專利名稱：：一種檢測手足口病病原的液相芯片及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種檢測疾病病原的液相芯片，還涉及該液相芯片的制備方法及應(yīng)用，屬于醫(yī)學(xué)檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：手足口病(hand,footand隨thdisease,HFMD)是由多種腸道病毒(enterovirus,EV)引起的急性傳染病，多發(fā)生于嬰幼兒，可引起發(fā)熱和手、足、口腔等部位的皮疹或皰滲。少數(shù)患者可引發(fā)無菌性腦膜炎、腦干腦炎、急性遲緩性癱瘓等與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的疾病以及心肌炎、肺水腫等嚴(yán)重并發(fā)癥，個別重癥患兒病情進(jìn)展快，易發(fā)生死亡。引起HFMD的EV包括腸道病毒71型(EV71)、A組柯薩奇病毒(coxsackieAvirus,CAV)和?？刹《?echovirus)的某些血清型，其中EV71和柯薩奇病毒A16型(CAV16)往往是HFMD暴發(fā)流行的最主要病原，二者在遺傳學(xué)上密切相關(guān)。與CAV16不同，EV71感染引起重癥病例的比例較大，因為EV隱性感染率高，傳染性強(qiáng)，可在短期內(nèi)造成大流行，而HFMD至今仍無有效的疫苗和特異性治療手段，所以，對EV進(jìn)行快速檢測無論是對于指導(dǎo)治療還是控制HFMD疫情均具有重要價值。液相芯片技術(shù)是20世紀(jì)90年代中期發(fā)展起的一種集流式技術(shù)、熒光微球、激光、數(shù)字信號處理和傳統(tǒng)化學(xué)技術(shù)為一體的新型生物分子高通量多重檢測技術(shù)。該項技術(shù)利用聚苯乙烯微球作為反應(yīng)載體，以熒光檢測儀作為檢測平臺，對核酸和蛋白質(zhì)等生物大分子進(jìn)行高通量的多指標(biāo)并行檢測，既滿足了高通量檢測的要求，同時還具備了快速準(zhǔn)確，靈敏度高，特異性好，結(jié)果重復(fù)性好等優(yōu)點。液相芯片技術(shù)自問世以來，已廣泛應(yīng)用于各個領(lǐng)域，極大的推動了科學(xué)研究和臨床檢測技術(shù)的快速發(fā)展。例如，申請日為2005年10月11曰，申請?zhí)枮?00510044899.8，名稱是"大腸癌蛋白標(biāo)記物平行檢測液相芯片及其制備方法與應(yīng)用"的中國專利，公開了液相芯片在大腸癌蛋白標(biāo)記物檢測中的應(yīng)用。液相芯片技術(shù)是一個靈活的、開放的技術(shù)平臺，可以根據(jù)需要進(jìn)行相應(yīng)的構(gòu)建，從而同時對多種不同待檢生物分子進(jìn)行快速、廉價、準(zhǔn)確的檢測。迄今為止，全球已有數(shù)百套基于此項技術(shù)的檢測平臺，診斷試劑的開發(fā)方面也發(fā)展相當(dāng)迅速，例如申i會日為2007.04.30，申請?zhí)枮?00710027841.1,名稱是"檢測多種抗EB病毒抗原抗體的液相芯片試劑盒及其制備方法"，公開了液相芯片在檢測鼻咽癌試劑盒中的應(yīng)用。但是，并沒有將液相芯片技術(shù)用于HFMD病原EV的檢測方法中。目前，EV的檢測方法包括病毒分離培養(yǎng)、病毒核酸檢測和血清學(xué)檢查三個方面。病毒分離培養(yǎng)的鑒定方法是在出現(xiàn)細(xì)胞病變后利用EV組合血清和EV71型標(biāo)準(zhǔn)血清對分離病毒抹進(jìn)行中和試驗鑒定。然而，目前能夠獲得的EV組合血清中尚不包含EV71和CAV16的抗血清，單價的EV71抗血清又可能因為抗原漂移而使得檢測結(jié)果呈假陰性，或者與CAV16出現(xiàn)交叉免疫反應(yīng)。同時，病毒分離方法費(fèi)時、費(fèi)力，^r測種類少，無法滿足疾病流行期間同時處理大量標(biāo)本的需要。病毒核酸^r測是采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reversetranscriptasePCR，RT-PCR)技術(shù)，為當(dāng)前腸道病毒快速檢測的主要手段，該方法檢測靈敏度高，操作簡單，但具有樣品污染，假陽性率高等缺點，同時，普通PCR和熒光定量PCR均不利于多重檢測，因為各組引物存在的不兼容性、擴(kuò)增背景高以及實驗重復(fù)性差等諸多因素直接影響了多重檢測的敏感性和特異性。