專利名稱：一種中溫耐堿性甘露聚糖酶Man5XH9及其基因和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因工程領域，具體地，本發(fā)明涉及一種中溫耐堿性甘露聚糖酶 Man5XH9及其基因和應用。
背景技術：
植物細胞壁多糖主要是由纖維素，半纖維素以及木質素這三大主要類多糖組成， 其中，半纖維素為不能被水或是螯合試劑所溶解，但能被堿性物質所水解的植物細胞壁多糖(Saha BC(2003)Hemicellulose bioconversion.J Ind Microbiol Biotechnolz30 279-291.)。半纖維素主要包括甘露聚糖、木聚糖、阿拉伯半乳聚糖、葡聚糖等多種多糖， 甘露聚糖也是一種重要的混合多糖型半纖維素，由半乳甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖組成 (Moreira LRiFilho EX(2008)An overview of mannan structure and mannan-degrading enzyme systems. Appl Microbiol Biotechnol 79:165-178·)。甘露聚糖的降解首先由甘露聚糖酶降解其主鏈生成寡糖，然后由甘露糖苷酶將其降解成甘露糖，其側鏈則由α-半乳糖苷酶來降解。目前報道的甘露聚糖酶主要來源于 GH 5 和 GH 26 家族(http //afmb. cnrs-mrs. fr/CAZY/)，在 GH 113 家族中也發(fā)現(xiàn)有甘露聚糖酶，并且它們采用的都是雙取代機制(Henrissat B, Bairoch A(1993)New families in the classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities. Biochem J 293:781-788.)。GH 5家族的酶包括內(nèi)切葡聚糖酶和甘露聚糖酶，形成典型的(β/α)8桶狀結構，并主要來源于細菌和真菌，如Bacillus circulans, Clostridium cellulolytic, Trichoderma reesei, Aspergillus aculeatus 禾口 Agaricus bisporus(Dhawan S, Kaur J (2007)Microbial mannanases :an overview of production and applications. Crit Rev Biotechnol 27:197-216·)。在飼料工業(yè)中，酸性甘露聚糖酶是一種飼料添加劑，其功能可減輕環(huán)境污染， 消除抗營養(yǎng)因子的作用，提高飼料利用率。在造紙工業(yè)中，耐堿甘露聚糖酶可運用于 氏菜的漂白工藝(Montiel MD, Rodriguez J, Perez-Leblic MI, Hernandez Μ, Arias ME, Copa- Patino JL(1999)Screening of mannanases in actinomycetes and their potential application in the biobleaching of pine kraft pulps. Appl Microbiol Biotechnol52 =240-245.)。在紡織工業(yè)中，甘露聚糖酶被用于降解天然纖維中的半纖維素成分，能有效地去除紡織印染產(chǎn)品上殘余的染料，利用酶法取代常規(guī)的化學處理工藝，降低了工業(yè)能耗和對環(huán)境的污染。在食品工業(yè)中，甘露聚糖酶可用于降解植物膠，生產(chǎn)功能性低聚甘露糖，可用于食品的加工、貯藏以及果汁澄清(趙月菊，薛燕芬，馬延和(2009) β-甘露聚糖酶的結構生物學研究現(xiàn)狀和展望.微生物學報，49(9) =1131-1137.)。β-甘露聚糖酶作為一種新型的工業(yè)酶，具有很大的潛在應用價值，在工業(yè)中有著廣闊的應用前景。國內(nèi)外早期的研究主要集中在產(chǎn)酶菌株的篩選和發(fā)酵條件的優(yōu)化、酶的分離純化和性質的研究等方面。近幾年，研究發(fā)現(xiàn)天然來源的甘露聚糖酶往往難以同時滿足工業(yè)實際需求，不能直接應用于生產(chǎn)實踐中，因此天然酶的異源表達成為獲得工業(yè)用酶一種有效途徑。另外，已報到的甘露聚糖酶多數(shù)在酸性PH條件下穩(wěn)定，而在超過pH 8.0后幾乎喪失其活力，其不能適應造紙、紡織工業(yè)中的堿性反應條件，因此，造紙、紡織工業(yè)需要耐堿的甘露聚糖酶。