專利名稱：一種新型嗜熱鏈球菌細菌素的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及嗜熱鏈球菌細菌素的生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
細菌素是由細菌產(chǎn)生的，通常只作用于與產(chǎn)生菌同種的其它菌株或親緣關(guān)系很近的種的 一種蛋白類抗菌物質(zhì)。它是一種多肽或多肽與糖和脂的復(fù)合物。
乳酸菌所產(chǎn)的細菌素引起人們的特別興趣。因為這些菌種總體上被認為是安全的。另外， 產(chǎn)細菌素的乳酸菌大多數(shù)來自于自然中的食物，所以它們特別適合用于食品中。
目前，對細菌素的研究主要是通過篩選發(fā)現(xiàn)產(chǎn)細菌素菌株，并對其特性進行研究。隨著 對細菌素研究的進一步深入,有必要探明細菌素分子特性以及遺傳學特性,而細菌素的純化是 這些研究的重要基礎(chǔ)。目前已經(jīng)純化出多種細菌素，純化細菌素的方法多種多樣，主要有 有機溶劑沉淀法、吸附法、熱變性法、離子交換、凝膠層析、高效液相色譜等等。
近幾年，尋找性狀良好并能產(chǎn)細菌素的發(fā)酵劑菌種成為研究的目標。嗜熱鏈球菌是鏈球 菌屬的一種，革蘭氏陽性，不產(chǎn)芽孢，無鞭毛，兼性厭氧，成對或成鏈狀出現(xiàn)。嗜熱鏈球菌 為健康人腸道正常菌群，可在人體腸道中生長、繁殖。可直接補充人體正常生理細菌， 調(diào)整腸道菌群平衡，抑制并清除腸道中對人具有潛在危害的細菌。嗜熱鏈球菌細菌素是 由嗜熱鏈球菌產(chǎn)生的細菌素，是具有抗菌活性的肽類，在食品方面的應(yīng)用很重要，尤其與乳 產(chǎn)品的生產(chǎn)有關(guān)。產(chǎn)細菌素發(fā)酵劑菌株在發(fā)酵酸奶的生產(chǎn)過程中可以使酸奶不易受雜菌污染， 并保證發(fā)酵過程的穩(wěn)定性及產(chǎn)品的安全性。
目前國內(nèi)論文尚未見到嗜熱鏈球菌細菌素生產(chǎn)和應(yīng)用的相關(guān)報道。關(guān)于嗜熱鏈球菌產(chǎn)細
菌素的專利只有1994年雀巢公司申請的嗜熱鏈球菌細菌素專利(專利申請?zhí)?4190654.X)。 該專利報道了兩種新的嗜熱鏈球菌細菌素氨基酸序列，這兩種細菌素的信號肽、編碼細菌素 的核苷酸序列，特別是編碼具有SEQ ID N0:3順序細菌素的操縱子、產(chǎn)生至少一種該細菌素 的菌株，特別是CNCM I-1351菌株、含有至少一種該細菌素上清提取液的生產(chǎn)方法，該細菌 素在食品，特別是乳酪和酸奶以及化妝品生產(chǎn)中用作抗病原體的活性劑，其提取方法采用的 是三氯醋酸沉淀法。
國外一些文獻有對嗜熱鏈球菌產(chǎn)細菌素相關(guān)報道。Olivier Mareiset等人報道了采用裝填 15-Phe樹脂的HR16/10色譜柱從嗜熱鏈球菌發(fā)酵液中分離純化嗜熱鏈球菌細菌素13,該細菌素 是由抗菌肽ThmA和加強因子ThmB組成的。A. G. Mathot等分離到產(chǎn)細菌素的嗜熱鏈球菌580， 該菌產(chǎn)的細菌素對熱不穩(wěn)定，60 'C熱處理1 h后活性完全喪失。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目標是提供一種新型嗜熱鏈球菌細菌素的生產(chǎn)方法。
本發(fā)明提供的嗜熱鏈球菌細菌素是由嗜熱鏈球菌(5^e/ tocoo^s AemopM^) CGMCC 1.1864發(fā)酵生產(chǎn)并經(jīng)分離純化后得到的。
