(kuò)增e -甘露聚糖酶基因。
圖2為10 L發(fā)酵罐中GS115-PIC-MA麗經(jīng)甲醇誘導(dǎo)不同時(shí)間表達(dá)的e-甘露聚 糖酶SDS-PAGE電泳。
圖3為10 L發(fā)酵罐中菌體濃度和P -甘露聚糖酶活性變化。
具體實(shí)施例方式
下述實(shí)施例中如無特殊說明所用方法均為常規(guī)方法，所用試劑均可從商業(yè)途徑 獲得。
實(shí)施例1、 GS115-PIC-MANM生產(chǎn)P -甘露聚糖酶 一、表達(dá)e-甘露聚糖酶的GS115-PIC-MANM的構(gòu)建 1、硫色曲霉的藥配及其總RNA的提取
將硫色曲霉"wer^777M 5Wp力wre^，保藏號(hào)CGMCC No. 0608)接種到其 生長(zhǎng)培養(yǎng)基(用400mL自來水溶解85g麥麩、10 g豆餅粉、0. 2 g KH2P04、 0. 3 g NaCl 和10g蔗糖，12rC蒸煮30min，過濾取上清，分裝后再高壓滅菌)中，3(TC搖床 培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束后，5000 r/min離心l min收集菌體，置于液^中研磨。取 100 mg研磨后的菌體，置于1. 5 mL離心管中，加入500 |nL RNA抽提緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl， pH8. 0， 1% SDS， 200 ramol/L NaCl， 5 mmol/L EDTA)，再加入500 |iL 酚/仿(l:l)， 4°C、 12000 r/min離心5 min，上清加入等體積4 mol/L LiCl， 4°C 沉淀4h，然后12000 r/min離心15 min，棄上清，將沉淀用70%的乙醇洗兩次， 真空抽干，溶于20 pl DEPC處理的ddH20中，得到目的菌株的總RNA。
42、 甘露聚糖酶基因cDNA片段的克隆
對(duì)GenBank中公布的刺孢曲霉(GenBank登錄號(hào)L35487)和瑞氏木霉(GenBank 登錄號(hào)L25310) e-甘露聚糖酶基因的mRNA序列進(jìn)行分析，分析結(jié)果表明在中間 段有一段高度同源的核苷酸序列，根據(jù)這一高度保守的核苷酸序列設(shè)計(jì)一對(duì)簡(jiǎn)并引 物，引物序列如下
Pl (上游引物)5, -TTCAACGACGTCAACAC-3，；
P2 (下游引物):5， -A(T/C)CCAGCC(G/A)TTGCCCCA-3，
以步驟1提取的硫色曲霉總RNA為模板，用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(Promega)合成 其第一鏈cDNA。再以反轉(zhuǎn)錄合成的第一鏈cDNA為模板，在引物1和引物2的引導(dǎo) 下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，50 PCR反應(yīng)體系為10XPCR緩沖液5 (iL、引物P1和P2各 1 )iL (20 )iM) 、 Taq酶1 fiL (5|V|iL) 、 dNTPs 1 pL (2.5 mM)、模板cDNA 1 jiL、 H20 40|iL; PCR反應(yīng)條件為首先94。C預(yù)變性3min;然后94。C預(yù)變性45 s， 49°C 退火45 s， 72'C延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；最后72。C延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后， 對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收長(zhǎng)度約600bp的目的片段并對(duì) 其進(jìn)行純化，將回收片段克隆到載體pUCm-T (上海生工生物工程有限公司)中，得 到含有回收片段的重組質(zhì)粒，對(duì)其進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明擴(kuò)增片段含有上述高度 保守的核苷酸序列，長(zhǎng)度為608bp。
3、 P-甘露聚糖酶基因cDNA的3' UTR (非翻譯區(qū))的克隆