本發(fā)明中來源于青霉屬Penicillium sp. XH9的甘露聚糖酶Man5XH9 具有以下性質最適pH 4. 5，并在pH4. 0 7. 0范圍內(nèi)具有75%以上的酶活力，具有很好的 PH穩(wěn)定性，37°C下作用Ih后，在pH 4.0 10.0之間，剩余酶活性均在60%以上，并且在pH 12. 0仍具有40%以上的酶活力；最適溫度60°C，在20°C都保持30%以上的酶活力，其低溫和中溫條件以及PH中性范圍內(nèi)具有較高酶活力，優(yōu)良的pH穩(wěn)定性等特性使其在造紙、紡織工業(yè)應用上具有很大的潛力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種中溫耐堿性甘露聚糖酶Man5XH9。本發(fā)明的再一目的是提供編碼上述中溫耐堿性甘露聚糖酶的基因Man5XH9。本發(fā)明的另一目的是提供包含上述中溫耐堿性甘露聚糖酶基因的重組載體。本發(fā)明的另一目的是提供包含上述中溫耐堿性甘露聚糖酶基因的重組菌株。本發(fā)明的另一目的是提供一種制備上述中溫耐堿性甘露聚糖酶方法。本發(fā)明的另一目的提供上述中溫耐堿性甘露聚糖酶的應用。本發(fā)明分離篩選出一種生產(chǎn)上述中溫耐堿性甘露聚糖酶Man5XH9的青霉 XH9 (Penicillium sp.)，于2011年10月21日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，100101)，其保藏號為CGMCC No. 5369。本發(fā)明提供了一種中溫耐堿性甘露聚糖酶Man5XH9，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1 所示MRSLSSLAIL SAVEAASAQL APSSSSASSS LALTSSAAGS TFSTAVSSTRQPTSTVSPSS60SAVSSTPLGN ARPSGSSSFA KVDGRKFNID GVAKYFAGTN AYffLPFQTNNADVDSIFKNL 120KESGLKVLRV WGFNDVNTVP AAGTVYFQLH DKATGTTTIN TGADGPKRLDYVVSAAEKNG180IKLIIPIVNS WDDYGGMDAY VNAYGGSKTE WYTNTKIQSV YQAYIKAVVS麗TSSAVFA240WELANEPRCS GCNTDIIAKff VAKTSAYIKS LDSNHMVTTG EEGMGLTVGSDGSYPYTTTE300GNDFAKNLAA PDIDFGVYHL YVADffGIKDN SffGNGffIETHAKICDAAGKP CVFEEYGIKN 360DHCSASLKffQ KTALATNAGD LIffQYGQKLS SGPSPNDDYTVYYGTDDffKC AV⑶HVSQI 419其中，該酶基因編碼419個氨基酸，N端18個氨基酸為其預測的信號肽序列 “MRSLSSLAILSAVEAASA“ (SEQ ID NO. 3)。因此，成熟的中溫耐堿性甘露聚糖酶Man5XH9的理論分子量為43. OkDa,其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示QLAPSSSSAS SSLALTSSAA GSTFSTAVSS TRQPTSTVSP SSSAVSSTPLGNARPSGSSS60FAKVDGRKFN IDGVAKYFAG TNAYffLPFQT NNADVDSIFK NLKESGLKVLRVffGFNDVNT120VPAAGTVYFQ LHDKATGTTT INTGADGPKR LDYVVSAAEK NGIKLIIPIVNSffDDYGGMD180AYVNAYGGSK TEffYTNTKIQ SVYQAYIKAV VSRYKTSSAV FAffELANEPRCSGCNTDIIA240KffVAKTSAYI KSLDSNHMVT TGEEGMGLTV GSDGSYPYTT TEGNDFAKNLAAPDIDFGVY300HLYVADffGIK DNSffGNGffIE THAKICDAAG KPCVFEEYGI KNDHCSASLKWQKTALATNA360GDLIffQYGQK LSSGPSPNDD YTVYYGTDDff KCAV⑶HVSQI401本發(fā)明的甘露聚糖酶Man5XH9同時具有好的pH穩(wěn)定性而低溫和中溫范圍內(nèi)均具有高活性等特性。本發(fā)明篩選到Penicillium sp. XH9所產(chǎn)生的甘露聚糖酶，其最適pH值為4. 