專利名稱：：蛋白-蛋白相互作用的高通量可視化芯片檢測方法以及一種蛋白-蛋白相互作用檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物領(lǐng)域，具體涉及一種對蛋白-蛋白相互作用的檢測方法以及一種蛋白-蛋白相互作用檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
：蛋白一蛋白相互作用(protein-proteininteraction,PPI)對于所有生物學(xué)過程都至關(guān)重要，為此，蛋白質(zhì)相互作用研究一直是細(xì)胞生物學(xué)與分子生物學(xué)領(lǐng)域的一大研究熱點(diǎn)。根據(jù)標(biāo)記物的種類，可將免疫分析方法分為酶免疫分析、熒光免疫分析、放射免疫分析、化學(xué)或生物發(fā)光免疫分析等。金屬免疫分析是基于金屬標(biāo)記物的一類免疫分析方法。早期的金屬免疫分析多是通過用金屬鰲合物來標(biāo)記抗原或抗體，由于--個(gè)蛋白質(zhì)分子只能標(biāo)記上幾個(gè)金屬鰲合物，因此這類方法的靈敏度受到很大的限制，通常只能達(dá)到nmol級。為了克服這一缺點(diǎn)，利用納米金作為標(biāo)記物標(biāo)記，由于納米金能催化銀離子的還原，因此通過銀染色放大可在納米金表面催化沉積大量的金屬銀，用酸性溶液將銀溶解后可釋放出成千上萬的銀離子，結(jié)合高靈敏的金屬溶出分析，極大地提高了金屬免疫分析的靈敏度，達(dá)到或超過了酶聯(lián)免疫分析和基于Eu鰲合物標(biāo)記的時(shí)間分辨熒光免疫分析的靈敏度(pmol級)，成為一種超靈敏的免疫分析方法。免疫沉淀(immunoprecipitation,IP)是利用抗原蛋白質(zhì)和抗體的特異性結(jié)合以及細(xì)菌蛋白質(zhì)的"proreinA"特異性地結(jié)合到免疫球蛋白的FC片段的現(xiàn)象開發(fā)出來的方法。如果用蛋白X的抗體免疫沉淀X，那么與X在體內(nèi)結(jié)合的蛋白Y可能也被沉淀下來?；谂c蛋白X的生理性相互作用，蛋白Y的免疫沉淀就叫免疫共沉淀(co-immunoprecipitation，Co-IP)。免疫共沉淀是發(fā)現(xiàn)或驗(yàn)證兩種蛋白質(zhì)間生理性相互作用的最有效、最常用的方法。在保持蛋白一蛋白相互作用(protein-proteininteraction,PPI)的條件下收獲和裂解細(xì)胞，從細(xì)胞提取液中特異性的免疫沉淀目的蛋白，然后通過聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離免疫沉淀物。目前多用純化的proreinA預(yù)先結(jié)合固定在瓊脂糖(argarose)的磁珠(beads)上，使之與抗原、抗體反應(yīng)后的細(xì)胞裂解液作用，磁珠上的proreinA就能吸附抗原，從而達(dá)到沉淀耙標(biāo)蛋白及其相互作用蛋白的目的。再進(jìn)一步通過SDS-PAGE分離及免疫印跡(Westernblot)檢測相互作用蛋白。不可否認(rèn)，傳統(tǒng)的Co-IP作為檢測和鑒定PPI最經(jīng)典和有效的方法，在功能基因組研究中發(fā)揮了巨大的作用，然而這種方法本身也存在著一些明顯的不足如操作過程因?yàn)閺?fù)雜煩瑣而費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，并且常需要大量的培養(yǎng)細(xì)胞；另外，通過SDS-PAGE分離免疫沉淀物及Westernblot檢測相互作用則進(jìn)一步延長了實(shí)驗(yàn)過程，這些缺陷大大的限制了檢測樣品的數(shù)量，這也是它不能成為高通量檢測方法的主要原因。在當(dāng)今蛋白質(zhì)組時(shí)代，隨著相關(guān)科學(xué)研究的逐步深入，人們需要越來越多的數(shù)據(jù)信息作為分析研究蛋白質(zhì)的基礎(chǔ)，由此蛋白質(zhì)芯片(proteinarray)應(yīng)運(yùn)而生。蛋白質(zhì)芯片是近年來興起的一種強(qiáng)有力的高通量研究方法，它類似于基因芯片，是將蛋白質(zhì)點(diǎn)到固相物質(zhì)上，然后與要檢測的組織或細(xì)胞等進(jìn)行"雜交"，再通過自動(dòng)化儀器分析得出結(jié)果。這里所指的"雜交"是指蛋白與蛋白之間如(抗體與抗原)在空間構(gòu)象上能特異性的相互識別。與傳統(tǒng)的研究方法相比，其最大的特點(diǎn)是小型化和高通量化，能夠一次平行分析成千上萬的蛋白樣品，具有很高的敏感度與準(zhǔn)確性。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種將膠體金結(jié)合銀增強(qiáng)顯色技術(shù)與免疫共沉淀芯片結(jié)合應(yīng)用，建立的簡捷實(shí)用、快速靈敏的高通量可視化芯片檢測蛋白-蛋白相互作用(PPI)的方法。