根據(jù)步驟2獲得的P -甘露聚糖酶基因的部分cDNA序列，設(shè)計(jì)出3， -RACE擴(kuò) 增特弓I物MAN-3-2: 5， -TACCCGTACCAATTCGC-3，。然后以總RNA為模板，用3 ， -Ful 1 RACE試劑盒(TaKaRa公司)擴(kuò)增e-甘露聚糖酶基因cDNA的3'末端片段，反應(yīng)體 系及反應(yīng)條件參照試劑盒說明書。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行1X瓊脂糖凝膠電 泳檢測(cè)，回收并純化長(zhǎng)度約600bp的擴(kuò)增片段，將其克隆到載體pUCm-T，得到含有 回收片段的重組質(zhì)粒，對(duì)其進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明擴(kuò)增的甘露聚糖酶基因 cDNA的3， UTR片段長(zhǎng)度為151bp。
4、 0 -甘露聚糖酶基因cDNA的5， UTR的克隆
根據(jù)步驟2獲得的P -甘露聚糖酶基因的部分cDNA序列，設(shè)計(jì)出5' -RACE擴(kuò) 增特引物Race-1、 Race-2、 Race-3、 Race-4和RT-P，引物序列如下 Race-1: 5' -GTATTTGCGTGGGAGTTGGC-3'; Race-2: 5， -TACCCGTACCAATTCGCCGA-3，；Race-3: 5，-TGCAATCTGCGTATCAGACG-3，； Race-4: 5' -ACGAGACGGATTTCTATACC-3，； RT-P: 5' -CCAACTCCCACGCAA-3'。
然后以硫色曲霉總RNA為模板，用5' -Full RACE試劑盒(TaKaRa公司)擴(kuò)增 P-甘露聚糖酶基因cDNA的5'末端片段，反應(yīng)體系及反應(yīng)條件參照試劑盒說明書。 應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行1X瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收并純化長(zhǎng)度約500bp的 擴(kuò)增片段，將其克隆到載體pUCm-T上，得到含有回收片段的重組質(zhì)粒，對(duì)其進(jìn)行 測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明擴(kuò)增的3-甘露聚糖酶基因cDNA的5'UTR片段長(zhǎng)度為24bp。
5、 P-甘露聚糖酶基因全長(zhǎng)cDNA序列的獲得
根據(jù)步驟3和4獲得的P -甘露聚糖酶基因的5'和3'末端序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物， 引物序列如下
Fl (上游弓l物)5-cggaattcatgaagctctccagctc-3; F2 (下游弓l物)5-cccaagcttttaggcgctatcaatagc-3
以硫色曲霉總RNA為模板，在引物F1和F2的引導(dǎo)下，PCR擴(kuò)增e-甘露聚糖 酶基因的全長(zhǎng)cDNA， 10XPCR buffer 5 (iL、引物(Fl/F2)各1 (20 、 Taq酶1 pL (5ji/nL) 、 dNTPs 1 pL (2.5 mM)、模板cDNA 1 jiL、 H20 40 /iL'總 反應(yīng)體系50 pL，反應(yīng)程序?yàn)?4t:預(yù)變性3 min，然后按以下循環(huán)參數(shù)進(jìn)行擴(kuò)增反 應(yīng)94。C預(yù)變性45 s, 49 °C退火45 s， 72 °。延伸1 min， 35個(gè)循環(huán)，最后72 °C 延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行1X瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收并純化 長(zhǎng)度約1152 bp的擴(kuò)增片段，將其克隆到載體pUCm-T上，得到含有回收片段的重 組質(zhì)粒，用M13+z-引物對(duì)其進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明硫色曲霉e-甘露聚糖酶基因 全長(zhǎng)cDNA具有序列表中SEQ ID Na: 2的核苷酸序列，序列表中的SEQ ID Na: 2 由1327個(gè)堿基組成，編碼序列為自5'端第25-1176位堿基，編碼具有序列表中 SEQIDNq: 1的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，自5'端第1-24位堿基為5'端非翻譯 區(qū)，自5'端第25-87位堿基為信號(hào)肽編碼序列，自5，端第88-1176位堿基為成 熟蛋白編碼序列，自5'端第613-621位堿基編碼典型的甘露聚糖酶保守序列，自 5，端第1177-1327位堿基為3，端非翻譯區(qū)。