專利名稱：一種里氏木霉表達(dá)盒及其重組菌株和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種里氏木霉表達(dá)盒及其重組菌株和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
里氏木霉(7Hc/20^/77^ a^/)是高效的纖維素酶產(chǎn)生菌，其纖維素酶系
包括五種內(nèi)切-卩-葡萄糖苷酶(EGI 、 EGII、 EGIII、 EGIV和EGV)、兩種纖維二糖水解酶(CBHI禾口CBHII)和兩種纖維二糖酶(BGI和BGII)，其中CBHI的含量最高，其表達(dá)量可達(dá)里氏木霉胞外分泌性蛋白總量的50%，而在誘導(dǎo)的情況下里氏木霉合成和分泌蛋白的總量最高可達(dá)到40 g/L。
里氏木霉的CBHI由單拷貝的^W基因編碼，由此可見(jiàn)，調(diào)控其表達(dá)的AW啟動(dòng)子是一個(gè)很強(qiáng)的絲狀真菌啟動(dòng)子，因此，利用^W基因啟動(dòng)子構(gòu)建的里氏木霉表達(dá)系統(tǒng)被認(rèn)為是一種有效的表達(dá)系統(tǒng)。
目前，國(guó)內(nèi)外所構(gòu)建的里氏木霉表達(dá)系統(tǒng)均使用c6W啟動(dòng)子調(diào)節(jié)外源基因的表達(dá)。芬蘭的VTT生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室于1990年代率先構(gòu)建了基于c^/啟動(dòng)子的里氏木霉表達(dá)系統(tǒng)，并進(jìn)行了異源和同源蛋白的一系列表達(dá)(HaakanaH，Miettinen-oinonen A, Joutsjoki V. Enzyme Microb Technol. 2004, 34(2):159-167) 。 Mantyla等將真菌Chaetomium thermophilum中編碼三個(gè)木聚糖酶的基因置于強(qiáng)啟動(dòng)子的控制之下，用此表達(dá)盒轉(zhuǎn)化里氏木霉后獲得了高效表達(dá)木聚糖酶的工程菌種。替換染色體的c6/27位點(diǎn)之后，EG1的產(chǎn)量是通常強(qiáng)纖維素分解菌所產(chǎn)CBHI量的2 或者與其一樣多(Mantyla A, PaloheimoM， Haskola S. Appl Microbiol Biotechnol. 2007, 76(2): 377-386 )。Miettinen-Oinonen等用"2置換c6/z7，使其位于c6W啟動(dòng)子的下游表達(dá)(Miettinen-Oinonen A, Suominen PL. Appl Environ Microbiol 2002, 68(8):3956-3964)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，內(nèi)切葡萄糖苷酶的活力比出發(fā)菌株增加2.3倍；再增加一個(gè)轉(zhuǎn)化到里氏木霉中的g2表達(dá)盒的拷貝數(shù)，內(nèi)切葡萄糖苷酶的活力比出發(fā)菌株增加3倍。汪天虹等構(gòu)建了 P艦-《3-TebM表達(dá)盒，用《3基因替換了c6W基因，成功地實(shí)現(xiàn)了 EG 3在c6W啟動(dòng)子控制下的表達(dá)(Wang TH, Liu T，Wu ZH. ACTA Biochim Biophysica Sin. 2004, 36(10): 667-672)。
里氏木霉被廣泛用來(lái)表達(dá)同源蛋白和異源蛋白(如來(lái)源于動(dòng)物的基因)，而且里氏木霉在大規(guī)模生產(chǎn)條件中(高達(dá)3601113發(fā)酵液)的表現(xiàn)良好，特別適于蛋白的大量生產(chǎn)。然而，在里氏木霉中使用cM7基因啟動(dòng)子表達(dá)蛋白時(shí)必須使用纖維素、乳糖或槐二糖等進(jìn)行誘導(dǎo)，而誘導(dǎo)不僅使WW基因啟動(dòng)子被激活，而且會(huì)使其它纖維素酶組分的啟動(dòng)子被激活。這將使表達(dá)液中雜蛋白的含量高， 一方面造成原料的浪費(fèi)，另一方面不利于對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行分離純化。
使用強(qiáng)的組成型啟動(dòng)子，利用里氏木霉高效的合成和分泌能力進(jìn)行蛋白的表達(dá)可能是解決這一問(wèn)題的有效手段。組成型啟動(dòng)子在以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中不受阻遏，不需要誘導(dǎo)就可以啟動(dòng)目的基因的轉(zhuǎn)錄。對(duì)于里氏木霉而言，使用組成型啟動(dòng)子將可以避免產(chǎn)生過(guò)多的雜蛋白，因?yàn)槔锸夏久顾a(chǎn)生的胞外蛋白多是經(jīng)誘導(dǎo)后產(chǎn)生的纖維素酶組分。
JoutsjokiVV等人就將釀酒酵母DPMl基因(編碼甘露糖基磷酸多萜醇合成酶)的編碼區(qū)插入到pLMRS3質(zhì)粒中，在瑞氏木霉pki啟動(dòng)子和cbh2終止子控制下表達(dá)。在pFGl質(zhì)粒(含有瑞氏木霉pyr4基因)存在下，與pLMRS3質(zhì)粒一起對(duì)瑞氏木霉的一種pyr4陰性突變株TU-6進(jìn)行共轉(zhuǎn)化，然后篩選pyr4陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，得到4株多拷貝DPM1基因串聯(lián)整合的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子。與受體菌株TU-6相比，轉(zhuǎn)化子的甘露糖基磷酸多萜醇合成酶活力提高了 15-19倍，分泌的蛋白總量也提高了 4倍(JoutsjokiVV， KuittinenM， TorkkeliTK，Suominen PL. FEMS Microbiol Lett. 1993, 112(3): 281-286)。
甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GPD)是糖酵解和糖異生途徑的關(guān)鍵酶，其編碼基因在真菌中是被大量表達(dá)的管家基因。甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(g;^/)的啟動(dòng)子在一些真菌中被用于進(jìn)行外源基因的表達(dá)，如畢赤酵母、釀酒酵母、構(gòu)巢曲霉等。
木聚糖酶在食品工業(yè)、飼料工業(yè)、造紙工業(yè)和生物質(zhì)能源工業(yè)中都得到廣泛的運(yùn)用。在生物質(zhì)能源工業(yè)中，通過(guò)木聚糖酶可將半纖維素水解為可發(fā)酵糖，提高過(guò)程的效率。然而在有些工業(yè)應(yīng)用過(guò)程，如造紙工業(yè)，需要使用不含纖維素酶的木聚糖酶。
里氏木霉不僅可以大量合成并分泌纖維素酶，而且也能分泌XYNI、XYNII 、 XYN m禾Q XYN IV等4種內(nèi)切木聚糖酶，其中XYN I和XYNII的酶活力占發(fā)酵液總活力的90 %以上。？:中木聚糖酶的合成受木質(zhì)纖維素、乳糖等的誘導(dǎo)，而且其合成過(guò)程與纖維素酶的合成同步，因此使用7>^^/野生菌株生產(chǎn)木聚糖酶時(shí)其中必定混有纖維素酶。XYNII作為Z ^M^主要的兩禾中木聚糖酉每之——，已經(jīng)在爿5pergz'〃us "/ger、5b/7/zasacc/zaram^ycas pom6e禾口 P/c/z/fl
幼^fe等宿主菌中實(shí)現(xiàn)了異源表達(dá)。由于表達(dá)后修飾的差異，使用7>^化/進(jìn)
行XYNII的同源表達(dá)是理想的選擇。然而，XYNlI在r ^"e/本身誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的調(diào)控下表達(dá)時(shí)，表達(dá)量較低，而且混有纖維素酶，不能適用于某些工業(yè)應(yīng)用過(guò)程。
迄今為止，利用里氏木霉的S^基因的啟動(dòng)子構(gòu)建組成型表達(dá)系統(tǒng)在國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道，由此方法所構(gòu)建的能高效表達(dá)不含纖維素酶的木聚糖酶的里氏木霉重組菌株在國(guó)內(nèi)外亦未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種無(wú)需誘導(dǎo)即可表達(dá)來(lái)源于動(dòng)物、植物或真菌的基因，且表達(dá)產(chǎn)物中雜蛋白少的里氏木霉表達(dá)盒。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種含有上述表達(dá)盒的表達(dá)載體。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種由上述表達(dá)盒和帶有篩選標(biāo)記的載體共轉(zhuǎn)化里氏木霉制備而得的重組菌株。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供上述重組菌株的應(yīng)用。
本發(fā)明的上述目的是通過(guò)如下方案予以實(shí)現(xiàn)的
本發(fā)明的里氏木霉表達(dá)盒，是由里氏木霉甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因的啟動(dòng)子序列(Pgpd)、外源目的基因和里氏木霉纖維二糖水解酶終止子序列(Tcbhl)組成。
上述里氏木霉甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因的啟動(dòng)子序列(Pgpd)，其GeneBank的登錄號(hào)為EF043568。
上述里氏木霉纖維二糖水解酶終止子序列(Tebhl)，其GeneBank的登錄號(hào)為1405332。
本發(fā)明的里氏木霉表達(dá)盒，其制備方法如下(1)將Pgpd和TebM依次連接到表達(dá)載體中，構(gòu)建得到重組表達(dá)載體l;這里所述的表達(dá)載體主要起大量拷貝本發(fā)明表達(dá)盒的作用，所以可以選擇任何一種常用的表達(dá)載體，如原核表達(dá)載體pUC18等；
(2)將外源目的基因插入到上述重組表達(dá)載體1中，使外源目的基因位于
Pgpd和T刪之間，得到重組表達(dá)載體2，然后以該重組表達(dá)載體2為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到本發(fā)明的里氏木霉表達(dá)盒，該表達(dá)盒中含有Pgpd、外源目的基因和Tebhl，且外源目的基因位于Pgpd和Tebhl之間。
上述步驟(2)中，PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增引物為上游引物P1，其核苷酸序列如SEQIDNO:l所示；下游引物P2，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件以及反應(yīng)液配方均可以參考本領(lǐng)域常用的試劑盒配方。