嗜熱鏈球菌細菌素的發(fā)酵生產(chǎn)方法采用的培養(yǎng)基為改良MRS培養(yǎng)基，其組成為葡萄 糖10~30 g/L、蛋白胨1~10 g/L、牛肉膏1~10 g/L、酵母膏0.5~5 g/L、 K2HP04'3H20 0.1~2 g/L、 乙酸鈉0.5 5g/L、擰檬酸銨0.1~2 g/L、 MgS04.7H20 0.01~0.58 g/L、 MnSO40.01 0.25 g/L、 吐溫-80 0.01~0.1 mL/L。
培養(yǎng)方式為三角瓶靜置培養(yǎng)或低速搖床振蕩培養(yǎng)，或發(fā)酵罐培養(yǎng)。
所述方法中的培養(yǎng)條件為28~37 'C，培養(yǎng)時間為12~36 h，培養(yǎng)至菌體密度約106~109 cfb/mL。
發(fā)酵得到的嗜熱鏈球菌細菌素按照以下方法進行純化
將按所述培養(yǎng)方法得到的發(fā)酵液調(diào)節(jié)pH 5.0-6.5， 4~30 'C振蕩2~12 h使細菌素充分吸附 到菌體上。然后，離心收集菌體，用pH6.0的磷酸鈉溶液(5mmol/L)洗滌菌體1~3次，最 后將菌體懸浮于pH 2.0的NaCl溶液(100mmol/L)中，振蕩5~12 h后離心去除菌體。取上 清液調(diào)節(jié)pH 6.0，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮10 20倍，所得細菌素粗提液采用Sephadex G-25層析柱 進一步除鹽和雜蛋白。凝膠層析洗脫條件為流速為0.5~2 mL/min,用去離子水進行洗脫， 合并收集的嗜熱鏈球菌細菌素活性峰溶液。
為了進一步描述嗜熱鏈球菌細菌素的特性，對抗菌活性進行了測定
測試菌株金黃色葡萄球菌、藤黃八疊球菌、李斯特氏菌、大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、 弗氏志賀氏菌、綠膿假單胞桿菌、干酪乳桿菌。
抑菌活性分析方法先在無菌平皿中倒入10mL加熱融化的素瓊脂(2%)，待其充分冷 卻凝固后，放入己滅菌的牛津杯數(shù)個，并按一定次序排列整齊。分別將培養(yǎng)好的測試菌株稀 釋至106~107 cfWmL,將滅菌好的15 mL固體MRS培養(yǎng)基冷卻至50 。C左右，加入測試菌液1 mL，迅速混合均勻，倒入放有牛津杯的平皿中，冷卻后用無菌鑷子取出牛津杯。將嗜熱鏈球 菌細菌素提取液100ixl加入到牛津杯形成的小孔中，37'C過夜培養(yǎng)，用游標卡尺測定抑菌圈 直徑。
實驗結(jié)果表明(如表1所示)，純化的嗜熱鏈球菌細菌素抑菌譜較廣，不但能抑制革蘭氏 陽性菌，對革蘭氏陰性菌也有抑制效果，還可以抑制部分芽孢桿菌。
4表1嗜熱鏈球菌細菌素抑菌譜指示菌來源抑菌圈直徑(mm)
金黃色葡萄球菌ATCC 6358915.10
藤黃八疊球菌CMCC 29001—
李斯特氏菌實驗室保藏12.02
大腸桿菌CGMCC 1,9013.84
鼠傷寒沙門氏菌CGMCC 1.117413.18
弗氏志賀氏菌CGMCC 1.186812.66
綠膿假單胞桿菌實驗室保藏14.02
干酪乳桿菌實驗室保藏15.12
對嗜熱鏈球菌細菌素的部分生物學特性進行了測定
(1) 對酶的敏感性將蛋白酶K、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、a-胰凝乳蛋白酶及cc-淀粉酶 分別配制成10 mg/mL的溶液，分別取100 |nl加入到400 pl嗜熱鏈球菌細菌素提取液中，使 各種酶的終濃度為2mg/mL， 37'C下處理4h，未加酶的嗜熱鏈球菌細菌素提取液作為對照， 檢測酶對嗜熱鏈球菌細菌素活性的影響。結(jié)果表明，嗜熱鏈球菌細菌素提取液經(jīng)以上各種酶 液處理后，無抑菌圈出現(xiàn)，即細菌素活性消失，對照抑菌圈直徑不變，表明嗜熱鏈球菌細菌 素為一種肽類物質(zhì)。
