專利名稱：Ck19單克隆抗體、其制備方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫學(xué)和生物醫(yī)藥領(lǐng)域。更具體而言，本發(fā)明涉及抗CK19單克隆抗體 的制備及其用途。
背景技術(shù)：
細(xì)胞角蛋白(Cytokeratin，CK)是構(gòu)成細(xì)胞骨架的一種中間絲狀物，幾乎所有上 皮細(xì)胞均可被其表達(dá)，用雙相膠電泳可將人類上皮細(xì)胞角蛋白分離出20個條帶，分別命名 為CK1 20，用單抗進(jìn)行免疫組化分析證實20種不同的角蛋白多肽在組織的分布具有特 異性。當(dāng)上皮細(xì)胞癌變時，CK組成不變但含量異常升高，20個細(xì)胞角蛋白中許多成員的片 段已作為腫瘤的血清學(xué)標(biāo)志物，腫瘤細(xì)胞中含量最豐富的是CK19，臨床上多以CK19和CK20 作為靶基因。其中細(xì)胞角蛋白19片斷(CK19)的研究最為引人注目。CK19屬酸性(I型)細(xì)胞角蛋白，分子量為40kDa，是單層上皮細(xì)胞特有的細(xì)胞骨 架結(jié)構(gòu)，在所有的單層上皮細(xì)胞中表達(dá)，在淋巴結(jié)和血細(xì)胞中不表達(dá)。CK19mRNA基因定位 于人染色體17q21 q23，編碼細(xì)胞角蛋白19亞型。作為循環(huán)上皮細(xì)胞的一個標(biāo)志物，它 也是早期癌癥微轉(zhuǎn)移研究中運用最多的分子標(biāo)志之一。CK19與CK7 —起被稱為膽管型CK。 CK19對肝細(xì)胞不著色，對膽管上皮和膽管癌(ICC)具有特異性染色，是目前診斷ICC最好的 免疫組化標(biāo)志物。目前，臨床上用的針對CK19的抗體主要是用MCF-7細(xì)胞系免疫動物制備而來的， 該方法制備工藝繁瑣，篩出特異性抗體的難度較大，成本相對較高。因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)出可簡單有效地生產(chǎn)高純度、高親和力CK19單克隆抗 體的方法，以及由該方法提供的單克隆抗體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一正是在于提供一種生產(chǎn)CK19單克隆抗體的方法。本發(fā)明的領(lǐng) 域目的在于提供由本發(fā)明方法制備的CK19單克隆抗體及其用途。在本發(fā)明的第一方面中，提供了一種CK19特異性單克隆抗體，所述的抗體的亞型 為 IgGl， k 。在本發(fā)明的一個實施方式中，所述單克隆抗體由選自下組的雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生 CCTCC-C200923、CCTCC-C200924 或 CCTCC-C200925。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的單克隆抗體特異地累積于膽管上皮或膽管癌 中。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的單克隆抗體是用原核系統(tǒng)表達(dá)的CK19抗原免 疫動物制得的。在本發(fā)明的第二方面中，提供了一種產(chǎn)生CK19特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞， 其選自CCTCC-C200923、CCTCC-C200924 或 CCTCC-C200925。在本發(fā)明的第三方面中，提供了一種制備本發(fā)明單克隆抗體的方法，所述方法包括如下步驟(a)構(gòu)建特異性表達(dá)CK19蛋白的原核表達(dá)系統(tǒng)；(b)由所述原核表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生CK19蛋白；(c)用步驟(b)中所產(chǎn)生的CK19蛋白免疫動物；(d)用被免疫動物的脾細(xì)胞制備特異性表達(dá)CK19的雜交瘤細(xì)胞；和(e)從步驟(d)的雜交瘤細(xì)胞中制得本發(fā)明所述的單克隆抗體。在本發(fā)明的一個實施方式中，所述原核表達(dá)系統(tǒng)是大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)。在本發(fā)明的另一個實施方式中，所述方法還包括在步驟(d)之前，對CK19蛋白進(jìn) 行純化的步驟。在一個優(yōu)選例中，純化所用的方法是包涵體變性純化，且在用8M尿素溶解包涵體 之前先用2M尿素洗滌包涵體，再用8M尿素溶解包涵體Ni柱親和純化，從而使得純化所得 蛋白的純度高于未用2M尿素洗滌的純化所得的蛋白。在本發(fā)明的第四方面中，提供了一種制備CK19特異性單克隆抗體的方法，所述的 方法包括步驟(1)培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞系 CCTCC-C200923、CCTCC-C200924 或 CCTCC-C200925，使之分
泌單克隆抗體；(2)分離步驟(1)中獲得的單克隆抗體。在本發(fā)明的第五方面中，提供了一種免疫偶聯(lián)物，該免疫偶聯(lián)物含有本發(fā)明的單 克隆抗體，以及選自下組的偶聯(lián)部分藥物、毒素、細(xì)胞因子、放射性核素或酶。在本發(fā)明的第六方面中，提供了一種檢測條或檢測試劑盒，其含有本發(fā)明的單克 隆抗體、本發(fā)明的免疫偶聯(lián)物、或它們與可檢測標(biāo)記物的結(jié)合物。在一個優(yōu)選例中，所述可檢測標(biāo)記物選自膠體金標(biāo)記、熒光標(biāo)記、同位素標(biāo)記、酶 標(biāo)記，優(yōu)選所述酶標(biāo)記為HRP酶標(biāo)。在本發(fā)明的第七方面中，提供了本發(fā)明單克隆抗體或本發(fā)明免疫偶聯(lián)物在制備用 于檢測樣品中CK19存在的檢測條或檢測試劑盒中的用途。在一個優(yōu)選例中，所述檢測條或檢測試劑盒用于檢測膽管癌或早期癌癥微轉(zhuǎn)移。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見 的。