上述步驟(1)中，所述的將Pgpd和Tebw依次連接到表達(dá)載體中，可采用
限制性內(nèi)切酶酶切和連接酶連接的方法將Pgpd和Tcbhl這兩個(gè)片段依次連接到表達(dá)載體中；所述的限制性內(nèi)切酶酶切以及連接酶連接都是本領(lǐng)域的常規(guī)做法。
上述步驟(2)中，所述將外源目的基因插入到上述重組表達(dá)載體1中，可采用限制性內(nèi)切酶酶切和連接酶連接的方法將外源目的基因插入到重組表達(dá)載體1中；所述的限制性內(nèi)切酶酶切以及連接酶連接都是本領(lǐng)域的常規(guī)做法。
一種重組菌株，該重組菌株是將本發(fā)明的里氏木霉表達(dá)盒和帶有篩選標(biāo)記的載體共轉(zhuǎn)化里氏木霉原生質(zhì)體，培養(yǎng)并篩選轉(zhuǎn)化子制備而得，其具體制備步驟如下
(1) 將本發(fā)明的里氏木霉表達(dá)盒和帶有篩選標(biāo)記的載體一起共轉(zhuǎn)化里氏木霉原生質(zhì)體；
(2) 將上述轉(zhuǎn)化后的原生質(zhì)體進(jìn)行篩選、再生后即可得到高效表達(dá)木聚糖酶的重組里氏木霉菌株，而且該重組菌株所表達(dá)的木聚糖酶不含纖維素酶。
上述步驟(1)中，帶有篩選標(biāo)記的載體其作用主要是用于后期陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的篩選，所以可以選擇任何一種常用的篩選標(biāo)記載體，對(duì)于里氏木霉來(lái)說(shuō)，
本領(lǐng)域的人常用潮霉素進(jìn)行篩選，所以這里可選擇質(zhì)粒pAN7-l (pAN7-l是本領(lǐng)域技術(shù)人員常用的帶潮霉素抗性的真菌表達(dá)質(zhì)粒)作為帶有篩選標(biāo)記的載體，和本發(fā)明的表達(dá)盒一起共轉(zhuǎn)化，在后期進(jìn)行篩選時(shí)，可采用潮霉素B作
為篩選劑，即可篩選出陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子
上述步驟(1)中，所用到的共轉(zhuǎn)化為本領(lǐng)域的常規(guī)做法。
上述步驟(2)中所述的篩選、再生均可參考本領(lǐng)域的通用做法。
上述重組菌株可用于制備蛋白質(zhì)藥物、工業(yè)酶制劑或飼料添加劑等，當(dāng)用
于制備木聚糖酶時(shí)，為了得到好的產(chǎn)酶效果，可選擇如下優(yōu)化的培養(yǎng)基配方
將葡萄糖60.0g、蛋白胨6.0g、 (NH4)2S04 1.4g、 KH2P04 2.0 g、尿素0.3 g、CaCl20.3g、 Mandels營(yíng)養(yǎng)鹽溶液lOOml、擰檬酸緩沖液50ml和Mandels微量元素溶液lml混合后，用蒸餾水溶解并定容至1L;所述Mandels營(yíng)養(yǎng)鹽濃縮液的配方為將14 g (NH4)2S04、 3g尿素、20gKH2PO4、 4 g CaCl2.2H20禾口 3gMgS04.7H20混合后，用蒸餾水溶解并定容至1L;所述檸檬酸緩沖液的配方為將一水合檸檬酸210.0 g和NaOH 78.0g混合后，用蒸餾水溶解并定容至1L;所述Mandels微量元素濃縮液的配方為將FeSCV7H20 5.0 g、 MnS04.H201.6 g、 ZnS04.7H20 1.4 g和CoCl2.6H20 3.7 g混合后，用蒸餾水溶解并定容至1L。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果
1.本發(fā)明的表達(dá)盒采用將里氏木霉甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因的啟動(dòng)子序列(Pgpd)和里氏木霉纖維二糖水解酶終止子序列(Tebhl)構(gòu)成組成型啟動(dòng)子，不但可以利用里氏木霉高效的合成和分泌能力進(jìn)行蛋白的表達(dá)，且蛋白表達(dá)量高，而且可以避免表達(dá)產(chǎn)物中產(chǎn)生過(guò)多的雜蛋白；
2. 本發(fā)明的表達(dá)盒采用將里氏木霉甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因的啟動(dòng)子序列(Pgpd)和里氏木霉纖維二糖水解酶終止子序列(Tebhl)構(gòu)成組成型啟動(dòng)子，無(wú)需誘導(dǎo)即可表達(dá)來(lái)源于動(dòng)物、植物或真菌的基因，且可以對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行合適的修飾；
3. 本發(fā)明的重組菌株可高效表達(dá)不含纖維素酶的木聚糖酶，這類木聚糖酶在造紙工業(yè)中具有很重要的應(yīng)用。


圖1為里氏木霉組成型表達(dá)載體pUC-PT的物理圖譜；
圖2為含Pgpd-GFP-Tebhl表達(dá)盒的重組載體pUC-PGT的物理圖譜；圖3為重組菌株r. reesez'-XYNl表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳圖；圖4為重組菌株T. reesei-XYNl表達(dá)木聚糖酶的時(shí)間曲線；其中，l為蛋白分子量標(biāo)記，2為野生型里氏木霉菌株在表達(dá)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的發(fā)酵上清液，3為野生型里氏木霉在含纖維素酶誘導(dǎo)物中培養(yǎng)的上清液，4為重組菌株T. reesei-XYNl在表達(dá)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的上清液。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步地描述，但具體實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何限定。
