手足口病病毒等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種手足口病病毒等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒，旨在提供一種操作簡(jiǎn)便、靈敏快捷的手足口病病毒等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒；其技術(shù)要點(diǎn)包括：1）等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液、陽(yáng)性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品，和2）分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒；所述的等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液由等溫?cái)U(kuò)增緩沖液、反應(yīng)酶、正、反向引物、分子信標(biāo)組成；其中：正向引物的堿基序列為ACACAGGTGAGCAGTCATCG；反向引物的堿基序列為AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAAGTCTCAATCATGCTCTCATCACT；分子信標(biāo)的堿基序列為CCTTGGACAGGTAAGGTTCCAGCACTCCAAGG，3）可用于熒光定量PCR儀的實(shí)時(shí)檢測(cè)和手持式熒光檢測(cè)儀的終點(diǎn)檢測(cè)。
【專利說(shuō)明】手足口病病毒等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明公開了一種測(cè)試手足口病的劑盒，具體地說(shuō)，是一種檢測(cè)手足口病病毒EV71的等溫?cái)U(kuò)增試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]腸道病毒71型(英文名為:Human enterovirus71),簡(jiǎn)稱EV71,是引起嬰幼兒手足口病主要病原體之一,EV71以其高致病性、高死亡率奪去了很多人的生命，根據(jù)中國(guó)疾病預(yù)防控制中心公布的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，自2009年以來(lái)，手足口病發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢(shì)，并連續(xù)3年成為我國(guó)丙類傳染病發(fā)病率和死亡率最高的疾病。診斷、治療和預(yù)防是應(yīng)對(duì)和處置重要傳染病的三個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而早期診斷最為關(guān)鍵，是有效治療的基礎(chǔ)，也是制定預(yù)防策略的依據(jù)，因此開發(fā)針對(duì)EV71病毒的快速診斷試劑盒就顯得尤為迫切和重要。
[0003]現(xiàn)有的快速檢測(cè)技術(shù)主要有兩類:第一類為免疫學(xué)方法，包括酶聯(lián)免疫吸附法、免疫熒光法、同位素標(biāo)記抗體法、乳膠凝集法、免疫傳感器法、免疫擴(kuò)散法及免疫色譜法等；第二類是以核酸為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)方法，主要有核酸探針?lè)ê途酆厦告湻磻?yīng)法(Polymerase Chain Reaction, PCR)。其中的PCR方法是核酸擴(kuò)增技術(shù)的典型代表,該技術(shù)是由美國(guó)PE-Cetus公司人類遺傳研究室的Mullin等人于1985年發(fā)明的，在過(guò)去的二十年里，PCR技術(shù)作為分子生物學(xué)的核心得到了迅猛的發(fā)展和應(yīng)用，特別是在疾病的臨床診斷中，PCR技術(shù)以其快速、靈敏和特異的優(yōu)勢(shì)，不僅日益取代了傳統(tǒng)的診斷方法，而且使以往無(wú)法完成的診斷成為了可能。
[0004]盡管PCR技術(shù)長(zhǎng)期以來(lái)占據(jù)著核酸擴(kuò)增壟斷技術(shù)的地位，新近研發(fā)的一系列等溫核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)正逐漸成為PCR技術(shù)的替代技術(shù)而被廣泛應(yīng)用。與PCR技術(shù)相比，核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的特點(diǎn)是可在特定溫度條件下實(shí)現(xiàn)核酸的擴(kuò)增。由于擴(kuò)增反應(yīng)的全過(guò)程均在同一溫度下進(jìn)行，使它們對(duì)儀器的要求大大簡(jiǎn)化，可通過(guò)加熱模塊、水浴槽等簡(jiǎn)單的，甚至是非專業(yè)的設(shè)備完成反應(yīng)。目前常用的等`溫技術(shù)有以下幾類:
[0005]1、依賴核酸序列擴(kuò)增(Nucleic acid sequence-based amplification, NASBA)
[0006]2、自主序列復(fù)制(Self-sustained Sequence Replication, 3SR)
[0007]3、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增(Transcription mediated amplification, TMA)
[0008]4、單引物等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Single Primer Isothermal Amplification, SPIA)
[0009]5、滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)(rolling circle amplification, RCA)
[0010]6、環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)
