專利名稱：：綠僵菌SC0924菌株和利用它制備β-間二羥基苯甲酸大環(huán)內(nèi)酯衍生物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種真菌，具體來(lái)說(shuō)涉及一種綠僵菌ifeterh'w'f^sp.SC0924真菌菌株，另外還涉及一種用這種菌株制備"-間二羥基苯甲酸大環(huán)內(nèi)酯衍生物的方法。
背景技術(shù)：
："-間二羥基苯甲酸大環(huán)內(nèi)酯(Resorcylicacidlactones,RALs)是一類結(jié)構(gòu)十分獨(dú)特的苯并14元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯，自從1953年Delmotte等首次分離得到radicicol以來(lái)，人們從天然產(chǎn)物中一共分離得到近30個(gè)RALs，它們基本上都含有一個(gè)l、2、4、6位四取代的苯環(huán)，苯環(huán)l位連有一個(gè)酯基，6位與一個(gè)長(zhǎng)碳鏈相連，并通過(guò)碳鏈的10'位與1位羰基連接形成14元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯。在長(zhǎng)碳鏈的9'位均為亞甲基，10'位連有甲基，其它位置則連有羥基、酮基、環(huán)氧基等含氧取代基，或碳碳雙鍵等。在研究綠僵菌i/et3rh'w'"yz7sp.SC0924代謝產(chǎn)物及其抗荔枝霜疫霉活性的過(guò)程中，我們還發(fā)現(xiàn)了七種e-間二羥基苯甲酸大環(huán)內(nèi)酯衍生物，已公開在徐良雄的博士學(xué)位論文中(見ID10001200418010715012)，其中包括結(jié)構(gòu)由式(1)-1表示的aigialomycinB(該化合物已公開在Isaka，etal.J.Org.Chem.，2002，67(5):1561-1566):OHOi式(l)-l結(jié)構(gòu)由式(1)-2表示的麥他菌素A(metarhizimycinA):OHO■式(l)-24結(jié)構(gòu)由式(1)-3表示的麥他菌素C(metarhizimycinC):OHOOH3CO'v丫、、。々"^X)H式(1)-3結(jié)構(gòu)由式(l)-4表示的麥他菌素D(metarhizimycinD):OHOH3COOH式(l)-4結(jié)構(gòu)由式(1)_5表示的麥他菌素E(metarhizimycinE):OHOH3CO式(l)-5結(jié)構(gòu)由式(1)-6表示的zeaenol(該化合物已公開在Sugawara，etal.Phytochemistry,1992，31(6):1987-1990):OH式(l)-6結(jié)構(gòu)由式(1)-7表示的aigialomycinD(該化合物已公開在Isaka，etal.J.Org.Chem.，2002，67(5):156卜1566):式(1)-
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于開發(fā)出一種新的綠僵菌屬真菌綠僵菌#"ar/w>y"/sp.SC0924,另外還開發(fā)出用這種真菌制備這些"-間二羥基苯甲酸大環(huán)內(nèi)酯衍生物的方法。我們從鼎湖山國(guó)家自然保護(hù)區(qū)的土壤樣品中分離得到一種綠僵菌#etarh力'湖sp.SC0924菌株，另外通過(guò)將這種菌株用小麥固體培養(yǎng)基或YMG液體培養(yǎng)基發(fā)酵得到發(fā)酵培養(yǎng)物，然后將發(fā)酵培養(yǎng)物用有機(jī)溶劑提取得到提取物，再將提取物用硅膠柱層析等方法分離得到》-間二羥基苯甲酸大環(huán)內(nèi)酯衍生物，從而實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明的目的。本發(fā)明的綠僵菌胞far力J'w'鵬sp.SC0924己于2009年2月12閂保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱為CGMCC，地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)園中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)，保藏號(hào)為CGMCCNo.2900。