專利名稱：耐熱酵母多形漢遜酵母在高溫的產(chǎn)乙醇的木糖發(fā)酵的制作方法
耐熱酵母多形漢遜酵母在高溫的產(chǎn)乙醇的木糖發(fā)酵對相關申請的交叉參考本申請要求2007年12月13日提交的待決美國臨時專利申請序列號61/007，477 的優(yōu)先權。美國臨時專利申請序列號61/007，477通過參考并入本申請，如同完全重新寫入 本文。
背景技術：
1.發(fā)明領域本文提供的實施方案涉及使用酵母從D-木糖發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的方法和組合物。2.背景微生物的代謝工程通常是商業(yè)上產(chǎn)生可用于多種應用的大量化學品的有效手段 (例如參見Lee，S. Y.等人，Macromol. Biosci. 4 157-164 (2004))。已經(jīng)吸引了許多注意的 一種化學品是乙醇。盡管乙醇具有多種用途，但它最通常用作燃料。作為燃料時，乙醇是一 種低價產(chǎn)品，其生產(chǎn)成本的大部分歸因于原材料的成本。因此，將期望開發(fā)從容易獲得的廉 價起始材料生產(chǎn)乙醇的產(chǎn)乙醇菌(ethanolgens)和發(fā)酵方法。這些起始材料可以是例如木 質(zhì)纖維。這些木質(zhì)纖維可能來自例如，食物的可再生的生物質(zhì)廢水、制漿操作、農(nóng)業(yè)殘留物 和從城市回收的紙。木質(zhì)纖維素是大約30 %的D-木糖(參見Ryabova，0. B.等人“Xylose andCellobiose Fermentation to Ethanol by the Thermotolerant MethylotrophicYeast Hansenula polymorpha (耐熱甲基營養(yǎng)酵母多形漢遜酵母(Hansenulapolymorpha)發(fā)酵木 糖和纖維二糖為乙醇)”FEMS Yeast Res. 4 157-164 (2003))。木糖是一種“木材糖”(wood sugar), IUPAC 名稱是(2S，3R，4S，5R)-噁烷-2，3，4，5-四醇。只有相對少量的野生型微生物能夠發(fā)酵D-木糖。這些微生物通常不適于大 規(guī)模發(fā)酵。這種不利性可能由于以下產(chǎn)生，例如對微生物不熟悉、難以獲得微生物、生 產(chǎn)率差和/或在粗加工的木質(zhì)纖維上生長差或當在從生物質(zhì)(biomass)獲得的混合糖
類上生長時令人不滿意的產(chǎn)率。C. Abbas，“Lignocellulosics to ethanol :meeting
ethanol demand in the future (從木質(zhì)纖維到乙醇滿足未來的乙醇需求)” The Alcohol Textbook(乙醇教科書)，第 4 版.(K. A. Jacques、Τ. P. Lyons 和 D. R. Kelsall 編 $t)· Nottingham UniversityPress, Nottingham, UK, 2003, H 41-57 M 弓 Iffl C. Abbas， “Emergingbiorefineries and biotechnological applications of nonconventional yeast :nowand in the future (正在出現(xiàn)的非常見酵母的生物精煉和生物技術應用現(xiàn)在 和未來)” The Alcohol Textbook (乙醇教科書)，第 4 版.(K. A. Jacques、Τ. P. Lyons 和 D. R. Kelsall 編輯).Nottingham University Press, Nottingham, United Kingdom, 2003, 第 171-191 頁。酵母被認為是用于木糖的乙醇發(fā)酵的最有希望的微生物(參見Ryabova，同上)。 它們具有比細菌大的細胞，對病毒感染耐受，并易于更耐受來自乙醇的負反饋。而且，已經(jīng) 廣泛研究了大量物種的酵母生長和代謝。已知大量酵母天然地發(fā)酵D-木糖。這些包括 樹干畢赤酵母(Pichiastipitis)、休哈塔假絲酵母(Candida shehatae)和嗜鞣管囊酵母(Pachysolentannophilus)(參見 Ryabova,同上；C. Abbas 2003)。已知常見啤酒酵母釀酒 酵母(Saccharomyces cerevisiae)天然地不發(fā)酵D-木糖，但已報道發(fā)酵D-木糖的生物改 造的大量釀酒酵母菌株。如