(2) 對酸的穩(wěn)定性將嗜熱鏈球菌細菌素提取液用5 mol/L HC1和5 mol/L NaOH調(diào)節(jié) pH為2.0 11.0。 37'C下溫育4h,再將pH調(diào)至6.0，分別測定其抑菌活性。結(jié)果表明，嗜熱 鏈球菌細菌素在pH3.0~9.0范圍內(nèi)活性保持穩(wěn)定，pH>9.0時活性降低。
(3) 對熱的穩(wěn)定性將嗜熱鏈球菌細菌素提取液在100'C處理2h，以未熱處理的樣品 為對照，測定其抑菌活性。結(jié)果表明活性基本不變。
具體實施例方式
下面用實例來說明本發(fā)明的技術(shù)方案，但不以實施例限制本發(fā)明。 實施例1
采用嗜熱鏈球菌(areptocoaw//^wo; Wto) CGMCC 1.1864生產(chǎn)嗜熱鏈球菌細菌素。 采用改良MRS液體培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基配方為葡萄糖30 g/L、蛋白胨10 g/L、牛肉膏5 g/L、
酵母膏5 g/L、 K2HP(V3H20 2 g/L、乙酸鈉5 g/L、檸檬酸銨2 g/L、 MgS04'7H20 0.58 g/L、
MnS04 0.25 g/L、吐溫-80 0.1 mL/L。 115 'C滅菌20 min。
首先在裝有50 mL改良MRS液體培養(yǎng)基三角瓶中接種嗜熱鏈球菌單菌落，30 'C靜置培
養(yǎng)8 h。將培養(yǎng)好的種子以1%接種量接入裝有200 mL改良MRS培養(yǎng)基的三角瓶中，30 'C下靜置培養(yǎng)36h，至菌體量達到108~10ycfii/mL。 實施例2
采用改良MRS液體培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基配方為葡萄糖20 g/L、蛋白胨5 g/L、牛肉膏2 g/L、 酵母膏10 g/L、 K2HP04.3H20 1 g/L、乙酸鈉1 g/L、檸檬酸銨1 g/L、 MgS04.7H20 0.1 g/L、 MnS04 0.05 g/L、吐溫-80 0.05 mL/L。 115 。C滅菌20 min。
首先在裝有50 mL改良MRS液體培養(yǎng)基三角瓶中接種嗜熱鏈球菌單菌落，28 °C ， 50 r/min 搖床振蕩培養(yǎng)6 h。將培養(yǎng)好的種子以2%接種量接入裝有200 mL改良MRS培養(yǎng)基的三角瓶 中，28°C， 50 r/min搖床振蕩培養(yǎng)18h，至菌體量達到108~109 cfu/mL。
實施例3
采用改良MRS液體培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基配方為葡萄糖20 g/L、蛋白胨1 g/L、牛肉膏2 g/L、 酵母膏5g/L、 K2HP04'3H20 1 g/L、乙酸鈉1 g/L、擰檬酸銨1 g/L、 MgS04.7H20 0.1 g/L、 MnS04 0.05 g/L、吐溫-80 0.1 mL/L。 115 。C滅菌20 min。
首先在裝有250mL改良MRS液體培養(yǎng)基的三角瓶中接種嗜熱鏈球菌單菌落，30 'C靜置 培養(yǎng)12h。將培養(yǎng)好的種子以lc/。接種量接入裝有16L改良MRS培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，30'C， 用無菌空氣維持罐壓0.5 MPa，培養(yǎng)16 h。
實例4