該菌株從鼎湖山國(guó)家自然保護(hù)區(qū)一土壤樣品中分離獲得，分離方法為稀釋平板法將采集好的土壤樣品lg轉(zhuǎn)入無(wú)菌三角瓶中，加入lOOmL無(wú)菌水?dāng)嚢鑜h后制得土壤懸浮液，取lmL懸浮液轉(zhuǎn)移至含9mL無(wú)菌水的試管中得10—1稀釋液，依次進(jìn)行稀釋得IO-2，10—3，10—4稀釋液。吸取lmL10—4土壤稀釋液至MEA培養(yǎng)基表面，用無(wú)菌三角棒將土壤稀釋液涂布均勻，放至25'C培養(yǎng)箱培養(yǎng)7d，用無(wú)菌牙簽挑取菌落邊緣，并轉(zhuǎn)移至新的MEA培養(yǎng)基上進(jìn)一步純化得白色絲狀真菌，所述MEA培養(yǎng)基每升含麥芽汁6瓊脂提取物33.6g，其余為水，pH4.54.9。該菌株的菌絲寬23Mm;孢子近球形至橢圓形，大小為2.44.9X2.53.7Mm，菌絲和孢子的形態(tài)如圖1和圖2所示。菌絲體以經(jīng)典的CTAB法提取得到DNA，通過(guò)以ITS4(5，-3，):TCCTCCGCTTATTGATATGC和ITS5(5，-3，):GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG為引物，在10XPCRbuffer5叱，Mg2+(25mM)帆,d鮮S(lOraM)l叱，Primers(10MM/each)2ML，Taq酶(5U/叱)0.3PL，模板DNA(10ng/叱)5mL，ddH2032.7叱的體系中，在94。C5min,94°C40s，57-52°C1min，72°C1min，cycles35，72°C6min程序下進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，經(jīng)測(cè)序得到的DNA序列表見附錄1:SEQIDNO.1。測(cè)序結(jié)果在Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)用Blast進(jìn)行檢索和同源性比較，其ITS序列同源性與Metarhiziumflavoviridevar.novazealandicum的同源性最高，為95%，再結(jié)合其初步的形態(tài)特征只能初步鑒定為J/"ar/iw'"歷屬的一個(gè)種，暫定名為綠僵菌ifez^r/iw'鵬sp.SC0924。本發(fā)明由下述通式(1)表示的》-間二羥基苯甲酸大環(huán)內(nèi)酯衍生物的制備方法，其中化合物1即aigialomycinB:R產(chǎn)OH，R2=H，R3=CH3，=為單鍵，Ra和&合并為一個(gè)氧原子，二:為雙鍵，R6=0H，R7=0H;或化合物2即麥他菌素A:R產(chǎn)H，R2=0H，R3=CH3，=為單鍵，&和Rs合并為一個(gè)氧原子，::=為雙鍵，R6=0H，R7=0H;或化合物3即麥他菌素C:R尸OH，R2=H,R3=CH3，=為單鍵，R4和R7合并為一個(gè)氧原子，:::為雙鍵，R5=0H，R6=0H;或化合物4即麥他菌素D:Rf0H，R產(chǎn)H，R3=CH3，=為雙鍵，&和15不存在，==::為單鍵，Re=0H，R7=0H;或化合物5即麥他菌素E:R產(chǎn)H，R2=0H，R3=CH3，=為雙鍵，14和Rs不存在，===為單鍵，R6=0H，R7=0H;或化合物6即zeaenol:R^0H，R2=H，R3=CH3，=為單鍵，14和Rs不存在，:===為雙鍵，R6=0H，R7=0H;或化合物7即aigialomycinD:R^H，R2=0H，R3=H，=為雙鍵，R4和Rs不存在，::=為雙鍵，R6=H，R7=0H，其制備方法包括以下的步驟(1)將綠僵菌i/etar力j'w'咖sp.SC0924CGMCCNo.2900在小麥固體培養(yǎng)基上，黑暗中于2428'C靜置培養(yǎng)，得到固體發(fā)酵培養(yǎng)物，所述的小麥固體培養(yǎng)基按質(zhì)量份計(jì)，包括小麥1份，YMG液體培養(yǎng)基1.8份；或?qū)⒕G僵菌ife^r/化i"http://7sp.SC0924CGMCCNo.2900在YMG液體培養(yǎng)基上，黑暗中于2428'C搖床培養(yǎng)，得到液體發(fā)酵培養(yǎng)物；(2)將步驟(l)得到的固體發(fā)酵培養(yǎng)物用乙醇浸提，過(guò)濾后濃縮得到浸膏A，或?qū)⒉襟E(l)得到的液體發(fā)酵培養(yǎng)物用乙醇浸泡，過(guò)濾后濃縮得到浸膏B;式(1)(3)將步驟(2)所述的浸膏A或浸膏B用乙醇溶解，將乙醇溶解物用石油醚萃取，離棄石油醚萃取物，將剩下的乙醇水溶液除去乙醇并用水補(bǔ)回原體積后，將水溶液用氯仿萃取，分離出氯仿萃取物和剩余的水溶液，將氯仿萃取物濃縮得到氯仿提取物