序列表中的SEQ ID N2: 1由383個(gè) 氨基酸殘基組成，自氨基端(N端)第l-21位氨基酸殘基為信號(hào)肽，自氨基端第 22-383位氨基酸殘基為成熟蛋白，自氨基端第205-207位氨基酸殘基為典型的甘露 聚糖酶保守序列。硫色曲霉e-甘露聚糖酶成熟蛋白的分子量為41 kDa。將克隆的硫色曲霉0 -甘露聚糖酶基因的核苷酸序列及其編碼蛋白的氨基酸序列與GenBank 中的序列進(jìn)行同源性比對(duì)，比對(duì)結(jié)果表明該酶與刺孢曲霉3 -甘露聚糖酶的親緣關(guān) 系最近，核苷酸序列相似性達(dá)71%，氨基酸序列相似性達(dá)72%。
6、 硫色曲霉e-甘露聚糖酶成熟蛋白基因的合成
在不改變氨基酸序列的前提下，僅將硫色曲霉e-甘露聚糖酶基因中編碼成熟 蛋白的密碼子替換為畢赤酵母的偏愛密碼子，從而得到另外一條硫色曲霉0 -甘露 聚糖酶基因的核苷酸序列，即序列表中的SEQ ID Na: 3，序列表中的SEQ ID N2: 3由1327個(gè)堿基組成，編碼序列為自5'端第25-1176位堿基，編碼具有序列表中 SEQIDNq: 1的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，自5'端第1-24位堿基為5'端非翻譯 區(qū)，自5'端第25-87位堿基為信號(hào)肽編碼序列，自5'端第88-1176位堿基為成 熟蛋白編碼序列，自5'端第613-621位堿基編碼典型的甘露聚糖酶保守序列，自 5'端第1177-1327位堿基為3'端非翻譯區(qū)。然后人工合成SEQ ID Na: 3中編碼 硫色曲霉e-甘露聚糖酶成熟蛋白的基因片段(SEQIDNa: 3中自5'端第88-1176 位堿基)，并在5'和3'末端分別添加限制性內(nèi)切fcoW I和JAa I酶切位點(diǎn)。
7、 硫色曲霉e-甘露聚糖酶基因畢赤酵母表達(dá)載體的獲得 用限制性內(nèi)切^bo7 I和J力a I對(duì)步驟1合成的基因進(jìn)行雙酶切后，將其連入
經(jīng)相同酶雙酶切的載體pPICzaA (Invitrogen)中a因子序列的下游，得到硫色 曲霉P-甘露聚糖酶基因的畢赤酵母表達(dá)載體，命名為pPIC-Mann。
8、 表達(dá)P-甘露聚糖酶的GS115-PIC-MA麗的構(gòu)建
根據(jù)硫色曲霉e -甘露聚糖酶基因的核苷酸序列設(shè)計(jì)引物
mann-opt-F(5， -CCGGAATTCTTGCCAAAGGCTTC-3，,下劃線為EcoRI酶切位點(diǎn))和 mann-opt-Rn: (5， -ATAAGAATGCGGCCGCTTAAGCAGAATCAATAGCAG-3，，下劃線為Not I 酶切位點(diǎn))，以pPIC-manM為模板，按以下條件進(jìn)行PCR反應(yīng)95°C 5 min， 35 個(gè)循環(huán)(94°C 30 s， 55°C 30 s， 72°C 1 min)，最后72。C延伸10 min。反應(yīng)結(jié) 束后，取PCR產(chǎn)物(5 uL)進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(圖l)。 圖1中M:分子量標(biāo)準(zhǔn)；l和2: PCR擴(kuò)增產(chǎn)物?；厥誔CR產(chǎn)物，用EcoRI/NotI雙 酶切，純化后與同樣雙酶切的表達(dá)載體pPIC9k連接，連接產(chǎn)物化學(xué)法轉(zhuǎn)化大腸桿 菌Topl0感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)過卡那霉素篩選獲得重組表達(dá)載體pPIC9k-mann。
挑取酵母單菌落，接種至含有5mLYPD培養(yǎng)基試管中，28-30°C， 250-300 rpm 培養(yǎng)過夜。取50 PL的培養(yǎng)物接種至含有50 mL新鮮培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，
