專利名稱：一種通過誘變提高芽孢桿菌對鎘的耐受性的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種通過微生物誘變手段提高微生物對鎘的耐受性的方法。
背景技術：
鎘(Cd)是生物毒性極強的重金屬元素，與Pb、Cr、As和Hg合稱為“五毒”，位列第 二。近年來，現(xiàn)代工業(yè)的發(fā)展以及鎘在冶煉、化工、造紙和電子工業(yè)等方面的廣泛應用，使得 Cd污染日趨嚴重。因此，如何修復環(huán)境中的鎘污染，成為國內外研究的熱點。目前，關于微 生物修復鎘污染的研究主要集中于對耐鎘微生物的選擇策略上。傳統(tǒng)的耐鎘微生物的篩選 主要是采用“馴化”的方法，許多研究表明，在起始階段經(jīng)過“馴化”的微生物對鎘能表現(xiàn)出 較好的耐性，而在后期這種耐性卻幾乎消失。利用紫外誘變對微生物進行誘變處理，是簡單 有效的誘變育種技術。國內外主要是利用紫外線誘變育種技術來獲得大量高產的工業(yè)微生 物菌株，但是利用誘變技術來選育高效耐鎘微生物的研究較少。本發(fā)明的目的旨在提供一種通過微生物誘變手段提高微生物對鎘的耐受性，以修 復環(huán)境中鎘污染的新方法。

發(fā)明內容
針對目前選擇高效耐鎘微生物技術中存在的問題，本發(fā)明提供一種通過誘變手段 提高枯草芽孢桿菌對鎘的耐受性，從而修復環(huán)境中鎘污染的方法。本發(fā)明的一種通過紫外誘變提高枯草芽孢桿菌對鎘的耐受性的方法，其包括以下 步驟(1)將枯草芽孢桿菌進行預培養(yǎng)，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，經(jīng)200轉/分鐘振蕩 培養(yǎng)IOh后，離心去除培養(yǎng)基，用生理鹽水制備菌懸液。加入玻璃球振蕩分散，以脫脂棉過 濾，使形成單細胞，分散程度達90-95 %。(2)對步驟(1)中所制備的菌懸液3mL(l X IO6個/mL)置于直徑7cm的平底培養(yǎng) 皿中，進行紫外線誘變用15W功率的紫外燈管和固定距離為30cm的條件下照射5min后， 對誘變后的活菌落進行篩選，獲得對鎘具耐受性的突變芽孢桿菌。(3)對步驟(2)誘變后的突變菌株進行篩選的方法為濃度梯度平板初篩和搖瓶發(fā) 酵復篩相結合的兩步篩選法。步驟(1)中出發(fā)菌枯草芽孢桿菌對鎘的耐性濃度為0. 25mmol/L。步驟(1)的每升培養(yǎng)基以及步驟(3)的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基成分為，蛋白胨10g、氯化 鈉5g、牛肉膏5g、pH 7.2。步驟(3)的濃度梯度平板培養(yǎng)基成分為，每升含有蛋白胨10g、 氯化鈉5g、牛肉膏5g、瓊脂20g、pH 7.2。步驟(2)的15W功率的紫外燈管需預熱20min，以穩(wěn)定光波(254nm)；平底培養(yǎng)皿 應在磁力攪拌器上，控制溫度為37°C。步驟(3)的濃度梯度平板初篩和搖瓶發(fā)酵復篩的培養(yǎng)基中含鎘濃度0. 36mmol/L。本發(fā)明的優(yōu)點
本發(fā)明通過紫外誘變和兩次篩選，得到對高濃度鎘充分耐受的突變芽孢桿菌B38， 其對鎘的耐受濃度達到3mmol/L，是出發(fā)菌枯草芽孢桿菌的耐鎘濃度的12倍。通過本方法， 提高了芽孢桿菌對鎘的耐受性。
具體實施例方式出發(fā)菌枯草芽孢桿菌難以耐受高濃度的鎘。將出發(fā)菌紫外誘變后會形成耐鎘能力 不同的芽孢桿菌突變庫，其中很可能含有少量對鎘的耐受者，關鍵是將這部分在突變庫中 占極少比例的鎘的耐受型突變芽孢桿菌從大量無義突變中篩選出來，如果鎘耐受型突變芽 孢桿菌確實在突變庫中存在，將突變庫接入高濃度鎘的培養(yǎng)基后，鎘耐受型突變芽孢桿菌 就會生長，而大量無義突變芽孢桿菌則死亡，從而誘變并篩選得到鎘耐受型突變芽孢桿菌。以下通過實施例進一步對本發(fā)明進行描述實施例1:紫外誘變與第一次篩選將菌落數(shù)為1 X IO6個/mL的枯草芽孢桿菌桿菌ImL接種 于IOOmL液體牛肉膏蛋白胨中，放入250mL帶硅膠塞的三角瓶中，200r/min振蕩培養(yǎng)IOh 后。離心去除培養(yǎng)基，用生理鹽水制備菌懸液。加入玻璃球振蕩分散，以脫脂棉過濾，使形 成單細胞，分散程度達90-95%。將所制備的菌懸液3mL(lX106個/mL)置于直徑7cm的平 底培養(yǎng)皿中，放在37°C的磁力攪拌器上進行紫外線誘變。誘變開始前，須將15W功率的紫外 燈管預熱20min，以穩(wěn)定光波(254nm)。調節(jié)培養(yǎng)皿與燈管的距離為30cm，打開培養(yǎng)皿蓋，在 暗室進行誘變，誘變時間為5min。取誘變后的芽孢桿菌0. lmL，將菌液涂在含鎘0. 36mmol/ L的濃度梯度平板上，培養(yǎng)基平板成分為蛋白胨10g、氯化鈉5g、牛肉膏5g、瓊脂20g，在平 板上生長的菌落即為初次誘變成功的能耐受鎘的突變芽孢桿菌。第二次篩選對第一次誘變成功的能耐受鎘的初次突變芽孢桿菌和出發(fā)菌枯草芽 孢桿菌進行預培養(yǎng)。