，將剩余的水溶液用乙酸乙酯萃取，將得到的乙酸乙酯萃取物濃縮得到乙酸乙酯提取物；(4)將步驟(3)得到的氯仿提取物上硅膠柱，以體積比95:580:20的氯仿-甲醇混合溶劑進(jìn)行梯度洗脫，用薄層層析檢測(cè)合并相似的流份，收集薄層板上氯仿-甲醇體積比95:5展開時(shí)比移值0.60.8的流份A或薄層板上氯仿-甲醇體積比90:10展開時(shí)比移值0.40.7的流份B;將流分A進(jìn)行硅膠柱層析，以體積比85:1560:40的石油醚-丙酮混合溶劑進(jìn)行梯度洗脫，收集薄層板上石油醚-丙酮50:50展開時(shí)比移值0.40.5的流份合并后在高效液相色譜以流動(dòng)相為體積分?jǐn)?shù)66%的甲醇分離純化，得到通式(1)表示的化合物4，或化合物5;或?qū)⒘鞣諦進(jìn)行硅膠柱層析，以體積比85:1560:40的石油醚-丙酮混合溶劑進(jìn)行梯度洗脫，收集薄層板上石油醚-丙酮50:50展開時(shí)比移值0.30.5的流份合并后以甲醇為溶媒重結(jié)晶得到以下通式(1)表示的化合物2;或?qū)⒅亟Y(jié)晶后的甲醇母液上常壓反相柱，以體積比2:14:1的甲醇-水混合溶劑進(jìn)行梯度洗脫，將流份在高效液相色譜以流動(dòng)相為體積分?jǐn)?shù)66%的甲醇純化，得到通式(l)表示的化合物l，通式(1)表示的化合物6或通式(1)表示的化合物7;或?qū)⒉襟E(3)得到的乙酸乙酯提取物上硅膠柱，以氯仿-甲醇混合溶劑體積比98:250:50進(jìn)行梯度洗脫，用薄層層析檢測(cè)合并相似的流份，收集薄層板上氯仿-甲醇體積比90:10展開時(shí)比移值0.30.5的流份C進(jìn)行硅膠柱層析，以體積比80:2050:50的石油醚-丙酮混合溶劑進(jìn)行梯度洗脫，收集薄層板上氯仿-甲醇體積比90:10展開時(shí)比移值0.30.4的流份合并后在高效液相色譜流動(dòng)相為體積分?jǐn)?shù)34%的甲醇純化，得到以下通式(1)表示的化合物3。步驟(l)中所述的YMG液體培養(yǎng)基為通用培養(yǎng)基，pH5.35.7,每升培養(yǎng)基中含有葡萄糖4g，麥芽提取物10g，酵母提取物4g，其余是水，所述的靜置培養(yǎng)時(shí)間可以是612d，培養(yǎng)溫度可以是2428°C，所述的搖床培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速可以是100120r/min，培養(yǎng)溫度可以是2428°C,培養(yǎng)時(shí)間可以是36d。步驟(2)所述的浸提最好是3次，每次48h，所述的浸泡時(shí)間最好是48h。步驟(3)所述的石油醚萃取，氯仿萃取和乙酸乙酯萃取的次數(shù)均最好是3次。通過(guò)結(jié)構(gòu)分析，也證實(shí)本發(fā)明的產(chǎn)物分別是結(jié)構(gòu)由通式(l)表示的aigialomycinB，麥他菌素A，麥他菌素C'麥他菌素D，麥他菌素E，zeaenol禾口aigialomycinD。其中aigialomycinB，無(wú)色針晶(MeOH)，分子式為C19H2408,mp186189°C，[a]24D—3.7°(c0.27，MeOH);UV(MeOH)A隨(logf)220(4.28)，265(3.98)，306(3.65)nm;正離子ESIMS/z/z3818[M+H]+，403[M+Na]+，363，345，327，309，265，253，235，207，135;負(fù)離子ESIMS頂/z379[M—H]—，415[M+Cl廠，275，231，205，187，179，164，151，135，95，85。'H國(guó)R和"C國(guó)R(溶劑氘代吡啶)的數(shù)據(jù)見表l。麥他菌素A，無(wú)色柱狀結(jié)晶(MeOH:THF=4:1)，分子式為C19H2408，卿184186°C,[a]24D—58.5。(c0.27，MeOH);UV(MeOH)入隨(logO222(4.31)，265(4.05)，306(3.71)nm;正離子ESIMS381[M+H]+，403[M+Na]+，363，345'327，309，265,253，235，207，135;負(fù)離子ESIMS379[M—H]-，415[M+CI]-,335,275，205，187,179，164，151，135。'HNMR和'3C國(guó)R(溶劑DMSO-aO的數(shù)據(jù)見表2。