圖1 :CK19蛋白原核表達(dá)的技術(shù)路線示意圖。其中，提交數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)如下DNA圖譜:lkb，100bp標(biāo)記物(marker)、基因引物和TA引物PCR(克隆到T載體)、 基因引物和雙酶切(克隆到表達(dá)載體)SDS-PAGE 標(biāo)記物、未誘導(dǎo)、誘導(dǎo)后、上清、沉淀、純化后純度驗證重組質(zhì)粒DNA圖譜標(biāo)記物，重組質(zhì)粒(50 u l,conc 300 u g/ml)，只保存用于大量 純化的表達(dá)質(zhì)粒甘油菌保存15%甘油保存(方法見方案protocol)。圖2 由肝癌組織PCR擴增cDNA的TaqPCR產(chǎn)物的電泳圖(1 %瓊脂糖凝膠)。其 中，左側(cè)為分子量標(biāo)記M，右側(cè)所示為CK19 (約1. 3kb)。
圖3 表達(dá)質(zhì)粒ckl9-pet28a構(gòu)建中的載體引物TaqPCR驗證的電泳圖(核酸膠電 泳瓊脂糖膠)。其中，1-8所示為不同的克隆，M為分子量標(biāo)記，7號為陽性克隆(擴增出大 小正確的目的片段)。圖4 由圖3的7號克隆抽取的ckl9-pet28a質(zhì)粒的雙酶切驗證的電泳圖(核酸 膠電泳瓊脂糖膠)。圖5 快速誘導(dǎo)蛋白的SDS-PAGE分析結(jié)果。圖6 :Ni-NTA變性親和層析柱純化蛋白的檢測結(jié)果。圖7 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測抗原的結(jié)果，其中所用一抗為抗his單 抗(購自TIANGEN公司)。圖8 蛋白質(zhì)印跡法檢測S-66-5、S-71-9和S-163-6三株單抗的原核表達(dá)CK19蛋 白的結(jié)果。圖9 :CK19單克隆抗體應(yīng)用膽管癌組織切片的膽管癌免疫組化。其中，三角箭頭所 指區(qū)域為癌組織，開放式箭頭所指為癌旁組織(即為陰性對照)。生物材料保藏本發(fā)明的雜交瘤細(xì)胞系已于2009年4月30日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心 (CCTCC，武漢大學(xué))，其培養(yǎng)物名稱與對應(yīng)的保藏號如下所示
具體實施例方式本發(fā)明人經(jīng)長期而深入的研究，構(gòu)建了特異性表達(dá)CK19蛋白的原核表達(dá)系統(tǒng)，并 利用該表達(dá)系統(tǒng)所產(chǎn)生的CK19蛋白作為抗原免疫動物制備了對CK19具有高親和力的單克 隆抗體。在此基礎(chǔ)上，發(fā)明人完成了本發(fā)明。具體而言，本領(lǐng)域中已知原核表達(dá)系統(tǒng)存在目的蛋白純化困難、以及原核表達(dá)系 統(tǒng)翻譯后加工修飾體系不完善，表達(dá)產(chǎn)物的生物活性較低的缺陷。因此，本領(lǐng)域在CK19抗 體制備時，采用的是真核表達(dá)系統(tǒng)，例如MCF-7細(xì)胞系。然而，采用真核表達(dá)系統(tǒng)制備工藝 繁瑣，篩選出特異性抗體的難度極大，成本也較高。本發(fā)明人通過研究意外地發(fā)現(xiàn)，通過構(gòu)建CK19原核表達(dá)系統(tǒng)不僅可獲得易于純 化的CK19蛋白，且所述蛋白對CK19具有高親和力，可用于制造和篩選特異性的親和力高的 抗體。并且，免疫組化結(jié)果顯示，用本發(fā)明方法制備的單克隆抗體特異性針對CK19，可以用 于臨床膽管癌的病理學(xué)檢測。CK19原核表汰系統(tǒng)及其表汰的CK19蛋白如本文所用，術(shù)語“原核表達(dá)系統(tǒng)”是指以原核細(xì)胞為表達(dá)宿主表達(dá)目的蛋白的系統(tǒng)，該術(shù)語與“真核表達(dá)系統(tǒng)”相對。代表性的原核表達(dá)系統(tǒng)是大腸桿菌(E.coli)表達(dá)系 統(tǒng)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，大腸桿菌因其遺傳學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)方面已被充分了解而 成為原核表達(dá)基因工程蛋白的首選表達(dá)系統(tǒng)。由本發(fā)明CK19原核表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的CK19蛋白具有高親和力和對CK19蛋白的高 特異性，可用于制造和篩選特異性的親和力高的抗體。與真核表達(dá)系統(tǒng)(如MCF-7表達(dá)系 統(tǒng))相比，本發(fā)明的CK19表達(dá)系統(tǒng)具有表達(dá)量高、易于擴大再生產(chǎn)、成本低廉等優(yōu)點。在本發(fā)明的方法中，優(yōu)選對所獲得的CK19蛋白進(jìn)行純化以提供高純度的蛋白產(chǎn) 品。可采用本領(lǐng)域中熟知的蛋白質(zhì)純化方法，這些方法包括但不限于蛋白A-S印harose、 羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析、離子交換層析、疏水層析、分子篩層析或親和層析。在本發(fā)明中還提供了一種改進(jìn)的純化方法，所述方法基于包涵體變性純化，在用 8M尿素溶解包涵體之前先用2M尿素洗滌包涵體，再用8M尿素溶解包涵體Ni柱親和純化。 研究結(jié)果表明，用2M尿素洗滌純化所得的CK19蛋白的純度高于未用2M尿素洗滌的純化所 得的蛋白。單克降抗體及雜交瘤細(xì)胞系本文所用的術(shù)語“單克隆抗體”是指獲自基本上同源的抗體群的抗體，即，組成該 群體的抗體個體都相同，除了可能存在少量可能的自發(fā)突變。因此，修飾語“單克隆”是指 該抗體的性質(zhì)不是離散抗體的混合物。本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，本發(fā) 明由原核表達(dá)產(chǎn)生的CK19抗原，可被施用于動物以誘導(dǎo)單克隆抗體的產(chǎn)生。對于單克隆抗 體，可利用雜交瘤技術(shù)來制備(見Kohler等人，Nature256 ；495，1975 ；Kohler等人，Eur. J. Immunol. 6 :511,1976 ；Kohler 等人，Eur. J. Immunol. 6 :292,1976 ；Hammer ling 等人，In Monoclonal Antibodies and TCell Hybridomas, Elsevier, N. Y. , 1981) ^nTffiMSDNA 法(美國專利號4，816，567)制備。