將菌落數(shù)為1 X IO6個/mL的初次突變芽孢桿菌ImL接種于IOOmL的 牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，接種兩份，一份含0. 36mmol/L的鎘，另一份不含鎘。分別放入 250mL三角瓶中，200r/min振蕩培養(yǎng)10h。在分光光度計上測定兩份搖瓶中微生物的0D_ 值，計算鎘對突變耐受微生物的致死率，其中致死率=(ODck-ODcd)/ODck, ODck代表菌株 在不含鎘培養(yǎng)基中的0D_值，ODcd代表菌株在含鎘培養(yǎng)基中的0D_值。按照上述步驟將 出發(fā)菌接種后，也進行搖瓶培養(yǎng)IOh后，計算鎘對出發(fā)菌的致死率。比較初次突變芽孢桿菌 和出發(fā)菌的致死率大小，挑選致死率小于出發(fā)菌的突變芽孢桿菌，即為高效耐鎘突變桿菌。 將第二次篩選出的耐鎘突變桿菌進行遺傳穩(wěn)定性試驗，共轉接10代，證明其是否是遺傳穩(wěn) 定的耐鎘突變桿菌。實例2 將菌落數(shù)為1 X IO6個/mL的耐鎘突變桿菌B38和出發(fā)菌，接種于IOOmL的含鎘 3mmol/L的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，在200r/min振蕩培養(yǎng)IOh后，B38突變桿菌可以生長， 而出發(fā)菌無法生長。最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的具體實施例子。顯然，本發(fā)明不 限于以上實施例子，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發(fā)明公開的內容直 接導出或聯(lián)想到的所有變形，均應認為是本發(fā)明的保護范圍。
權利要求
一種通過誘變提高芽孢桿菌對鎘的耐受性的方法，其特征依次包括以下步驟(1)將枯草芽孢桿菌進行預培養(yǎng)，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，經(jīng)200r/min振蕩培養(yǎng)10h后，離心去除培養(yǎng)基，用生理鹽水制備菌懸液。加入玻璃球振蕩分散，以脫脂棉過濾，使形成單細胞，分散程度達90 95％。(2)對步驟(1)中所制備的菌懸液3mL(106個/mL)置于直徑7cm的平底培養(yǎng)皿中，進行紫外線誘變用15W功率的紫外燈管和固定距離為30cm的條件下照射5min后，對誘變后的活菌落進行篩選，獲得對鎘具耐受性的突變芽孢桿菌。(3)對步驟(2)誘變后的突變菌株進行篩選的方法為濃度梯度平板初篩和搖瓶發(fā)酵復篩相結合的兩步篩選法。
2.根據(jù)權利要求1所述的通過誘變提高芽孢桿菌對鎘的耐受性的方法，其特征在于 步驟(1)中出發(fā)菌枯草芽孢桿菌對鎘的耐性為0.25mmol/L。
3.根據(jù)權利要求1所述的通過誘變提高芽孢桿菌對鎘的耐受性的方法，其特征在于 步驟(1)的每升液體培養(yǎng)基以及步驟(3)的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基成分為，蛋白胨10g、氯化鈉 5g、牛肉膏5g、pH 7.2。步驟(3)的濃度梯度平板固體培養(yǎng)基成分為，每升含有蛋白胨10g、 氯化鈉5g、牛肉膏5g、瓊脂20g、pH 7.2。
4.根據(jù)權利要求1所述的通過誘變提高芽孢桿菌對鎘的耐受性的方法，其特征在于 步驟(2)的15W功率的紫外燈管需預熱20min，以穩(wěn)定光波(254rm)；平底培養(yǎng)皿應在磁力 攪拌器上，控制溫度為37°C。
5.根據(jù)權利要求1所述的通過誘變提高芽孢桿菌對鎘的耐受性的方法，其特征在于 步驟(3)的濃度梯度平板初篩和搖瓶發(fā)酵復篩的培養(yǎng)基中含鎘濃度為0. 36mmol/L。
全文摘要
本發(fā)明涉及微生物育種方法，具體說涉及建立一種基于基因組改組技術進行真核和原核微生物原生質體多親本融合的方法。為實現(xiàn)本發(fā)明的目的采用的技術方案是首先對微生物進行人工誘變，經(jīng)篩選獲得對鎘具有高效抗鎘性能的突變微生物；接下來以具有高效抗鎘性能的突變微生物為出發(fā)菌株，采用細胞原生質體多親本融合方法，經(jīng)培養(yǎng)斜面孢子、菌株誘變、基因組改組、篩選、遞推式多次融合，獲得具有較好性狀抗鎘的菌株。采用本發(fā)明建立的細胞原生質體多親本融合方法，對抗鎘的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtillis)和熱帶假絲酵母菌(Candida tropicalis)進行改造，獲得2株抗鎘性能比Bacillus subtillis和Candida tropicalis大幅度提高的優(yōu)良融合菌株。
文檔編號C12R1/125GK101955925SQ20091006971
公開日2011年1月26日 申請日期2009年7月14日 優(yōu)先權日2009年7月14日
發(fā)明者姜春曉, 孫紅文, 張彥峰, 張清敏, 王婷 申請人:南開大學