圖1所示，酵母中的D-木糖代謝已被報道為沿著類似于葡萄糖的經(jīng)由磷酸戊糖 途徑的途徑進行。D-木糖的碳經(jīng)糖酵解過程加工為乙醇或經(jīng)由呼吸TCA循環(huán)加工為C02。已經(jīng)提出，D-木糖發(fā)酵中牽涉的一個阻礙是將半纖維素的主要成分木聚糖水 解為單糖(參見Ryabova，同上)?？朔@一阻礙的一種方法是通過使用“同時糖化和發(fā) 酵”(SSF)。這一工藝中，粗加工的木質(zhì)纖維素被纖維素酶和半纖維素酶水解，而這一水解產(chǎn) 生的己糖和戊糖(包括木糖)被發(fā)酵為乙醇。這將允許持續(xù)地將糖類轉(zhuǎn)化為乙醇，阻止糖 類在培養(yǎng)基中積聚。SSF的一種可能缺點是纖維素酶和半纖維素酶有活性的最佳溫度(至少約50°C ) 與酵母生長和發(fā)酵木糖的最佳溫度(約30°C) —致的差異。這一可能缺點的一種解決方 案是使用耐熱甲基營養(yǎng)酵母多形漢遜酵母(還稱為安格斯畢赤酵母(Pichia angusta)) 進行SSF。這種酵母已被報道為具有分別是37°C和48°C的最佳生長溫度和最高生長溫度。 這些溫度高于大多數(shù)其它產(chǎn)乙醇酵母所耐受的溫度(Ryabova等人)。而且，Ryabova等人 報道，在一些條件下多形漢遜酵母能夠天然地發(fā)酵D-木糖(還參見Voronovsky，Α. Y.等 人“Expression of xylA Genes Encoding XyloseIsomerases From Escherichia coli and Streptomyces coelicolor in theMethylotrophic Yeast Hansenula polymorpha(來 自大腸桿菌和天藍色鏈霉菌的編碼木糖異構(gòu)酶的xylA基因在甲基營養(yǎng)酵母多形漢遜 酵母中的表達)”FEMS Yeast Res. 5 (11) 1055-62 (2005))。報道了多形漢遜酵母在高 溫下的表現(xiàn)，例如在 Escalante, J.等人“Biomass Production by a Thermotolerant Yeast =Hansenula polymorpha (耐熱酵母多形漢遜酵母的生物質(zhì)生產(chǎn))” J. Chem. Tech.Biotechnol. 48 61-70(1990) ；Tsiomenko, A. B.等 K,"SecretoryHeat-Shock Protein of the Thermotolerant Yeast Hansenula polymorpha. Identification and Comparative Characteristics (耐熱酵母多形漢遜酵母的分泌性熱激蛋白鑒定和比較特 IE ) "Biochemistry(Moscow)62(2) 123-128(1997) ；Lindquist，S. & Kim，G. ，“Heat—shock Protein 104 Expression isSuff icient for Thermotolerance in Yeast (熱激蛋白 104 的表達對于酵母耐熱性是足夠的)” Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 5301-5306 (1996)； Guerra, Ε.,等 A"Hypoxia Abolishes Transience of the Heat-shock Response in theMethylotrophic Yeast Hansenula polymorpha(低氧消除了甲基營養(yǎng)酵母多形漢遜酵 母中熱激響應的暫時性)”Microbiology 151 805-811 (2005)。因此，開發(fā)具有從包括C5糖、D-木糖的木質(zhì)纖維起始材料產(chǎn)生乙醇的增加能力的 多形漢遜酵母菌株將是有益的。