專利名稱：棕果蝠瘦素蛋白及其cDNA序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及痩素蛋白，具體涉及一種來源于棕果蝠^ o^em^ /wc/zwaw/^'y*的瘦素蛋白及其cDNA序列。
背景技術(shù)：
痩素蛋白(leptin)是1994年發(fā)現(xiàn)的一個由167個氨基酸組成的小蛋白， 由脂肪組織分泌的蛋白質(zhì)類激素，目前研究結(jié)果已經(jīng)證實其它組織也能產(chǎn)生， 包括胎盤、大鼠的骨胳肌、大鼠的胃、人的乳腺上皮細胞、人和鼠的腺垂體等。
瘦素蛋白是肥胖相關(guān)的信號，脂肪組織的反饋信號作用到腦中心，控制飲 食行為和活動(代謝和運動)，是ob (obese)基因的產(chǎn)物。脂肪組織產(chǎn)生的痩 素蛋白經(jīng)血液運輸?shù)侥X，與下丘腦的受體作用后通過控制飲食攝入和能量消耗 來控制哺乳動物的體重，被認(rèn)為是最具有潛力的減肥藥物之一。
痩素蛋白除了能夠降低食欲，控制體重，減少體內(nèi)脂肪含量外，還可傳遞 動物體內(nèi)外能量貯存信號到大腦中樞，影響神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)，促進動物生殖系 統(tǒng)發(fā)育和獲得生育能力，調(diào)控動物初情期的啟動、性成熟和妊娠等生殖活動， 調(diào)節(jié)胎兒胎盤，使動物提前發(fā)情，縮短發(fā)情周期，調(diào)節(jié)葡萄糖代謝，脂類代謝， 調(diào)節(jié)血壓、大腦和骨骼發(fā)育，傷口愈合，細胞分化增殖，參與造血作用，機體 免疫調(diào)節(jié)等功能。痩素功能的多樣性尤其在能量調(diào)節(jié)方面的關(guān)鍵作用，也賦予 痩素更大的產(chǎn)品開發(fā)的價值。
瘦素蛋白的開發(fā)和利用己深入到許多領(lǐng)域包括減肥藥物的開發(fā)以及減肥 產(chǎn)品的深加工，治療糖尿病藥物開發(fā)，治療高血壓藥物開發(fā)，治療脂肪肝藥物開發(fā)等等，隨著對其功能認(rèn)識的不斷深入，關(guān)于leptin產(chǎn)業(yè)化前景將更加廣闊。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種來源于棕果蝠O ow^m^ /Mc/zeMm^'O的痩
素蛋白，為今后開發(fā)痩素基因工程產(chǎn)品奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。
本發(fā)明的另一個目的在于提供含有上述痩素蛋白完整編碼區(qū)的cDNA序列。
本發(fā)明的上述目的通過如下方案予以實現(xiàn)
本發(fā)明提供一種痩素蛋白，該痩素蛋白為如下(i )或(ii)所述任一項
的蛋白質(zhì)
(i ) 一種具有SEQIDNO: 3所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)；
(ii)在氨基酸序列(i )中，由缺失、取代或加成1個或幾個氨基酸的
氨基酸序列所組成，且與氨基酸序列(i)的蛋白質(zhì)具有相同功能的蛋白質(zhì)。 本發(fā)明的痩素蛋白優(yōu)選具有SEQIDNO: 3所示的氨基酸序列。 本發(fā)明還提供編碼上述痩素蛋白的cDNA序列，該cDNA序列為編碼如
下(i )或(ii)所述任一項蛋白質(zhì)的cDNA序列
(i ) 一種具有SEQIDNO: 3所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；
(ii )在氨基酸序列(i )中，由缺失、取代或加成1個或幾個氨基酸的氨
基酸序列所組成，且與氨基酸序列(i)的蛋白質(zhì)具有相同功能的蛋白質(zhì)。 上述編碼痩素蛋白的cDNA序列優(yōu)選其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。 本發(fā)明的痩素蛋白來自于棕果蝠0 oM化m^ /Mc/zwm^/"，提取棕果蝠脂
肪組織總RNA反轉(zhuǎn)錄后作為模板，根據(jù)已知哺乳動物痩素蛋白序列保守區(qū)設(shè)
計簡并引物進行簡并PCR擴增，測序后得到本發(fā)明痩素蛋白的全長cDNA列，并對該全長CDNA序列進行氨基酸分析，得到本發(fā)明棕果蝠瘦素蛋白為
SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列，總共165個氨基酸，其中前21個氨基酸 為信號肽序列。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點
本發(fā)明從棕果蝠的脂肪組織中獲得了一種痩素蛋白的全長cDNA，并進行 了蛋白表達，通過利用GST重組表達技術(shù)和凝血酶酶切除去GST標(biāo)記物，成 功獲得了棕果蝠痩素蛋白，此外對該蛋白進行細胞活性分析，結(jié)果表明本發(fā)明 的棕果蝠痩素蛋白具有明顯的脂肪降解活性，可用于制備減肥藥物、治療糖尿 病藥物、治療高血壓藥物以及治療脂肪肝藥物等。


圖1為棕果蝠瘦素蛋白全長cDNA序列的PCR擴增電泳其中，l為分子量標(biāo)記，2為PCR擴增產(chǎn)物；
圖2為實施例2中重組質(zhì)粒表達產(chǎn)物的SDS-PAGE檢測電泳其中，1為分子量標(biāo)記，2為重組表達菌未誘導(dǎo)對照樣品，3為重組表達
菌IPTG誘導(dǎo)3h后樣品，箭頭所指處為新的表達條帶；
圖3為實施例3中蛋白表達的SDS-PAGE檢測電泳其中，1為分子量標(biāo)記，2為過柱純化但未經(jīng)凝血酶切對照樣品，3為過
柱純化且經(jīng)凝血酶切的樣品，4為GST， 5為瘦素蛋白； 圖4為棕果蝠瘦素蛋白MTT活性檢測結(jié)果柱狀圖； 其中，1為GST對照組，2為棕果蝠痩素蛋白組，3為空白對照組，**:
PO.01;
圖5為棕果蝠痩素蛋白LDH活性檢測結(jié)果柱狀圖；其中，1為GST對照組，2為棕果蝠痩素蛋白組，3為空白對照組，**:
PO.Ol。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步的描述，但具體實施例并不對本發(fā) 明做任何限定。
實施例l棕果蝠瘦素蛋白全長cDNA序列的獲得
1、 模板制備
按照RNAiso試劑盒(TakaRa公司)說明書提取棕果蝠(i ou^K^ /Mc/ze"aw加/)脂肪組織總RNA，并采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒，以該總RNA為模板， 進行反轉(zhuǎn)錄試驗得到下述PCR擴增用模板。
2、 引物設(shè)計
根據(jù)已知的哺乳動物痩素蛋白序列保守區(qū)設(shè)計簡并引物，如下所示 Primer 1，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 4所示； Primer 2，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 5所示。
3、 PCR擴增
PCR擴增反應(yīng)體系(50pl) : PCR擴增模板2ji1，引物Primer 1/ Primer 2 (10pM)各lpl， 10 XTaq Polymerase mix (TaKaRa公司)5pl， ddH2041nl;
PCR擴增反應(yīng)條件94。C預(yù)變性5min， 94。C變性l min， 54。C退火90s， 72 'C延伸2min， 30個循環(huán)，最后72。C延伸5 min。
4、 PCR產(chǎn)物的連接、轉(zhuǎn)化和測序
將上述PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)膠回收、連接、轉(zhuǎn)化等常規(guī)操作后克隆入pMD-19T 載體(市售)，陽性克隆經(jīng)藍白斑篩選和PCR鑒定后，送測序公司進行測序同時對測序結(jié)果進行氨基酸序列分析。
測序結(jié)果及氨基酸序列分析結(jié)果表明，本實施擴增所得棕果蝠痩素蛋白的
全長cDNA為498 bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO: l所示，該cDNA序列編碼 165個氨基酸編碼，其氨基酸序列如SEQIDNO: 3所示，其中前21個氨基酸為 信號肽序列。
實施例2重組表達載體的構(gòu)建
根據(jù)實施例l所得棕果蝠痩素蛋白基因序列設(shè)計引物(P1和P2)，擴增不 含信號肽序列的全部編碼區(qū)，并引入BamH I / Sal I限制酶切位點用于重組表達 載體的構(gòu)建。