血清學(xué)檢查同樣由于檢測通量的局限性而不能滿足快速診斷的需要。雖然基因芯片技術(shù)用于腸道病毒檢測，能夠做到快速高通量，但傳統(tǒng)的固相芯片價格昂貴，而且敏感性不高，檢測結(jié)果的可重復(fù)性差。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明針對以上現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點，提出一種快速檢測手足口病病原的液相芯片及其制備方法，并通過對其的應(yīng)用達(dá)到檢測種類多、反應(yīng)時間短、靈敏度高且特異性強(qiáng)的效果。本發(fā)明的原理是結(jié)合液相芯片技術(shù)，將5'端加上"分子臂和氨基修飾后的、含有病原特征信息的特異性檢測探針與熒光微球偶聯(lián)制成液相芯片，再將液相芯片與待測樣品的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雜交，得到的雜交反應(yīng)產(chǎn)物與SA-PE反應(yīng)，通過液相芯片檢測儀檢測達(dá)到快速準(zhǔn)確檢測病原的目的，其中病原特征信息是標(biāo)記了生物素的反向引物。本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)一種檢測手足口病病原的液相芯片，由分別包被有特異性檢測探針的熒光微球構(gòu)成，其特異性檢測探針由以下序列特異性探針中的至少一種，在5'端加上Cu分子臂和氨基修飾得到EV-probeCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTEV71-probeTCACCTGCGAGTGCTTATCAATGCAV16-probeATTGGGAATTTCTTTAGCCGTGCRnase-probeTTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG。本發(fā)明檢測手足口病病原的液相芯片制備方法，包括以下步驟第一步、通過對現(xiàn)有核酸數(shù)據(jù)庫中同源性比對，根據(jù)保守序列，得出如下序列的特異性^:針的至少一種EV-probeCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTEV71-probeTCACCTGCGAGTGCTTATCAATGCAV16-probeATTGGGAATTTCTTTAGCCGTGCRnase-probeTTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG第二步、在第一步得到的特異性探針的5'端加上Cu分子臂和氨基修飾，得到特異性檢測探針；第三步、將第二步得到的特異性檢測探針與萸光微球偶聯(lián)，成為特異性檢測微球，即制得所需液相芯片。上述特異性探針是針對EV5'端非編碼區(qū)(5'-UTR)、EV71VP1區(qū)、CAV16VP1區(qū)核酸序列各區(qū)段和針對核糖核酸酶(Rnase)基因中的一種。步驟三中，每ix106個熒光微球?qū)?yīng)的特異性檢測揮:針加入量為0.04~0.lnmol。本發(fā)明檢測手足口病病原的液相芯片的應(yīng)用，主要包括以下步驟第一步、通過對現(xiàn)有核酸數(shù)據(jù)庫中同源性比對，根據(jù)保守序列，得出如下特異性檢測引物的至少一種EV正向CCCTGAATGCGGCTAATCCEV反向ATTGTCACCATAAGCAGCCAEV71正向CAGGTTTCAGTRCCATTCATEV71反向ATTAGGACATGCCCCRTATTCAV16正向GAACCAYCACTCCACRCAGGAGCAV16反向GTRCCCGTAGTGGGCATTG尺nase正向AGATTTGGACCTGCGAGCGHnase反向GAGCGGCTGTCTCCACAAGT;第二步、對上迷反向引物進(jìn)行生物素標(biāo)記，得到標(biāo)記的特異性檢測引物；第三步、RT-PCR擴(kuò)增待測樣品，得到待測樣品的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；第四步、待測樣品的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與液相芯片雜交，得到雜交反應(yīng)物;第五步、雜交反應(yīng)產(chǎn)物與鏈霉菌抗生物素蛋白-藻紅蛋白進(jìn)行反應(yīng)；第六步、通過液相芯片檢測儀檢測。