代表性的骨髓瘤細(xì)胞是有效融合、通過選擇的抗體產(chǎn)生細(xì)胞支持抗體的穩(wěn)定高水 平產(chǎn)生、且對培養(yǎng)基(HAT培養(yǎng)基基質(zhì))敏感的那些骨髓瘤細(xì)胞，包括骨髓瘤細(xì)胞系，例如 鼠類的骨髓瘤細(xì)胞系，包括衍生自M0PC-21和MPC-Il小鼠腫瘤的骨髓瘤細(xì)胞系(可購自 Salk Institute Cell Distribution Center，圣地亞哥，加利福尼亞，美國)以及 SP_2、NZ0 或 X63-Ag8-653 細(xì)胞(可購自 American Type Culture Collection，洛克維爾，馬里蘭，美 國)。人骨髓瘤和小鼠-人雜合骨髓瘤細(xì)胞系也已被描述用于產(chǎn)生人單克隆抗體[Kozbor， J. Immunol. ,133 =3001(1984) ；Brodeur 等，單克隆抗體的生產(chǎn)技術(shù)和應(yīng)用(Monoclonal Antibodies Production Techniques and Applications),51-63 頁(Marcel Dekker, Inc.，紐約，1987)]。對雜交瘤細(xì)胞生長于其中的培養(yǎng)基進(jìn)行分析以檢測具有所需特異性的單克隆 抗體的產(chǎn)生，如，通過體外結(jié)合分析例如，酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)或放射免疫分析 (RIA)，單克隆抗體的結(jié)合親和力例如可用Munson等，Anal. Biochem.，107 =220(1980)的 Scatchard分析來測定。表達(dá)抗體的細(xì)胞的位置可用FACS進(jìn)行檢測。然后，可將雜交瘤 克隆通過有限稀釋步驟形成亞克隆(subcloned)，并通過標(biāo)準(zhǔn)方法生長(Goding，單克隆 抗體(Monoclonal Antibodies)原則禾口實踐(Principles and Practice), Academic Press (1986) 59-103頁)。為了達(dá)到這一目的而使用的適合的培養(yǎng)基包括，例如，DMEM或RPMI-1640培養(yǎng)基。此外，雜交瘤細(xì)胞可在動物體內(nèi)作為腹水瘤生長。由亞克隆分泌的單克隆抗體從培養(yǎng)基、腹水或血清中通過常規(guī)的免疫球蛋白純化 工藝適當(dāng)?shù)氐玫椒蛛x，這些純化工藝為例如，蛋白A-瓊脂糖法(proteinA-S印harose)、羥 基磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析。在本發(fā)明的實施方式中，提供了用本發(fā)明原核表達(dá)的CK19制備而得的三 種抗CK19的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株S-66-5 (保藏編號CCTCC-C200923)、雜交 瘤細(xì)胞株S-71-9(保藏編號CCTCC-C200924)和雜交瘤細(xì)胞株S-163-6 (保藏編號 CCTCC-C200925)，經(jīng)鑒定它們的亞型均為IgGl，κ。本發(fā)明的一個優(yōu)選的方案中，單克隆抗體采用培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞方法制備。取雜 交瘤細(xì)胞培養(yǎng)的上清液，經(jīng)飽和硫酸銨沉淀法粗提出IgG，再將粗提的抗體經(jīng)親和層析柱 (Protein G-Sephrose)純化。本發(fā)明的一個優(yōu)選的方案中，單克隆抗體采用Balb/C小鼠腹水生產(chǎn)單克隆抗體 的方法制備。將約IO6-IO7個雜交瘤細(xì)胞接種到致敏的小鼠腹腔內(nèi)，2-4周內(nèi)可見腹部明顯 脹大。抽取腹水，經(jīng)飽和硫酸銨沉淀法粗提出IgG，再將粗提的抗體經(jīng)親和層析柱(Protein G-Sephrose)純化。在獲得CK19單克隆抗體后，可對其進(jìn)行標(biāo)記或進(jìn)一步修飾，例如可采用膠膠體金 標(biāo)記、熒光標(biāo)記、同位素標(biāo)記、酶標(biāo)記等進(jìn)行標(biāo)記，優(yōu)選所述酶標(biāo)記為HRP酶標(biāo)(曾立波、 陳連康等《關(guān)于建立度冷丁單克隆抗體的研究》第三屆全國毒物分析學(xué)術(shù)交流會論文選， 289-294，中國人民公安大學(xué)出版社2000年9月；朱立平、陳學(xué)清《免疫學(xué)常用實驗方法》
2000 ^Ξ 3 ^ ；Ed Harlow, David Lane, Using Antibodies :A Laboratory
Manual. 1999)。檢測板或檢測試劑盒可將本發(fā)明的單克隆抗體用于制備檢測CK19存在或濃度的檢測板或檢測試劑 盒。采用本發(fā)明的檢測板和檢測試劑盒可檢測與CK19表達(dá)相關(guān)的疾病或征狀，例如膽管 癌、早期癌癥微轉(zhuǎn)移等。本發(fā)明的檢測板或試劑盒可采用本領(lǐng)域常用的檢測板或檢測試劑盒材料，采用常 規(guī)的檢測板或試劑盒制備方法制成。例如，本發(fā)明的檢測板，可包括測試條和支撐測試條的支撐板，如可采用PVC聚脂 膠板等；所述的測試條由濾樣紙、層析材料、硝酸纖維素膜和吸水紙依次搭接組成，搭接部 位可以采用常規(guī)的方法，如膠帶等固定連接；其中層析材料預(yù)包被帶有有色標(biāo)記或其它 可觀測標(biāo)記(例如膠體金標(biāo)記)的本發(fā)明抗CK19單克隆抗體。硝酸纖維素膜上吸附檢測 線和質(zhì)控線；所述的檢測線為抗CK19單克隆抗體，檢測線所在的區(qū)域為檢測區(qū)；所述的質(zhì) 控線為羊抗鼠多克隆抗體，質(zhì)控線所在的區(qū)域為質(zhì)控區(qū)。因此，測試條上的檢測物依次為 預(yù)包被的單克隆抗體、檢測線和質(zhì)控線。本發(fā)明的檢測板或檢測試劑盒所針對的生物樣品可以是獲自患者的新鮮組織、福 爾馬林固定或石蠟包埋組織、體液、血液、或細(xì)胞等，優(yōu)選為新鮮組織、福爾馬林固定或石蠟 包埋組織。這些樣品可為切片、涂片、懸液、溶液等適于檢測的各種形式存在，例如在結(jié)合免 疫組織化學(xué)的檢測中，優(yōu)選采用石蠟切片標(biāo)本。優(yōu)選在采集樣品前，所述患者未經(jīng)臨床治療。