Pl，其核苷酸序列如SEQIDNO: 6所示；
P2，其核苷酸序列如SEQIDNO: 7所示。
上述PCR擴增反應(yīng)體系可參照PCR反應(yīng)試劑盒說明書，其具體反應(yīng)條件 為94。C預(yù)變性5min， 94°C變性l min， 55。C退火90s， 72。C延伸2min， 30個 循環(huán)，最后72。C延伸5min。擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，可見到清晰的目 的片段擴增條帶，如圖1所示，擴增出的片段長度約435bp，與設(shè)計的擴增片段 長度相符，且未出現(xiàn)非特異性擴增。
將上述PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)膠純化回收后，用BamHI禾BSal I于37'C消化過夜， 隨后與PGEX-4T-2載體(Invitrogen)連接構(gòu)建重組表達質(zhì)粒，挑選陽性克隆 進行測序，測序結(jié)果與原序列相同，表明擴增克隆后的基因未發(fā)生突變，而且 開放閱讀框架(ORF)與載體ORF—致，融合蛋白約373氨基酸(含GST)，理 論分子量為41.8kDa。
將上述經(jīng)測序驗證序列讀碼框正確的陽性克隆轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達菌BL21(市售)內(nèi)，經(jīng)lmmol/L異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)3 h，將重組表達 菌誘導(dǎo)前、后菌體裂解物一起經(jīng)SDS-PAGE檢測，電泳檢測結(jié)果如圖2所示， 與重組表達菌誘導(dǎo)前的SDS-PAGE電泳圖對比后，發(fā)現(xiàn)重組表達菌誘導(dǎo)后在42 kDa處出現(xiàn)了一條新的表達條帶(圖中箭頭所指條帶)，該條帶的分子量大小 與理論推導(dǎo)值相符，說明誘導(dǎo)表達產(chǎn)物為GST-Leptin重組蛋白。
本實施例所涉及的膠回收、雙酶切消化、載體連接、大腸桿菌轉(zhuǎn)化以及 IPTG誘導(dǎo)表達等技術(shù)均采用本領(lǐng)域技術(shù)人員的常規(guī)操作。
實施例3蛋白表達與純化
將實施例2中制備得到的含有棕果蝠瘦素蛋白基因重組表達質(zhì)粒陽性克 隆的大腸桿菌BL21，按l: 100 (菌液LB+培養(yǎng)基，體積比)接種于含有氨 芐青霉素的LB+培養(yǎng)基(酵母提取物5g，蛋白胨10g，瓊脂15g， NaC15g， ddH20至l升，pH=7.4，氨芐抗生素1%)中，37°C， 190rpm，培養(yǎng)約3h。當(dāng) OD600=0.6 1時，加入IPTG至工作濃度為0.6mM，于28°C， 190rpm，誘導(dǎo) 3h。
將上述誘導(dǎo)后的菌液于5000g， 4"離心10min，菌體用PBS洗2遍，期 間5000g， 4。C離心10min;按照每2 5ml菌液加入28ml裂解液、50}il溶菌酶、 30 4(^l苯甲基磺酰氟(PMSF)(終濃度100piM)對菌體裂解0.5 lh;裂解好 的菌體于4"C或冰浴破碎(工作時間3s，隔時間5s， 300WM50次，約20 25min， 然后于4。C離心(12000g， 10min)收集上清；上清用0.45pm慮膜過濾后，作 為下一步GST親和純化的上樣品。
本實施例的GST親和純化的填料采用High-Affinity GST Resin (市售)， 其純化具體操作可參考相關(guān)試劑說明書填料4ml，先用25 30mlPBS洗柱，然后加入前述已制備好的上樣品過柱，流速控制2 4s/滴；再用20倍柱床體積
的PBS清洗純化柱；還原型谷胱甘肽洗脫新鮮配制0.154g谷胱甘肽+50ml Tris-HCl (50mM， PH8.0)，每次3ml，流速4 5s/滴；最后用PBS清洗純化柱
