專利名稱：廢水生物處理反應(yīng)器中微生物群落組成的快速分子檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到利用PCR-DGGE技術(shù)設(shè)計(jì)構(gòu)建DGGE Marker對(duì)廢水生物處理反應(yīng)器 中顆粒污泥、活性污泥、生物膜等樣品中微生物群落組成從而進(jìn)行快速分析檢測(cè)的技 術(shù)，屬于環(huán)境微生物分子生態(tài)學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
廢水生物處理技術(shù)是目前世界上處理市政廢水和有機(jī)工業(yè)廢水的主要方法。為了 提高廢水處理性能和穩(wěn)定性，人們對(duì)反應(yīng)器的設(shè)計(jì)和操作條件進(jìn)行了大量研究。廢水 處理過(guò)程中主要是依賴以活性污泥(包括顆粒污泥)和生物膜為核心的微生物群落來(lái) 降解和轉(zhuǎn)化污染物，但由于研究技術(shù)和手段的缺乏，人們只能把反應(yīng)器中的微生物群 落看作是一個(gè)"黑箱"，把整個(gè)廢水處理過(guò)程當(dāng)做一個(gè)物理化學(xué)過(guò)程，通過(guò)控制和監(jiān)控生 物反應(yīng)器的物化參數(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)廢水的無(wú)害化排放。但這些操作條件是否破壞微生物群落 的正常結(jié)構(gòu)，是否能夠長(zhǎng)期穩(wěn)定地達(dá)到廢水的高效處理，都是工程師們和微生物學(xué)家 熱衷的問題。因此需對(duì)參與廢水處理的微生物群落中各個(gè)種群的組成、豐度、分布及 其在環(huán)境中生理生化特性進(jìn)行整理全面研究，并且以此為基礎(chǔ)適當(dāng)改變反應(yīng)器設(shè)計(jì)或 者操作條件，以適應(yīng)廢水生物處理中涉及的微生物的生長(zhǎng)，才能更好的優(yōu)化反應(yīng)器的 設(shè)計(jì)和性能，提高生物處理的效率。
目前自然界中只有極少部分微生物能夠被分離和純化，因此傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)和 鑒定方法不足以代表微環(huán)境中的真實(shí)情況?；?6S rDNA的免純培養(yǎng)技術(shù)的分子生物 學(xué)研究手段，例如末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析、熒光原位 雜交技術(shù)等逐步被引入到環(huán)境微生物學(xué)研究中，已經(jīng)將環(huán)境微生物領(lǐng)域研究帶入一個(gè) 革命性的新時(shí)代。變性梯度凝膠電泳(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis, DGGE) 技術(shù)直接利用DNA及RNA對(duì)微生物遺傳特性進(jìn)行表征，不但避免了傳統(tǒng)上耗時(shí)的菌種 分離，更可進(jìn)而鑒定出無(wú)法利用傳統(tǒng)方法分離出來(lái)的菌種。
傳統(tǒng)培養(yǎng)方法和構(gòu)建克隆文庫(kù)等微生物群落組成分析方法，效率較低。目前有利 用DGGE技術(shù)分析城市污水廠污泥和工業(yè)廢水處理中的微生物群落的專利申請(qǐng)，如同濟(jì) 大學(xué)提出的分析城巿污水廠污泥微生物群落構(gòu)成的方法(CN1584051 ),上海交通大學(xué) 發(fā)明的工業(yè)廢水處理中的功能菌群特異性分子檢測(cè)方法(CN1995389)，但未涉及如何 進(jìn)一步縮短利用DGGE技術(shù)檢測(cè)時(shí)間更加快速檢測(cè)廢水生物處理中微生物群落。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種縮短微生物群落組成的檢測(cè)周期的檢測(cè)技術(shù)，即微生物 群落樣品DNA的PCR再經(jīng)DGGE分離獲取條帶所代表的微生物種類的信息來(lái)設(shè)計(jì)構(gòu) 建變性梯度凝膠電泳Marker作為對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)廢水生物處理反應(yīng)器中顆粒污泥、活性 污泥、生物膜等樣品中微生物群落組成從而進(jìn)行快速分析檢測(cè)的技術(shù)。本發(fā)明技術(shù)方案是
廢水生物處理反應(yīng)器中微生物群落組成的快速分子檢測(cè)方法，
① 收集廢水生物處理反應(yīng)器中微生物樣品進(jìn)行預(yù)處理，利用苯酚-氯仿法提取基因 組總DNA;