本發(fā)明所提供的基于膠體金結(jié)合銀增強(qiáng)顯色技術(shù)與免疫共沉淀檢測蛋白-蛋白相互作用的高通量可視化芯片檢測方法，其特征在于，制備一Flag抗體芯片，然后將含有Flag-誘餌融合蛋白和Myc-獵物融合蛋白的細(xì)胞裂解液加入到芯片表面進(jìn)行免疫共沉淀反應(yīng)，再經(jīng)膠體金結(jié)合銀增強(qiáng)顯色技術(shù)檢測誘餌蛋白和獵物蛋白是否具有相互作用。具體來講，本發(fā)明所提供的檢測方法，可包括以下步驟步驟一制備Flag抗體芯片，將醛基玻片分成多個(gè)芯片框，將anti-flagM2單抗及作為抗體對照的鼠IgG噴點(diǎn)到各芯片框內(nèi)，保存?zhèn)溆?；步驟二構(gòu)建誘餌和獵物蛋白表達(dá)載體，將誘餌蛋白的編碼基因構(gòu)建到flag標(biāo)簽載體上，將獵物蛋白的編碼基因構(gòu)建到Myc標(biāo)簽載體上，分別形成誘餌融合蛋白和獵物融合蛋白；步驟三細(xì)胞轉(zhuǎn)染及制備裂解液，將誘餌和獵物真核表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，收集細(xì)胞并充分裂解，將實(shí)驗(yàn)品細(xì)胞裂解液上清收集待用；同樣制備陰性對照品細(xì)胞裂解液收集待用；步驟四將實(shí)驗(yàn)品細(xì)胞裂解液和對照品細(xì)胞裂解液分別加入處理后的芯片中不同芯片框內(nèi)進(jìn)行免疫共沉淀反應(yīng)，洗滌；步驟五加單克隆Anti-c-Myc-biotion孵育，洗滌，以洗去未結(jié)合的Anti_c_Myc_biotion;步驟六加鏈親和素膠體金孵育，洗滌，以洗去未結(jié)合的鏈親和素膠體金；步驟七加銀增強(qiáng)溶液A和B反應(yīng)，反應(yīng)后用重蒸水沖洗芯片終止反應(yīng)；步驟八芯片上出現(xiàn)肉眼可見的黑色信號點(diǎn)，通過觀察實(shí)驗(yàn)品與對照品信號點(diǎn)的差異對結(jié)果進(jìn)行判讀。采用普通掃描儀掃描并保存圖片，再通過GenePix軟件讀取各信號點(diǎn)的相對灰度值獲得信號的數(shù)字化結(jié)果。本發(fā)明提供的基于蛋白芯片的免疫共沉淀檢測蛋A相互作用的方法，步驟一中Flag抗體芯片用貼膜分為3X6個(gè)芯片框，每個(gè)芯片框內(nèi)平行點(diǎn)入anti-flagM2單抗及作為抗體對照的小鼠IgG,anti-flagM2單抗和小鼠IgG各點(diǎn)3個(gè)重復(fù)點(diǎn)。本發(fā)明提供的檢測方法，步驟四中芯片處理是指用封閉液封閉芯片，室溫孵育，然后用TBST重復(fù)洗滌；將實(shí)驗(yàn)品細(xì)胞裂解液和對照品細(xì)胞裂解液加入芯片框中的量為20u1/框；所述免疫共沉淀反應(yīng)指在室溫保濕條件下反應(yīng)2小時(shí)；所述洗滌指用TBST洗滌15分鐘，重復(fù)3次。步驟五中所述加入Anti-c-Myc-biotion單抗的濃度為1:50，加入量為25u1/芯片框，在室溫下放置于濕盒中孵育1小時(shí)；所述洗滌指用TBST洗滌15分鐘，重復(fù)3次。步驟六中所述加入鏈親和素膠體金的濃度為1:25，加入量為25ul/芯片框，在室溫下放置于濕盒中孵育1小時(shí)；所述洗滌指用TBST洗滌15分鐘，重復(fù)3次。步驟七中銀增強(qiáng)溶液A和B的比例為1:1，加入量為35u1/芯片框，反應(yīng)時(shí)間為18至20分鐘。本發(fā)明還提供一種蛋白-蛋白相互作用檢測試劑盒，包括一具有多個(gè)分區(qū)的醛基玻片，上述方法中的FLAG和c-Myc標(biāo)簽載體和其對應(yīng)的單抗，鏈親和素膠體金，銀增強(qiáng)溶液A和B，陽性對照和陰性對照質(zhì)粒以及基于上述方法的使用說明書。本發(fā)明提供的試劑盒中醛基玻片分為3X6個(gè)分區(qū)。本發(fā)明提供的試劑盒中，醛基玻片型號為CSS-IOO，F(xiàn)LAG標(biāo)簽載體為SIGMA公司的pFLAG-CMV-2，c-Myc標(biāo)簽載體為CLONTECH公司的pCMV-Myc，F(xiàn)LAG單抗為SIGMA公司的ANTI-FLAGM2單克隆抗體，c-Myc單抗為SIGMA公司的Anti-c-Myc-biotion單克隆抗體，鏈親和素膠體金為SIGMA公司的biotionConjugateStr印tavidincolloidalgold-labeled,銀增強(qiáng)溶液A和B為SIGMA公司產(chǎn)品；還可提供陽性對照質(zhì)粒Flag-p50/c-Myc-p65(已知陽性相互作用對)和陰性對照質(zhì)粒Flag-Jun/c-Myc-lacZ(已知陰性相互作用對)。本發(fā)明提供的高通量可視化芯片檢測蛋白-蛋白相互作用的方法，首次將銀增強(qiáng)顯色技術(shù)和免疫膠體金技術(shù)結(jié)合，用于蛋白質(zhì)芯片研究蛋白質(zhì)相互作用，利用FLAG和c-Myc表位標(biāo)簽和其對應(yīng)的單抗，建立了一種基于芯片的高通量可視化檢測蛋白相互作用的新型技術(shù)。