5，在pH4. O 6. O的范圍內(nèi)維持90%以上的酶活性；最適溫度為60°C，在20°C仍具有 30%左右的酶活力。本發(fā)明提供了編碼上述中溫耐堿性甘露聚糖酶基因Man5XH9。具體地，該基因的基因組序列如SEQ ID NO. 4所示atgcgttcct tgtcttccct tgctattcta tctgcggtag aagcagcttc cgcgcaactt60gccccttcaa gtagctcggc ttcgtctagc ttggctttaa ctagctcggc cgcgggatca120actttctcga ctgctgtttc ttcaaccaga cagcctacat ctaccgtgtc tccatcttcg180tctgcagttt cgtccacccc actgggcaat gctcgcccct ctggcagcag ctcttttgct240aaggtggatg gtcgcaagtt caacattgac ggcgtggcta agtacttcgc tggaacgaac300gcgtactggc taccattcca gaccaacaat gcggatgttg actccatctt caaaaacctg360aaggagtccg gtcttaaagt tctccgagtt tggggtttca acgatgtgaa caccgtcccg420gcggctggca ctgtctactt ccagctccat gacaaggcca ccggtactac taccatcaac480actggtgctg atggtccgaa gcgtcttgat tacgttgtct ctgctgccga gaagaacggc540atcaagctta tcattcccat tgtgaattcc tgggatgatt acggtggtat ggatgcctac600gtcaatgcct atggtggcag caagaccgaa tggtacacca acacgaagat ccagagcgtg660taccaggcgt atatcaaggc tgtcgtctct cgctacaaga cttcctctgc tgtctttgcg720tgggagttgg ctaatgagcc tcgctgctct ggctgcaaca ccgacatcat cgccaaatgg780gtagccaaga catctgccta catcaagtcc ctcgattcta accacatggt tactaccggt840gaagagggca tgggcctaac tgtcggatcg gatggctctt acccttacac taccaccgaa900ggcaacgact tcgccaagaa ccttgcggcc cctgatattg actttggagt gtaccacctc960tacgtcgccg actggggtat caaggataac tcctggggca atgggtggat cgagacccat 1020 gccaagatct gcgacgctgc tggaaagcct tgcgtgttcg aggagtatgg catcaagaac 1080
gaccactgct ccgcctcgct gaagtggcag aagaccgccc tggctaccaa cgctggtgat 1140ctcatctggc aatatggcca gaagctgtcc tccggtccct ctcccaatga cgactacacc 1200gtctactatg gcactgacga ctggaagtgc gctgtcggtg accatgtcag ccagatttaa 1260本發(fā)明通過RT-PCR的方法分離克隆了甘露聚糖酶基因Man5XH9，cDNA全序列分析結果表明，甘露聚糖酶Man5XH9基因Man5XH9全長1260bp。其中，信號肽的堿基序列為 atgcgttcct tgtcttccct tgctattcta tctgcggtag aagcagcttc cgcg (SEQ ID NO· 6)0因此，成熟的甘露聚糖酶Man5XH9的基因序列如SEQ ID NO. 5 所示
caacttgccccttcaagtagctcggcttcgtctagcttggctttaactagctcggccgcg60
ggatcaactttctcgactgctgtttcttcaaccagacagcctacatctaccgtgtctcca120
tcttcgtctgcagtttcgtccaccccactgggcaatgctcgcccctctggcagcagctct180