本教導可能提供這些優(yōu)點和/或其它優(yōu)點，并可能提供本 領域技術人員將易于從以下的發(fā)明詳述中看出的進一步的優(yōu)點。發(fā)明概述本教導參考各個示例性實施方案描述了本發(fā)明的多個不同特征和方面。然而應理 解的是，本發(fā)明包含大量替代實施方案，替代實施方案可以通過以本領域普通技術人員發(fā) 現(xiàn)有用的任何組合來組合本文描述的任何不同特征和方面而實現(xiàn)。本文提供了可用于修飾宿主細胞的基因和遺傳元件。這些宿主細胞可包括例如微生物。用于本發(fā)明的實施方案中的一種特別適合的微生物是酵母多形漢遜酵母。本發(fā) 明的方法和組合物可用于提供具有增加的酶活性的微生物。在一個實施方案中，多形漢遜 酵母宿主細胞過表達多形漢遜酵母的熱激蛋白104。在進一步的實施方案中，提供了具有 ATHl (酸性海藻糖酶)基因缺失的多形漢遜酵母細胞。ATHl缺失改進了耐熱性和對乙醇的 耐受性，導致乙醇產(chǎn)生增加。在進一步的實施方案中，多形漢遜酵母的菌株過表達木酮糖激 酶(XYL3)。在又一個實施方案中，本發(fā)明的酵母菌株具有至少兩種以下特征(a)該酵母過 表達熱激蛋白104 ； (b)該酵母具有失活的ATHl基因；和(c)該酵母過表達木酮糖激酶。進一步的實施方案提供通過發(fā)酵本發(fā)明的一種或多種酵母菌株產(chǎn)生乙醇的工藝。附圖簡述圖1是酵母中木糖和葡萄糖代謝的示意圖。發(fā)明詳述如本文所用，除非上下文另外地清楚指明，否則說明書和權利要求書中使用的單 數(shù)形式“一(an)”、“一(a)”和“該(the) ”包括單數(shù)和多數(shù)。特別是，本領域技術人員將理 解，盡管以單細胞的方式描述了催化材料和催化支持物的設計和產(chǎn)生，但更有效的系統(tǒng)將 包含各表達一種或多種受體蛋白的一種或多種細胞。本文提供了可用于一種或多種在產(chǎn)乙醇酵母中增加耐熱性和減少乙醇的反饋抑 制的方法和物質(zhì)組合物(composition of matter)，特別是在漢遜酵母屬(畢赤酵母屬)的 成員，更特別地在多形漢遜酵母(安格斯畢赤酵母)中。提供了新穎的菌株。還提供了使 用本發(fā)明的菌株生產(chǎn)乙醇的方法。應理解的是，本發(fā)明的實施方案的某些描述已被簡化以闡述僅與清楚理解本發(fā)明 相關的那些元件和限定，而為了清楚的目的省略了其它元件。本領域技術人員在考慮本說 明書后，將理解其它元件和/或限定對于實施本發(fā)明的實施方案可能是期望的。因為這樣 的其它元件和/或限定可由本領域技術人員在考慮本說明書后確定，且對于完全理解實施 方案不是必需的，本文未提供這樣的元件和限定的討論。本文所列的說明書仍然不意為限 制權利要求書的范圍。術語“基因”是指核酸，DNA或RNA，的區(qū)段，其編碼特定基因產(chǎn)物并能夠表達特定 基因產(chǎn)物?；蛲ǔ．a(chǎn)生蛋白或多肽為其基因產(chǎn)物，但在更廣泛的含義上，基因可產(chǎn)生任何 期望的產(chǎn)物，無論產(chǎn)物是蛋白、多肽還是核酸。功能或結(jié)構(gòu)核酸，例如但不限于rRNA、核酶、 反義RNA或干擾RNA (如siRNA)也可被視為“基因產(chǎn)物”?！盎颉卑粌H可編碼蛋白或多肽，而且可編碼結(jié)構(gòu)或功能核酸例如反義RNA或 siRNA的“表達的序列”。基因還可包含含有調(diào)控元件例如但不限于啟動子、增強子和終止 子的序列；這樣的調(diào)控元件可以是“可操作地連接的”，更典型地彼此適當?shù)亟咏?。這樣的啟 動子順式作用(在同一核酸分子上互相連接)來造成“基因產(chǎn)物”表達?；蚪M成成分的 選擇例如調(diào)控元件和表達的序列的特定組合將規(guī)定表達的條件。例如，組成型啟動子例如 TEFl (翻譯延伸因子IA基因)啟動子偶合到表達的序列將導致表達的序列當轉(zhuǎn)染到合適的 宿主細胞時組成型表達?！敖M成型啟動子”是不受調(diào)節(jié)的啟動子，允許其相關基因的連續(xù)轉(zhuǎn) 錄。如果一種啟動子作用為促進基因在正常生長條件下表達，則認為它是組成型的。