[0011]7、鏈替代擴(kuò)增技術(shù)(Strand displacement amplification, SDA)
[0012]這些核酸擴(kuò)增技術(shù)(PCR技術(shù)、等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)等)的擴(kuò)增產(chǎn)物為DNA或RNA，與之相對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)方法主要有以下幾種:
[0013]電泳分析:常規(guī)變性凝膠電泳后用EB或SYBR Green I染色，在1%_1.5%瓊脂糖凝膠中可以輕易識(shí)別。目前該方法已很少使用；
[0014]雜交技術(shù):產(chǎn)物通過(guò)與特異性探針標(biāo)記的序列雜交，如32P標(biāo)記的寡核苷酸序列與擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行Northern雜交以檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0015]酶聯(lián)凝膠(enzyme-1 inked gel assay,ELGA)技術(shù):用非放射性的辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的探針檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。未雜交的探針通過(guò)在垂直凝膠電泳中得以分離，然后將凝膠置于有HRP底物的溶液中孵育，則可目測(cè)反應(yīng)結(jié)果；
[0016]電化學(xué)發(fā)光(electrochemiluminescence, ECL)技術(shù):5’端標(biāo)記有生物素的捕獲探針將擴(kuò)增產(chǎn)物固定在鏈霉親和素結(jié)合的磁珠上，下游引物的5’末端含有和釘標(biāo)電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)探針互補(bǔ)的序列。擴(kuò)增產(chǎn)物與ECL探針形成復(fù)合物，攜帶該復(fù)合物的磁珠被電極的表面磁性捕獲。電極上的電壓引起電化學(xué)發(fā)光(ECL)反應(yīng)。已雜交上的釘標(biāo)磁珠發(fā)出的光和擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)生的RNA擴(kuò)增產(chǎn)物總量成比例對(duì)應(yīng)，由此可以對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)和定量；
[0017]分子信標(biāo)技術(shù):分子信標(biāo)是根據(jù)核酸堿基配對(duì)原則和熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)現(xiàn)象設(shè)計(jì)的。分子信標(biāo)為一莖環(huán)結(jié)構(gòu)的寡核苷酸探針，其環(huán)狀區(qū)核苷酸序列長(zhǎng)度一般為15~30個(gè)堿基，能與目標(biāo)序列互補(bǔ)，靠近兩端的部分序列構(gòu)成分子信標(biāo)的莖干區(qū)，大約有6-8個(gè)堿基對(duì)，兩端分別標(biāo)記熒光基團(tuán)(fIuorophore)和淬滅基團(tuán)(quencher)。沒(méi)有目標(biāo)序列存在時(shí),分子信標(biāo)保持莖環(huán)結(jié)構(gòu),突光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)靠近，此時(shí)發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，使熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光被猝滅基團(tuán)吸收并以熱的形式散發(fā)，熒光幾乎完全被猝滅，熒光本底極低。當(dāng)目標(biāo)序列存在時(shí)，分子信標(biāo)與序列完全互補(bǔ)的靶序列結(jié)合形成雙鏈雜交體時(shí)，信標(biāo)莖干互補(bǔ)區(qū)被拉開，熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)距離增大，熒光產(chǎn)生。在核酸擴(kuò)增體系中應(yīng)用分子信標(biāo)可隨著擴(kuò)增的進(jìn)行，均一地產(chǎn)生熒光信號(hào)，使分子信標(biāo)的環(huán)狀序列不斷與擴(kuò)增子雜交產(chǎn)生熒光信號(hào)進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)。分子信標(biāo)中常用4- (4’ - 二甲基氨基偶氮苯基)苯甲酸(DABCYL)作為淬滅基團(tuán)，德克薩斯紅(TexasRed)、突光素(Fluoresein)等作為突光基團(tuán)。
[0018]其中，基于T7RNA聚合酶、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、分子信標(biāo)及RNA酶H的NASBA等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)因其靈敏度高、特異性強(qiáng)、可對(duì)核酸進(jìn)行實(shí)時(shí)測(cè)定而得到了一定的運(yùn)用。但是目前的NASBA等溫?cái)U(kuò)增結(jié)果檢測(cè)需要在價(jià)格昂貴的熒光定量PCR儀上進(jìn)行，目前我國(guó)裝備有大型熒光定量PCR儀的實(shí)驗(yàn)室及醫(yī)院有限，不能滿足口岸、基層和偏遠(yuǎn)地區(qū)對(duì)于EV71病毒檢測(cè)的需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0019]針對(duì)上述問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種操作簡(jiǎn)便、價(jià)格低廉的手足口病病毒等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒。