tttgctaaggtggatggtcgcaagttcaacattgacggcgtggctaagtacttcgctgga240
acgaacgcgtactggctaccattccagaccaacaatgcggatgttgactccatcttcaaa300
aacctgaaggagtccggtcttaaagttctccgagtttggggtttcaacgatgtgaacacc360
gtcccggcggctggcactgtctacttccagctccatgacaaggccaccggtactactacc420
atcaacactggtgctgatggtccgaagcgtcttgattacgttgtctctgctgccgagaag480
aacggcatcaagcttatcattcccattgtgaattcctgggatgattacggtggtatggat540
gcctacgtcaatgcctatggtggcagcaagaccgaatggt3.C3.CC3.3.C3.Cgaagatccag600
agcgtgtaccaggcgtatatcaaggctgtcgtctctcgctacaagacttcctctgctgtc660
tttgcgtgggagttggctaatgagcctcgctgctctggctgcaacaccgacatcatcgcc720
aaatgggtagccaagacatctgcctacatcaagtccctcgattctaaccacatggttact780
accggtgaagagggcatgggcctaactgtcggatcggatggctcttacccttacactacc840
accgaaggcaacgacttcgccaagaaccttgcggcccctgatattgactttggagtgtac900
cacctctacgtcgccgactggggtatcaaggataactcctggggcaatgggtggatcgag960
acccatgccaagatctgcgacgctgctggaaagccttgcgtgttcgaggagtatggcatc1020
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ggtgatctcatctggcaatatggccagaagctgtcctccggtccctctcccaatgacgac1140
tacaccgtctactatggcactgacgactggaagtgcgctgtcggtgaccatgtcagccag1200
1206成熟蛋白理論分子量為43. OkDa,將甘露聚糖酶基因Man5XH9序列及推導出的氨基酸序列在GenBank中進行BLAST比對，該基因與性質驗證的來源于Aspergillus fumigatus的甘露聚糖酶氨基酸序列一致性為76%。說明Man5XH9是一種新的甘露聚糖酶。本發(fā)明還提供了包含上述中溫耐堿性甘露聚糖酶基因Man5XH9的重組載體，優(yōu)選為pPIC-Man5XH9。將本發(fā)明的甘露聚糖酶基因插入到表達載體合適的限制性酶切位點之間，使其核苷酸序列可操作的與表達調(diào)控序列相連接。作為本發(fā)明的一個最優(yōu)選的實施方案，優(yōu)選為將本發(fā)明的甘露聚糖酶基因插入到質粒PPIC9上的SpeI和NotI限制性酶切位點之間，使該核苷酸序列位于AOXl啟動子的下游并受其調(diào)控，得到重組酵母表達質粒 pPIC9-Man5XH9。本發(fā)明還提供了包含上述中溫耐堿甘露聚糖酶基因Man5XH9的重組菌株，所述菌株為大腸桿菌、酵母菌、芽孢桿菌或乳酸桿菌，優(yōu)選為重組畢赤酵母菌株GS115/Man5XH9。
本發(fā)明還提供了一種制備上述中溫耐堿性甘露聚糖酶Man5XH9的方法，包括以下步驟 1)用上述的重組載體轉化宿主細胞，得重組菌株；2)培養(yǎng)重組菌株，誘導重組甘露聚糖酶Man5XH9表達；以及3)回收并純化所表達的甘露聚糖酶Man5XH9。其中，所述宿主細胞為畢赤酵母細胞、啤酒酵母細胞或多型遜酵母細胞，優(yōu)選將重組酵母表達質粒轉化畢赤酵母細胞(Pichia past0ris)GS115，得到重組菌株GS115/ Man5XH9。本發(fā)明還提供了上述中溫耐堿甘露聚糖酶Man5XH9的應用，優(yōu)選其在水解甘露聚糖酶及在造紙、紡織工業(yè)中的應用。本發(fā)明首先所要解決的技術問題是克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種性質優(yōu)良的、 適合于在造紙、紡織工業(yè)中應用新的甘露聚糖酶。本發(fā)明的甘露聚糖酶最適PH為4. 5，在 PH 4.0 7.0都有較高的酶活性；pH穩(wěn)定性好。此外，Man5XH9可有效降解半乳甘露聚糖與葡萄甘露聚糖，而不降解木聚糖與微晶纖維素鈉，可以有效降解漂白紙漿中的甘露聚糖部分而不影響纖維素。因此，本甘露聚糖酶在工業(yè)中的應用顯示出其巨大的潛力。