728-30°C， 250-300 rpm培養(yǎng)過夜，至0D600值達(dá)到1. 3-1. 5。將細(xì)胞培養(yǎng)物于4。C， 1500 g離心5 min，用500 mL冰預(yù)冷的滅菌水將菌體沉淀重懸。4°C， 1500 g離心 5 min，用250 mL冰預(yù)冷的滅菌水將菌體沉淀重懸。4°C， 1500 g離心5 min，用 20 mL冰預(yù)冷的l mol/L的山梨醇溶液將菌體沉淀重懸。4°C， 1500 g離心5 min， 用1 raL冰預(yù)冷的1 mol/L的山梨醇溶液將菌體沉淀重懸，其終體積約為1. 5 mL。
將10 Pg用Sacl線性化的pPIC9K-mann溶解在5-10叱滅菌雙蒸水中，與80 PL 的畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞混勻，轉(zhuǎn)至0.2 cm冰預(yù)冷的電轉(zhuǎn)化杯中，將電轉(zhuǎn)化 杯冰浴5 min后進(jìn)行電擊，電擊條件為2.0kV、 5ms。電擊完畢后，加入1 mL冰 預(yù)冷的l mol/L的山梨醇溶液將菌體混勻，轉(zhuǎn)至50 mL離心管中，28。C溫育2 h。 將菌體懸液涂布于MDS (0.67 g/100ml YNB， 1 g/100ml葡萄糖，1 mol/L山梨醇， 2 g/100ml瓊脂)平板上，每100-200叱涂布一塊平板，于3(TC培養(yǎng)2-3d，直至 長(zhǎng)出清晰的菌落，獲得的菌株命名為GS115/PICmann。
將10 Pg的線性化pPIC-manM溶解在5-10 ML滅菌雙蒸水中，與80化的 GS115/PIQnann感受態(tài)細(xì)胞混勻，轉(zhuǎn)至0. 2 cm冰預(yù)冷的電轉(zhuǎn)化杯中，將電轉(zhuǎn)化杯冰 浴5 min后進(jìn)行電擊。電擊完畢后，加入l mL冰預(yù)冷的l mol/L的山梨醇溶液將 菌體混勻，轉(zhuǎn)至50 mL離心管中，28'C溫育2 h。將菌體懸液涂布于YPDS平板上 (lg/100ml酵母提取物，2g/100ml蛋白胨，2g/100ml葡萄糖，1 mol/L山梨醇, 2g/100ml瓊脂、100 Pg/mL Zeocin)，每100-200叱涂布一塊平板，于30。C培養(yǎng) 2-3 d,直至長(zhǎng)出清晰的菌落，獲得的菌株命名為GS115-PIC-MANM。
GS115-PIC-MANM已于2009年04月23日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員 會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC，地址北京市朝陽區(qū)大屯路，中國(guó)科學(xué)院微生物 研究所，郵編100101)，保藏編號(hào)為CGMCC No. 3031。
二、 10升發(fā)酵罐發(fā)酵生產(chǎn)e-甘露聚糖酶
配制3LBMGY培養(yǎng)基(lg/100ml酵母提取物，2g/100ml蛋白胨，1. 34g/100ml YNB， 4X10—5g/100mlbiotin， lml/100ml甘油，100 mM p朋.0磷酸鹽緩沖液)，在 10 L自動(dòng)控制發(fā)酵罐中滅菌后，冷卻至28. 5°C。按10ml/100ml接種量將種子液(種 子液挑取GS115-PIC-MANM CGMCC No. 3031單克隆接入BMGY培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng))加 入到裝3L發(fā)酵培養(yǎng)基BMGY的10L發(fā)酵罐中，進(jìn)行階段培養(yǎng)，用氨水和磷酸調(diào)pH 至5.0，通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速和空氣流量控制溶氧大于30%，發(fā)酵溫度為28.(TC。當(dāng)接入 種子液24 h后，甘油消耗完全(溶氧標(biāo)記為100%)，進(jìn)入流加25% (質(zhì)量百分含量)甘油階段，流速為60 mL/h。流加4-6 h后，將甘油消耗完全后(溶氧標(biāo)記為 100%)，待濕菌重達(dá)到200 g/L時(shí)加入甲醇，開始誘導(dǎo)。進(jìn)入甘油與甲醇混合流加 階段，混合比例為9:1，流速為12 mL/h。