② 設(shè)計(jì)16S rDNA V3區(qū)引物[341F-GC和518R(細(xì)菌)；344F-GC和518R(古菌)]對(duì)樣 品DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
③ 利用變性梯度凝膠電泳即DGGE技術(shù)分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；
④ 得到的DGGE圖譜利用Quantity one軟件分析，并根據(jù)切膠測(cè)序特征DGGE條帶，
對(duì)所代表的微生物進(jìn)行鑒定；
⑤ 根據(jù)條帶所代表的微生物種類來(lái)設(shè)計(jì)構(gòu)建變性梯度凝膠電泳集合庫(kù)DGGE Marker作為快速分子檢測(cè)的對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)。所述變性梯度凝膠電泳集合庫(kù)DGGE Marker是根 據(jù)PCR產(chǎn)物經(jīng)DGGE分離后的條帶通過(guò)切膠克隆測(cè)序然后在Genbank中同源比對(duì)明確其 代表的微生物種類來(lái)設(shè)計(jì)構(gòu)建的；直接采用已知條帶的PCR產(chǎn)物混合或者將已知條帶所 對(duì)應(yīng)的純培養(yǎng)物DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物混合，從而作為快速分子檢測(cè)方法的對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)。
根據(jù)DGGE分離后的條帶經(jīng)測(cè)序并在Genbank中比對(duì)，判斷其代表的微生物種類來(lái) 設(shè)計(jì)構(gòu)建DGGE Marker作為分子檢測(cè)的對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)，從而對(duì)廢水生物處理反應(yīng)器中顆粒污 泥、活性污泥、生物膜等樣品中微生物群落組成進(jìn)行快速分析。
其中步驟①、②中，收集廢水生物處理反應(yīng)器中微生物樣品，提取基因組總DNA; 使用16S rDNA V3區(qū)引物對(duì)所述DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增的條件是；所述DNA由細(xì)菌和古菌 的16S rDNA V3區(qū)片段設(shè)計(jì)正向引物5 '連接至GC-夾板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；所述16S rDNA V3 區(qū)片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增條件為94t:預(yù)變性5min,然后94。C變性30S, 65'C退火30S， 72°C延 伸lmin共30個(gè)循環(huán)，最后72。C延伸10min;
所述生物樣品為廢水生物處理反應(yīng)器中活性污泥；包括厭氧顆粒污泥、好氧顆粒污泥 和生物膜樣品，且經(jīng)過(guò)冷凍干燥和液氮研磨的預(yù)處理，再提取基因組總DNA。
步驟③中，利用DGGE分析所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的條件為制備隨變性劑尿素濃度 梯度45%-70%,同時(shí)增加丙烯酰胺凝膠濃度梯度8%-10%形成雙梯度-變性梯度凝膠電 泳(DG-DGGE)，電泳電壓80V，電泳時(shí)間15h, 二溴乙錠染色20min,脫色20min;
步驟①中，DNA提取的步驟是溶菌酶處理和SDS裂解將50mg研缽加入液氮 研磨直至粉末狀沉淀懸浮在1.5ml0.1MTris-HCl， 0.1MNa2EDTA, O.lMNaCl, pH8 構(gòu)成的DNA提取液，并加入10mg/ml的150|aL溶菌酶溶液；37。C溫洛lh后，向 菌液中加入0.5ml 10%SDS溶液，并漩渦振蕩搖勻，65"溫洛30min，每間隔幾分鐘 搖勻，待菌液變清后離心10min(12 000xg, 4°C),得到DNA上清液并取DNA上清 液置于冰上留用；收集兩步的DNA上清液；用等體積的苯酚+氯仿+異戊醇(體積比為 25:24:l)和氯仿+異戊醇(體積比為24:1)各抽提1次，離心并空氣干燥至DNA沉淀干燥 后，溶于100pLTE緩沖液中。