圖1重組甘露聚糖酶的最適pH。圖2重組甘露聚糖酶的pH穩(wěn)定性。圖3重組甘露聚糖酶的最適溫度。圖4重組甘露聚糖酶的熱穩(wěn)定性。青霉XH9 (Penicillium sp.)，于2011年10月21日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所， 100101)，其保藏號為CGMCC No. 5369。
具體實施例方式試驗材料和試劑1、菌株及載體青霉Penicillium sp. XH9由發(fā)明人分離獲得，畢赤酵母表達載體 pPIC9及菌株GS115購自于Invitrogen公司。2、酶類及其它生化試劑內(nèi)切酶購自TaKaRa公司，連接酶購自Invitrogen公司。 底物購自Sigma公司，其它都為國產(chǎn)試劑(均可從普通生化試劑公司購買得到)。3、培養(yǎng)基(I)Penicillium sp. XH9 CGMCC5369培養(yǎng)基為馬鈴薯汁培養(yǎng)基IOOOmL馬鈴薯汁， IOg葡萄糖，25g瓊脂，pH3. 0。(2)大腸桿菌培養(yǎng)基LB (1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、NaCl，pH7.0)。(3) BMGY 培養(yǎng)基1 % 酵母提取物，2 % 蛋白胨，1. 34 % YNB，0. 00004 % Biotin, 1 % 甘油(V/V)。(4) BMMY培養(yǎng)基除以0. 5 %甲醇代替甘油，其余成份均與BMGY相同，pH4. 0。說明以下實施例中未作具體說明的分子生物學實驗方法，均參照《分子克隆實驗指南》(第三版)J-薩姆布魯克一書中所列的具體方法進行，或者按照試劑盒和產(chǎn)品說明書進行。實施例1青霉Penicillium sp. XH9分離及產(chǎn)酶特性青霉Penicillium sp. XH9分離自發(fā)酵棉粕中，pH5. 0。分離培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，PH3.0，通過多次稀釋涂板獲得單菌。在PDA培養(yǎng)基14天菌落灰綠色，直徑2.0 3. Ocm0營養(yǎng)菌絲體無色。菌絲有橫隔，分生孢子梗亦有橫隔，光滑或粗糙?；繜o足細胞， 頂端不形成膨大的頂囊，其分生孢子梗經(jīng)過多次分枝，產(chǎn)生幾輪對稱或不對稱的小梗，形如掃帚，稱為帚狀體。分生孢子球形、橢圓形或短柱形，光滑或粗糙，大部分生長時呈藍綠色。 該菌為Penicillium屬，命名為XH9 (Penicillium sp.)。該菌株于2011年10月21日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號， 中國科學院微生物研究所，100101)，其保藏號為CGMCC No. 5369。將青霉Penicillium sp. XH9 接種于產(chǎn)酶培養(yǎng)基((NH4)2S04 5g/L，KH2PO4lg/L， MgSO4 · 7H20 0. 5g/L, FeSO4 · 7H20 0. Olg/L, CaCl2 0. 2g/L，角豆膠 0. 5%,pH6. 0)，30°C培養(yǎng) 3 6d，觀察其是否產(chǎn)甘露聚糖酶。誘導6天后，測定到培養(yǎng)基上清具有甘露聚糖酶酶活， 達到 1. OU/ml.實施例2青霉Penicillium sp. XH9甘露聚糖酶編碼基因Man5XH9的克隆提取青霉Penicillium sp. XH9 基因組 DNA 將液體培養(yǎng)3天的菌絲體用離心后取入研缽中，加入2mLCTAB提取液，液氮凍制研磨5min，然后將研磨液置于50mL離心管中，70°C水浴鍋裂解20min，每隔IOmin混勻一次， 在4°C下IOOOOrpm離心5min。取上清于酚/氯仿中抽提除去雜蛋白，再取上清加入等體積異丙醇，于室溫靜置5min后，4°C下IOOOOrpm離心lOmin。棄上清，沉淀用70%的乙醇洗滌兩次，真空干燥，加入適量TE溶解，置于-20°C備用。根據(jù)第五家族甘露聚糖酶基因的保守(NWSDYGG和AWELGNE)序列設計合成了簡并引物Pl，P2 Pl 5' -AAYTGGGAYGAYTWYGGNGG-3‘；P2 5' -TCRYYNSCNARYTCCCANGC-3‘。