上述步驟三、步驟四和步驟五是由以下步驟進(jìn)一步實現(xiàn)的a.對待測樣品進(jìn)行引物濃度不對稱的4重PCR反應(yīng)，其中特異性檢測引物中的正向引物濃度范圍是0.04|aM~0.16|aM,特異性檢測引物中的反向引物濃度范圍是O.4|iM~0.8jaM;b.雜交反應(yīng)體系是33ji1的1.5xTMAC、偶聯(lián)特異性檢測探針的混合熒光微球5~2.5)i1、待測樣品的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1~10ju1，空白孔以等量TE耳又代PCR產(chǎn)物，以TE補(bǔ)足反應(yīng)體積至50ju1，52。C雜交10min,得到雜交反應(yīng)產(chǎn)物；c.雜交反應(yīng)產(chǎn)物離心2min棄上清后，加入1xTMAC稀釋后濃度為4ug/ml的鏈霉菌抗生物素蛋白-藻紅蛋白反應(yīng)，52。C雜交10min。在上述檢測方法中以檢測Rnase的特異性檢測引物與特異性檢測探針作為檢測方法中的陽性對照。本發(fā)明所提供的檢測手足口病病原的液相芯片及其檢測方法不僅可以檢測腸道病毒、同時還可對腸道病毒71型和柯薩奇病毒A16型進(jìn)行分型，從而對手足口病病原進(jìn)行快速準(zhǔn)確的檢測和分型，值得一提的是同時引入Rnase作為陽性質(zhì)控，可以監(jiān)控整個檢測體系的工作狀態(tài)。這種基于液相芯片檢測手足口病病原的方法具有非常好的信號-噪聲比，所設(shè)計的引物和探針具有非常好的特異性，能準(zhǔn)確區(qū)分EV71、CAV16和其它類型的腸道病毒感染，并能夠準(zhǔn)確診斷EV71和CAV16的混合感染。其有益效果是不僅克服了普通PCR和熒光定量PCR在多重檢測方面的局限性，同時也克服了固相芯片敏感性不高，檢測結(jié)果的可重復(fù)性差的缺陷，且具有檢測種類多、反應(yīng)時間短、靈敏度高、特異性強(qiáng)且檢測準(zhǔn)確的特性，具有廣闊的應(yīng)用前景。下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。圖1為本發(fā)明檢測方法的原理示意圖2為偶聯(lián)特異性探針的微球所確定的gatevalue;圖3為一例EV71標(biāo)本片全測圖4為一例CAV16標(biāo)本4全測圖5為一例柯薩奇病毒B3型(CBV3)標(biāo)本4企測圖6為一例柯薩奇病毒B5型(CBV5)標(biāo)本4企測圖7為一例?？刹《?型(ECH07)標(biāo)本檢測圖；圖8為一例?？刹《?0型(ECH030)標(biāo)本^企測圖。具體實施例方式本發(fā)明的原理如圖l所示結(jié)合液相芯片技術(shù)，將5'端加上Cu分子臂和氨基修飾后的、含有病原特征信息的特異性檢測探針與熒光微球偶聯(lián)制成液相芯片，再將液相芯片與待測樣品的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雜交，得到的雜交反應(yīng)產(chǎn)物與SA-PE反應(yīng)，通過液相芯片檢測儀檢測達(dá)到快速準(zhǔn)確;險測病原的目的，其中病原特征信息是標(biāo)記了生物素的反向引物。實施例一1.本實施例檢測手足口病病原的液相芯片，是由分別包被有特異性檢測探針的熒光微球構(gòu)成，其中，特異性檢測探針由以下序列特異性探針(實際應(yīng)用時具有至少一種即可)，在5'端加上C12分子臂和氨基修飾得到EV-probeCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTEV71-probeTCACCTGCGAGTGCTTATCAATGCAV16-probeATTGGGAATTTCTTTAGCCGTGCRnase-probeTTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG。2.上述液相芯片的制備方法如下第一步、運(yùn)用生物信息學(xué)知識和相關(guān)生物信息學(xué)軟件對現(xiàn)有核酸數(shù)據(jù)庫中能夠檢索到的所有EV5'端非編碼區(qū)(5'-UTR)、EV71VP1區(qū)和CAV16VP1區(qū)核酸序列進(jìn)行同源性比對，根據(jù)保守序列，設(shè)計針對各區(qū)段的特異性探針；同時設(shè)計針對核糖核酸酶(Rnase)基因的特異性探針作為陽性對照，以監(jiān)控檢測體系的工作狀態(tài)。