對上述過柱樣品進行超濾濃縮，可采用5000rpm， 4"C離心30min。 按照每lmg蛋白加入10U凝血酶比例，采用凝血酶(市售)對上述濃縮樣 品進行常溫酶切3h，酶切后的產(chǎn)物再次進行親和純化以去除GST (具體操作同 前述的GST親和純化)，回收過柱樣品再次進行超濾濃縮(操作同前)，從而最 終得到棕果蝠痩素蛋白。將該濃縮上清液、進行凝血酶酶切的樣品一起進行 SDS-PAGE檢測，檢測結(jié)果如圖3所示，從圖3可以看出，過柱純化且經(jīng)過凝血 酶酶切后的樣品得到兩條帶， 一條在26KD位置，根據(jù)現(xiàn)有材料可知該條帶為 GST (GST的分子量為26KD)，另外一條帶在16KD的位置，這與理論值(本 發(fā)明的痩素蛋白不含信號肽的成熟肽序列為144個氨基酸，而144個氨基酸編碼 蛋白約為15.8KD)相符，說明棕果蝠瘦素蛋白與GST標(biāo)簽成功分離，同時蛋白 濃度檢測結(jié)果也表明分離、回收的棕果蝠瘦素蛋白濃度和純度達到細胞實驗要 求。
實施例4 細胞活性分析
本實施例首先采用傳統(tǒng)細胞培養(yǎng)的操作培養(yǎng)3T3-L1前脂肪細胞，然后以 培養(yǎng)好的3T3-L1前脂肪細胞作為實驗樣品，對實施例3分離純化出的棕果蝠 瘦素蛋白(15.8KD)進行MTT檢測和LDH檢測。
本實施例的MTT檢測以及LDH檢測，均采用本領(lǐng)域技術(shù)人員的常規(guī)操 作，將棕果蝠痩素蛋白(10—6M)孵育3T3-Ll前脂肪細胞24h，同時每個檢測均設(shè)兩個平行實驗對照， 一個是不含3T3-L1前脂肪細胞的空白對照組， 一個
是采用GST (1(T6M)孵育3T3-Ll前脂肪細胞24h的對照組。 細胞活性分析結(jié)果
1. 圖4給出棕果蝠痩素蛋白MTT活性檢測結(jié)果，從圖中可以看出，空白 對照組的數(shù)據(jù)為0，用棕果蝠痩素基因重組蛋白(10—6M)孵育3T3-L1前脂肪 細胞24h后，活細胞比率(MTT)下降16.8%，與GST對照組(6.6%)相比 差異極顯著(PO.01);
2. 圖5給出棕果蝠痩素蛋白LDH活性檢測結(jié)果，從圖中可以看出，空白 對照組的數(shù)據(jù)為0，用棕果蝠瘦素基因重組蛋白(1(T6M)孵育3T3-L1前脂肪 細胞24h后，脂肪細胞的乳酸脫氫酶釋放比率(LDH)顯著升高(4.5%)，明 顯高于GST對照(0.2%) (PO.Ol)。
根據(jù)圖4和圖5的對比結(jié)果，說明本發(fā)明的棕果蝠痩素蛋白具有明顯的脂 肪降解活性。棕果蝠瘦素蛋白及其cDNA序列序列表.txt SEQUENCE LISTING
<110>廣東省昆蟲研究所
<120>棕果蝠瘦素蛋白及其cDNA序列
<130〉
〈160〉 7
<170〉 Patentln version 3.5
<210〉 1
<211〉 498
<212> 腿一
<213> 棕果蝠(Rousettus lesche腳ltii)
<400〉 1
atgcattgtggactcctgtgccgattcctgtggctttggcctt"ttc"tcttctacattgaa60
gctgtgcccatccaaaaagtccaggertgactCCElELELElttCgatcatcacc120
aggatcaatacatgcggtcggtctcctctaaacagacggtcactggtttg180
gacttcattcctcggctccacactgatctgactttctccaagatgaaccagacattagca240
gtctaccaacagatccttgccgclxtgtcttccagaaatgtggtccaaatatccaacgac300
ctacagsacctccaggaccttctccatctgctggccctcagaagctgtcccttcctccag360
gacagccgcccgaataccttggagggcctgggtggcatcctagaaacctcattctccatg420
gaggtggtgaccctgagcaggctgcagggg■tttctgcaggacatgttacagcagctggac■
ctcagccctggatgctga498
<210〉 2
<211〉 498
〈212〉 DNA 一
〈213〉 棕果蝠(Rousettus lesche腿ltii)
<220>
<221> CDS
<222> (1).. (495)
〈400〉 2 atg cat tgt Met His Cys 1
gga Gly
etc Leu 5
ctg Leu
tgc Cys
cga Arg
Uc Phe
ctg Leu 10
Trp
ctt Leu
tgg Trp
Pro
Phe 15