該技術(shù)采用膠體金作為一個(gè)成核的位點(diǎn)，使還原出來的金屬銀在其周圍沉積，黑色沉積物不斷增大形成肉眼可見的明顯信號，省去了一般熒光標(biāo)記法檢測時(shí)必須釆用共聚焦熒光掃描儀獲得信號的步驟，也省去了傳統(tǒng)CoIP過程中的瓊脂糖磁珠沉淀、SDS-PAGE分離、Westernblot檢測等諸多費(fèi)時(shí)、繁瑣的步驟，大大簡化了實(shí)驗(yàn)過程。另外，該技術(shù)對樣品、試劑的需求量大大減少，并且同一樣品可同時(shí)進(jìn)行對照抗體的平行實(shí)驗(yàn)，大大降低實(shí)驗(yàn)成本。更難能可貴的是該技術(shù)充分利用了芯片高通量化、流程簡單、耗時(shí)短等特點(diǎn)，從而可實(shí)現(xiàn)對樣品的通量化檢測。在進(jìn)行蛋白相互作用檢測時(shí)，重復(fù)性好，背景噪音小，靈敏度高。因此，本發(fā)明建立的蛋白-蛋白相互作用高通量可視化芯片檢測技術(shù)將成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究中高效有力的工具。下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。圖l為本發(fā)明方法的實(shí)驗(yàn)流程示意圖圖2為本發(fā)明方法的實(shí)驗(yàn)原理示意圖圖3為pCMV-myc-p65和pFlag-p50重組子的雙酶切電泳鑒定圖圖4A為本發(fā)明高通量可視化芯片檢測方法檢測p65-p50相互作用的檢測結(jié)果；圖4B為熒光標(biāo)記抗體檢測方法對照檢測p65-p50相互作用的檢測結(jié)果；圖5為本發(fā)明高通量可視化芯片檢測方法與作為對照的熒光標(biāo)記抗體檢測方法對19對具潛在相互作用蛋白的檢測結(jié)果。具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。本發(fā)明所用到的試劑包括抗體單克隆抗FLAG抗體(Monoclonalanti-FLAGM2antibody,Sigma);生物素標(biāo)記單克隆抗c-Myc抗體(Monoclonalanti-c-Myc-biotionantibody,Sigma);Cy3標(biāo)記單克隆抗c-Myc抗體(Monoclonalanti-c-Myc-Cy3antibody,Sigma);p50多克隆抗體(polyclonalanti-p50antibody,SantaCruz);p65多克隆抗體(polyclonalanti-p65antibody,SantaCruz);小鼠IgG(中山金橋生物公司)。月旨質(zhì)體月旨質(zhì)體2000(Lipofectamine2000reagent,Invitrogen)。醛基玻片CSS-100醛基玻片(AldehydeCSS-100SilylatedSlides,CELAssociates,Inc.)。蛋白酶抑制劑無EDTA型完全蛋白酶抑制劑藥片(completemini,EDTAfree,proteaseinhibitorcocktailtablets,Roche)鏈親禾口素膠體金biotionConjugateStreptavidincolloidalgold-labeled(Sigma)銀增強(qiáng)試劑A:SilverEnhancerSolutionA(Sigma)銀增強(qiáng)試劑B:SilverEnhancerSolutionB(Sigma)其他各種分子生物學(xué)常用試劑均為進(jìn)口試劑。試劑配制EBC裂解緩沖液:Tris-ClNaClNP-40EDTA50mmol/L，pH8.0120mmol/L0.5%(V/V)lramol/L用前補(bǔ)加50ixg/mLPMSF，蛋白酶抑制劑Tris-CI20mmol/L，p朋.0NaCl150腸1/L含O.05%(V/V)吐溫20的TBS10mg/mLBSA(牛血清白蛋白)，溶于TBST中。本發(fā)明檢測誘餌蛋白和獵物蛋白之間的相互作用，可采用以下操作，參見圖l所示流程以及圖2(MCS:多克隆位點(diǎn)；X，Y為待測蛋白，其以單體或復(fù)合體的形式存在于細(xì)胞裂解液中。)所示原理。Flag抗體芯片的制備在醛基玻片上貼上貼膜，使其分區(qū)形成3X6個(gè)用于區(qū)分樣品的芯片框。在每一芯片框內(nèi)，將anti-flagM2單抗和小鼠IgG(作為對照抗體)分別噴點(diǎn)到醛基玻璃片分區(qū)框內(nèi)，每個(gè)反應(yīng)框內(nèi)平行點(diǎn)3個(gè)含anti-flagM2單抗的點(diǎn)和對應(yīng)數(shù)量的含小鼠IgG的點(diǎn)(形成2X3陣列)。4'C保存?zhèn)溆谩BS:TBST:封閉液:本發(fā)明實(shí)施例采用M2單抗，由于M2單抗是鼠源IgG，因此采用小鼠IgG作為抗體對照。本發(fā)明不限于采用M2單抗，也可以選用其它型號的單抗。