DNA分子雙螺旋結(jié)構(gòu)是由氫鍵和堿基的疏水作用共同作用的結(jié)果。溫度、有機(jī)溶劑和pH等因素可以使氫鍵受到破壞，導(dǎo)致雙鏈變性為單鏈。變性梯度凝膠電泳的原理 是通過(guò)不同序列的DNA片段在各自相應(yīng)的變性劑濃度下變性，部分發(fā)生解鏈引起發(fā)生 空間構(gòu)型的變化，導(dǎo)致電泳速度的急劇下降，最后在其相應(yīng)的變性劑梯度位置停滯， 經(jīng)過(guò)染色后可以在凝膠上呈現(xiàn)為分散的條帶。在引物的3，端加上40個(gè)堿基左右的G-C夾 板可使DGGE對(duì)序列差異的分辨率提高到近100%。該技術(shù)可以分辨具有相同或相近分 子量的目的片段序列差異，可用于微生物群落結(jié)構(gòu)的研究、微生物種群動(dòng)態(tài)的分析、 富集培養(yǎng)物及分離物的分析、核糖體RNA同源性的分析。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明為了進(jìn)一步縮短微生物群落組成的檢測(cè)周期，根據(jù)廢 水生物處理反應(yīng)器中顆粒污泥、活性污泥、生物膜等樣品總DNA的特異性擴(kuò)增PCR產(chǎn) 物經(jīng)DGGE分離獲取條帶所代表的微生物種類的信息來(lái)設(shè)計(jì)構(gòu)建變性梯度凝膠電泳 Marker作為對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)其它樣品以相同條件進(jìn)行DGGE分析時(shí)，出現(xiàn)與Marker位置相 同的條帶則初步認(rèn)為樣品中含有此條帶所代表的微生物種類，如果出現(xiàn)與Marker位置不 同的條帶則可以進(jìn)行切膠測(cè)序，初步判定其種屬，從而快速準(zhǔn)確地進(jìn)行廢水生物處理 中微生物群落組成分析。
① 可快速簡(jiǎn)便的監(jiān)控微生物群落組成的時(shí)間和空間變化。DNA提取大約4h, PCR擴(kuò) 增大約2.5h、凝膠準(zhǔn)備lh，電泳15h、染色30min,此項(xiàng)分析僅需24h就可以初步判斷樣 品的微生物群落組成。
② 相對(duì)簡(jiǎn)單的可獲知微生物樣品中優(yōu)勢(shì)菌。
③ 可對(duì)廢水生物處理過(guò)程中微生物種群多樣性和動(dòng)態(tài)性變化、以及樣品之間群落相 似性進(jìn)行分析。
④ 適用于多種廢水處理過(guò)程中微生物樣品，包括好氧顆粒污泥、厭氧顆粒污泥、活 性污泥、生物膜等樣品。


圖l DNA瓊脂糖電泳圖譜照片 圖2PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖譜 圖3 PCR產(chǎn)物DGGE電泳圖譜
圖4DGGE圖譜樣品種群多樣性分析和部分微生物種類示例
具體實(shí)施例方式
微生物樣品收集、預(yù)處理和DNA提取
微生物樣品收集和預(yù)處理無(wú)菌瓶收集以上裝置厭氧反應(yīng)器UASB上、中、下層顆 粒污泥、缺氧池活性、二級(jí)好氧池顆粒污泥五個(gè)樣品50m1,收集后在-20。C冷凍。三角 瓶收集連同填料一起的生物流化床MBBR生物膜樣品5克，加入1 Oml無(wú)菌PBS緩沖液， 劇烈震蕩將生物膜從填料洗脫至生物膜全部洗脫。并用PBS緩沖液清洗兩次，收集沉淀。 一共六個(gè)樣品進(jìn)行冷凍干燥，倒入研缽加入液氮研磨直至粉末狀，-20'C保存。
溶菌酶處理和SDS裂解將50mg沉淀懸浮在1.5ml DNA提取液(0.1M Tris-HCl, 0.1MNa2EDTA, O.lMNaCl， pH8), 并加入15(VL溶菌酶溶液(配制100mg/ml的母液，-20°。保存)，使終濃度為10mg/ml。 37"溫浴lh后，向菌液中加入0.5mllO。/。SDS 溶液(O.lMNaCl, 0.5M Tris-HCl， 10% SDS, pH 8)， 并漩渦振蕩搖勻，65。C溫 洛30min，每間隔幾分鐘搖勻，待菌液變清后離心10min(12 000xg, 4°C),取上清置 于冰上留用。
DNA提取和純化重復(fù)以上步驟一次，收集兩步的DNA上清液。用等體積的苯酚+ 氯仿+異戊醇(體積比為25:24:l)和氯仿+異戊醇(體積比為24:l)各抽提1次，氯仿和異戊 醇兩相應(yīng)清楚分離，12000xg離心5min收集上清液。以0.6倍體積的異丙醇于4'C沉淀1 小時(shí)，4'C下10 000xg離心20min。用lml的70。/。乙醇洗滌沉淀，用槍頭吸打均勻，離 心10min(10 000xg, 4°C)?？諝飧稍镏罝NA沉淀干燥后，溶于100pLTE緩沖液中，加 RnaseA3nL(10mg/ml) ， 37°C溫浴15 ~ 20min消化RNA ,樣品在-20。C保存?zhèn)溆谩?br> 3. 總DNA中16S rDNA的PCR擴(kuò)增；