麥他菌素C，棕黃色固體，分子式為Cl9H2408，[ci]V40.400.27，MeOH);UV(MeOH)、ax(logO216(4.04)，283(3.34)nm;正離子ESIMS仿/z403[M+Na]+;負(fù)離子ESIMS邁/z379[M—H]—，415[M+Cl]_，759[2M—H]_，239，205，189，179,163，151，148,137，122，95,59。臓和13CNMR(溶劑:氖代吡啶)的數(shù)據(jù)見表3。麥他菌素D，白色粉末，分子式為C19H2607，mpl04106。C，[a]2°D—96.4°(c0.28，MeOH);UV(MeOH)X腿(logf)233(4.31)，271(3.95)，311(3.64)nm;正離子ESIMS辺/z367[M+H]+，389[M+Na]、349，331，313，295，219，191，99，81;負(fù)離子ESIMS邁/z365[M—H]—，401[M+Cl]一，305，277，207，189，187,174'163，148,146，59。'H和13C醒R(溶劑氘代氯仿)的數(shù)據(jù)見表4。麥他菌素E，白色粉末，分子式為C19H2607，mp175178。C，[a]2°D-106.4o(c0.28，MeOH);UV(MeOH)入腿(logf)235(4.36)，271(4.01)，314(3.70)nm;正離子ESIMS歷/z367[M+H]+，389[M+Na]+;負(fù)離子ESIMS/z//z365[M—H]—，401[M+CI]—，731[2M—Hr，305，277，207，189，187，174，163，148，146,59。'H醒R和"CNMR(溶劑氖代氯仿)的數(shù)據(jù)見表5。Zeaenol，無(wú)色針晶(Me0H)，分子式為CwH240"mp192195°C，[a]24D—72.6°(c0.27,MeOH);UV(MeOH)入鵬(logf)235(4.33)，273(3.95)，314(3.63)nm;正離子ESIMS辺/z365[M+H]+，387[M+Na]+,729[2M+H]+，751[2M+Na]+，347，329,311，283，269，237，229，219，191，175，163;負(fù)離子ESIMS363[M—H廠，399[M+CI]—，727[2M—H]—，763[2M+Cl]一，249，216，207，189，174，163，148，122，95，59。'HNMR和13CNMR(溶劑:氘代吡啶)的數(shù)據(jù)見表6。AigialomycinD，無(wú)色針晶(Me0H)，分子式為C18H2206，mpl48152。C，[a]2°D—26.7°0.27，MeOH);UV(MeOH)A酣(logf)235(4.37),274(4.17),314(3.83)nm;正離子ESIMS335[M+H]+，357[M+Na]+;負(fù)離子ESIMSw/z333[M—H]—，369[M+CI]—，315，271，253，217，189，175，161，145，130。WNMR和13CNMR(溶劑氘代丙酮)數(shù)據(jù)見表7。表1AigialomycinB的和13CNMR數(shù)據(jù)位置'H(/inHz)13c位置'H(JinHz)13C1106.24，4.36(d,10.5)70.12165.55，4.47(dd，1.3,7.5)79.736.68(d，2.7)101,36，4.59(t,7.4)75.64165.57'6.00(dd，7.4,15.5)134.356.75(d，2.7)103.98，6,13(ddd,4.8，7.2，15.4)126.66143.79,2.58(ddd,3.7，7.2,15.9)2.40(dt,4.6,15.8)37.37171.410'5.55(m)72.61'4.84(d，1.5)56.910'-CH31.30(3H，d，6.4)19.42,3.53(dt,1.7,9.7)2.85(ddd,1.5,10.6，64.74-0CH33.66(3H，s)55.53，13.5)1.98(dd,10.1,13.5)34.92-OH12.29(brs)表2麥他菌素A的'H和13CNMR數(shù)據(jù)位置'H(/inHz)13C位置'H(/inHz)13c1106.94,3.48(dd，4.1，9.6)69.52162.55，3.52(dd，3.2,4.0)77.136.41(d,2.4)100.56,3.99(dd，2.8'5.2)73.24163.67,5.40—5.60(overlapped)133.356.25(d，2.4)102,08，5.40-5.60(overlapped)125.36141.89，2.33(td，6.0,13.0)2.58(td，3,3,15.1)36.17169.510'5.30(m)73.14.12(d,1.6)55.