誘餌蛋白和獵物蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建將誘餌蛋白的編碼基因構(gòu)建到flag標(biāo)簽載體上，將獵物蛋白的編碼基因構(gòu)建到Myc標(biāo)簽載體上，分別形成flag-誘餌融合蛋白和Myc-獵物融合蛋白。細(xì)胞轉(zhuǎn)染及裂解液的制備選擇培養(yǎng)細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)到80%密度時(shí)，以脂質(zhì)體將誘餌和獵物真核表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染，收集細(xì)胞并充分裂解，將實(shí)驗(yàn)品細(xì)胞裂解液上清收集待用。用同樣方法制備得到對照品細(xì)胞裂解液。芯片CoIP及相互作用的檢測封閉液封閉芯片，洗滌后在其中之一芯片框內(nèi)加入實(shí)驗(yàn)品細(xì)胞裂解液，同時(shí)在另一芯片框內(nèi)加入對照品細(xì)胞裂解液作為陰性對照，反應(yīng)一定時(shí)間后，洗滌；在每一芯片框內(nèi)再加入生物素標(biāo)記的抗myc單克隆抗體(anti-c-Myc-biotion)，孵育一段時(shí)間后洗滌；加鏈親和素膠體金孵育，洗滌；加銀增強(qiáng)溶液A和B反應(yīng)，反應(yīng)后用重蒸水沖洗芯片終止反應(yīng)。肉眼觀察芯片上信號點(diǎn)的顏色變化。通過比較實(shí)驗(yàn)品與對照品信號點(diǎn)的差異對結(jié)果進(jìn)行判讀如果存在相互作用，在實(shí)驗(yàn)品對應(yīng)的芯片框內(nèi)會出現(xiàn)黑色信號點(diǎn)，而對照品對應(yīng)的框內(nèi)則無明顯黑色信號點(diǎn)出現(xiàn)。采用普通掃描儀掃描并保存圖片，可再通過GenePix軟件讀取各信號點(diǎn)的相對灰度值獲得信號的數(shù)字化結(jié)果。實(shí)施例l:核轉(zhuǎn)錄因子-KB(NF—KB)的p65和p50亞基相互作用的免疫共沉淀芯片分析NF-KB的p65和p50亞基在生理?xiàng)l件下，以異二聚體的形式存在，因此，以p65和p50的相互作用為陽性模型設(shè)計(jì)本實(shí)施例。一、Flag抗體芯片的制備在醛基玻片上貼上貼膜，使其分區(qū)形成3X6個(gè)芯片框。用微陣列點(diǎn)樣器(microarrayer，CAPITALBIO博奧，晶芯SmartArrayer-48)在每一芯片框中將anti-flagM2單抗和小鼠IgG(作為對照抗體)分別噴點(diǎn)到醛基玻璃片框內(nèi)，每個(gè)反應(yīng)框內(nèi)點(diǎn)3個(gè)含anti-flagM2單抗的點(diǎn)(上一行)和3個(gè)含小鼠IgG的點(diǎn)(下一行)形成2X3點(diǎn)陣。至少制備兩個(gè)Flag抗體芯片，4'C保存?zhèn)溆谩６?、誘館和獵物表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定將p65(麗021975)和p50(麗003998)分別構(gòu)建到pCMV-Myc和pCMV-Flag-2載體上，獲得pCMV-myc-p65和pFLAG-p50表達(dá)載體。構(gòu)建過程具體操作a)設(shè)計(jì)p65和p50特異性引物，由賽百盛公司合成引物名稱引物序列限制性內(nèi)切酶p50-up5'-CCGCGAATTCAATGGCAGAAGATGATCC-3'(序列1)EcoRIp50-down5'-CAGAGTCGACCTAAGTGTCCATGGTTCC-3，(序列2)Sailp65-up5，-ATCTCTCGAGGTATGGACGAACTGTTCCCC-3，(序列3)Xholp65-down5，-CAATGCGGCCGCTTAGGAGCTGATCTGACTC-3，(序列4)NotIb)以肝臟cDNA文庫(Invitrogen)為模板，PCR擴(kuò)增p65和p50基因:PCR體系為10xBuffer5(al，dNTPMixture(2,5mM)4ul，合成引物(10tiM)p50-up、p50-down各1^1，PyrobestTaq(5U/ul)0.5"1，cDNA文庫lul，加去離子水至50ul。PCR反應(yīng)條件為94'C預(yù)變性2min;94"變性lmin，55。C退火lmin、72'C延伸2min，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)；72'C繼續(xù)延伸7min。c)PCR產(chǎn)物進(jìn)行l(wèi)^瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下切下目的條帶(p65大小為1656bp，p50大小為1314bp)，使用凝膠回收試劑盒(Promega)并按照其說明書所述方法回收目的基因。d)目的基因及相應(yīng)載體進(jìn)行限制性酶切p50和pFLAG-CMV-2用EcoRI&Sa11進(jìn)行雙酶切，p65和pCMV-Myc用XhoI&Notl進(jìn)行雙酶切，反應(yīng)體系如下10XHbuffer5w1PCR純化產(chǎn)物P50(或P65)20iUEcoRI(或XhoI)2.5"1Sail(或NotI)2.5u1加無菌水至50nl，37。