通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速、空氣流量和甲醇速度控 制溶氧為30%以上，如不能保持在30%以上則停止甲醇添加，直至溶氧回升。12 h 后，將甘油與甲醇比例調(diào)至8:1。再過12h，比例調(diào)至6:1，并保持到最后，控制 溶氧為30%以上。在不同時(shí)間取樣測(cè)定菌體量、酶活和蛋白含量，并對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn) 行12% SDS-PAGE電泳分析。甘露聚糖酶酶活的測(cè)定方法采用DNS法，在pH2. 4 和5(TC條件下，每分鐘從底物半乳甘露聚糖(Sigma公司，貨號(hào)G0753)中水解 產(chǎn)生l Wnol/L的甘露糖的所需的酶量定義為1個(gè)酶活單位，用U表示。蛋白質(zhì)定 量采用BCA蛋白分析試劑盒(美國(guó)Pierce公司)進(jìn)行。
12%SDS-PAGE電泳分析結(jié)果如圖2所示，圖2中M:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；卜8: 重組菌株誘導(dǎo)0 h、 12 h、 24 h、 36 h、 48 h、 60 h、 72 h、 78 h和84 h的表達(dá) 產(chǎn)物。
10 L發(fā)酵罐中GS115-PIC-MA醒CGMCC No. 3031菌體濃度和P -甘露聚糖酶活 性變化如圖3所示，圖3中，a:甘油培養(yǎng)階段；b:甘油補(bǔ)料培養(yǎng)階段；C:甘油 和甲醇混合誘導(dǎo)階段；(■):濕菌重；(▲) : 0-甘露聚糖酶活力，表明重組 菌GS115-PIC-MA醒CGMCC No. 3031 10升發(fā)酵罐的發(fā)酵活力最高可達(dá)到2300 U/mL， 蛋白表達(dá)量達(dá)到6 mg/mL，適合用于動(dòng)物飼料添加劑使用。序列表
<110> 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)
<i2o>雙拷貝e -甘露聚糖酶的基因工程菌及其應(yīng)用
<160> 3
<210> 1
<211> 383
〈212〉 PRT
〈213〉 硫色曲霉(Aspergillus Sulphureus)
<400> 1
Met Lys Leu Ser Ser Ser Leu Leu Thr Leu Ala Ser Leu Ala Leu Ala
15 10 15
Asn Leu Ser Thr Ala Leu Pro Lys Ala Ser Pro Ala Pro Ser Thr Ser
20 25 30
Ser Ser Ser Ala Ser Thr Ser Phe Ala Ser Thr Ser Gly Leu Gin Phe
35 40 45
Thr lie Asp Gly Glu Thr Gly Tyr Phe Ala Gly Thr Asn Ser Tyr Trp
50 55 60
lie Gly Phe Leu Thr Asp Asp Ser Asp Val Asp Leu Val Met Ser His 65 70 75 80
Leu Lys Ser Ser Gly Leu Lys lie Leu Arg Val Trp Gly Phe Asn Asp
85 90 95
Val Thr Thr Gin Pro Ser Ser Gly Thr Val Trp Tyr Gin Leu His Gin
100 105 110
Asp Gly Lys Ser Thr lie Asn Thr Gly Ala Asp Gly Leu Gin Arg Leu115
Val Val Ser Ser
Asp Tyr 130
Asn Phe Val Asn Tyr 145
Ser Ala Tyr Gly Gly 165 Tyr
Trp 150
Ser
Ala 135 Thr
120
Glu Gin His Gly
125
Lys Leu lie lie
Met Gin Ser Ala 180
Ser Ala Val Phe
Asp Tyr Gly Asp Glu Thr Gin Thr Tyr
lie 140
Met Ser Ala Tyr
Gly 155
Phe Tyr Thr Ser
Asp 170
Lys Thr Val Val
Ser Asn Ser 195 Ser
Cys
Cys Pro 210 Ser Lys 225
Asp Glu Gly Phe
Asp
Phe lie Lys