組成 型啟動子通常不是底物特異性的，并且在正常生長條件下其表達不顯著地變化?！盎颉笨砂▋?nèi)含子或可從最終RNA轉(zhuǎn)錄物剪接的其它DNA序列。編碼蛋白或肽的表達的DNA序列(“蛋白編碼序列”)包括開放讀碼框(ORF)。蛋白編碼序列可包含插入 的內(nèi)含子。進一步地，術語“基因”包括表達的序列以及非表達的序列。除非另外指明，否則 本文提供的所有DNA序列理解為包括互補鏈。而且，通過用尿嘧啶取代胸腺嘧啶，可從DNA 序列制備RNA序列，并且該RNA序列以及從細胞分離的本發(fā)明的DNA序列的RNA拷貝包括 在本定義和本發(fā)明的范圍內(nèi)。術語“寡核苷酸”是指從約7至約50個堿基的核酸，盡管它們更通常是從約15至 約35個堿基。寡核苷酸可用作雜交或擴增測定中所用的探針或引物，所述雜交或擴增測 定例如DNA印跡(Southern blot)或RNA印跡(Northern blot)；分子信標；聚合酶鏈式 反應(PCR)；逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)；定量RT-PCR(QRT-PCT)如TAQMAN ；等溫擴增方法，例如 NASBA(基于核酸序列的擴增)；和滾環(huán)擴增，包括使用鎖式探針。本發(fā)明的寡核苷酸可通過 加入肽、標記(包括熒光、量子點或酶標簽)和其它化學部分來修飾，并理解為包括在本定 義和本發(fā)明范圍中。如本文所用，在本文所述的新核苷酸序列范疇中，如果核酸可在嚴格條件下與給 定序列特異性雜交，所述嚴格條件例如但不限于，0.2XSSC在65°C或在PCR反應中在典型 反應(退火)溫度下，則該核酸對給定序列例如提供的丙酮酸脫羧酶cDNA和基因組序列具 有“特異性”。通常，如果核酸與參考序列具有90%至100%的同源性(序列同一性)，則該 序列對參考序列具有“特異性”。以下術語用于描述兩條或多條核酸或多核苷酸之間的序列關系(a) “參考序列”、 (b) “比較窗”、(c) “序列同一性”、(d) “序列同一性百分比”和(e) “實質(zhì)同一性”。本文所用的“參考序列”是定義的用作序列比較基礎的序列。參考序列可以是指 定序列的子集或全部；例如，作為全長cDNA或基因序列的區(qū)段、或完整cDNA或基因序列。本文所用的“比較窗”提及多核苷酸序列的連續(xù)和指定的區(qū)段，其中比較窗中的多 核苷酸序列可以包含與參考序列(不包含添加或缺失)相比的添加或缺失(即，缺口)以 最佳地比對兩種序列。通常，比較窗長度是至少20個連續(xù)核苷酸，任選地可以是30、40、50、 100個連續(xù)核苷酸或更長。本領域技術人員理解，為了避免由于多核苷酸序列中包含缺口而 造成的與參考序列的高相似性，通常引入缺口罰分，并從匹配數(shù)中減去該缺口罰分。用于比 較序列的比對方法是本領域公知的。因此，任何兩條序列之間序列同一性百分比的確定可 使用數(shù)學算法來實現(xiàn)。這樣的數(shù)學算法的非限制性實例是Myers和Miller (1988) CABIOS 4 11-17 的算法；Smith 等人(1981)Adv. Appl Math. 2 482 的局部比對算法；Needleman 和 Wunsch(1970) J. Mol. Biol. 48 443-453 的總體比對算法；Pearson 和 Lipman(1988)Proc. Natl. Acad. Sci. 85 2444-2448 的局部搜索(search-for-local)比對方法；Karlin 和 Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264 的算法，在 Karlin 和 Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :5873_5877 中修改。這些數(shù)學算法的計算機實現(xiàn)可用于比較序列來確定序列同一性。這樣的實現(xiàn)包 括但不限于PC/Gene 程序中的 CLUSTAL(可從 Intelligenetics，Mouth View, Calif.獲 得)；CGC Wisconsin遺傳學軟件包，10版本中的ALIGN程序(2. 