C水浴酶切4h。e)酶切產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，使用凝膠回收試劑盒(WizardSVGelandPCRClean-UpSystem,Promega)并按照其說明書所述方法回收酶切片段，切下目的基因(P50或P65)和載體酶切片段(pFLAG-CMV-2或pCMV-Myc)。f)用T4連接酶連接，連接體系如下10XBuffer2ul目的基因10ul載體酶切片段1^1T4DNALigase1u1加去離子水至20"1，室溫連接2小時(shí)或4'C連接過夜。g)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞將20ixl連接產(chǎn)物加入100yl大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕旋轉(zhuǎn)混勻；冰水浴30分鐘；42t;熱休克90秒；冰上放置2分鐘；加入500ulLB培養(yǎng)液，37。C搖床(150rpm)培養(yǎng)45分鐘；將培養(yǎng)液涂于加有氨芐的LB固體培養(yǎng)基平板上超凈工作臺中吹千后，37°〇培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)過夜。釆用以下步驟對pCMV-Myc-p65和pFLAG-p50載體進(jìn)行鑒定h)從平板上挑取單克隆菌落到一加有35mL含氨節(jié)的LB液體培養(yǎng)基的無菌玻璃試管中，37°。搖床(200rpm)過夜。i)使用小量質(zhì)粒DNA提取試劑盒(Wizard/V"5SVMinipr印s,Promega)并按照其說明書所述方法提質(zhì)粒。j)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定重組子pFLAG-P50用EcoRI&Sall進(jìn)行雙酶切，pCMV-Myc-p65用XhoI&NotI進(jìn)行雙酶切，反應(yīng)體系如下10XHbuffer2n1含有重組子pFLAG-p50(或pCMV-Myc-p65)的質(zhì)粒DN5"1Ec。RI(或Xhol)1n1Sail(或NotI)ly1加無菌水至20lU，37'C水浴酶切4h。k)酶切產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，如果電泳結(jié)果顯示大小與預(yù)期相一致的兩條帶，則表明該質(zhì)粒為重組子。結(jié)果如圖3所示(1.pCMV-myc-p65(未酶切)；2.pCMV-myc-p65(xhol和Notl酶切);3.pFlag-p50(未酶切);4.pFlag-p50(EcoRI和Sall酶切)):其中2，4分別為pCMV-myc-p65和pFlag-p50的重組子。1)選擇重組子進(jìn)行測序確認(rèn)。三、細(xì)胞轉(zhuǎn)染及裂解液的制備1、pCMV-myc-p65和pFLAG-p50共轉(zhuǎn)染細(xì)胞裂解液(實(shí)驗(yàn)品)的制備用含10%FBS(胎牛血清)(杭州四季青生物工程材料有限公司)的DMEM高糖培養(yǎng)液(北京天潤善達(dá)生物技術(shù)有限公司)，在含5%C02的37'C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板上的HEK-293細(xì)胞(人胚腎細(xì)胞，中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心)，顯微鏡下觀察細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞長到約80%密度時(shí)，以脂質(zhì)體2000將pCMV-myc-p65和pFLAG-p50共轉(zhuǎn)染細(xì)胞在一個(gè)0.5mL無菌EP管中同吋加入300ngpCMV-myc-p65、300ngpFLAG-p50和50u1無血清的DMEM培養(yǎng)基，混勻；在另一個(gè)0.5mL無菌EP管中同時(shí)加入2u1脂質(zhì)體2000和50u1無血清的DMEM培養(yǎng)基，混勻；室溫孵育5分鐘后，將兩者混合到一起，混勻后室溫孵育20分鐘；將上述混合物加入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板的各孔細(xì)胞中；將細(xì)胞放回含5%C02的37'C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染24-36小時(shí)后收集細(xì)胞將細(xì)胞培養(yǎng)液吸走，然后用預(yù)冷到4"C的PBS(磷酸鹽緩沖液，137mmol/LNaCl，2.7mmol/LKC1，10mmol/LNa2HP04，2mmol/LKH2P04，pH7.4)清洗細(xì)胞，之后向24孔細(xì)胞培養(yǎng)板的各孔中加入EBC裂解緩沖液(50u1/孔)，室溫放置15分鐘進(jìn)行充分裂解。