710'-CH31.32(3H，d,6.3)19.12,2.85(td,2.0,9.9)63.84-0CH33.73(3H,s)55.43，1.50(dd，10.2，13.4)1.85(ddd,2.4，10.4'13.2)34.82-OH11.40(brs)10表3麥他菌素C的'H和"CNMR數(shù)據(jù)位置(/inHz)13C位置(/inHz)1116.53，2.15-2.45(overlapped)3.03(dt,4.4,11,5)44.72157.95，4.08(t，11.5)89.236.67(brs)101.66，5.50(d'3.7)71.34160.37，6.28(dd,4.4,16.0)134.856.68(brs)107.66.14(ddd,4.6,7.1,15.4)123.56141.52.15-2.45(overlapped)37.87169.610'5.77(m)70.0r4.44(d,8.9)87.110'—CH31.42(3H,d，6.1)21.02，5.11(ddd，4.7，8.9,11.2)68.94-0CH33.56(3H，s)55.1表4麥他菌素D的'H和'3CNMR數(shù)據(jù)位置'H(/inHz)'3C位置'H(/inHz)13c1103.94,4.17(m)77.32164.05,3.67(brd,3.5)71.336.38(s)100.26，3.93(dd，6.4，10.7)76.04165.97，1.76(m)33.856.38(s)108.68,1.72(m)35.86143,09,1.68(m);1.42(m)21.17171.310'5.00(m)74.11，7.20(dd,1.6,15.4)128.310'-CH31.40(3H，d,6.1)20.52，5.75(ddd,3.0,10.3，14.8)134.54-0CH33.79加，s)55.43，2.75(td,10.8,14.6)2.63(m)39.02-OH12.00(brs)表5麥他菌素E的'H和13CNMR數(shù)據(jù)位置<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>表7AigialomycinD的'H和"CNMR數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>圖1:綠僵菌#"arf^yi/y/7sp.SC0924孢子形態(tài)。圖2:綠僵菌Jfeta2^z'幻'咖sp.SC0924菌絲形態(tài)。具體實(shí)施例方式下面實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，不是對(duì)本發(fā)明限制。實(shí)施例l:將綠僵菌itfetar/ki咖sp.SC0924CGMCCNo.2900菌株在小麥固體培養(yǎng)基(小麥1份，上述YMG液體培養(yǎng)基1.8份)上，黑暗中于24。C靜置培養(yǎng)12d，得到固體發(fā)酵培養(yǎng)物。將固體發(fā)酵培養(yǎng)物(25L)用等體積的體積分?jǐn)?shù)95%乙醇浸泡三次，每次48h，過(guò)濾后減壓濃縮至浸膏狀(630g)，將浸膏用體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇水溶液(4L)溶解，將乙醇溶解物用等體積的石油醚萃取3次，石油醚萃取物離棄，將剩下的乙醇水溶液合并除去乙醇，然后用水補(bǔ)回原體積，將此水溶液用等量的氯仿萃取3次，分離出氯仿萃取物和剩余的水溶液，將氯仿萃取物合并并濃縮得到氯仿提取物19.23g，將剩余的水溶液用等量乙酸乙酯萃取3次，將得到的乙酸乙酯萃取物合并并濃縮得到乙酸乙酯提取物39.31g。將氯仿提取物19.00g上硅膠柱(硅膠為100200目，300g)，以氯仿-甲醇混合溶劑作為洗脫劑，以體積比95:580:20的梯度進(jìn)行洗脫，用薄層層析(TLC)檢測(cè)合并相似的流份，收集薄層板上氯仿-甲醇體積比95:5展開時(shí)比移值0.60.8的流份A，蒸餾濃縮得3.40g，和薄層板上氯仿-甲醇體積比90:10展開時(shí)比移值0.4~0.7的流份B，蒸餾濃縮得6.83g，將流分A進(jìn)行硅膠柱層析，硅膠(硅膠為100200目，70g)，以石油醚-丙酮混合溶劑作為洗脫劑，在體積比85:1560:40進(jìn)行梯度洗脫，收集薄層板上石油醚-丙酮50:50展開時(shí)比移值0.40.5的流份合并后以高效液相色譜(LC-6AD型半制備高效液相色譜儀，RID-10A檢測(cè)器，日本Shimadzu公司生產(chǎn)，流動(dòng)相為體積分?jǐn)?shù)66%的甲醇)分離純化，得到白色粉末0.060g和0.025g兩個(gè)化合物，通過(guò)上述結(jié)構(gòu)分析證明前者是通式(1)表示的化合物4，即是麥他菌素D，后者是化合物5，即是麥他菌素E。