0版本)和GAP、BESTFIT、 BLAST、FASTA 禾口 TFASTA (可從 Accelrys Inc.，9685 Scranton Road, San Diego, Calif.， USA獲得)。使用這些程序的比對可利用默認參數(shù)進行。CLUSTAL程序充分描述在Higgins 等人(1988) Gene 73 :237_244 ；Higgins 等人(1989) CABI0S5 151-153 ；Corpet 等人(1988)Nucleic Acids Res. 16 10881-90 ；Huange 等人(1992) CABIOS 8 155-65 ；和 Pearson 等 人(1994)Meth.Mol.Biol. 24 :307-331。ALIGN 程序是基于 Myers 和 Miller (1988)同上 的算法。在比較氨基酸序列時，PAM120權重殘基表、缺口長度罰分12、缺口罰分4可用于 ALIGN 程序。Altschul 等人(1990) J. Mol. Biol. 215 403 的 BLAST 程序是基于 Karlin 和 Altschul (1990)同上的算法。BLAST核苷酸搜索可用BLASTN程序，分數(shù)=100、字長=12進行以獲得與編碼本 發(fā)明的蛋白的核苷酸序列同源的核苷酸序列。BLAST蛋白搜索可用BLASTX程序，分數(shù)=5、 字長=3進行以獲得與本發(fā)明的蛋白或多肽同源的氨基酸序列。為了獲得用于比較目的的 帶缺口的比對，可利用 Gapped BLAST (在 BLAST 2. 0 中)，如 Altschul 等人(1997) Nucleic Acids Res. 25 :3389所述的?？蛇x地，PSI-BLAST (在BLAST 2. 0中)可用于進行檢測分子之 間疏遠關系(distant relationships)的迭代搜索。參見Altschul等人(1997)同上。當 利用BLAST、Gapped BLAST和PSI-BLAST時，可使用各自程序(如，對核苷酸序列是BLASTN， 對蛋白是BLASTX)的默認參數(shù)。參見在萬維網(wǎng)ncbi.nlm.nih.gov上的美國國家生物技術 信息中心網(wǎng)頁。比對還可通過目視手工地進行。除非另外指明，否則本文提供的序列同一性/相似性值是指使用GAP版本10利用 以下參數(shù)獲得的值核苷酸序列的同一性％和相似性％，使用GAP權重50和長度權重3以 及nswgapdna. cmp評分矩陣；或其任何等價程序?！暗葍r程序”意為指對于所討論的任何兩條序列，與GAP版本10產(chǎn)生的相應比對相 比，產(chǎn)生具有相同的核苷酸或氨基酸殘基匹配和相同的序列同一性百分比的比對的任何序 列比較程序。GAP使用Needleman和Wunsch (1970)同上的算法來尋求兩條完整序列之間使得匹 配的數(shù)目最大而缺口數(shù)目最小的比對。GAP考慮所有可能的比對和缺口位置并產(chǎn)生具有最 大數(shù)目的匹配的堿基和最少缺口的比對。它允許在匹配的堿基單元中規(guī)定缺口產(chǎn)生罰分和 缺口延伸罰分。對于插入的每個缺口，GAP必須獲得匹配的缺口產(chǎn)生罰分數(shù)。如果選擇了大于零的缺口延伸罰分，對于插入的每個缺口，GAP必須獲得缺口長度 乘以缺口延伸罰分。版本10的GCG Wisconsin遺傳學軟件包中對于蛋白序列的默認缺口 產(chǎn)生罰分值和缺口延伸罰分值分別是8和2。對于核苷酸序列，默認缺口產(chǎn)生罰分是50而 默認缺口延伸罰分是3。缺口產(chǎn)生罰分和缺口延伸罰分可以表示為選自0至200組成的整 數(shù)組的整數(shù)。因此，例如，缺口產(chǎn)生罰分和缺口延伸罰分可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、 15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65 或更大。GAP提供最佳比對家族的一個成員。這一家族中可能有許多成員，但其它成員沒 有更好的質(zhì)量。GAP展示了比對的四個優(yōu)值(figures of merit)質(zhì)量、比例、同一性和 相似性。