將24孔細(xì)胞培養(yǎng)板各孔中的細(xì)胞裂解液回收到EP管中，4°C，12000rpm離心IO分鐘，收集細(xì)胞裂解液上清放入另一干凈的EP管中，作為實(shí)驗(yàn)品備用。2、pCMV-myc-p65和pFLAG-CMV-2共轉(zhuǎn)染細(xì)胞裂解液(陰性對照品)的制備用和1相同的操作制備對照品，其中以脂質(zhì)體2000將pCMViyc-p65禾口pFLAG-CMV-2共轉(zhuǎn)染，作為驗(yàn)證免疫沉淀特異性的陰性對照(flag-p50缺失)。四、芯片CoIP及相互作用的檢測取一Flag抗體芯片，用封閉液(25ixl/框)封閉芯片，室溫孵育l小時(shí)；TBST洗滌5分鐘，重復(fù)3次；在第一芯片框內(nèi)加入實(shí)驗(yàn)品細(xì)胞裂解液(20yl/框)，在第二芯片框內(nèi)加入陰性對照品細(xì)胞裂解液(20wl/框)，室溫保濕反應(yīng)2小時(shí)；對所有芯片框，用TBST洗滌15分鐘，重復(fù)3次；加單克隆Anti-c-Myc-biotion(l:50，25y1/框)，在室溫下放置于濕盒中孵育1小時(shí)；TBST清洗芯片3次，每次5分鐘；加鏈親和素膠體金(1:25，25iU/框)，在室溫下放置于濕盒中避光孵育1小時(shí)；TBST清洗芯片3次，每次5分鐘；加銀增強(qiáng)溶液A和B(1:1，35ul/框)反應(yīng)18到20分鐘；使用重蒸水沖洗芯片終止反應(yīng)，肉眼觀察芯片上信號點(diǎn)的顏色變化。通過比較實(shí)驗(yàn)品(第一芯片框)與陰性對照品(第二芯片框)信號點(diǎn)的差異對結(jié)果進(jìn)行判讀如果存在相互作用，在實(shí)驗(yàn)品對應(yīng)的芯片框內(nèi)會出現(xiàn)黑色信號點(diǎn)，而對照品對應(yīng)的框內(nèi)則無明顯黑色信號點(diǎn)出現(xiàn)，結(jié)果參見圖4A中左側(cè)圖片，在第一芯片框上一行實(shí)驗(yàn)品出現(xiàn)黑色信號點(diǎn)，在第二芯片框?qū)φ掌窙]有出現(xiàn)黑色信號點(diǎn)。釆用普通掃描儀掃描并保存圖片，再通過GenePix軟件讀取各信號點(diǎn)的相對灰度值獲得信號的數(shù)字化結(jié)果(參見圖4A中右側(cè)柱圖)。同時(shí)以熒光標(biāo)記抗體檢測方法為對照，檢測方法為用另一Flag抗體芯片，用封閉液(20ul/框)封閉芯片，室溫孵育45分鐘；TBST洗滌5分鐘，重復(fù)3次；在第一芯片框內(nèi)加入實(shí)驗(yàn)品細(xì)胞裂解液(20nl/框)，在第二芯片框內(nèi)加入陰性對照品細(xì)胞裂解液(20ul/框)；室溫保濕反應(yīng)2小時(shí)；TBST洗滌15分鐘，重復(fù)3次；加入anti-Myc-Cy3單抗(l:200〈抗體封閉液〉，20ul/芯片框)，室溫避光保濕反應(yīng)1小時(shí)；TBST洗滌15分鐘，重復(fù)3次；將芯片上的貼膜取下，待玻片干燥后放入共聚焦熒光芯片掃描儀(LuxScan-10K/A，CapitalBio)中掃描，保存圖片并讀取數(shù)據(jù)。檢測結(jié)果見圖4B，左側(cè)圖片顯示在第一芯片框上一行實(shí)驗(yàn)品出現(xiàn)熒光信號點(diǎn)，在第二芯片框?qū)φ掌窙]有出現(xiàn)熒光信號點(diǎn)；同時(shí)參見右側(cè)柱圖顯示的熒光強(qiáng)度。五、檢測結(jié)果NF-KB的p65和p50亞基在生理?xiàng)l件下，以異二聚體的形式存在，因此，本實(shí)施例以p65和p50的相互作用為陽性相互作用建立芯片免疫共沉淀技術(shù)。首先，將p65和p50分別構(gòu)建到pCMV-Myc和pCMV-Flag-2載體上，獲得pCMV-myc-p65和pFLAG-p50表達(dá)載體。然后將pCMV-myc-p65和pFLAG-p50共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，同時(shí)以pCMViyc-p65和pFLAG-CMV-2共轉(zhuǎn)染作為陰性對照。獲得細(xì)胞裂解液后，在芯片上進(jìn)行免疫共沉淀反應(yīng)，再經(jīng)膠體金結(jié)合銀增強(qiáng)顯色技術(shù)檢測誘餌蛋白和獵物蛋白是否具有相互作用。經(jīng)可視化芯片檢測技術(shù)檢測后，得到相應(yīng)的相互作用信號(如圖4A所示)，檢測結(jié)果與熒光標(biāo)記抗體檢測結(jié)果(圖4B)—致，顯示本例蛋白對之間具有相互作用。