使用帶GC夾板的正向引物341F-GC (5'-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGGG CCT ACG GGA GGC AGC AG-3')和反向引物518R 5'-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3'對(duì)樣品進(jìn)行細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增 (344F-GC和518R(古菌)]對(duì)樣品DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增)。50pl PCR反應(yīng)體系為10xPCR buffer 5jul， MgCl2 (25mM) 3pl, dNTP(2.5 mM)各4(^1，引物(25mM )各l(al， Taq( 5U/(il) 0.25W，模板DNA (稀釋十倍)lpl。 PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4。C預(yù)變性5min,然后94"變 性30S, 65。C退火30S, 72°C延伸lmin共30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸10min。見圖2。
4. DGGE電泳分析，即利用DGGE分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物； 制備隨變性劑尿素濃度梯度45%-70%,同時(shí)增加丙烯酰胺凝膠濃度梯度8%-10%形成 雙梯度-變性梯度凝膠電泳(DG-DGGE),電泳電壓80V，電泳時(shí)間15h， 二溴乙錠染色 20min，脫色20min。見圖3 PCR產(chǎn)物DGGE電泳圖譜。
5. 凝膠中DNA回收、切膠測(cè)序特征DGGE條帶，對(duì)所代表的微生物進(jìn)行鑒定；用 潔凈刀片將條帶切下，放入1.5m正P管，搗碎，加入10(^1無(wú)菌水溶解，4'C靜止24h,離 心取上清液做為DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，正向引物去除5'GC夾板。PCR產(chǎn)物純化后送 測(cè)序公司。得到DNA序列登錄NCBI Genbank利用blastn程序進(jìn)行同源比對(duì)。
6. 根據(jù)條帶所代表的微生物種類來(lái)設(shè)計(jì)構(gòu)建DGGE Marker作為快速分子檢測(cè)的對(duì) 照標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)測(cè)序已知微生物種類的條帶的PCR產(chǎn)物混合，或者將其所對(duì)應(yīng)的純培養(yǎng) 物DNA進(jìn)行16S rDNA V3區(qū)PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物混合構(gòu)建每條帶均已知其所代表的微生 物種類的DGGE Marker,從而作為快速分子檢測(cè)方法的對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)。樣品以相同條件進(jìn) 行DGGE分析時(shí)，出現(xiàn)與Marker位置相同的條帶則初步認(rèn)為樣品中含有此條帶所代表 的微生物種類，如果出現(xiàn)與Marker位置不同的條帶則可以進(jìn)行切膠測(cè)序，初步判定其 種屬。圖4中DGGE圖譜樣品種群多樣性分析和部分微生物種類示例，其中條帶l-布 爾開納博厭氧弧菌爿"aeraw7Wo 6wWb'"(^e"w;sv條帶2-脫硫弧菌Den^/cn^n'o早/條帶 15-古字狀菌屬細(xì)菌i w"e//fl/!>wwa，'條帶16-叢毛單胞菌Cowawow^取條帶17-土芽孢 才千菌屬細(xì)菌Geo&ac"/ws條帶18-腐蟲累方定菌牙斗細(xì)菌Saprosp/racgag &a"er/i/w
權(quán)利要求
1. 一種廢水生物處理反應(yīng)器中微生物群落組成的快速分子檢測(cè)方法，其特征在于，具體步驟如下①收集廢水生物處理反應(yīng)器中微生物樣品進(jìn)行預(yù)處理，利用苯酚-氯仿法提取基因組總DNA；②使用16S rDNA V3區(qū)引物[341F-GC和518R(細(xì)菌)；344F-GC和518R(古菌)]對(duì)樣品DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；③利用變性梯度凝膠電泳即DGGE技術(shù)分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；④得到的DGGE圖譜利用Quantity one軟件分析，并根據(jù)切膠測(cè)序特征DGGE條帶，對(duì)所代表的微生物進(jìn)行鑒定；⑤根據(jù)條帶所代表的微生物種類來(lái)設(shè)計(jì)構(gòu)建變性梯度凝膠電泳數(shù)據(jù)庫(kù)DGGEMarker作為快速分子檢測(cè)的對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)；所述變性梯度凝膠電泳集合庫(kù)DGGE Marker是根據(jù)PCR產(chǎn)物經(jīng)DGGE分離后的條帶通過(guò)切膠克隆測(cè)序然后在Genbank中同源比對(duì)明確其代表的微生物種類來(lái)設(shè)計(jì)構(gòu)建的；直接采用已知條帶的PCR產(chǎn)物混合或者將已知條帶所對(duì)應(yīng)的純培養(yǎng)物DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物混合，從而作為快速分子檢測(cè)方法的對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述廢水生物處理反應(yīng)器中微生物群落組成的快速分子檢測(cè)方法，其特征為，所述生物樣品為廢水生物處理反應(yīng)器中活性污泥；包括厭氧顆粒污泥、好氧顆粒污泥和生物膜樣品，且經(jīng)過(guò)冷凍干燥和液氮研磨的預(yù)處理，再提取基因組總DNA。