所設(shè)計的特異性探針序列如下EV-probeCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTEV71-probeTCACCTGCGAGTGCTTATCAATGCAV16-probeATTGGGAATTTCTTTAGCCGTGCRnase-probeTTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG第二步、在第一步得到的特異性探針的5'端加上Cu分子臂和氨基修飾，得到特異性檢測探針；技術(shù)服務(wù)有限公司完成。第三步、將第二步得到的特異性檢測探針與熒光微球偶聯(lián)，成為特異性;險測微球，即制得所需液相芯片，具體做法是取200yl(2.5x106個)羧基化的微球(購自美國Bio-Rad公司),lOOOOg離心2tnin后棄上清，加入2-[f嗎啉代]乙磺酸(MES)(0.1M，pH=4.5)25jal，混勻。將步驟2-1中制得的特異性檢測探針用MES稀釋至0.lmM,取2n1加至反應(yīng)體系中，再加入新鮮配置的10mg/ml1-乙基-3-(3-二曱氨丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)2.5jul(1.25-2.5混勻后室溫避光孵育30min,重復(fù)加入新鮮配置的EDC—次，再次室溫避光孵育30min，用0.5ml吐溫-20(Tween—20)(0.02%V/V)和0.5ml十二烷基磺酸鈉(SDS)(0.1%W/V)各洗滌一次，最后用200julTris-EDTA(TE)重懸微球，血細(xì)胞計數(shù)器計數(shù)后混合4種微球，用TE稀釋每種微球的濃度至2000個/y1，即液相芯片，4°C避光保存。其中，MES偶聯(lián)緩沖液的配方如下0.1M的MES偶聯(lián)緩沖液(pH=4.5)配方(250ml):試劑來源終濃度每250ml用量MES(2[N-Morpholino]ethanesulfonicacid)SigmaM29330.1M4.88g5NNaOHFisherSS256—5005滴過濾后4t:儲存。3.采用上述制得的液相芯片對樣本進(jìn)行檢測第一步、運(yùn)用生物信息學(xué)知識和相關(guān)生物信息學(xué)軟件對現(xiàn)有核酸數(shù)據(jù)庫中能夠檢索到的所有EV5'端非編碼區(qū)(5'-UTR)、EV71VPl區(qū)和CAV16VP1區(qū)核酸序列進(jìn)行同源性比對，根據(jù)保守序列，設(shè)計并合成針對各區(qū)段的簡并引物；同時設(shè)計針對核糖核酸酶(Rnase)基因的引物作為陽性對照，以監(jiān)控檢測體系的工作狀態(tài)。所合成的引物序列如下EV正向(EV-For)EV反向(EV-Rev)EV71正向(EV71-For)EV71反向(EV71-Rev)CCCTGAATGCGGCTAATCCATTGTCACCATAAGCAGCCACAGGTTTCAGTRCCATTCATATTAGGACATGCCCCRTATTCAV16正向(CAV16-For)GAACCAYCACTCCACRCAGGAGCAV16反向(CAV16-Rev)GTRCCCGTAGTGGGCATTG12Rnase正向(Rnase-For)AGATTTGGACCTGCGAGCGRnase反向(Rnase-Rev)GAGCGGCTGTCTCCACAAGT第二步、對上述反向引物EV-Rev、EV71-Rev、CAV16-Rev和Rnase-Rev進(jìn)行生物素標(biāo)記，得到標(biāo)記的特異性檢測引物；務(wù)有限公司完成。第三步、RT-PCR擴(kuò)增待測樣品，得到待測樣品的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，方法如下RT-PCR反應(yīng)為引物濃度不對稱的4重PCR反應(yīng)，其中特異性檢測引物中正向引物的濃度取0.08nM，特異性檢測引物中反向引物的濃度取0.6jiM。