實(shí)施例l里氏木霉組成型表達(dá)載體的構(gòu)建
1、里氏木霉基因組DNA的提取及檢驗(yàn)將里氏木霉7Hc/zo&，a ^"e/ QM9414 (本領(lǐng)域常用菌種)接種于PDA 培養(yǎng)基上，于28。C恒溫培養(yǎng)7天至孢子成熟。制備適量孢子懸液接種于液體 種子培養(yǎng)基中，于30。C， 180rpm條件下培養(yǎng)2天至菌絲體濃度達(dá)到4 5g/L 用于提取基因組DNA。
上述液體種子培養(yǎng)基的配方為將葡萄糖20.0g、蛋白胨2.0g、 (NH4)2S04 1.4 g、 KH2PO42.0g、尿素0.3g、 CaCl20.3g、 Mandels營(yíng)養(yǎng)液濃縮液lOOml、 檸檬酸緩沖液(pH4.5， lmol/L) 50ml和Mandels微量元素濃縮液lml混合 后，用蒸餾水溶解并且定容至1L。
上述Mandels營(yíng)養(yǎng)液濃縮液的配方為將14 g (NH4)2S04、 3 g尿素、20 g KH2P04、 4 g CaCl2.2H20和3 g MgS04.7H20混合后，用蒸餾水溶解并且定容 至1L。
上述Mandels微量元素濃縮液的配方為將5g FeS(V7H20、 1.7g ZnS04.7H20、 3.7gCoCl2.6H20和1.6gMnS04.H20混合后，用蒸餾水溶解并 且定容至1L。
上述檸檬酸緩沖液(pH4.5， lmol/L)的配方為取一水合檸檬酸210g， NaOH約78g，加水750ml，混合溶解后定容至1L。
本實(shí)施例采用本領(lǐng)域常用的2-巰基乙醇/CTAB法提取里氏木霉基因組 DNA，提取完畢后用瓊脂糖凝膠(含1X瓊脂糖和0.5嗎/ml溴化乙錠)電泳檢 驗(yàn)所提取基因組DNA。
2、里氏木霉甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因的啟動(dòng)子序列(Pgpd)的分離
根據(jù)GeneBank上發(fā)布的gpd啟動(dòng)子的序列(EF043568)，以上述提取的里 氏木霉基因組DNA為模板，以上游引物G1和下游引物G2進(jìn)行特異的PCR擴(kuò)增分離Pgpd。
上游引物G1，其核苷酸序列如SEQIDNO:3所示，其中含有i^'/^III的酶切 位點(diǎn)；
下游引物G2，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，其中含尸wl的酶切位點(diǎn)。
PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件以及反應(yīng)體系參考試劑盒說(shuō)明書(shū)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的分子 大小為1500bp，該擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和DNA序列分析，結(jié)果表明所 獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物為目的片段。
3、 里氏木霉纖維二糖水解酶終止子序列(Tebhl)的分離 根據(jù)GeneBank上發(fā)布的cbhl終止子的序列(1405332)，以上述提取的里
氏木霉基因組DNA為模板，以上游引物T1和下游引物T2進(jìn)行特異的PCR擴(kuò)增
分尚丁cbhl。
上游引物T1，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，其中含&cl的酶切 位點(diǎn)；
下游引物T2，其核苷酸序列如SEQIDNO:6所示，其中含I的酶切位點(diǎn)。
PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件以及反應(yīng)體系參考試劑盒說(shuō)明書(shū)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的分子 大小為340bp，該擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和DNA序列分析，結(jié)果表明所獲
得的擴(kuò)增產(chǎn)物為目的片段。
4、 里氏木霉組成型表達(dá)載體pUC-PT的構(gòu)建
用限制性內(nèi)切酶酶切(歷""ni與尸W I ，及^c I與&oi I )和連接酶將Tcbh！ 與Pgpd這兩個(gè)片段依次連接到質(zhì)粒pUC18 (市售)中，即得到可表達(dá)外源基因的里氏木霉組成型表達(dá)載體pUC-PT (如圖l所示)。
實(shí)施例2利用里氏木霉組成型表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)綠色熒光蛋白
1、 綠色熒光蛋白基因GFP的獲得
以質(zhì)粒pCAMBIA1302 (市售)為模板，使用引物Fl和F2經(jīng)PCR擴(kuò)增 得到了 750 bp的綠色熒光蛋白GFP基因。