用于本發(fā)明中的檢測方法優(yōu)選免疫組織化學(xué)檢測法，該方法可極為簡便而有效地 檢測并確定樣品中表達(dá)的狀況，非常適用于臨床應(yīng)用?？筛鶕?jù)多種檢測原理和方法，按照需要在試劑盒中配備檢測所需的試劑或試劑 組。在本發(fā)明中，“試劑組”是指包含了檢測所需的多種試劑的試劑組合。此外，本發(fā)明的試劑盒還可根據(jù)需要包括容器、對照物(包括陽性或陰性對照)、 使用說明書、緩沖劑、免疫助劑等，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)具體情況對其進(jìn)行選擇。本發(fā)明的優(yōu)點1.本發(fā)明采用原核蛋白表達(dá)系統(tǒng)來制備CK19抗原，具有表達(dá)量高、易于擴大再生 產(chǎn)、成本低廉等優(yōu)點；2.用本發(fā)明原核系統(tǒng)表達(dá)出的CK19抗原免疫動物制備單克隆抗體，生產(chǎn)工藝簡 單，可以篩選出特異性的親和力高的抗體，生產(chǎn)成本相對較低；3.本發(fā)明的單克隆抗體可特效性地用于臨床膽管癌的病理學(xué)檢測。實施例下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條 件如Sambrook等人《分子克隆實驗室指南》ew York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和 份數(shù)按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意 義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所 述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。實施例1. CK19蛋白的原核表達(dá)CK19蛋白的原核表達(dá)的總體技術(shù)路線可參見圖1，其具體步驟如下(1)基因克隆參考《分子克隆實驗指南》記載的方法，從人肝癌組織中抽取RNA，然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。使用CK19特異性引物進(jìn)行PCR擴增引物 1 (正義引物)5，-TCCCGCGAATCGCAGCTTCT-3，引物 2 (反義引物)5，-AAAGGACAGCAGAAGCCCCAGAGC-3，。PCR 體系50iil2Xpfu PCR Master Mix 25 u 1模板(抽提的RNA)2 ill引物 12 ill引物 22 illddH2019 illPCR 步驟94 °C4min
4°C
7min 5minPCR產(chǎn)物的檢測采用瓊脂糖凝膠電泳法進(jìn)行，所用凝膠為1 %瓊脂糖凝膠，分子量 標(biāo)記為購自TIANGEN公司的100bp-1500bp范圍的標(biāo)記物。電泳結(jié)果如圖2所示，結(jié)果顯示 由從肝癌組織PCR擴增cDNA的TaqPCR產(chǎn)物中包含大小約為1. 3Kb的CK19。然后將PCR擴增產(chǎn)物克隆到T載體(購自Promega公司)里測序(在Invitrogen 公司測序)。測序結(jié)果表明，序列正確。(2)表達(dá)質(zhì)粒ckl9_pet28a的構(gòu)建將步驟(1)中獲得的CK19目的片段基因連接(參考Sambrook等人《分子克隆實 驗指南》)到表達(dá)載體pet28a中，然后轉(zhuǎn)化入DH5a中，隨機挑取8個克隆進(jìn)行載體引物PCR
驗證。
PCR驗證實驗的條件如下
PCR 體系25ii 1
2XTaq PCR Master Mix12. 5u 1
模板(菌液)2u 1
引物11 u 1
引物21 u 1
ddH208. 5u 1
PCR步驟
94 °C4min

72 °C
4°C
7min 5min
PCR驗證結(jié)果如圖3所示，結(jié)果顯示電泳圖譜中7號泳道所對應(yīng)的克隆為陽性克 隆，其中擴增出大小正確的目的片段(即CK19)。將上述的7號克隆在卡那霉素抗性(50ug/ml)的LB培養(yǎng)基中搖菌培養(yǎng)(37°C， 8-12小時)，用小抽試劑盒(購自TIANGEN公司)抽取ckl9_pet28a質(zhì)粒，雙酶切(BamH I 和Sal I，購自寶生物公司)驗證目的基因是否正確連在載體上。結(jié)果如圖4所示，結(jié)果顯 示在1. 3KB大小處有目的帶，證明目的基因正確連在載體上。(3)CK19蛋白誘導(dǎo)表達(dá)1.用步驟2中所得的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21菌后，用IPTG快速誘導(dǎo)表達(dá)。目的基因 所編碼的蛋白約為40KD，PET-28a載體上，目的蛋白加上載體上His tag等，整個蛋白的大小是47KD左右，即重組蛋白最后的分子量約為47KD?？焖僬T導(dǎo)的目的是為檢測該重組質(zhì)粒在BL21中是否能被誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白，并 確定在不同IPTG濃度蛋白誘導(dǎo)效率的差異。具體實驗過程如下a.挑取單克隆菌落(表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21后挑取的克隆)于7ml含有相應(yīng)抗生素 (卡那霉素，50ug/ml)LB培養(yǎng)液的50ml培養(yǎng)管中，37°C振蕩培養(yǎng)過夜(8_16h)；b. 37°C下，用0. lmM、0. 5mM或ImM的IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)取700 yl過夜搖菌，加 入7ml含有相應(yīng)抗生素LB培養(yǎng)液(卡那霉素，50ug/ml)的50ml離心管中，于0D6(1(1 = 0. 4 0.6時，加入相應(yīng)濃度的IPTG;c.誘導(dǎo)前，在37 °C培養(yǎng)的菌液中取1ml未誘導(dǎo)的菌液作為對照，按1ml菌 液X OD600X 100 u 1的比例加入2 X上樣緩沖液，例如1ml OD600為0. 