RT-PCR反應(yīng)體系如下5xRT-PCRBuffer5p1dNTP1ju1Enzymemix1(i1特異性檢測引物各ljalRNA模板5ji1ddH205|i1共25|i1PCR擴(kuò)增條件為:50°C30min;95°C15min，94°C30sec，56°Clmin30sec，72°C30sec,45個循環(huán);72°C5min;得到待測樣品的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；第四步、取步驟三中待測樣品的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與制得的液相芯片雜交，得到雜交反應(yīng)物，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與液相芯片的雜交反應(yīng)體系為50jal:1.5x氯化四曱銨(TMAC)33"1，液相芯片lpl，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5nl，空白孔以等量TE取代PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用TE補(bǔ)足反應(yīng)體積至50iul。雜交反應(yīng)的條件為52。C雜交15min;第五步、雜交反應(yīng)產(chǎn)物與鏈霉菌抗生物素蛋白-藻紅蛋白(SA-PE)進(jìn)行反應(yīng)，取步驟四制得的雜交反應(yīng)產(chǎn)物lOOOOg離心2min后棄上清，加入1xTMAC新鮮稀釋的SA-PE(4ug/ml)共75ju1，52°C雜交10min;第六步、通過液相芯片才企測儀;險測，首先，通過液相芯片4企測儀(Bio-PlexSystem)直接讀取以上實驗中偶聯(lián)特異性探針的微球，重復(fù)3次，確定Gatevalue的值為4335-14262,然后芯片4企測儀的參數(shù)設(shè)置如下Events:50;MinEvents:0;如圖2所示，偶耳關(guān)特異性探針的微球所確定的Gatevalue:4335-14262。雜交反應(yīng)產(chǎn)物與SA-PE反應(yīng)10min后上機(jī)檢測。所述主要溶液的配方如下20%Sarkosyl配方(250ml):試劑來源終濃度每250ml用量SarkosylSigmaL915020%50g(N-Lauroylsarcosine)過濾后室溫儲存；1.5xTMAC雜交緩沖液配方(250ml):試劑來源終濃度每250ml用量5MTMACSigmaT34114.5M225ml20%Sarkosyl------0.15%1.88ml1MTris-HCl,pH8.0SigmaT303875mM18.75ml0.5MEDTA，pH8.0Invitrogenl5575-0206mM3.0mlH20------------1.37ml室溫儲存；141xTMAC雜交緩沖液配方(250ml):試劑來源終濃度每250ml用量5MTMACSigmaT34113M150ml20%Sarkosyl------0.1%1.25mllMTris-HCl，pH8.0SigmaT303850mM12.5ml0.5MEDTA,pH8.0Invitrogen15575-0204mM2,0mlH20------------84.25ml室溫儲存。5.檢測結(jié)果與數(shù)據(jù)分析5.1、陽性判斷值(cut-off值)的確定取8份陰性對照標(biāo)本，采用本發(fā)明的方法進(jìn)行檢測，計算每種特異性檢測微球平均熒光強(qiáng)度(medianfluorescentintensity,MFI)的均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差,以均數(shù)+4倍標(biāo)準(zhǔn)差所得的值作為對應(yīng)檢測指標(biāo)的cut-off值，高于cut-off值就;現(xiàn)為該指標(biāo)陽性，各^r測指標(biāo)的cut-off值如下EV:182;EV71:135;CAV16:112;Rnase:1285.2、靈敏度試驗結(jié)果將EV71和CAV16病毒分離培養(yǎng)物的RNA模板進(jìn)行梯度稀釋后用本發(fā)明的方法檢測，結(jié)果見表1,隨著RNA濃度的降低，檢測的熒光強(qiáng)度減弱，本發(fā)明對EV71和CAV16RNA的最低檢出量均為lpg，檢測靈敏度高。