上游引物F1 ，其核苷酸序列如SEQIDNO:7所示，其中含力al的酶切 位點(diǎn)；
下游引物F2 ，其核苷酸序列如SEQIDNO:8所示，其中含尺/ "I的酶切位點(diǎn)。
擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為750bp，長(zhǎng)度及序列分析的結(jié)果均與預(yù)期相符。
2、 Pgpd-GFP-T,表達(dá)盒的構(gòu)建
將她基因通過(guò)限制性酶切位(力a I與i^w I )和連接酶連接到表達(dá)載 體pUC-PT中，得到含Pgpd-GFP-Tcbhl表達(dá)盒的重組載體pUC-PGT (如圖2所示)。
3、 里氏木霉原生質(zhì)體的制備與再生
采用5mg/ml的溶壁酶(市售)對(duì)24h左右菌齡的里氏木霉菌絲進(jìn)行酶解， 過(guò)濾除去未酶解的菌絲，離心得到白色的原生質(zhì)體沉淀，經(jīng)1 mol/LMgS04和 STC (1.2M山梨醇、pH7.5的10mmol/LTris-Cl和50mmol/LCaCl2)溶液洗滌， 最后將里氏木霉原生質(zhì)體沉淀溶于lmlSTC溶液中，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，原生質(zhì) 體的濃度大約為109個(gè)/ml l(T個(gè)/ml。取100iLil，稀釋至1()3個(gè)/ml，分別涂100jil 于3個(gè)固體再生平板上。三天后觀察，平均再生率為20%。
4、 表達(dá)盒Pgpd-GFP-Tebhl的獲得
13使用引物P1 (其核苷酸序列如SEQIDNO:l所示)和P2 (其核苷酸序列 如SEQIDNO:2所示)，以重組質(zhì)粒pUC-PGT為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得表 達(dá)盒Pgpd-GFP-Tebhl，其長(zhǎng)度為2.5 kb。
5、 表達(dá)盒Pgpd-GFP-T,與質(zhì)粒pAN7-l對(duì)里氏木霉原生質(zhì)體的共轉(zhuǎn)化 采用本領(lǐng)域的常規(guī)做法將上述表達(dá)盒Pgpd-GFP-Tebhl和質(zhì)粒pAN7-l共轉(zhuǎn)
化里氏木霉原生質(zhì)體，轉(zhuǎn)化后的原生質(zhì)體在原生質(zhì)體液體再生培養(yǎng)基中進(jìn)行再 生，培養(yǎng)24 h后球狀原生質(zhì)體再生并長(zhǎng)出芽管，呈短絲狀，有些則凝集在一 起。上述液體再生培養(yǎng)基的成分為里氏木霉液體種子培養(yǎng)基+STC (1.2M山梨 醇-10mMpH7.5的Tris《l-50mMCaCl2)，其中里氏木霉液體種子培養(yǎng)基的 成分如實(shí)施例1中步驟(1)所述。
將液體再生的原生質(zhì)體均勻涂布在含100 pg/ml潮霉素B的篩選平板上， 28'C培養(yǎng)2天后得到具有潮霉素抗性的轉(zhuǎn)化子10株，轉(zhuǎn)化效率為2株/pgDNA。 在對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，未轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的r. w"e/原生質(zhì)體在100 |ag/ml潮霉素B的篩選 平板上不生長(zhǎng)。
6、 轉(zhuǎn)化子的鑒定及目的基因的表達(dá)
提取具有潮霉素B抗性的轉(zhuǎn)化子的基因組DNA作為模板，用引物F1 (其 核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示)和F2 (其核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示) 進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示，10株抗性轉(zhuǎn)化子的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳均 得到大小約750 bp的她基因的特異帶，而用原菌株r. re"e/QM9414的基因 組DNA為模板進(jìn)行同樣的PCR反應(yīng)，沒(méi)有出現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物。
使用里氏木霉的液體種子培養(yǎng)基，取10株抗性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行液體培養(yǎng)，48 h 后進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)其中有8株轉(zhuǎn)化子的菌絲中表達(dá)綠色熒光蛋白。相對(duì)應(yīng)的QM9414原菌株，菌絲不表達(dá)綠色熒光蛋白，表明在轉(zhuǎn)化子中GFP的表達(dá)是 受g/^啟動(dòng)子調(diào)控的。
取一株表達(dá)綠色熒光蛋白的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行基因型鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用引物Fl (其核苷酸序列如SEQIDNO:7所示)和F2 (其核苷酸序列如SEQ ID NO:8 所示)擴(kuò)增出750bp的片段，對(duì)應(yīng)于基因GF戶的大?。挥靡颬1 (其核苷酸 序列如SEQIDNO:l所示)和P2 (其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示)可以 擴(kuò)增出2.5 kb左右的片段，對(duì)應(yīng)于表達(dá)盒Pgpd-GFP-Tebhl的大小。