采用改良MRS液體培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基配方為葡萄糖10 g/L、蛋白胨1 g/L、牛肉膏1 g/L、 酵母膏0.5 g/L、K2HP04.3H20 0.1 g/L、乙酸鈉0.5 g/L、檸檬酸銨0.1 g/L、MgS04.7H20 0.01 g/L、 MnS04 0.01 g/L、吐溫-80 0.01 mL/L。 115 。C滅菌20 min。
首先在裝有50 mL改良MRS液體培養(yǎng)基三角瓶中接種嗜熱鏈球菌單菌落，37 。C靜置培 養(yǎng)8h。將培養(yǎng)好的種子以5。/。接種量接入裝有200mL改良MRS培養(yǎng)基的三角瓶中，37'C下 靜置培養(yǎng)12 h。
實例5
將所得發(fā)酵液用5 mol/LNaOH調(diào)節(jié)pH 5.0， 4 'C振蕩12 h使細菌素充分吸附到菌體上。 然后，5000 r/min離心10min收集菌體，用pH6.0的磷酸鈉溶液(5 mmol/L)洗滌菌體1次， 最后將菌體懸浮于pH 2.0的NaCl溶液(100 mmol/L)中，4 °C ， 150 r/min振蕩5 h后5000 r/min 離心10min去除菌體。取上清液用5mol/LNaOH調(diào)節(jié)至pH6.0，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮10 20倍， 所得細菌素粗提液采用Sephadex G-25層析柱進一步除鹽和雜蛋白。凝膠層析洗脫條件為 流速為0.5 mL/min，用去離子水進行洗脫。每4min接收l管。合并嗜熱鏈球菌細菌素活性 峰溶液。
實例6
6將所得發(fā)酵液用5 mol/LNaOH調(diào)節(jié)pH 6.5， 25 'C振蕩2 h使細菌素充分吸附到菌體上。 然后，5000 r/min離心10 min收集菌體，用pH6.0的磷酸鈉溶液(5 mmol/L)洗滌菌體1次， 最后將菌體懸浮于pH 2.0的NaCl溶液(100 mmol/L)中，25 °C 150 r/min振蕩10 h后5000 r/min離心10min去除菌體。取上清液用5 mol/LNaOH調(diào)至pH 6.0，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮10~20 倍，所得細菌素粗提液采用Sephadex G-25層析柱進一步除鹽和雜蛋白。凝膠層析洗脫條件 為流速為2mL/min，用去離子水進行洗脫。每2min接收l管。合并嗜熱鏈球菌細菌素活 性峰溶液。
實例7
將所得發(fā)酵液用5 mol/LNaOH調(diào)節(jié)pH 6.0, 30 'C振蕩6 h使細菌素充分吸附到菌體上。 然后，5000 r/min離心10 min收集菌體，用pH6.0的磷酸鈉溶液(5 mmol/L)洗滌菌體3次， 最后將菌體懸浮于pH 2.0的NaCl溶液(100 mmol/L)中，30 。C振蕩2 h后5000 r/min離心 10min去除菌體。取上清液用5mol/LNaOH調(diào)節(jié)至pH6.0，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮10 20倍，所得 細菌素粗提液采用Sephadex G-25層析柱進一步除鹽和雜蛋白。凝膠層析洗脫條件為流速 為lmL/min，用去離子水進行洗脫。每2min接收1管。合并嗜熱鏈球菌細菌素活性峰溶液。
權(quán)利要求