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>10pg1216.51891.043.5872.0lpg780.01148.026.0220.0lOOfg64.031.037.0152.0CAV16腿lug2977.081.54230.02758.0lOOpg2522.048.03491.02137.010pg1780.083.03311.5958.0lpg265.552.0855.0179.0lOOfg68.035.050.0140.5表l靈敏度試驗結(jié)果5.3、特異性試驗結(jié)果采用本發(fā)明的方法;險測EV71、CAV16、CBV3、CBV5、ECH07和ECHO30腸道病毒分離培養(yǎng)標(biāo)本。如圖3，在EV71標(biāo)本4全測圖中，偶聯(lián)EV通用型、EV71和Rnase特異性探針的微球都得到了較高的熒光值，呈陽性，而偶聯(lián)CAV16探針的微球熒光值低于cut-off值，呈陰性；如圖4,在CAV16標(biāo)本4企測圖中，偶if關(guān)EV通用型、CAV16和Rnase探針的三種微球得到了較高的熒光值，呈陽性，而偶聯(lián)EV71探針的微球焚光值低于100,呈陰性；如圖5,在CBV3標(biāo)本檢測圖中；如圖6，在CBV5標(biāo)本檢測圖中；如圖7,在ECH07標(biāo)本檢測圖中；如圖8，在ECHO30標(biāo)本;f企測圖中，均只有偶i[關(guān)EV通用型和Rnase探針的兩種微球得到了陽性結(jié)果。5.4、手足口病臨床樣本才企測取10份手足口病臨床樣本(采自哨點醫(yī)院的咽拭子和糞便)，經(jīng)熒光定量PCR檢測證實為腸道病毒感染，且8份為EV71感染，2份為CAV16感染，其芯片檢測結(jié)果如表2所示。與熒光定量PCR檢測結(jié)果做對照，本方法檢測結(jié)果與熒光定量PCR檢測結(jié)果吻合率達(dá)16到100%，說明本發(fā)明所提供的基于液相芯片檢測手足口病病原的方法不僅具有快速高效、多重檢測的特點，而且檢測結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定、可靠。同時，從結(jié)果還可以看出，以檢測Rnase作為本^f企測方法的陽性對照成功地起到了對整個檢測過程的質(zhì)控作用。<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>表2手足口病臨床樣本檢測結(jié)果除上述實施例外，本發(fā)明還可以有其他實施方式。凡采用等同替換或等效變換形成的技術(shù)方案，均落在本發(fā)明要求的保護(hù)范圍。權(quán)利要求1、一種檢測手足口病病原的液相芯片，由分別包被有特異性檢測探針的熒光微球構(gòu)成，其特征在于所述特異性檢測探針由以下序列特異性探針中的至少一種，在5′端加上C12分子臂和氨基修飾得到EV-probeCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTEV71-probeTCACCTGCGAGTGCTTATCAATGCAV16-probeATTGGGAATTTCTTTAGCCGTGCRnase-probeTTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG2、一種檢測手足口病病原的液相芯片制備方法，包括以下步驟第一步、通過對現(xiàn)有核酸數(shù)據(jù)庫中同源性比對，根據(jù)保守序列，得出如下序列的特異性探針的至少一種EV-probeCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTEV71-probeTCACCTGCGAGTGCTTATCAATGCAV16-probeATTGGGAATTTCTTTAGCCGTGCRnase-probeTTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG第二步、在第一步得到的特異性探針的5'端加上Cu分子臂和氨基修飾，得到特異性檢測探針；第三步、將第二步得到的特異性檢測探針與熒光微球偶聯(lián)，成為特異性檢測微球，即制得所需液相芯片。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述檢測手足口病病原的液相芯片制備方法，其特征在于所述特異性探針是針對EV5'端非編碼區(qū)(5'-UTR)、EV71VP1區(qū)、CAV16VP1區(qū)核酸序列各區(qū)段和針對核糖核酸酶(Rnase)基因中的一種。