以Penicillium sp. XH9總DNA為模板進行PCR擴增。PCR反應參數(shù)為94°C變性 5min ；然后94°C變性30sec，50°C降落45°C (每個循環(huán)降落0· 5°C )退火30sec，72°C延伸 30s，接著94°C變性30s，45°C退火30s, 72°C延伸30s, 30個循環(huán)，72°C保溫7min。得到一約 170bp片段，將該片段回收后與PEASY-T3載體相連送三博生物技術有限公司測序。根據(jù)測序得到的核苷酸序列，設計上游和下游各二條TAIL-PCR特異性引物設計方向為需要擴增的未知區(qū)域方向，第二條引物的位置設計在第一條引物的內(nèi)側。每兩個引物之間的距離為80bp左右，引物長度一般22 30nt，退火溫度在60°C。并將它們分別命名為uspl, usp2 (上游特異性引物)，dspl, dsp2 (下游特異性引物)見表1。表1.甘露聚糖酶Man5XH9 TAIL-PCR特異性引物引物名稱引物序列(5’一3’)引物長度(bp)
usplCAGCAGAGGAAGTCTTGTAGCGAGAGAC28usp2GCTGCCACCATAGGCATTGACGTAGG26dsplCCTACGTCAATGCCTATGGTGGCAGC26dsp2GTCTCTCGCTACAAGACTTCCTCTGCTG28通過反向TAIL-PCR得到已知基因序列的側翼序列，擴增得到產(chǎn)物回收后送三博生物技術有限公司測序。拼接后再通過RT-PCR方法獲得Man5XH9甘露聚糖酶基因全長1260bp(SEQ ID NO. 2)，編碼419個氨基酸(SEQ ID NO. 4)和一個終止密碼子。用 SignalP (http://www. cbs. dtu. dk/services/SignalP)進行分析表明 N端 18 個氨基酸為預測的信號肽(SEQ ID NO. 3)。預測該基因所編碼的成熟蛋白的理論分子量為43. OkDa。實施例3重組甘露聚糖酶的制備將表達載體pPIC9進行雙酶切(Spe I+Not I)，同時將擴增到編碼甘露聚糖酶的基因Man5XH9(不含信號肽)雙酶切(Spe I+Not I)，切出編碼甘露聚糖酶的基因片段與表達載體PPIC9連接，獲得含有Penicillium sp. XH9 CGMCC5369甘露聚糖酶基因Man5XH9的重組質粒pPIC-Man5XH9并轉化畢赤酵母GSl 15，獲得重組畢赤酵母菌株GS115/Man5XH9 ； 同樣，將包含有信號肽序列的甘露聚糖酶Man5XH9的cDNA通過酶切、連接方法插入已去除α-因子信號肽序列的表達載體pPIC9中，獲得含信號肽序列的編碼甘露聚糖酶的基因Man5XH9的重組質粒pPIC-Man5XH9-l并轉化畢赤酵母GSl 15，獲得重組畢赤酵母菌株 GS115/Man5XH9-l。分別取含有兩種重組質粒的GS115菌株，分別接種于300mL BMGY培養(yǎng)液中， 300C 250rpm振蕩培養(yǎng)48h后，離心收集菌體。然后于IOOmL BMMY培養(yǎng)基重懸，30°C 250rpm 振蕩培養(yǎng)。誘導72h后，離心收集上清。測定甘露聚糖酶的活力。重組菌株GS115/Man5XH9 的重組甘露聚糖酶的表達量為43. 5U/mL，相比之下，重組菌株GS115/Man5XH9-l的重組甘露聚糖酶的表達量低于前者。SDS-PAGE結果表明，重組甘露聚糖酶在畢赤酵母中得到了表達。重組甘露聚糖酶的比活為47.5U/mg。實施例4重組甘露聚糖酶的活性分析純化重組菌株GS115/MAn5XH9和GS115/Man5XH9_ 1所產(chǎn)重組甘露聚糖酶，使用DNS 法進行活性分析。DNS法具體方法如下在pH4. 5，60°C條件下，ImL的反應體系包括100 μ L適當?shù)南♂屆敢海?00 μ L底物，反應lOmin，加入1. 5mLDNS終止反應，沸水煮5min。冷卻后540nm 測定OD值。1個酶活單位(U)定義為在給定的條件下每分鐘釋放出Iymol還原糖的酶量。實施例5重組甘露聚糖酶Man5XH9的性質測定1、重組甘露聚糖酶Man5XH9的最適pH和pH穩(wěn)定性的測定方法如下將實施例4純化的重組甘露聚糖酶在不同的pH下進行酶促反應以測定其最適pH。 底物角豆膠用不同PH的0. lmol/L檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液中37°C下進行甘露聚糖酶活力測定。結果(圖1)表明，重組酶Man5XH9的最適pH為4. 