將流份B進(jìn)行硅膠柱層析(硅膠為100200目，150g)，以石油醚-丙酮混合溶劑作為洗脫劑，在體積比85:1560:40梯度洗脫，收集薄層板上石油醚-丙酮50:50展開時(shí)比移值0.30.5的流份合并后以甲醇為溶媒重結(jié)晶得無(wú)色柱狀結(jié)晶的化合物0.320g，通過(guò)上述結(jié)構(gòu)分析證明是通式(1)表示的化合物2，即是麥他菌素A。重結(jié)晶后的甲醇母液上常壓反相柱，以甲醇-水混合溶劑作為洗脫劑，在體積比2:14:1進(jìn)行梯度洗脫，將流份以高效液相色譜(儀器同前，流動(dòng)相為體積分?jǐn)?shù)66%的甲醇)純化，得到針狀結(jié)晶甲O,110g，針狀結(jié)晶乙0.060g和針狀結(jié)晶丙0.091g三個(gè)化合物，通過(guò)上述結(jié)構(gòu)分析證明針狀結(jié)晶甲是通式(1)表示的化合物l,即是aigialomyciriB，針狀結(jié)晶乙是通式(1)表示的化合物6，即是zeaenol,針狀結(jié)晶丙是通式(1)表示的化合物7,即是aigialomycinD。將前述乙酸乙酯提取物39.31g上硅膠柱(硅膠為100200目，800g)，以氯仿-甲醇混合溶劑作為洗脫劑，在體積比98:250:50的梯度進(jìn)行洗脫，用薄層層析檢測(cè)合并相似的流份，收集薄層板上氯仿-甲醇體積比90:10展開時(shí)比移值0.30.5的流份C，蒸餾濃縮得5.56g進(jìn)行硅膠柱層析(硅膠為100200目，80g)，以石油醚-丙酮混合溶劑作為洗脫劑，在體積比80:2050:50的梯度進(jìn)行洗脫，收集薄層板上氯仿-甲醇體積比90:10展開時(shí)比移值0.30.4的流份合并后以高效液相色譜(儀器同前，流動(dòng)相為體積分?jǐn)?shù)34%的甲醇)純化，得到化合物0.056g，通過(guò)上述結(jié)構(gòu)分析證明是通式(1)表示的化合物3，即是麥他菌素C。實(shí)施例2:將綠僵菌ifeter力iw'Msp.SC0924CGMCCNo.2900菌株在小麥固體培養(yǎng)基(小麥1份，上述YMG液體培養(yǎng)基1.8份)上，黑暗中于28'C靜置培養(yǎng)6d，得到固體發(fā)酵培養(yǎng)物。將固體發(fā)酵培養(yǎng)物(25L)用等體積的體積分?jǐn)?shù)95%乙醇浸泡三次，每次48h，過(guò)濾后減壓濃縮至浸膏狀(500g)，將浸膏用體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇水溶液(4L)溶解，將乙醇溶解物用等體積的石油醚萃取3次，石油醚萃取物離棄，將剩下的乙醇水溶液合并除去乙醇，然后用水補(bǔ)回原體積，將此水溶液用等量的氯仿萃取3次，分離出氯仿萃取物和剩余的水溶液，將氯仿萃取物合并并濃縮得到氯仿提取物28.60g，將剩余的水溶液用等量乙酸乙酯萃取3次，將得到的乙酸乙酯萃取物合并并濃縮得到乙酸乙酯提取物44.50g。將氯仿提取物28.00g以實(shí)施例1相同方法分離純化得到通式(1)表示的化合物4(麥他菌素D)0.080g，化合物5(麥他菌素E)0.016g，化合物2(麥他菌素A)1.280g，化合物l(aigialomycinB)0.180g，化合物6(zeaenol)0.076g，化合物7(aigialomycinD)(X420g。將前述的乙酸乙酯提取物44.OOg以實(shí)施例1相同方法分離純化得到通式(1)表示的化合物3(麥他菌素C)0.080g。實(shí)施例3:將綠僵菌#"31^力'"邁sp.SC0924CGMCCNo.2900菌株用YMG液體培養(yǎng)基(pH5.7，每升含葡萄糖4g,麥芽提取物10g，酵母提取物4g，其余是水)置于搖床上120iVmin，24°C，黑暗條件下培養(yǎng)6d，得到液體發(fā)酵培養(yǎng)物。將液體發(fā)酵培養(yǎng)物(200用等體積的體積分?jǐn)?shù)95%乙醇浸泡48h，過(guò)濾后的濾液減壓濃縮至浸膏狀(180g)，將浸膏用體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇水溶液(1L)溶解，將乙醇溶解物用等體積的石油醚萃取3次，石油醚萃取物離棄，將剩下的乙醇水溶液合并除去乙醇，然后用水補(bǔ)回原體積，將此水溶液用等量的氯仿萃取3次，分離出氯仿萃取物和剩余的水溶液，將氯仿萃取物合并并濃縮得到氯仿提取物8.30g，將剩余的水溶液用等量乙酸乙酯萃取3次，將得到的乙酸乙酯萃取物合并并濃縮得到乙酸乙酯提取物14.20g。