etc Leu
48
ttc tac att gaa get gtg ccc at:c caa aaa gtc cag ga/t gac tec aaa Phe Tyr lie Glu Ala Val Pro lie Gin Lys Val Gin Asp Asp Ser Us 20 25 30
96
att etc ate aag acg ate ate acc agg ate aat aat att cca cac atg lie Leu lie Lys Thr lie lie Thr Arg lie Asn Asn lie Pro His Met 35 40 45
144
egg teg gtx tec tct aaa cag acg gtc act ggt ttg gac ttc att cct Arg Ser Val Ser Ser Lys Gin Thr Val Thr Gly Leu Asp Phe lie Pro 50 55 60
192
egg etc cac act gat ctg act ttc tec aag atg aac cag aca tta gca Arg Leu His Thr Asp Leu Thr Phe Ser Lys Met Asn Gin Thr Leu Ala 65 70 75 80
240
gtc tac caa cag ate ctt gcc get ctg "tct tec aga aat gtg gtx caa Val Tyr Gin Gin lie Leu Ala Ala Leu Ser Ser Arg Asn寸al Val Gin 85 90 95
288
ata tec aac gac eta cag aac etc cag gac ctt etc cat ctg ctg gcc lie Ser Asn人sp Leu Gin Asn Leu Gin Asp Leu Leu His Leu Leu Ala 100 105 110
336棕果蝠瘦素蛋白及其cDNA序列序列表.txt
etc aga age tgt ccc ttc etc cag gac age cgc ccg aat acc ttg gag Leu Arg Ser Cys Pro Phe Leu Gin Asp Ser Arg Pro Asn Thr Leu Glu
115
120
125
ggc ctg ggt ggc ate eta gaa acc tea ttc tec atg gag gtg gtg acc Gly Leu Gly Gly lie Leu Glu Thr Ser Phe Ser Met Glu Val Val Thr
130
135
140
ctg age agg ctg cag ggg ttt ctg cag gac atg tta cag cag ctg gac Leu Ser Arg Leu Gin Gly Phe Leu Gin Asp Met Leu Gin Gin Leu人sp
145
150
155 160
etc age cct gga tgc tga Leu Ser Pro Gly Cys 165
<210> 3 <211〉 165 <212> PRT 一
<213〉 棕果蝠(Rousettus leschenaultii) <400〉 3
Met His Cys Gly Leu Leu Cys Arg Phe Leu Trp Leu Trp Pro Phe Leu
1
5
10
15
Phe Tyr lie Glu Ala Val Pro lie Gin Lys Val Gin Asp Asp Ser Lys 20 25 30
lie Leu lie Lys Thr lie lie Thr Arg lie Asn Asn lie Pro His Met 35 40 45
Arg Ser Val Ser Ser Lys Gin Thr Val Thr Gly Leu Asp Phe lie Pro 50 55 60
Arg Leu His Thr Asp Leu Thr Phe Ser Lys Met Asn Gin Thr Leu Ala
65
70
75
80
Val Tyr Gin Gin lie Leu Ala Ala Leu Ser Ser Arg Asn Val Val Gin 85 90 95
lie Ser Asn Asp Leu Gin Asn Leu Gin Asp Leu Leu His Leu Leu Ala 100 105 110