實(shí)施例3利用里氏木霉組成型表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)木聚糖酶基因
1、 x，2基因的分離
以里氏木霉的基因組DNA為模板，以引物X1和X2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得 到；qy"2基因。
上游引物X1 ，其核苷酸序列如SEQIDNO:9所示，其中含力"I的酶切 位點(diǎn)；
下游引物X2 ，其核苷酸序列如SEQIDNO:10所示，其中含《p"I的酶 切位點(diǎn)。
擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳檢測(cè)，其分子大小為800bp，與預(yù)期結(jié)果相符合； 經(jīng)DNA序列分析，其序列與GeneBank上發(fā)布的序列具有100%的同源性。
2、 Pgpd-XYN-Tewu表達(dá)盒的構(gòu)建
將上述所獲得的矽W基因經(jīng)Wfl I和I酶切后與經(jīng)同樣酶切的表達(dá) 載體pUC-PT連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化大腸桿菌、篩選，獲得含表達(dá)盒Pgpd-XYN-Tebhl的 重組質(zhì)粒pUC-PXT。將重組質(zhì)粒中的表達(dá)盒進(jìn)行DNA測(cè)序分析，結(jié)果表明表 達(dá)盒中各元素包括啟動(dòng)子、目的基因以及終止序列的結(jié)構(gòu)正確。3、 表達(dá)盒Pgpd-XYN-Tebhl與質(zhì)粒pAN7-l對(duì)里氏木霉原生質(zhì)體的共轉(zhuǎn)化 使用引物P1 (其核苷酸序列如SEQIDNO:l所示)和P2 (其核苷酸序列
如SEQ ID NO:2所示)，以重組質(zhì)粒pUC-PXT為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得表 達(dá)盒Pgpd-XYN-Tcbhl。使用實(shí)施例2的轉(zhuǎn)化方法，以表達(dá)盒Pgpd-XYN-Tcbhl和質(zhì) 粒pAN7-l對(duì)里氏木霉的原生質(zhì)體進(jìn)行共轉(zhuǎn)化。經(jīng)篩選，獲得含Pgpd-XYN-Tcbhl 表達(dá)盒的重組里氏木霉菌株。
4、 重組菌株的鑒定
取一株重組菌株進(jìn)行進(jìn)行基因型鑒定。以重組菌株的基因組DNA為模板， 用引物X1 (其核苷酸序列如SEQIDNO:9所示)和X2 (其核苷酸序列如SEQ ID NO:IO所示)擴(kuò)增出800bp的片段，對(duì)應(yīng)于基因；qy"2的大?。挥靡颬l (其核苷酸序列如SEQIDNO:l所示)和P2 (其核苷酸序列如SEQ ID NO:2 所示)可以擴(kuò)增出2.5kb左右的片段，對(duì)應(yīng)于表達(dá)盒Pgpd-XYN-Tc磁的大小， 該重組菌株命名為r. "e^/-XYNl，用于后續(xù)的實(shí)施方案。
實(shí)施例4重組菌株r. mm"'-XYN1表達(dá)產(chǎn)物的分析
將在含潮霉素抗性的PDA平板上生長(zhǎng)良好的重組菌株r. ^"d-XYNl接 種于里氏木霉液體種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48h后按5%的接種量轉(zhuǎn)接到重組里氏 木霉表達(dá)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)84h后分析XYN的表達(dá)情況。
上述里氏木霉液體種子的配方為100ml/L Mandels營(yíng)養(yǎng)液濃縮液，1.0 ml/LMandels微量元素濃縮液，10g/L葡萄糖，1.0g/L蛋白胨，50 ml/L的檸檬 酸緩沖液(pH4.5， lmol/L)， 1.0 2.0g/L吐溫80。
上述重組里氏木霉表達(dá)培養(yǎng)基配方為100ml/L Mandels營(yíng)養(yǎng)液濃縮液， 1.0ml/LMandels微量元素濃縮液，20g/L葡萄糖，5.0g/L蛋白胨，50ml/L的檸檬酸緩沖液(pH4.5， lmol/L)， 1.0 2.0g/L吐溫80。
上述Mandels營(yíng)養(yǎng)液濃縮液、Mandels微量元素濃縮液和檸檬酸緩沖液的 配方同實(shí)施例1。
以樺木木聚糖(birch xylan， Sigma)為底物，根據(jù)一個(gè)活力單位(IU) 定義為在體系中反應(yīng)中每分鐘形成lpmol的還原糖(以木糖計(jì))所需要的酶 量來(lái)檢測(cè)重組菌株T. reesei-XYNl表達(dá)產(chǎn)物(木聚糖酶)活性，經(jīng)測(cè)定重組菌 株T. reesei-XYNl在不誘導(dǎo)的情況下產(chǎn)木聚糖的活性為172 IU/ml。
將發(fā)酵液經(jīng)常規(guī)處理后進(jìn)行SDS-PAGE分析，分析表明，組成型的重組 菌株T. reesei-XYNl直接將蛋白分泌到胞外，而原菌在沒(méi)有誘導(dǎo)的情況下沒(méi)有
表達(dá)，而且用稻草粉誘導(dǎo)的原菌的表達(dá)量也明顯小于重組木聚糖酶菌，r.