[0020]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案是這樣的:一種足口病病毒等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒，包括:1)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液、陽(yáng)性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品，和2)分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒； 所述的等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液由等溫?cái)U(kuò)增緩沖液、反應(yīng)酶、正、反向引物、分子信標(biāo)組成；
[0021]其中:
[0022]所述的正向引物的堿基序列為SEQ ID N0.1:
[0023]ACACAGGTGAGCAGTCATCG ；
[0024]所述的反向引物的堿基序列為SEQ ID N0.2:
[0025]AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAAGTCTCAATCATGCTCTCATCACT ；[0026]所述的分子信標(biāo)的堿基序列為SEQ ID N0.3:
[0027]CCTTGGACAGGTAAGGTTCCAGCACTCCAAGG。
[0028]上述的手足口病病毒等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒，所述的等溫?cái)U(kuò)增緩沖液包括TrisHC140mM、KC170mM，MgCl212mM, DTTlOmM, dNTPlmM, rNTP2mM,山梨糖醇 375mM。
[0029]上述的手足口病病毒等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒,所述的反應(yīng)酶由T7RNA聚合酶、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶H組成。
[0030]上述的手足口病病毒等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒，所述的陽(yáng)性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品為重組質(zhì)粒pET_32a0
[0031]上述的手足口病病毒等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒，所述的陽(yáng)性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為IO5Copies/ 反應(yīng)~IO2Copies/ 反應(yīng)。
[0032]上述的手足口病病毒等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒，所述的T7RNA聚合酶的酶活力32U，AVM聚合酶的酶活力6.4U、RNA酶H的酶活力0.08U。
[0033]上述的手足口病病毒等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒，所述的分子信標(biāo)熒光報(bào)告基團(tuán)為FAM，熒光淬滅基團(tuán)為BHQl。
[0034]上述的手足口病病毒等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒，所述的分子信標(biāo)使用濃度為ΙΟΟηΜ。
[0035]上述的手足口病病毒等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒，所述的等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的條件為:650C 5min、42°C 5min預(yù)處理，加入酶液42V反應(yīng)90分鐘。
[0036]更優(yōu)的，上述的手足口病病毒等溫?cái)U(kuò)增`檢測(cè)試劑盒，所述的陽(yáng)性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建方法是采用PCR方法對(duì)EV71cDNA模板進(jìn)行擴(kuò)增，得到所需的EV71VP1基因序列，序列片段經(jīng)雙酶切后與相應(yīng)雙酶切pET-32a質(zhì)粒載體進(jìn)行連接，用氯化鈣法轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑選陽(yáng)性克隆，并進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證以獲得所需的陽(yáng)性質(zhì)控樣品。
[0037]與現(xiàn)有現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的技術(shù)方案具有如下優(yōu)點(diǎn):
[0038]1、本發(fā)明提供的技術(shù)方案通過(guò)設(shè)計(jì)發(fā)夾結(jié)構(gòu)與目標(biāo)序列部分互補(bǔ)的分子信標(biāo)，提高檢測(cè)結(jié)果信噪比，在滿足實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)的同時(shí)，通過(guò)結(jié)合手持式熒光檢測(cè)儀，實(shí)現(xiàn)了對(duì)于NASBA擴(kuò)增結(jié)果的終點(diǎn)檢測(cè)，檢測(cè)靈敏度達(dá)到了熒光定量PCR水平，能廣泛運(yùn)用于口岸、基層和偏遠(yuǎn)地區(qū)這些缺乏大型熒光定量PCR儀而人群密度又較大的場(chǎng)所；
[0039]2、針對(duì)EV71病毒特異性序列設(shè)計(jì)引物、分子信標(biāo)，與傳統(tǒng)培養(yǎng)法相比具有更高的特異性、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、價(jià)格低廉；