從結(jié)果可以看出本發(fā)明的可視化芯片檢測技術(shù)用于檢測蛋白-蛋白相互作用是可行的，并且有相當(dāng)?shù)目尚哦?。?shí)施例2、用本發(fā)明的髙通量可視化芯片檢測技術(shù)對19對具潛在相互作用的蛋白進(jìn)行相互作用的驗(yàn)證，并與熒光標(biāo)記抗體檢測方法檢測效果進(jìn)行比較為了檢驗(yàn)本發(fā)明高通量可視化銀增強(qiáng)芯片檢測方法的可靠性，隨機(jī)選擇了19對具潛在相互作用的蛋白(見表l)用本發(fā)明的高通量可視化芯片檢測技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證，并同步采用熒光免疫檢測方法進(jìn)行檢驗(yàn)，每組實(shí)驗(yàn)均帶了已知陽性相互作用對Flag-p50/c-Myc-p65和已知陰性相互作用對Flag-Jun/c-Myc-lacZ分別作為陽性對照和陰性對照，并將兩組實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比對。將誘餌分別構(gòu)建到pFLAG-CMV-2真核表達(dá)載體上(請參照實(shí)施例1的方法)，將獵物分別構(gòu)建到pCMV-Myc真核表達(dá)載體上(請參照實(shí)施例l的方法)。參照實(shí)施例1中的方法；將19種pCMV-Myc-獵物蛋白分別和相應(yīng)的pFLAG-誘餌蛋白共轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞，獲得細(xì)胞裂解液后，分別在芯片上不同芯片框內(nèi)(每一芯片框內(nèi)對應(yīng)一對蛋白)進(jìn)行免疫共沉淀反應(yīng)，經(jīng)本發(fā)明實(shí)施例l所用的高通量可視化芯片檢測技術(shù)和熒光免疫檢測方法進(jìn)行檢測后，得到相應(yīng)的相互作用信號。結(jié)果如圖5所示，本發(fā)明高通量可視化芯片檢測方法結(jié)果(圖中"可視法"組)與熒光免疫檢測方法結(jié)果(圖中"熒光法"組)具有很好的一致性，其中，1、2、3、9、Y號蛋白對之間具有明顯相互作用。該實(shí)施例進(jìn)一步證明本發(fā)明的高通量可視化芯片檢測技術(shù)在分析蛋白相互作用中是非常有效的。表119對相互作用對蛋白名稱及對照<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>本發(fā)明在具體實(shí)施中，還可以形成一種蛋白-蛋白相互作用檢測試劑盒，該試劑盒可包括具有多個(gè)分區(qū)的醛基玻片(每個(gè)醛基片可進(jìn)行18個(gè)樣品的檢測，可根據(jù)需要檢測的相互作用數(shù)量選擇醛基片的數(shù)量)；FLAG標(biāo)簽載體pFLAG-CMV-2;c-Myc標(biāo)簽載體pCMV-Myc;單克隆抗FLAG抗體；生物素標(biāo)記單克隆抗c-Myc抗體；小鼠IgG;鏈親和素膠體金；銀增強(qiáng)溶液A和B;陽性對照和陰性對照質(zhì)粒及使用說明書。具體的一種試劑盒，其中醛基玻片型號為CSS-IOO，F(xiàn)LAG標(biāo)簽載體為SIGMA公司的pFLAG-CMV-2，c-Myc標(biāo)簽載體為CLONTECH公司的pCMV-Myc,FLAG單抗為SIGMA公司的ANTI-FLAGM2單克隆抗體，c-Myc單抗為SIGMA公司的Anti-c-Myc-Motion單克隆抗體，鏈親和素膠體金為SIGMA公司的biotionConjugateStr印tavidincolloidalgold-labeled,銀增強(qiáng)溶液A和B為SIGMA公司產(chǎn)品，陽性對照質(zhì)?？梢詾镕lag-p50/c-Myc-P65(已知陽性相互作用對)，陰性對照質(zhì)粒為Flag-Jun/c-Myc-lacZ(已知陰性相互作用對)。權(quán)利要求1、一種蛋白-蛋白相互作用的高通量可視化芯片檢測方法，其特征在于，制備一Flag抗體芯片，然后將含有Flag-誘餌融合蛋白和Myc-獵物融合蛋白的細(xì)胞裂解液加入到芯片表面進(jìn)行免疫共沉淀反應(yīng)，再經(jīng)膠體金結(jié)合銀增強(qiáng)顯色技術(shù)檢測誘餌蛋白和獵物蛋白是否具有相互作用。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于所述檢測方法，包括以下步驟步驟一制備Flag抗體芯片將醛基玻片分成多個(gè)芯片框，將anti-flagM2單抗及作為抗體對照的鼠IgG分別噴點(diǎn)到每一芯片框內(nèi)，保存?zhèn)溆貌襟E二構(gòu)建誘佴和獵物蛋白表達(dá)載體將誘餌蛋白的編碼基因構(gòu)建到flag標(biāo)簽載體上，將獵物蛋白的編碼基因構(gòu)建到Myc標(biāo)簽載體上，分別形成誘餌融合蛋白表達(dá)載體和獵物融合蛋白表達(dá)載體；步驟三細(xì)胞轉(zhuǎn)染及制備裂解液將誘餌和獵物真核表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，收集細(xì)胞并充分裂解，將實(shí)驗(yàn)品細(xì)胞裂解液上清收集待用；同樣制備陰性對照品細(xì)胞裂解液收集待用；步驟四將實(shí)驗(yàn)品細(xì)胞裂解液和對照品細(xì)胞裂解液分別加入處理后的芯片中不同芯片框內(nèi)進(jìn)行免疫共沉淀反應(yīng)，洗滌；步驟五加單克隆Anti-c-Myc-biotion孵育，洗滌；步驟六加鏈親和素膠體金孵育，洗滌；步驟七加銀增強(qiáng)溶液A和B反應(yīng)，反應(yīng)后用重蒸水沖洗芯片終止反應(yīng)；步驟八肉眼觀察芯片上信號點(diǎn)的顏色變化。