mm^-XYN1所表達(dá)木聚糖酶的表達(dá)分子量為21KD，如圖3所示。
對(duì)重組菌株T. reesei-XYN的表達(dá)產(chǎn)物采用Applied Biosystems Voyager DE-STR MALDI-TOF-MS生物質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析，使用MALDI-TOF-MS 質(zhì)譜儀進(jìn)行分析，。經(jīng)質(zhì)譜分析后所得到的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與Matrixscience的數(shù)據(jù)庫(kù) 進(jìn)行比較，質(zhì)譜分析結(jié)果顯示檢測(cè)到6個(gè)肽段與里氏木霉所產(chǎn)生的XYN2 中肽段的氨基酸序列完全一致，提示所表達(dá)的蛋白為重組XYN2。 實(shí)施例5重組菌株T. reesei-XYNl表達(dá)木聚糖酶的條件優(yōu)化 本實(shí)施例選擇初始培養(yǎng)基中不同的碳源濃度以及氮源濃度對(duì)重組菌株表 達(dá)產(chǎn)酶的培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，使用的葡萄糖初始濃度為60g/L、蛋白 胨初始濃度為6g/L時(shí)效果最佳。表達(dá)結(jié)束后發(fā)酵上清液中的木聚糖酶活性達(dá) 到194.8 IU/ml。
本實(shí)施例的重組菌株產(chǎn)木聚糖酶優(yōu)選培養(yǎng)基為將葡萄糖60.0g、蛋白胨6.0 g、 (NH4)2S04 1.4g、 KH2PO42.0g、尿素0.3 g、 CaCl2 0.3 g、 Mandels營(yíng)養(yǎng) 鹽溶液lOOml、檸檬酸緩沖液50ml和Mandels微量元素溶液1ml混合后，用 蒸餾水溶解并定容至1L;所述Mandels營(yíng)養(yǎng)鹽濃縮液的配方為將14 g (NH4)2S04、 3g尿素、20gKH2PO4、 4 g CaCl2'2H20和3 g MgS04'7H20混合
后，用蒸餾水溶解并定容至1L;所述檸檬酸緩沖液的配方為將一水合擰檬 酸210.0 g和NaOH 78,0g混合后，用蒸餾水溶解并定容至1L;所述Mandels 微量元素濃縮液的配方為將FeS04.7H20 5.0 g、MnS04-H20 1.6 g、ZnS04.7H20 1.4 g和CoClr6H20 3.7 g混合后，用蒸餾水溶解并定容至1L。
在該優(yōu)選培養(yǎng)條件下，重組菌株r w^eZ-XYNl產(chǎn)木聚糖酶具有組成型產(chǎn) 酶的特性，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期即開(kāi)始產(chǎn)酶，并一直持續(xù)到84 h，最該酶活達(dá)到 194.8 IU/ml，在發(fā)酵末期發(fā)酵液中的酶活性略有下降，如圖4所示。
實(shí)施例6重組菌株TT wm"'-XYN1的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)
將重組菌株7: mm^-XYNI在不含潮霉素抗性的PDA平板上連續(xù)傳代五 次，分別測(cè)定各次傳代的重組菌株在表達(dá)培養(yǎng)基中的產(chǎn)酶活性，發(fā)現(xiàn)各次傳代 的重組菌株的產(chǎn)木聚糖酶的能力沒(méi)有顯著差異，說(shuō)明本發(fā)明所構(gòu)建的重組菌株 具有遺傳穩(wěn)定性。
18一種里氏木霉表達(dá)盒及其重組菌株和應(yīng)用序列表 SEQUENCE LISTING
<110>
<120>
<130>
<160>
<170>
<210> <211〉 <212> <213>
邢，苗 劉，剛
一種里氏木霉表達(dá)盒及其重組菌株和應(yīng)用 10
Patentin version 3.5 1
22 DNA
人工序列
<400〉 1
gacgcagaag 33ggaaatcg cc 22
<210> <211> <212〉 <213〉
2
21 腿
人工序列
〈400> 2
tggtactggg atacacgaag a 21
<210> 3
<211> 31
<212〉 DNA <213〉人工序列
〈400> 3
gctaagcttg acgcagaaga aggaaatcgc c 31
<210> 4
<211〉 30
<212> 腿 〈213〉人工序列
〈400> 4
tgactgcagt ttgtatctgc gaattgagct 30
<210> 5
<211> 28
<212〉 DNA <213〉人工序列
<400> 5
caagagctct aaagctccgt gcgaaagc 28
<210> 6
<211〉 30
<212> 腿 <213〉人工序列
<400〉 6
acgg犯ttct ggtactggga tacacgaaga 30
<210> 7
<211> 34
<212> DNA <213〉人工序列
<400〉 7
gc3tct3gaa tggtagatct gaxtagt朋a ggsg 34一種里氏木霉表達(dá)盒及其重組菌株和應(yīng)用序列表