[0040]3、閉管檢測(cè)不需后處理，避免了由于樣本間的交叉污染引起的假陽(yáng)性和環(huán)境污染；
[0041]4、本發(fā)明提供的手足口病病毒EV71等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒可作為EV71病毒檢測(cè)的試劑，用于科研及臨床應(yīng)用。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0042]圖1構(gòu)建的陽(yáng)性質(zhì)控樣品的電泳檢測(cè)結(jié)果；
[0043]圖2EV71等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒實(shí)時(shí)檢測(cè)結(jié)果；
[0044]圖3EV71等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒終點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果；
[0045]圖4EV71等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒穩(wěn)定性評(píng)價(jià)結(jié)果?！揪唧w實(shí)施方式】
[0046]本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆:實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkiColdSpring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。本發(fā)明給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過(guò)程，但保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。
[0047]1、根據(jù)待檢目標(biāo)的序列特征，設(shè)計(jì)相應(yīng)檢測(cè)引物序列。
[0048]所述的待檢目標(biāo)的序列特征，具體為:待檢序列的GC含量、序列保守性及序列二級(jí)結(jié)構(gòu)等特征。
[0049]所述的引物序列特征，具體為:針對(duì)目標(biāo)序列設(shè)計(jì)的兩條核酸序列，具有物種特異性及高的擴(kuò)增效率，其中一條含T7RNA聚合酶啟動(dòng)序列。
[0050]2、根據(jù)待檢目標(biāo)的序列特征，設(shè)計(jì)相應(yīng)分子信標(biāo)的環(huán)狀區(qū)序列。
[0051]所述的待檢目標(biāo)的序列特征，具體為:待檢序列的GC含量、序列保守性及序列二級(jí)結(jié)構(gòu)等特征；
[0052]所述的設(shè)計(jì)相應(yīng)分子信標(biāo)的環(huán)狀區(qū)序列，具體為:選擇待檢序列中GC含量在20%和80%之間、序列保守性高同時(shí)具有最小二級(jí)結(jié)構(gòu)的片段作為分子信標(biāo)的環(huán)狀區(qū)序列，序列長(zhǎng)度在10~45堿基之間；
[0053]3、設(shè)計(jì)合適的分子信標(biāo)莖干區(qū)，并選擇相應(yīng)的標(biāo)記基團(tuán)。
[0054]所述的設(shè)計(jì)合適的分子信標(biāo)莖干區(qū)，具體為:所設(shè)計(jì)的分子信標(biāo)莖干區(qū)序列為互相完全配對(duì)的兩段核酸序列，莖`干區(qū)序列部分序列與環(huán)狀區(qū)序列一起作為目標(biāo)雜交區(qū)域，其Tm值應(yīng)該比體系反應(yīng)溫度高5°C以上，且不與環(huán)狀區(qū)序列形成復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu)，分子信標(biāo)莖干區(qū)序列長(zhǎng)度為5~10個(gè)堿基對(duì)。
[0055]所述的選擇相應(yīng)的標(biāo)記基團(tuán)，具體為:分子信標(biāo)的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)制可以分為熒光共振能量轉(zhuǎn)移、波長(zhǎng)紅移、金屬淬滅、接觸淬滅、酶促反應(yīng)及電化學(xué)反應(yīng)等。每種分子信標(biāo)可根據(jù)需要偶聯(lián)多個(gè)熒光基團(tuán)或淬滅基團(tuán)，另外還有生物素、辣根過(guò)氧化物酶、地高辛、抗原、半抗原、抗體、量子點(diǎn)、二茂鐵及納米金顆粒等標(biāo)記的分子信標(biāo)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)具體的檢測(cè)需要選擇合適的標(biāo)記。
[0056]4、構(gòu)建陽(yáng)性質(zhì)控樣品
[0057]所述的陽(yáng)性質(zhì)控樣品，具體為包含有EV71VP1基因序列的pET_32a質(zhì)粒。采用PCR技術(shù)對(duì)EV71cDNA模板進(jìn)行擴(kuò)增，得到所需的EV71VP1基因序列(如SEQ ID N0.4所示)，序列片段經(jīng)雙酶切后與相應(yīng)雙酶切pET-32a質(zhì)粒載體進(jìn)行連接，用氯化鈣法轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑選陽(yáng)性克隆，并進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證以獲得所需的陽(yáng)性質(zhì)控樣品(結(jié)果如附圖1所示)。
[0058]5、選擇合適的鎖核酸分子信標(biāo)濃度、引物濃度、二硫蘇糖醇(DTT)濃度、K+和Mg2+離子濃度用于等溫?cái)U(kuò)增。
[0059]所述的合適的分子信標(biāo)使用濃度，具體為:根據(jù)等溫?cái)U(kuò)增體系的需要，通過(guò)梯度稀釋的鎖核酸分子信標(biāo)(50nM - 500nM)，選擇合適的分子信標(biāo)濃度，以獲得最佳的信噪比。