Leu Arg Ser Cys Pro Phe Leu Gin Asp Ser Arg Pro Asn Thr Leu Glu 115 120 125
Gly Leu Gly Gly lie Leu Glu Thr Ser Phe Ser Met Glu Val Val Thr 130 135 140
Leu Ser Arg Leu Gin Gly Phe Leu Gin Asp Met Leu Gin Gin Leu Asp
145 150
Leu Ser Pro Gly Cys 165
〈210〉 4
<211〉 27
<212〉 腿 <213>人工序列
〈400〉 4
155 160
384
432
480
498棕果蝠瘦素蛋白及其cDNA序列序列表.trt aagaagmmsa tccyrggrag gaaaatg 27
<210> 5
<211> 25
<212〉 DNA <213>人工序列
<400> 5
wgrccttyra rrcytcagca yycag 25
〈210〉 6
<211> 35
〈212〉 DNA 〈213〉人工序列
<400〉 6
ccggatccgt gcccatccaa aaagtccagg atgac 35
<210> 7 -
<211> 25
〈212〉 腿 <213〉人工序列
<400〉 7
ccgtcgactc agcatccagg gctga 2權(quán)利要求
1、一種瘦素蛋白，該瘦素蛋白為如下(i)或(ii)所述任一項的蛋白質(zhì)(i)一種具有SEQ ID NO3所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(ii)在氨基酸序列(i)中，由缺失、取代或加成1個或幾個氨基酸的氨基酸序列所組成，且與氨基酸序列(i)的蛋白質(zhì)具有相同功能的蛋白質(zhì)。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述瘦素蛋白，其特征在于該瘦素蛋白具有SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述痩素蛋白，其特征在于該蛋白質(zhì)氨基酸序列中的 前21個氨基酸為信號肽序列。
4、 一種編碼痩素蛋白的cDNA序列，其特征在于該cDNA序列編碼如下 (i )或(ii)所述任一項蛋白質(zhì)(i ) 一種具有SEQIDNO: 3所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)； (ii)在氨基酸序列(i )中，由缺失、取代或加成1個或幾個氨基酸的氨 基酸序列所組成，且與氨基酸序列(i )的蛋白質(zhì)具有相同功能的蛋白質(zhì)。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的cDNA序列，其特征在于該cDNA序列具有SEQ ID NO: l所示核苷酸序列。
6、 一種含有權(quán)利要求4所述cDNA序列的質(zhì)粒。
7、 一種含有權(quán)利要求6所述質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體。
全文摘要
本發(fā)明公開一種棕果蝠的瘦素蛋白及其cDNA序列，該瘦素蛋白為一種具有SEQ ID No3所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)，或在氨基酸序列(i)中，由缺失、取代或加成1個或幾個氨基酸的氨基酸序列所組成，且與氨基酸序列(i)的蛋白質(zhì)具有相同功能的蛋白質(zhì)。本發(fā)明采用GST重組表達技術(shù)和凝血酶酶切除去GST標(biāo)記物，從棕果蝠中提取得到瘦素蛋白，細胞活性分析結(jié)果表明該棕果蝠瘦素蛋白具有明顯的脂肪降解活性，可用于制備減肥藥物、治療糖尿病藥物、治療高血壓藥物以及治療脂肪肝藥物等。
文檔編號C12N15/16GK101544692SQ200910039440
公開日2009年9月30日 申請日期2009年5月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月13日
發(fā)明者何靈江, 原麗紅, 左學(xué)國, 張樹義, 林本夫, 陳金平 申請人:廣東省昆蟲研究所