4、根據(jù)權(quán)利要求2所述檢測手足口病病原的液相芯片制備方法，其特征在于所述第三步中，每1x106個熒光微球?qū)?yīng)的特異性檢測揮:針加入量為0.04~0.lnmol。5、一種檢測手足口病病原的液相芯片的應(yīng)用，主要包括以下步驟第一步、通過對現(xiàn)有核酸數(shù)據(jù)庫中同源性比對，根據(jù)保守序列，得出如下特異性檢測引物的至少一種EV正向CCCTGAATGCGGCTAATCCEV反向ATTGTCACCATAAGCAGCCAEV71正向CAGGTTTCAGTRCCATTCATEV71反向ATTAGGACATGCCCCRTATTCAV16正向GAACCAYCACTCCACRCAGGAGCAV16反向GTRCCCGTAGTGGGCATTGHnase正向AGATTTGGACCTGCGAGCGHnase反向GAGCGGCTGTCTCCACAAGT;第二步、對上述反向引物進(jìn)行生物素標(biāo)記，得到標(biāo)記的特異性檢測引物；第三步、RT-PCR擴(kuò)增待測樣品，得到待測樣品的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；第四步、待測樣品的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與液相芯片雜交，得到雜交反應(yīng)物；第五步、雜交反應(yīng)產(chǎn)物與鏈霉菌抗生物素蛋白-藻紅蛋白進(jìn)行反應(yīng)；第六步、將第五步中的反應(yīng)產(chǎn)物通過液相芯片4企測儀檢測。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述檢測手足口病病原的液相芯片的應(yīng)用，其特征在于所述第三步具體為，對待測樣品進(jìn)行引物濃度不對稱的4重PCR反應(yīng)，其中特異性檢測引物中的正向引物濃度范圍是0.04|aM~0.16MM,特異性檢測引物中的反向引物濃度范圍是0.4jiM~0.8inM;所述第四步具體為，雜交反應(yīng)體系是33|ul的1.5xTMAC、偶聯(lián)特異性檢測探針的混合熒光微球，0.5~2.5m1、待測樣品的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物l10jal，空白孔以等量TE取代PCR產(chǎn)物，以TE補(bǔ)足反應(yīng)體積至50inl，52。C雜交10min;所述第五步具體為，雜交反應(yīng)產(chǎn)物離心2min棄上清后，加入1xTMAC稀釋后濃度為4ug/ml的鏈霉菌抗生物素蛋白-藻紅蛋白反應(yīng)，52。C雜交10min。7、根據(jù)權(quán)利要求5所述檢測手足口病病原的液相芯片的應(yīng)用，其特征在于所述第六步中，以檢測Rnase的特異性檢測引物與特異性檢測探針作為檢測中的陽性對照。全文摘要本發(fā)明涉及一種檢測疾病病原的液相芯片，還涉及該液相芯片的制備方法及應(yīng)用，屬于醫(yī)學(xué)檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
。本發(fā)明的原理是結(jié)合液相芯片技術(shù)，將5′端加上C₁₂分子臂和氨基修飾后的、含有病原特征信息的特異性檢測探針與熒光微球偶聯(lián)制成液相芯片，再將液相芯片與待測樣品的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雜交，得到的雜交反應(yīng)產(chǎn)物與SA-PE反應(yīng)，通過液相芯片檢測儀檢測達(dá)到快速準(zhǔn)確檢測病原的目的，其中病原特征信息是標(biāo)記了生物素的反向引物。其有益效果是不僅克服了普通PCR和熒光定量PCR在多重檢測方面的局限性，同時也克服了固相芯片敏感性不高，檢測結(jié)果的可重復(fù)性差的缺陷，且具有檢測種類多、反應(yīng)時間短、靈敏度高、特異性強(qiáng)且檢測準(zhǔn)確的特性，具有廣闊的應(yīng)用前景。文檔編號C12Q1/70GK101550457SQ20091002794公開日2009年10月7日申請日期2009年5月14日優(yōu)先權(quán)日2009年5月14日發(fā)明者史智揚(yáng),崔侖標(biāo),戚宇華,顯李,華汪,焦永軍,賢祁,葛以躍,郭喜玲申請人:江蘇省疾病預(yù)防控制中心