5，在pH 4.0 7.0有75%以上的相對酶活性。甘露聚糖酶于上述各種不同PH的緩沖液中37°C處理60min，再在pH 4.5緩沖液體系中60°C下測定酶活性，以研究酶的pH穩(wěn)定性。結果(圖2)表明甘露聚糖酶在 pH 4. 0-10. 0之間均很穩(wěn)定，在此pH范圍內(nèi)處理60min后剩余酶活性在60%以上，這說明此酶在中性和堿性范圍內(nèi)具有良好的PH穩(wěn)定性。2、甘露聚糖酶的最適溫度及熱穩(wěn)定性測定方法如下甘露聚糖酶的最適溫度的測定為在檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(pH4. 5)緩沖液體系及不同溫度下進行酶促反應。耐溫性測定為甘露聚糖酶在不同溫度下處理不同時間，再在60°C下進行酶活性測定。酶反應最適溫度測定結果(圖幻表明其最適溫度為60°C。酶的熱穩(wěn)定性性試驗表明(圖4)，Man5XH9在50°C下溫育lh，能保持原有的酶活性的70%。3、甘露聚糖酶的Km值測定方法如下分別以不同濃度的角豆膠或魔芋粉為底物，在檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(pH 4. 5)緩沖液體系中，60°C下測定酶活性，計算出其在60°C下的Km值。經(jīng)測定，以角豆膠與魔芋粉為底物時的Km值分別為7. 8mg/mL和2. 3mg/mL,最大反應速度Vmax分別為70. 4 μ mol/ min · mg 禾口 61. 7 μ mol/min · mg。4、不同金屬離子化學試劑對Man5XH9酶活的影響測定如下在酶促反應體系中加入lmmol/L的不同的金屬離子及化學試劑，研究其對酶活性的影響。在60°C、pH 4.5條件下測定酶活性。結果表明(表幻，1^+463+、1%2+、&3+對酶活有部分抑制作用，SDS強烈抑制其活性，而Cu2+、Co2+和巰基乙醇對酶活都有一定的促進作用，其它金屬離子和化學試劑對酶活的影響不大。
表2.各種化學試劑及離子的對Cel6的影響如表所示
權利要求
1.一種中溫耐堿性甘露聚糖酶Man5XH9，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1或 SEQ ID NO. 2 所示。
2.一種中溫耐堿性甘露聚糖酶基因Man5XH9，其特征在于，編碼權利要求1所述的中溫耐堿性甘露聚糖酶Man5XH9。
3.根據(jù)權利要求2所述的中溫耐堿性甘露聚糖酶基因Man5XH9，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4或5所示。
4.包含權利要求2或3所述中溫耐堿性甘露聚糖酶基因Man5)(h9的重組載體。
5.根據(jù)權利要求4所述的重組載體，其特征在于，所述重組載體為pPIC9-Man5XH9。
6.包含權利要求2或3所述中溫耐堿性甘露聚糖酶基因Man5XH9的重組菌株。
7.根據(jù)權利要求6所述的重組菌株，其特征在于，所述重組菌株為畢赤酵母菌。
8.一種制備中溫耐堿性甘露聚糖酶Man5XH9的方法，其特征在于，包括以下步驟1)用權利要求4的重組載體轉化宿主細胞，得重組菌株；2)培養(yǎng)重組菌株，誘導重組甘露聚糖酶Man5XH9的表達；以及3)回收并純化所表達的甘露聚糖酶Man5XH9。
9.權利要求1所述中溫耐堿性甘露聚糖酶Man5XH9的應用。
10.青霉XH9(Penicillium sp.)，其特征在于，其保藏編號為CGMCC No. 5369。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程領域，具體地，本發(fā)明涉及一種中溫耐堿性甘露聚糖酶Man5XH9及其基因和應用。本發(fā)明提供了一種新的中溫耐堿性甘露聚糖酶Man5XH9，其具有如SEQ ID NO.1或2所示氨基酸序列，且本發(fā)明還提供了編碼上述中溫耐堿性甘露聚糖酶Man5XH9的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4或5所示，以及包含該基因的重組載體和重組菌株及其應用。本發(fā)明提供的甘露聚糖酶Man5XH9最適pH為4.5，在pH 4.0～7.0都有較高的酶活性，pH穩(wěn)定性好，適合于在造紙、紡織工業(yè)中應用。
文檔編號C12N1/15GK102329785SQ20111033481
公開日2012年1月25日 申請日期2011年10月28日 優(yōu)先權日2011年10月28日
發(fā)明者張菁, 詹志春 申請人:武漢新華揚生物股份有限公司