〈210> 8 <211〉 32 <212> DNA <213>人工序列
<400> 8
cacggtaccg gctagctttg tatagttcat cc 32
<210〉 9
<211> 30
<212> 瞧 <213>人工序列
<400> 9
gcatctagaa tggtctcctt cacctccctc 30
<210〉 10
<211> 29
<212> DNA <213>人工序列
<400> 10
cacggtaccc atcac朋aag aagagcccc 29
20
權(quán)利要求
1、一種里氏木霉表達(dá)盒，其特征在于該表達(dá)盒是由里氏木霉甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動(dòng)子、外源目的基因和里氏木霉纖維二糖水解酶終止子組成。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述里氏木霉表達(dá)盒，其特征在于所述表達(dá)盒的PCR擴(kuò)增引物為(1) 上游引物P1，其核苷酸序列如SEQIDNO:l所示；(2) 下游引物P2，其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。
3、 一種表達(dá)載體，其特征在于該表達(dá)載體含有權(quán)利要求1所述里氏木霉表達(dá)盒。
4、 一種重組菌株，其特征在于該重組菌株是由權(quán)利要求1所述表達(dá)盒和帶有篩選標(biāo)記的載體共轉(zhuǎn)化里氏木霉原生質(zhì)體，培養(yǎng)并篩選轉(zhuǎn)化子制備而得。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述重組菌株，其特征在于所述帶有篩選標(biāo)記的載體為pAN7-l。
6、 根據(jù)權(quán)利要求4所述重組菌株，其特征在于所述篩選是以潮霉素B作為篩選劑。
7、 權(quán)利要求4所述重組菌株在制備蛋白質(zhì)藥物、工業(yè)酶制劑或詞料添加劑中的應(yīng)用。
8、 根據(jù)權(quán)利要求7所述應(yīng)用，其特征在于所述工業(yè)酶制劑為木聚糖酶。
9、 根據(jù)權(quán)利要求8所述應(yīng)用，其特征在于重組菌株生產(chǎn)木聚糖酶時(shí)所用葡萄糖蛋白胨發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為將葡萄糖60.0g、蛋白胨6.0g、 (NH4)2S04，1.4g、 KH2PO42.0g、尿素0.3g、 CaCl20.3g、 Mandels營(yíng)養(yǎng)鹽溶液lOOml、擰檬酸緩沖液50ml和Mandds微量元素溶液1ml混合后，用蒸餾水溶解并定容至1L;所述Mandels營(yíng)養(yǎng)鹽濃縮液的配方為將14 g (NH4)2S04、 3 g尿素、20gKH2PO4、 4gCaCl2.2H20和3gMgS(V7H20混合后，用蒸餾水溶解并定容至1L;所述擰檬酸緩沖液的配方為將一水合檸檬酸210.0 g和NaOH 78.0g混合后，用蒸餾水溶解并定容至1L;所述Mandels微量元素濃縮液的配方為將FeS04.7H20 5.0 g、 MnS04H20 1.6 g、 ZnS04.7H20 1.4 g和CoClr6H20 3.7 g混合后，用蒸餾水溶解并定容至1L。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種里氏木霉表達(dá)盒及其重組菌株和應(yīng)用，該表達(dá)盒是由里氏木霉甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動(dòng)子、外源目的基因和里氏木霉纖維二糖水解酶終止子組成。本發(fā)明的表達(dá)盒采用將里氏木霉甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因的啟動(dòng)子序列和里氏木霉纖維二糖水解酶終止子序列構(gòu)成組成型啟動(dòng)子，無(wú)需誘導(dǎo)即可表達(dá)來(lái)源于動(dòng)物、植物或真菌的基因，且可以對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行合適的修飾，不但可以利用里氏木霉高效的合成和分泌能力進(jìn)行蛋白的表達(dá)，且蛋白表達(dá)量高，而且可以避免表達(dá)產(chǎn)物中產(chǎn)生過(guò)多的雜蛋白。本發(fā)明的重組菌株可高效表達(dá)不含纖維素酶的木聚糖酶，這類木聚糖酶在造紙工業(yè)中具有很重要的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12P21/02GK101560513SQ20091003953
公開(kāi)日2009年10月21日 申請(qǐng)日期2009年5月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月15日
發(fā)明者剛 劉, 康 康, 云 李, 苗 邢 申請(qǐng)人:邢 苗;劉 剛