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述廢水生物處理反應(yīng)器中微生物群落組成的快速分子檢測(cè)方法，其特征為步驟①、②中，所述DNA由細(xì)菌和古菌的16SrDNAV3區(qū)片段設(shè)計(jì)正向引物5'連接至GC-夾板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；所述16S rDNA V3區(qū)片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增條件為94。C預(yù)變性5min,然后94。C變性30S, 65。C退火30S, 72°C延伸lmin共30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸10min。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1、 2所述的廢水生物處理反應(yīng)器中微生物群落組成的快速分子檢測(cè)方法，其特征為，利用DGGE分析所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的條件為制備隨變性劑尿素濃度梯度45%-70%，同時(shí)增加丙烯酰胺凝膠濃度梯度8%-10%形成雙梯度-變性梯度凝膠電泳(DG-DGGE),電泳電壓80V,電泳時(shí)間15h， 二溴乙錠染色20min,脫色20min。
5. 權(quán)利要求1、 2所述的廢水生物處理反應(yīng)器中微生物群落組成的快速分子檢測(cè)方法，其特征是步驟①中，DNA提取的步驟是微生物樣品經(jīng)溶菌酶處理和SDS裂解將50mg研缽加入液氮研磨直至粉末狀沉淀懸浮在1.5ml 0.1M Tris-HCl, 0.1MNa2EDTA, 0.1M NaCl, pH8構(gòu)成的DNA提取液，并加入10mg/ml的150|iL溶菌酶溶液；37。C溫洛lh后，向菌液中加入0.5ml 10%SDS溶液，并漩渦振蕩搖勾，65°C溫洛30min,每間隔幾分鐘搖勻，待菌液變清后離心10min(12 OOOxg， 4°C)， 得到DNA上清液并取DNA上清液置于冰上留用；收集兩步的DNA上清液；用等體積的苯酚+氯仿+異戊醇(體積比為25:24:l)和氯仿+異戊醇(體積比為24:1)各抽提1次，離心并空氣干燥至DNA沉淀干燥后，溶于lOOpLTE緩沖液中。
全文摘要
廢水生物處理反應(yīng)器中微生物群落組成的快速分子檢測(cè)方法，①收集廢水生物處理反應(yīng)器中微生物樣品進(jìn)行預(yù)處理，利用苯酚-氯仿法提取基因組總DNA；②使用16S rDNAV3區(qū)引物對(duì)樣品DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；③利用變性梯度凝膠電泳分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；④得到的DGGE圖譜利用軟件分析，并根據(jù)切膠測(cè)序特征DGGE條帶，對(duì)所代表的微生物進(jìn)行鑒定；⑤根據(jù)條帶所代表的微生物種類來(lái)設(shè)計(jì)構(gòu)建變性梯度凝膠電泳數(shù)據(jù)庫(kù)作為快速分子檢測(cè)的對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)；所述變性梯度凝膠電泳集合庫(kù)是根據(jù)PCR產(chǎn)物經(jīng)DGGE分離后的條帶通過(guò)切膠克隆測(cè)序然后在Genbank中同源比對(duì)明確其代表的微生物種類來(lái)設(shè)計(jì)構(gòu)建的；作為快速分子檢測(cè)方法的對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101475987SQ200910028319
公開日2009年7月8日 申請(qǐng)日期2009年1月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月13日
發(fā)明者丁麗麗, 任洪強(qiáng), 廖瀟逸, 睿 梁, 波 符 申請(qǐng)人:南京大學(xué)