4的菌需加入40 yl的 緩沖液，混勻，-20°C保存或直接上樣；d.誘導(dǎo)3-4h后收集菌液，取lml樣品，測OD600, lOOOOrpm，離心1分鐘，去除上清 后，加入相應(yīng)體積(如c中計算)的2X上樣緩沖液；e.根據(jù)蛋白質(zhì)分子量大小配置相應(yīng)濃度的SDS-PAGE膠；將收集的菌液在水 (100°C )中煮5分鐘，取10 yl上樣；在120V的電壓下，進(jìn)行濃縮膠電泳，提高電壓至150V， 進(jìn)入分離膠(12%膠濃度)電泳，直到染料剛好走到膠底；f.取下膠，用考馬斯亮藍(lán)染色至少30分鐘，然后用脫色液脫色。各種濃度IPTG快速誘導(dǎo)的電泳結(jié)果如圖5所示，結(jié)果顯示不同濃度IPTG誘導(dǎo)后， 蛋白表達(dá)量無明顯區(qū)別。因此，在本實驗中選擇低濃度IPTG誘導(dǎo)，將IPTG的誘導(dǎo)濃度設(shè)定 為 0. ImM。(4)蛋白純化A.實驗步驟a.挑單克隆的菌落(用來誘導(dǎo)的克隆保藏的甘油菌)于50ml含有相應(yīng)的抗生素 LB培養(yǎng)液中，37°C振蕩培養(yǎng)過夜；b.取過夜培養(yǎng)的菌液，以1 100的比例(v/v)加入到1000ml含有相應(yīng)的抗生素 (卡那霉素，50ug/ml)LB培養(yǎng)液中，37°C振蕩培養(yǎng)至0D6(1(1達(dá)到0. 4 0. 6 ；c.加入IPTG誘導(dǎo)劑至終濃度為0. ImM, 37°C振蕩培養(yǎng)4h左右；d. 4°C，7000rpm離心15分鐘，去上清，將沉淀置于冰上，用冰上預(yù)冷的lXPBS(pH 7.0)重懸沉淀，每100ml菌液加入4ml 1XPBS。加入PMSF(苯甲基磺酰氟，分子式為 C7H7F02S，分子量為174. 19，上海雙向西巴斯科技有限公司)至終濃度為ImM，以抑制裂解物 中的蛋白酶；e.將重懸的沉淀置于冰上超聲(JY92-II超聲波破碎儀，寧波新芝公司)破碎 200W, 10s超聲，15s間隔，30循環(huán)，重復(fù)三次(共90循環(huán))，每次循環(huán)之間間隔2 3分鐘， 注意防止泡沫產(chǎn)生；f.4°C，12000rpm離心10分鐘，取沉淀純化。由于蛋白是表達(dá)在包涵體中，可采用 變性親和層析柱(Ni-NTA Agarose)(純化所用試劑盒購自GE公司)1.取超聲后的lml樣，用緩沖液B重懸后，置于旋轉(zhuǎn)混勻器上洗脫8小時。2.離心，15000rpm, lOmin，沉淀用lml的IXPBS重懸，取40ul加2X上樣緩沖液 用于跑SDS-PAGE看純度，結(jié)果顯示洗脫后，雜蛋白明顯減少，但為了提高純度，仍然用變性親和層析柱(Ni-NTA瓊脂糖)接著純化其余的目的蛋白。3.要純化的樣品用緩沖液B洗脫8h后，離心，15000rpm, 10min，4°C。4.沉淀用8mol/L尿素重懸，8mol/L尿素洗后，則包涵體溶解，目的蛋白溶于其中。5.離心，15000rpm，10min，4°C。取上清，0. 2um 濾膜中過濾。6.親和層析柱的處理先用IX PBS洗凈柱子上的乙醇，再加入珠子1ml左右(取 珠子前渦旋混合)，用1XPBS洗珠子兩次后，用8mol/L尿素再洗一次珠子。7.加剛才過濾后的樣品過柱。8.樣品過柱后，加珠子等體積的洗脫緩沖液與珠子混30分鐘以上，過柱，留洗脫 液，反復(fù)兩次9.上10ul樣，跑SDS-PAGE，染色，脫色看純化后純度。(裂解緩沖液可以使包含體裂解釋放出蛋白質(zhì)，并使蛋白質(zhì)結(jié)合到M珠上，洗滌 緩沖液可以將雜蛋白洗脫下來，洗脫緩沖液可以將目的蛋白從珠子上洗脫下來)g.用電泳和蛋白質(zhì)印跡法(一抗為抗his單抗，購自TIANGENG公司)按常規(guī)方法 檢測實驗各步驟中的樣品中的蛋白質(zhì)。B.實驗結(jié)果與分析圖6所示為實驗過程中各步驟取樣的電泳結(jié)果，其中第一泳道為分子量標(biāo)記 (14KD-94KD)，第二泳道為未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)時的樣品，第三泳道為經(jīng)IPTG誘導(dǎo)4小時的樣品， 第四泳道為經(jīng)超聲破碎后的上清液樣品，第五泳道為經(jīng)超聲破碎后的沉淀樣品，第六泳道 為經(jīng)Ni-NTA變性親和層析柱純化的蛋白樣品。圖7所示為實驗過程中各步驟取樣的蛋白質(zhì)印跡檢測結(jié)果，其中第一道為未經(jīng) IPTG誘導(dǎo)時的樣品，第二道為經(jīng)IPTG誘導(dǎo)4小時的樣品，第三道為經(jīng)超聲破碎后的上清液 樣品，第四泳道為經(jīng)超聲破碎后的沉淀樣品，第五泳道為經(jīng)Ni-NTA變性親和層析柱純化的 蛋白樣品。結(jié)果顯示，IPTG誘導(dǎo)后產(chǎn)生了所需分子量的目標(biāo)產(chǎn)物CK19蛋白，該蛋白存在于超 聲破碎樣品的沉淀中，經(jīng)M-NTA變性親和層析柱純化處理后已基本去除雜質(zhì)，獲得純CK19 蛋白。通過上述純化獲得15mg純CK19蛋白，用于進(jìn)一步的抗體制備。實施例2.單克隆抗體的制備實驗步驟(1)動物免疫用實施例1中所獲得的純化的重組CK19抗原免疫BALB/C小鼠 (8-12周，雌雄不限，實驗動物中心，5只)。免疫三次，每次間隔一個月左右。方法具體如 下選擇與所用骨髓瘤細(xì)胞同源的BALB/c健康小鼠，鼠齡在8_12周，雌雄不限?？?原為上述CK19蛋白。抗原原液濃度lmg/ml，Balb/C小鼠免疫劑量100ugCK19每只每次。 注射方式為肌肉多點注射。使用時用PBS或生理鹽水稀釋。免疫程序；0，3，6周三次免疫。 融合前三天取lOOug加PBS稀釋到0. 5ml腹腔注射，做回憶刺激。末次免疫三天后，分離脾 細(xì)胞用于融合。(2)雜交瘤的制備和篩選取免疫三次后的小鼠脾臟細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞按常規(guī)方 法用50% PEG進(jìn)行融合，經(jīng)間接ELISA方法篩選和克隆后，得到雜交瘤細(xì)胞株；