1、一種采用發(fā)酵法生產(chǎn)嗜熱鏈球菌細菌素的方法。其特征在于所述方法中的菌種為嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)CGMCC 1.1864，培養(yǎng)溫度為28～37℃，培養(yǎng)基為改良MRS培養(yǎng)基，其組成為葡萄糖10～30g/L、蛋白胨1～10g/L、牛肉膏1～10g/L、酵母膏0.5～5g/L、K2HPO4·3H2O 0.1～2g/L、乙酸鈉0.5～5g/L、檸檬酸銨0.1～2g/L、MgSO4·7H2O0.01～0.58g/L、MnSO40.01～0.25g/L、吐溫-800.01～0.1mL/L。培養(yǎng)方式為三角瓶靜置培養(yǎng)或低速搖床振蕩培養(yǎng)，或發(fā)酵罐培養(yǎng)。培養(yǎng)時間12～36h，培養(yǎng)至菌體密度約106～109cfu/mL。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，將發(fā)酵得到的嗜熱鏈球菌細菌素進行純化的方法。分離純化 的主要步驟包括pH吸附釋放法、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮、凝膠層析。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2的方法進行嗜熱鏈球菌細菌素純化。其特征在于將按所述培養(yǎng)方法 得到的發(fā)酵液調(diào)節(jié)pH 5.0~6.5， 4~30 'C振蕩2~12 h使嗜熱鏈球菌細菌素充分吸附到菌體上。
4、 根據(jù)權(quán)利要求2的方法進行嗜熱鏈球菌細菌素純化。其特征在于離心收集吸附了嗜 熱鏈球菌素的菌體，用pH6.0的磷酸鈉溶液(5mmol/L)洗滌菌體1~3次，最后將菌體懸浮 于pH2.0的NaCl溶液(100mmol/L)中，振蕩5~12 h后離心去除菌體。
5、 根據(jù)權(quán)利要求2的方法進行嗜熱鏈球菌細菌素純化。其特征在于取離心后上清液調(diào) 節(jié)pH6.0，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮10-20倍。
6、 根據(jù)權(quán)利要求2的方法進行嗜熱鏈球菌細菌素純化。其特征在于將所得細菌素粗提 液采用Sephadex G-25層析柱進一步除鹽和雜蛋白。凝膠層析洗脫條件為流速為0.5~2 mL/min，用去離子水進行洗脫，收集活性組分。
7、 該嗜熱鏈球菌細菌素對熱、酸穩(wěn)定，10(TC處理2h，活性基本不變，在pH3.0 9.0范 圍內(nèi)活性穩(wěn)定。抑菌譜較廣，可應(yīng)用于乳制品、肉制品、飲料、水果蔬菜、速凍食品、面食、 化妝品或洗滌用品、表抗菌材料、醫(yī)藥產(chǎn)品等。
全文摘要
本發(fā)明提供一種采用嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)CGMCC 1.1864發(fā)酵生產(chǎn)和提取嗜熱鏈球菌細菌素的方法。該方法包括將活化的嗜熱鏈球菌轉(zhuǎn)接入改良MRS培養(yǎng)基中，在合適溫度下培養(yǎng)一定時間得到含有嗜熱鏈球菌細菌素的發(fā)酵液。嗜熱鏈球菌細菌素的提取步驟主要包括利用嗜熱鏈球菌細菌素對生產(chǎn)菌的吸附作用對其進行粗提，然后利用凝膠層析除去無機鹽和雜蛋白進行精制。該提取方法簡單、成本低、分離效果好。
文檔編號C12P21/02GK101608201SQ20091006970
公開日2009年12月23日 申請日期2009年7月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月13日
發(fā)明者曹美娜, 琳 李, 王國良, 范寶慶, 莫治文, 譚之磊, 賈士儒 申請人:天津科技大學