將氯仿提取物8.00g以實(shí)施例l相同方法分離純化得到通式(1)表示的化合物4(麥他菌素D)0.080g，化合物5(麥他菌素E)0.015g，化合物2(麥他菌素A)0.660g，化合物1(aigialomycinB)0.060g，化合物6(zeaenol)0.,g，化合物7(aigialomycinD)0.031g。將前述的乙酸乙酯提取物14.00g以實(shí)施例1相同方法分離純化得到通式(1)表示的化合物3(麥他菌素C)0.016g。實(shí)施例4:將綠僵菌i/ez^/^力'Msp.SC0924CGMCCNo.2900菌株用YMG液體培養(yǎng)基(pH5.3，每升含葡萄糖4g，麥芽提取物10g，酵母提取物4g，其余是水)置于搖床上100r/min，2S。C，黑暗條件下培養(yǎng)3d，得到液體發(fā)酵培養(yǎng)物。將液體發(fā)酵培養(yǎng)物(20L)用等體積的體積分?jǐn)?shù)95%乙醇浸泡48h，過(guò)濾后的濾液減壓濃縮至浸膏狀(140g),將浸膏用體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇水溶液(1L)溶解，將乙醇溶解物用等體積的石油醚萃取3次，石油醚萃取物離棄，將剩下的乙醇水溶液合并除去乙醇，然后用水補(bǔ)回原體積，將此水溶液用等量的氯仿萃取3次，分離出氯仿萃取物和剩余的水溶液，將氯仿萃取物合并并濃縮得到氯仿提取物6.80g，將剩余的水溶液用等量乙酸乙酯萃取3次，將得到的乙酸乙酯萃取物合并并濃縮得到乙酸乙酯提取物10.20g。將氯仿提取物6.50g以實(shí)施例l相同方法分離純化得到通式(1)表示的化合物4(麥他菌素D)0.040g，化合物5(麥他菌素E)0.006g，化合物2(麥他菌素A)0.480g，化合物1(aigialoraycinB)0.060g，化合物6(zeaenol)0.010g，化合物7(aigialomycinD)0.020g。將乙酸乙酯分部提取物10.00g以實(shí)施例1相同方法分離純化得到通式(1)表示的化合物3(麥他菌素C)0.010g?！?10〉中國(guó)科學(xué)院華南植物園<120>綠僵菌SC0924菌株和利用它制備間二羥基苯甲酸大環(huán)內(nèi)酯衍生物的方法<160〉1〈210〉1<211>585〈212〉DNA〈213〉綠僵菌#ez^/_z^':/wsp.〈400〉1GGATCCTACCTGATTCGAGGTCACTTCTAAAAAAGTTGGGCGTTTTACGGCAGTGGCCGC60GTCGCGCTCCTGTTGCGAGGTTGTGCTACTACGCAGAGGAGGCCGCGACGAGACCGCCAA120TTCATTTCGGGGGCGGCGCAACGCTGCCGAGGCAGCGAGGATCGCCGGTCCCCAACACCA180AACCACGGGGGCTTGAGGGTTGAAATGACGCTCGAACAGGCATGCCCGCCAGAATACTGG240CGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTT300ATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTT360TGATTCATTTGATATGATTCCACTCAGACATGTAAATGTAAAAAATACAAGAGTTTAGGT420CCCCCGGCGGGCGCCTGGTTCCGGGCAGGAAGAACCTGTTCCGGGGCGAGAACCCGCCGA■AGCAACGGTAAAAGGTATAAGTTCACAGGGGTTTGGGAGTTGTAAACTCGGTAATGATCC540CTCCGCTGGTTCACCAACGGAGACCTTGTTACGCTTTTTACTTCA58權(quán)利要求1.綠僵菌Metarhiziumsp.SC0924CGMCCNo.2900。2.