a.骨髓瘤細(xì)胞株的培養(yǎng)采用SP2/0細(xì)胞株，該細(xì)胞株生長及融合效率均佳，且其本身不分泌任何免疫球 蛋白重鏈或輕鏈。細(xì)胞的最高生長刻度為9X105/ml，倍增時間通常為10-15h。融合細(xì)胞 選擇在對數(shù)生長期、細(xì)胞形態(tài)和活性佳的細(xì)胞(活性大于95%)。骨髓瘤細(xì)胞株再融合前 先用含8-氮鳥嘌呤的培養(yǎng)基作適應(yīng)培養(yǎng)，在細(xì)胞融合的前一天用新鮮培養(yǎng)基為2X105/ml， 次日一般為對數(shù)生長期細(xì)胞。b.飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)在體外培養(yǎng)條件下，細(xì)胞的生長以來適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度。因而，在培養(yǎng)融合細(xì)胞活細(xì) 胞克隆化培養(yǎng)時，還需加其它飼養(yǎng)細(xì)胞(feeder cell)。所用飼養(yǎng)細(xì)胞為小鼠的腹腔細(xì)胞， 制備方法為用冰凍培養(yǎng)液注入小鼠腹腔，輕揉腹部數(shù)次，吸出后的液體中即含小鼠腹腔細(xì) 胞，其中有巨噬細(xì)胞和其它細(xì)胞。飼養(yǎng)細(xì)胞調(diào)至IX 105/ml，提前一天置板孔中培養(yǎng)。c.細(xì)胞融合回憶刺激后三天融合。細(xì)胞融合是雜交瘤技術(shù)的中心環(huán)節(jié)，基本步驟是將兩種細(xì)胞混合后加入PEG使細(xì) 胞彼此融合。其后用培養(yǎng)液稀釋PEG，消除PEG的作用。將融合后的細(xì)胞適當(dāng)稀釋，分置培 養(yǎng)板孔中培養(yǎng)。骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞的比值可以從1 2到1 10不等，我們用1 4的 比例，保證了兩種細(xì)胞在融合前都具有較高的活性。d.有限稀釋法篩選陽性株選用的骨髓瘤細(xì)胞為HAT敏感細(xì)胞株，所以只有融合的細(xì)胞才能持續(xù) 存活一周以上。融合細(xì)胞呈克隆生長，經(jīng)有限稀釋后(一般稀釋至0.8個細(xì)胞/孔)，按 Poission法計算，應(yīng)用的36%的孔為1個細(xì)胞/孔。細(xì)胞培養(yǎng)至覆蓋0%-20%孔底時，吸 取培養(yǎng)上清用ELISA檢測抗體分泌量，所用篩選用免疫所用抗原。首先把抗體的分泌量按 照0D45(I> 1劃分為陽性和陰性孔，對陽性克隆進(jìn)行克隆化；連續(xù)三次克隆化均為100%陽性 的克隆，再選做擴大培養(yǎng)或凍存。(3)腹水的制備每只小鼠腹腔注射0. 5ml pristine，7_10天后腹腔注射106個雜 交瘤細(xì)胞/只小鼠，再過7-10天后取腹水。方法具體如下取Balb/c小鼠，首先腹腔注射0.5ml液體石蠟或降植烷進(jìn)行預(yù)處理。1_2周后，腹 腔接種雜交瘤細(xì)胞。雜交瘤細(xì)胞在小鼠腹腔內(nèi)增殖，并產(chǎn)生和分泌單克隆抗體，約1-2周， 可見小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水，即可獲得大量單克隆抗體。(4)抗體純化將步驟(3)中所得的腹水先用硫酸銨鹽析法(《分子克隆實驗指 南》)初步純化后，再用G蛋白免疫親和層析進(jìn)一步純化。a.過濾取3ml腹水4000轉(zhuǎn)/秒離心，0. 2um濾嘴過濾。b.交換緩沖液根據(jù)凝膠過濾的原理，大分子量蛋白先洗脫出來，小分子量離子滯后洗脫出來的 原理。旨在將蛋白與原來的離子環(huán)境分開。方法具體如下(a)用5-10倍柱體積0. 02M磷酸鹽緩沖液洗滌脫鹽柱，將脫鹽柱內(nèi)部保護(hù)液徹底 洗干凈。洗滌速度5ml/min。
(b)將過濾好的樣品用注射器注入脫鹽柱，3ml/min。(c)用注射器將0.02M磷酸鹽緩沖液注入脫鹽柱，洗出液每1.5ml離心管收集 lml。直到洗出液0D28(1 < 0. 08。將所得洗脫液中0D28(1值> 0. 2的樣品收集起來并且混合。 緩沖液交換完畢。c.抗體純化(a)準(zhǔn)備20個1.5ml離心管，每個離心管中加入lOOul lMTris-HCl (pH = 8. 0)溶
液。用來盛裝后來的洗脫液。(b)用5-10倍柱體積0. 02M磷酸鹽緩沖液洗滌G蛋白抗體回收柱，將柱內(nèi)部保護(hù) 液徹底洗干凈。洗滌速度5ml/min。(c)將緩沖液交換完畢的樣品用注射器注入G蛋白抗體回收柱，lml/min。收集流 出液。(d)重復(fù)第二步操作兩次。(e)用注射器將0. 02M磷酸鹽緩沖液注入脫鹽柱，直到洗出液0D28(1 < 0. 08。(f)用0. 1M甘氨酸-HCl，pH = 2. 7洗脫該柱，lml/min。洗出液用準(zhǔn)備好的1. 5ml 離心管每個盛裝lml。直到洗出液0D28(1<0.08。將所得洗脫液中0D■值>0.2的樣品收 集起來并且混合。用PH試紙檢測收集液的pH值，用lMTris-HCl (PH = 8. 0)溶液調(diào)整到 7.0左右。測完濃度后分裝。實驗結(jié)果通過上述步驟，獲得了三株特異性分泌抗CK19抗體的雜交瘤細(xì)胞株S-66_5、 S-71-9 和 S-163-6(即 CCTCC-C200923、CCTCC-C200924 和 CCTCC-C200925)，經(jīng)鑒別其亞型 均為 IgGl, k。實施例3.單克隆抗體的功能檢測A.采用蛋白質(zhì)印跡法，以實施例2中所得三株單克隆抗體檢測原核表達(dá)CK19蛋白。實驗結(jié)果如圖8所示，結(jié)果顯示所得的三株單克隆抗體可以很好的識別免疫原。B.利用實施例2中所得的三株單克隆抗體對膽管癌組織樣品進(jìn)行免疫組化檢測膽管癌組織樣品獲自東方肝膽醫(yī)院病理科。根據(jù)常規(guī)方法進(jìn)行免疫組化實驗的方 法。結(jié)果如圖9所示，結(jié)果顯示這三株單克隆抗體都能特異性識別膽管癌上皮的CK19 抗原(深灰色部分代表陽性染色)。該結(jié)果表明，通過本發(fā)明獲得的單克隆抗體可用于臨床膽管癌的病理學(xué)檢測，也 可用于特異性表達(dá)CK19的其它病癥的檢測。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨 引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可 以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范 圍。