[0060]所述的合適的引物使用濃度，具體為:根據(jù)等溫?cái)U(kuò)增體系的需要，通過(guò)添加不同濃度的引物(50nM - 500nM),以獲得最佳的信噪比。
[0061]所述的合適的DTT使用濃度，具體為:根據(jù)等溫?cái)U(kuò)增體系的需要，通過(guò)添加不同濃度的DTT (ImM -1OmM),以獲得最佳的信噪比。[0062]所述的合適的K+使用濃度，具體為:根據(jù)等溫?cái)U(kuò)增體系的需要，通過(guò)添加不同濃度的K+ (IOmM-1OOmM),以獲得最佳的信噪比。
[0063]所述的合適的Mg2+使用濃度，具體為:根據(jù)等溫?cái)U(kuò)增體系的需要，通過(guò)添加不同濃度的Mg2+ (5mM - 25mM),以獲得最佳的信噪比。
[0064]在本發(fā)明所述的技術(shù)方案中:可以通過(guò)熒光識(shí)別儀、質(zhì)譜、凝膠電泳、分子夾、序列分析、DNA/RNA傳感器、檢驗(yàn)層析試紙條、微陣列系統(tǒng)或變色反應(yīng)等方式檢測(cè)分子信標(biāo)產(chǎn)生的信號(hào)，其檢測(cè)方式可以是實(shí)時(shí)檢測(cè)也可以是終點(diǎn)檢測(cè)。
[0065]實(shí)施例1:EV71等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒及其使用
[0066]1、制備包括下列組成成分的試劑盒:等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液I管，引物探針混合液I管，T7RNA聚合酶、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶H混合液I管，陽(yáng)性質(zhì)控樣品I管。
[0067]2、樣本采集:EV71樣本采集遵循一般病原體采集程序，采集如下標(biāo)本:肛拭子、咽拭子、皰疹液、血清。標(biāo)本應(yīng)置于無(wú)菌病毒采樣液。
[0068]存放:保存在4°C (不能超過(guò)4天)或者_(dá)70°C或_70°C以下。
[0069]3、樣品處理及RNA提取:等溫?cái)U(kuò)增效能依賴于樣品RNA的質(zhì)與量。用戶可采用通用型病毒RNA提取試劑盒提取EV71病毒RNA用于檢測(cè)或保存于_20°C (_70°C更佳)以待檢測(cè)。
[0070]4、等溫?cái)U(kuò)增及檢測(cè)
[0071]4.1試劑準(zhǔn)備:
[0072]將試劑盒中的等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液、`引物探針混合液、陽(yáng)性質(zhì)控樣品及RNase FreedH20進(jìn)行解凍。按標(biāo)本的數(shù)量(η)個(gè)加上陽(yáng)性對(duì)照(I個(gè))、陰性對(duì)照(I個(gè))和空白對(duì)照(I個(gè)，RNase Free dH20)的數(shù)量進(jìn)行等溫反應(yīng)液的配制，共(n+4)個(gè)，配制方法如下:
[0073]
試劑試劑I試劑II
單人份用量8.6ul
配制量(n+4) X8.6ul (n+4) X4ul
[0074]混合好上述反應(yīng)液后，以每管12.6ul分裝于(n+3)個(gè)PCR反應(yīng)管中。
[0075]4.2 加樣
[0076]分裝好的反應(yīng)管分別加入已提取好的標(biāo)本、陰陽(yáng)性對(duì)照品及RNase Free dH20各
3.4ul，然后各加入I滴礦物油(約15ul)
[0077]4.3預(yù)處理
[0078]將加好樣的PCR管進(jìn)行65°C 5min、42°C 5min預(yù)處理，處理完后各加入4ul酶混液或 4ulRNase Free dH20 (空白對(duì)照)。
[0079]4.4等溫?cái)U(kuò)增
[0080]將反應(yīng)管放置在熒光定量PCR儀或恒溫儀上，42°C溫浴90分鐘，進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)或反應(yīng)結(jié)束后用手持式熒光檢測(cè)儀進(jìn)行終點(diǎn)檢測(cè)。
[0081]上述EV71病毒實(shí)時(shí)或終點(diǎn)檢測(cè)的等溫?cái)U(kuò)增試劑盒的檢測(cè)方法，包括以下步驟:
[0082]1、采用常規(guī)方法提取待測(cè)樣品RNA為模板，[0083]2、采用EV71等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增，
[0084]3、將擴(kuò)增體系置于熒光定量PCR儀進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)或用手持式熒光檢測(cè)儀進(jìn)行終
點(diǎn)檢測(cè)。
[0085]所述的實(shí)時(shí)檢測(cè)具體為:選擇熒光檢測(cè)模式為FAM熒光，設(shè)定閾值線，若待測(cè)樣品
熒光增長(zhǎng)曲線超過(guò)閾值線，并呈對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，則判斷為陽(yáng)性，即樣品中存在EV71病毒，否則樣
品中不存在EV71病毒；
[0086]所述的終點(diǎn)檢測(cè)具體為:采用手持式熒光檢測(cè)儀測(cè)定等溫?cái)U(kuò)增樣品，根據(jù)待測(cè)樣
品熒光信號(hào)強(qiáng)度與陰性樣品熒光信號(hào)強(qiáng)度的比值(信噪比)，判定檢測(cè)結(jié)果:陰性對(duì)照與空
白對(duì)照的熒光信號(hào)強(qiáng)度比值〈1.5，陽(yáng)性對(duì)照與陰性對(duì)照的熒光信號(hào)強(qiáng)度比值≥2 ；
[0087]所述的等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的參數(shù)為:65。0 5min>42°C 5min預(yù)處理,加入酶液42?反應(yīng)
90分鐘。
[0088]實(shí)施例2:EV71等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒實(shí)時(shí)檢測(cè)