—種由權(quán)利要求1所述的綠僵菌SC0924制備通式(l)化合物的方法，OHOv式(1)其中化合物1:R產(chǎn)OH，R2=H，R3=CH3，=為單鍵，14和Rs合并為一個(gè)氧原子，:::為雙鍵，R6=0H，R7=0H;或化合物2:R產(chǎn)H，R2=0H，R3=CH3，=為單鍵，14和Rs合并為一個(gè)氧原子，====為雙鍵，R6=0H，R產(chǎn)0H;或化合物3:R產(chǎn)OH，R2=H，R3=CH3，=為單鍵，R4和R合并為一個(gè)氧原子，二:為雙鍵，R5=0H，R6=0H;或化合物4:R^0H，R2=H，R3=CH3，rr二為雙鍵，R4和Rs不存在，==:為單鍵，Re二0H，R7=0H;或化合物5:R尸H，R2=0H，R3=CH3，rr二為雙鍵，R4和Rs不存在，:二為單鍵，R6=0H，R7=0H;或化合物6:R產(chǎn)0H，R2=H，R3=CH3，=為單鍵，14和{5不存在，:=:為雙鍵，R6=0H，R7=0H;或化合物7:R尸H，R2=0H，R3=H，=為雙鍵，R4和Rs不存在，二:為雙鍵，R6=H，R7=0H，其制備方法包括以下的步驟(1)將綠僵菌#etar/w>i^Z7sp.SC0924CGMCCNo.2900在小麥固體培養(yǎng)基上，黑暗中于2428'C靜置培養(yǎng)，得到固體發(fā)酵培養(yǎng)物，所述的小麥固體培養(yǎng)基按質(zhì)量份計(jì)，包括小麥1份，YMG液體培養(yǎng)基1.8份；或?qū)⒕G僵菌ifetar/w'zisp.SC0924CGMCCNo.2900在YMG液體培養(yǎng)基上，黑暗中于2428'C搖床培養(yǎng)，得到液體發(fā)酵培養(yǎng)物；(2)將步驟(l)得到的固體發(fā)酵培養(yǎng)物用乙醇浸提，過(guò)濾后濃縮得到浸膏A，或?qū)⒉襟E(l)得到的液體發(fā)酵培養(yǎng)物用乙醇浸泡，過(guò)濾后濃縮得到浸膏B;(3)將步驟(2)所述的浸膏A或浸膏B用乙醇溶解，將乙醇溶解物用石油醚萃取，離棄石油醚萃取物，將剩下的乙醇水溶液除去乙醇并用水補(bǔ)回原體積后，將水溶液用氯仿萃取，分離出氯仿萃取物和剩余的水溶液，將氯仿萃取物濃縮得到氯仿提取物，將剩余的水溶液用乙酸乙酯萃取，將得到的乙酸乙酯萃取物濃縮得到乙酸乙酯提取物；(4)將步驟(3)得到的氯仿提取物上硅膠柱，以體積比95:580:20的氯仿-甲醇混合溶劑進(jìn)行梯度洗脫，用薄層層析檢測(cè)合并相似的流份，收集薄層板上氯仿-甲醇體積比95:5展開時(shí)比移值0.60.8的流份A或薄層板上氯仿-甲醇體積比90:10展開時(shí)比移值0.40.7的流份B;將流分A進(jìn)行硅膠柱層析，以體積比85:1560:40的石油醚-丙酮混合溶劑進(jìn)行梯度洗脫，收集薄層板上石油醚-丙酮50:50展開時(shí)比移值0.40.5的流份合并后在高效液相色譜以流動(dòng)相為體積分?jǐn)?shù)66%的甲醇分離純化，得到通式(1)表示的化合物4，或化合物5;或?qū)⒘鞣諦進(jìn)行硅膠柱層析，以體積比85:1560:40的石油醚-丙酮混合溶劑進(jìn)行梯度洗脫，收集薄層板上石油醚-丙酮50:50展開時(shí)比移值0.30.5的流份合并后以甲醇為溶媒重結(jié)晶得到以下通式(1)表示的化合物2;或?qū)⒅亟Y(jié)晶后的甲醇母液上常壓反相柱，以體積比2:14:1的甲醇-水混合溶劑進(jìn)行梯度洗脫，將流份在高效液相色譜以流動(dòng)相為體積分?jǐn)?shù)66%的甲醇純化，得到通式(l)表示的化合物l，通式(1)表示的化合物6或通式(1)表示的化合物7;或?qū)⒉襟E(3)得到的乙酸乙酯提取物上硅膠柱，以氯仿-甲醇混合溶劑體積比98:250:50的進(jìn)行梯度洗脫，用薄層層析檢測(cè)合并相似的流份，收集薄層板上氯仿-甲醇體積比90:10展開時(shí)比移值0.30.5的流份C進(jìn)行硅膠柱層析，以體積比80:2050:50的石油醚-丙酮混合溶劑進(jìn)行梯度洗脫，收集薄層板上氯仿-甲醇體積比90:10展開時(shí)比移值0.30.4的流份合并后在高效液相色譜以流動(dòng)相為體積分?jǐn)?shù)34%的甲醇純化，得到以下通式(1)表示的化合物3。全文摘要本發(fā)明涉及一種綠僵菌Metarhiziumsp.SC0924CGMCCNo.2900。本發(fā)明還涉及由綠僵菌Metarhiziumsp.SC0924CGMCCNo.2900制備下述通式(1)化合物的方法，其特征是將該綠僵菌SC0924菌株用小麥固體培養(yǎng)基或YMG液體培養(yǎng)基發(fā)酵得到發(fā)酵培養(yǎng)物，然后將發(fā)酵培養(yǎng)物用有機(jī)溶劑提取得到提取物，再將提取物通過(guò)硅膠柱層析等方法分離得到下列通式(1)表示的化合物。文檔編號(hào)C12P17/08GK101565678SQ200910037639公開日2009年10月28日申請(qǐng)日期2009年3月6日優(yōu)先權(quán)日2009年3月6日發(fā)明者徐良雄,薛璟花,魏孝義申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院華南植物園