序列表<110>中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院<120>CK19單克隆抗體、其制備方法及用途<130)092114
attCttggtgccaccattgagaactccaggattgtcctgcagategac603
lieLeuGlyAlaThrlieGluAsnSerArglieValLeuGlnlieAsp
145150155
aatgccCgtCtggetgcagatgacttccgaaccaagtttgagacggaa651
AsnAlaArgLeuAlaAlaAspAspPheArgThrLysPheGluThrGlu
160165170
caggetCtgCgCatgagegtggaggccgacateaacggcctgCgCagg699
GlnAlaLeuArgMetSerValGluAlaAsplieAsnGlyLeuArgArg
175180185
gtgCtggatgagCtgaccCtggccaggaccgacctggagatgcagate747
ValLeuAspGluLeuThrLeuAlaArgThrAspLeuGluMetGlnlie
190195200
gaaggcCtgaaggaagagCtggcctacctgaagaagaaccatgaggag795
GluGlyLeuLysGluGluLeuAlaTyrLeuLysLysAsnHisGluGlu
205210215220
gaaateagtacgCtgaggggccaagtgggaggccaggtcagtgtggag843
GlulieSerThrLeuArgGlyGlnValGlyGlyGlnValSerValGlu
225230235
gtggattccgetCCgggcaccgatctcgccaagatectgagtgacatg891
ValAspSerAlaProGlyThrAspLeuAlaLyslieLeuSerAspMet
240245250
cgaagecaatatgaggtcatggccgagcagaaceggaaggatgetgaa939
ArgSerGlnTyrGluValMetAlaGluGlnAsnArgLysAspAlaGlu
255260265
gcctggttcaccageeggactgaagaattgaacegggaggtcgetggc987
AlaTrpPheThrSerArgThrGluGluLeuAsnArgGluValAlaGly
270275280
cacacggagcagctccag atgageaggtccgaggtt act gac ctg egg1035
HisThrGluGln Leu Gln Met Ser Arg Ser Glu ValThr Asp Leu Arg
285290295300
CgCaccCttcagggtCttgagattgagctgcagtea ιzag ctg age atg1083
ArgThrLeuGLn Gly Leu GlulieGluLeuGlnSerGlnLeuSerMet
305310315
SlSlSlgetgccttggaagacacaCtggcagaaacggag ι^cg cgc ttt gga1131
LysAlaAlaLeu Glu Asp Thr Leu Ala Glu Thr Glu Ala Arg Phe Gly
320325330
gcccagCtggcgcatatecaggcgctg ateageggt att gaa gcc cag1179
AlaGlnLeuAlaHislieGlnAlaLeulie Ser GlylieGluAlaGln
335340345[0273Ctgggcgatgtgcgagetgatagtgageggcagaat cag gag tac cag1227[0274LeuGlyAspValArgAlaAsp Ser Glu Arg Gln Asn Gln Glu Tyr Gln[0275350355360[0276eggctcatggacateaagtcgeggCtggagcaggag att gcc acc tac1275[0277ArgLeuMetAsplieLysSer Arg Leu Glu Gln Glulie Ala Thr Tyr[0278365370375380[0279CgCageCtgctcgagggacaggaagatcactacaac aat ttg tct gcc1323[0280ArgSerLeuLeuGluGlyGln Glu Asp His Tyr Asn Asn Leu Ser Ala[0281385390395[0282tccaaggtcctctgaggcagcaggc tctggggctt ctgctgtcctttggagggtg1378[0283SerLysValLeu[0284400[0285tcttctgggt agagggatgg gaaggaagggacccttaccc ccggctcttctcctgacctg1438[0286ccaataaaaa tttatggtcc aagggaaaaaSLSLSLSLSLSLSLSLSLSL SLSLSLSLSLSLSLSLSLSLSLSLSLSLSLSLSLSLSLSL1498[0287SLSLSLSLSLSLSLSLSLSL SLSLSLSLSL1513[0288<210>2[0289<211>400[0290<212>PRT[0291<213> 智人(Homosapiens)[0292<400>2[0293MetThrSerTyrSerTyrArgGlnSerSerAlaThrSerSerPheGly[0294151015[0295GlyLeuGlyGlyGlySerValArgPheGlyProGlyValAlaPheArg[0296202530[0297AlaProSerlieHisGlyGlySerGlyGlyArgGlyValSerValSer[0298354045[0299SerAlaArgPheValSerSerSerSerSerGlyAlaTyrGlyGlyGly[0300505560[0301TyrGlyGlyValLeuThrAlaSerAspGlyLeuLeuAlaGlyAsnGlu[030265707580[0303LysLeuThrMetGlnAsnLeuAsnAspArgLeuAlaSerTyrLeuAsp[0304859095[0305LysValArgAlaLeuGluAlaAlaAsnGlyGluLeuGluValLyslie[0306100105110[0307ArgAspTrpTyrGlnLysGlnGlyProGlyProSerArgAspTyrSer[0