通過比較實(shí)驗(yàn)品與對照品信號點(diǎn)的顏色差異對結(jié)果進(jìn)行判讀如果存在相互作用，在實(shí)驗(yàn)品對應(yīng)的芯片框內(nèi)會出現(xiàn)黑色信號點(diǎn)，而對照品對應(yīng)的框內(nèi)則無明顯黑色信號點(diǎn)出現(xiàn)。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述方法，其特征在于，所述步驟八可進(jìn)一步用掃描儀掃描并保存圖片，再通過GenePix軟件讀取各信號點(diǎn)的相對灰度值獲得信號的數(shù)字化結(jié)果，通過相對灰度值的大小判斷誘餌蛋白和獵物蛋白是否存在相互作用。4、根據(jù)權(quán)利要求2或3所述方法，其特征在于，所述步驟四中芯片處理是指用封閉液封閉芯片，室溫孵育，然后用TBST重復(fù)洗滌；將實(shí)驗(yàn)品細(xì)胞裂解液和對照品細(xì)胞裂解液加入芯片框中的量為20y1/框；所述免疫共沉淀反應(yīng)指在室溫保濕條件下反應(yīng)2小時(shí)；所述洗滌指用TBST洗滌15分鐘，重復(fù)3次。5、根據(jù)權(quán)利要求2或3所述方法，其特征在于，所述步驟五中所述加入Anti-c-Myc-biotion單抗的濃度為1:50，加入量為25y1/芯片框，在室溫下放置于濕盒中孵育1小時(shí)；所述洗滌指用TBST洗滌15分鐘，重復(fù)3次。6、根據(jù)權(quán)利要求2或3所述方法，其特征在于，所述步驟六中所述加入鏈親和素膠體金的濃度為1:25，加入量為25ul/芯片框，在室溫下放置于濕盒中孵育1小時(shí)；所述洗滌指用TBST洗滌15分鐘，重復(fù)3次。7、根據(jù)權(quán)利要求2或3所述方法，其特征在于，所述步驟七中銀增強(qiáng)溶液A和B的比例為l:1，加入量為35^1/芯片框，反應(yīng)時(shí)間為18至20分鐘。8、一種蛋白-蛋白相互作用檢測試劑盒，包括一具有多個(gè)分區(qū)的醛基玻片，權(quán)利要求1至7任一所述方法中的FLAG和c-Myc標(biāo)簽載體和其對應(yīng)的單抗，鏈親和素膠體金，銀增強(qiáng)溶液A和B，陽性對照和陰性對照質(zhì)粒以及基于權(quán)利要求l一7任一所述方法的使用說明書。9、根據(jù)權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于，所述醛基玻片分為3X6個(gè)分區(qū)。10、根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的試劑盒，其特征在于，所述醛基玻片型號為CSS-100，F(xiàn)LAG標(biāo)簽載體為SIGMA公司的pFLAG-CMV-2，c-Myc標(biāo)簽載體為CLONTECH公司的pCMV-Myc，F(xiàn)LAG單抗為SIGMA公司的ANTI-FLAGM2單克隆抗體，c-Myc單抗為SIGMA公司的Anti-c-Myc-biotion單克隆抗體，鏈親和素膠體金為SIGMA公司的biotionConjugateStr印tavidincolloidalgold-labeled,銀增強(qiáng)溶液A禾口B為SIGMA公司產(chǎn)品，陽性對照質(zhì)粒為Flag-p50/c-Myc-p65(已知陽性相互作用對)，陰性對照質(zhì)粒為Flag-Jun/c-Myc-lacZ(已知陰性相互作用對)。全文摘要本發(fā)明公開了一種蛋白-蛋白相互作用的高通量可視化芯片檢測方法以及一種蛋白-蛋白相互作用檢測試劑盒。該方法為制備一Flag抗體芯片，然后將含有Flag-誘餌融合蛋白和Myc-獵物融合蛋白的細(xì)胞裂解液加入到芯片表面進(jìn)行免疫共沉淀反應(yīng)，再經(jīng)膠體金結(jié)合銀增強(qiáng)顯色技術(shù)檢測誘餌蛋白和獵物蛋白是否具有相互作用。該試劑盒包括一具有多個(gè)分區(qū)的醛基玻片，F(xiàn)LAG和c-Myc標(biāo)簽載體和其對應(yīng)的單抗，鏈親和素膠體金，銀增強(qiáng)溶液A和B以及基于上述方法的使用說明書。本發(fā)明建立的蛋白-蛋白相互作用高通量可視化芯片檢測技術(shù)將成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究中高效有力的工具。文檔編號C12N15/79GK101539573SQ20091008310公開日2009年9月23日申請日期2009年4月30日優(yōu)先權(quán)日2009年4月30日發(fā)明者為何,劉瓊明,許丹科,卿陳申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所