[0089]實(shí)施例中所述研究對(duì)象及檢測(cè)引物與分子信標(biāo)如實(shí)施例1所述。
[0090]經(jīng)過(guò)優(yōu)化，選擇等溫檢測(cè)的反應(yīng)溫度為42°C，確定的反應(yīng)體系如下:
[0091]
【權(quán)利要求】
1.一種手足口病病毒等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒，包括:1)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液、陽(yáng)性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品，和2)分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒；其特征在于，所述的等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液由等溫?cái)U(kuò)增緩沖液、反應(yīng)酶、正、反向引物、分子信標(biāo)組成； 其中: 所述的正向引物的堿基序列為SEQ ID N0.1:
ACACAGGTGAGCAGTCATCG ； 所述的反向引物的堿基序列為SEQ ID N0.2:
AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAAGTCTCAATCATGCTCTCATCACT ； 所述的分子信標(biāo)的堿基序列為SEQ ID N0.3:
CCTTGGACAGGTAAGGTTCCAGCACTCCAAGGo
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的手足口病病毒等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的等溫?cái)U(kuò)增緩沖液包括 Tris HC140mM,KC170mM,MgCl212mM, DTTlOmM, dNTPlmM, rNTP2mM,山梨糖醇 375mM。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的手足口病病毒等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的反應(yīng)酶由T7RNA聚合酶、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶H組成。
4.根據(jù)權(quán)利要 求1所述的手足口病病毒等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的陽(yáng)性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品為重組質(zhì)粒pET-32a。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的手足口病病毒等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的陽(yáng)性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為IO5Copies/反應(yīng)~IO2Copies/反應(yīng)。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的手足口病病毒等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的T7RNA聚合酶的酶活力32U，AVM聚合酶的酶活力6.4U、RNA酶H的酶活力0.08U。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的手足口病病毒等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的分子信標(biāo)熒光報(bào)告基團(tuán)為FAM，熒光淬滅基團(tuán)為BHQl。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的手足口病病毒等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的分子信標(biāo)使用濃度為ΙΟΟηΜ。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的手足口病病毒等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的條件為:65°C 5min、42°C 5min預(yù)處理，加入酶液42°C反應(yīng)90分鐘。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的手足口病病毒等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的陽(yáng)性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建方法是采用PCR方法對(duì)EV71CDNA模板進(jìn)行擴(kuò)增，得到所需的EV71VP1基因序列，序列片段經(jīng)雙酶切后與相應(yīng)雙酶切pET-32a質(zhì)粒載體進(jìn)行連接，用氯化鈣法轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑選陽(yáng)性克隆，并進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證以獲得所需的陽(yáng)性質(zhì)控樣品。
【文檔編號(hào)】C12R1/93GK103757130SQ201310633713
【公開日】2014年4月30日 申請(qǐng)日期:2013年11月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月28日
【發(fā)明者】彭濤, 龍飛, 蘇文瀚, 肖靜, 殷仙麗, 盧然如 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院, 佛山市燁泰科技有限公司