Ala 200 Val
lie 185
Trp Glu Leu Ala
Glu 190 Glu
Asp 175 Arg
Pro
Leu
Thr Thr 215
Gly Leu Asp Ala 230
Leu Asn Thr Asp
Tyr Asp
Gly 245
Gly Leu Asn Phe
Asp
His 235 Asp
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Val
Cys
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Gin
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〈210> 2
<211> 1327
<212> 腿
<213〉 硫色曲霉(Aspergillus Sulphureus)
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〈213> 硫色曲霉(A印ergillus Sulphureus)
〈400〉 3
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1、重組菌，是將兩個(gè)拷貝的β-甘露聚糖酶基因?qū)虢湍妇蝎@得的重組菌。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組菌，其特征在于所述P-甘露聚糖酶基因的核苷 酸序列為GenBank DQ464114。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的重組菌，其特征在于:所述酵母菌為畢赤酵母GS115。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組菌，其特征在于所述重組菌的保藏編號(hào)為CGMCC No. 3031。
5、 一種生產(chǎn)e-甘露聚糖酶的方法，是用權(quán)利要求1至4中任一所述的重組菌發(fā)酵生產(chǎn)e-甘露聚糖酶。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基為BMGY培養(yǎng)基。
7、 根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵過程中溶解氧飽和 度第一次為100%時(shí)，流加甘油；所述發(fā)酵過程中溶解氧飽和度第二次為100%時(shí)，流 加甘油與甲醇的混合物。
8、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述甘油為質(zhì)量百分含量25%的甘 油；所述甘油流加速度為6ml/h L;所述甘油與甲醇的混合物的流加速度為1. 2ml/ h * L。
9、 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵過程中溶解氧飽和度為 30%以上流加甘油與甲醇混合物；所述發(fā)酵過程中溶解氧飽和度為30%以下，流加甘油。
10、 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述甘油與甲醇的混合物中，甘 油與甲醇的的質(zhì)量比為(6-9) :1。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種雙拷貝β-甘露聚糖酶的基因工程菌及其應(yīng)用。該基因工程菌是將兩個(gè)拷貝的β-甘露聚糖酶基因?qū)虢湍妇蝎@得的重組菌。本發(fā)明還公開了生產(chǎn)β-甘露聚糖酶的方法，是用所述的重組菌發(fā)酵生產(chǎn)β-甘露聚糖酶。本發(fā)明的方法生產(chǎn)的β-甘露聚糖酶具有比活性高、酸穩(wěn)定性好、催化pH值范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，適于用作豬、雞等單胃動(dòng)物的添加劑。
文檔編號(hào)C12N1/19GK101560476SQ20091008328
公開日2009年10月21日 申請(qǐng)日期2009年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月30日
發(fā)明者曹云鶴, 李一航, 李德發(fā), 王春林, 陸文清 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)