308115120125[0309HisTyrTyrThrThrlieGlnAspLeuArgAspLyslieLeuGlyAla[0310130135140[0311ThrlieGluAsnSerArglieValLeuGlnlieAspAsnAlaArgLeu[0312145150155160[0313AlaAlaAspAspPheArgThrLysPheGluThrGluGlnAlaLeuArg[0314165170175[0315MetSerValGluAlaAsplieAsnGlyLeuArgArgValLeuAspGlu[0316180185190[0317LeuThrLeuAlaArgThrAspLeuGluMetGlnlieGluGlyLeuLys[0318195200205[0319GluGluLeuAlaTyrLeuLysLysAsnHisGluGluGlulieSerThr[0320210215220[0321LeuArgGlyGlnValGlyGlyGlnValSerValGluValAspSerAla[0322225230235240[0323ProGlyThrAspLeuAlaLyslieLeuSerAspMetArgSerGlnTyr[0324245250255[0325GluValMetAlaGluGlnAsnArgLysAspAlaGluAlaTrpPheThr[0326260265270[0327SerArgThrGluGluLeuAsnArgGluValAlaGlyHisThrGluGln[0328275280285[0329LeuGlnMetSerArgSerGluValThrAspLeuArgArgThrLeuGln[0330290295300[0331GlyLeuGlulieGluLeuGlnSerGlnLeuSerMetLysAlaAlaLeu[0332305310315320[0333GluAspThrLeuAlaGluThrGluAlaArgPheGlyAlaGlnLeuAla[0334325330335[0335HislieGlnAlaLeulieSerGlylieGluAlaGlnLeuGlyAspVal[0336340345350[0337ArgAlaAspSerGluArgGlnAsnGlnGluTyrGlnArgLeuMetAsp[0338355360365[0339lieLysSerArgLeuGluGlnGlulieAlaThrTyrArgSerLeuLeu[0340370375380[0341GluGlyGlnGluAspHisTyrAsnAsnLeuSerAlaSerLysValLeu[0342385390395400
1權(quán)利要求
一種CK19特異性單克隆抗體，所述的抗體的亞型為IgG1，κ。
2.如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體，其特征在于，所述單克隆抗體由選自下組的雜交 瘤細(xì)胞株產(chǎn)生CCTCC-C200923、CCTCC-C200924 或 CCTCC-C200925。
3 .一種產(chǎn)生CK19特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，其選自CCTCC-C200923、 CCTCC-C200924 或 CCTCC-C200925。
4.一種制備權(quán)利要求1所述的單克隆抗體的方法，其特征在于，它包括步驟(a)構(gòu)建特異性表達(dá)CK19蛋白的原核表達(dá)系統(tǒng)；(b)由所述原核表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生CK19蛋白；(c)用步驟(b)中所產(chǎn)生的CK19蛋白免疫動物；(d)用被免疫動物的脾細(xì)胞制備特異性表達(dá)CK19的雜交瘤細(xì)胞；和(e)從步驟(d)的雜交瘤細(xì)胞中制得權(quán)利要求1所述的單克隆抗體。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述原核表達(dá)系統(tǒng)是大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)。
6.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法還包括在步驟(d)之前，對CK19蛋 白進(jìn)行純化的步驟。
7.一種制備CK19特異性單克隆抗體的方法，所述的方法包括步驟(1)培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞系CCTCC-C200923、CCTCC-C200924 或 CCTCC-C200925，使之分泌單 克隆抗體；(2)分離步驟(1)中獲得的單克隆抗體。
8.一種免疫偶聯(lián)物，該免疫偶聯(lián)物含有權(quán)利要求1所述的單克隆抗體，以及選自下組 的偶聯(lián)部分藥物、毒素、細(xì)胞因子、放射性核素或酶。
9.一種檢測條或檢測試劑盒，其含有權(quán)利要求1所述的單克隆抗體、權(quán)利要求5所述的 免疫偶聯(lián)物、或它們與可檢測標(biāo)記物的結(jié)合物。
10.權(quán)利要求1所述單克隆抗體或權(quán)利要求5所述的免疫偶聯(lián)物在制備用于檢測樣品 中CK19存在的檢測條或檢測試劑盒中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及CK19單克隆抗體、其制備方法及用途，產(chǎn)生該單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株、包含CK19單克隆抗體的免疫偶聯(lián)物、檢測條或試劑盒。本發(fā)明的單克隆抗體是用原核系統(tǒng)表達(dá)的CK19抗原免疫動物制得的，具有生產(chǎn)工藝簡單、成本低的特點，且所得的單克隆抗體親和力高、可用于膽管癌的臨床檢測。
文檔編號C12N5/20GK101891815SQ200910051760
公開日2010年11月24日 申請日期2009年5月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月22日
發(fā)明者孫兵, 季永鏞, 曹劉麗, 潘榮, 田林 申請人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院