質(zhì)量是最大化以比對序列的度量。比例是質(zhì)量除以較短區(qū)段中的堿基數(shù)。同一 性百分比是實際上匹配的符號的百分比。相似性百分比是相似的符號的百分比。跨缺口 的符號被忽略。當一對符號的評分矩陣值大于或等于相似性閾值0. 50時，對相似性評分。 用于版本10的GCG Wisconsin遺傳學軟件包的評分矩陣是BL0SUM62 (參見Henikoff和 Henikoff (1989)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 10915)。在兩條核酸或多肽序列的范疇中，本文所用的“序列同一性”或“同一性”提及兩條 序列中當經(jīng)指定的比較窗比對最大對應性(correspondence)時相同的殘基。當序列同一性百分比用于指蛋白時，公認的是，不相同的殘基位置通常因保守氨基酸取代而不同，其中 氨基酸殘基被具有相似化學性質(zhì)(如電荷或疏水性)的其它氨基酸殘基取代，因此不改變 分子的功能性質(zhì)。當序列因保守取代而不同時，序列同一性百分比可被上調(diào)以糾正取代的 保守性質(zhì)。區(qū)別是這樣的保守取代的序列被稱為具有“序列相似性”或“相似性”。進行這 種調(diào)整的手段是本領域技術人員公知的。通常，這包括將保守取代評分為部分而不是完全 錯配，從而增加序列同一性百分比。因此，例如，當相同氨基酸被給予分數(shù)1，非保守取代被 給予分數(shù)零時，保守取代被給予零和1之間的分數(shù)。計算保守取代的評分，例如在程序PC/ GENEdntelligenetics, Mountain View, Calif.)中實現(xiàn)的。本文所用的“序列同一性百分比”是指通過比較經(jīng)比較窗最佳地比對的兩條序列 而確定的值，其中多核苷酸序列在比較窗中的部分可能包含與參考序列(不包含添加或缺 失)相比的添加或缺失(即，缺口)以最佳地比對兩條序列。通過如下計算百分比確定兩 條序列中出現(xiàn)相同核酸堿基或氨基酸殘基的位置的數(shù)目來獲得匹配的位置數(shù)目，將匹配的 位置數(shù)目除以比較窗中的位置總數(shù)目，將結(jié)果乘以100來獲得序列同一性百分比。術語多核苷酸序列的“實質(zhì)同一性”是指使用所述比對程序之一，利用標準參數(shù)， 多核苷酸包含與參考序列相比至少70%、通常至少80%、更通常至少90%、最通常至少 95%的序列同一性的序列。在本文提供的序列范疇中，如果在可用于區(qū)分一條序列和另一條序列的任何給 定反應條件下，但不與其它序列，則序列是對參考序列特異性的，所述反應條件例如但不 限于，PCR、DNA印跡或RNA印跡，所述其它序列例如來自其它物種包括但不限于釀酒酵 母、黑曲霉(A.niger)、土曲霉(A. terreus)、巴斯德畢赤酵母(P. pastoris)和裂殖酵母 (S. pombe)的序列。因此，在核酸檢測測定中，如果一種探針/引物能結(jié)合從標本提取的特 定轉(zhuǎn)錄物或轉(zhuǎn)錄物的期望家族而實際上并入(inclusion) (S卩，大致上不干擾檢測測定)其 它序列，則其是對序列“特異性的”。在PCR測定中，如果引物特異性地擴增參考序列的一部 分而實際上排除樣品中的其它序列，則引物是對該序列特異性的。本文所用的用于檢測特定核酸物質(zhì)的“引物”或“探針，，是可用于檢測和/或定量 特定核酸物質(zhì)的任何引物、引物組和/或探針。“核酸物質(zhì)” (nucleic acid species)可以 是對應于單基因的單個核酸物質(zhì)，或可以是由單種共同引物和/或探針組合檢測的多種核酸。術語“宿主細胞”是指期望的核酸序列已被引入細胞中的任何原核細胞或真 核細胞。這樣的宿主細胞的代謝過程和途徑能夠保持、復制和/或表達含有外來基因 或DNA分子的載體。有多種適合的宿主細胞，包括但不限于可以多種方式(例如，作為 攜帶者來保持包含期望序列的質(zhì)粒)利用的細菌、真菌、昆蟲、哺乳動物和植物細胞。代 表性的微生物宿主細胞包括但不限于，真菌細胞例如根霉屬(Rhizopus sp.)、酵母菌屬 (Saccharomycessp.)、鏈霉菌屬(Streptomyces sp·)、畢赤酵母屬(Pichia sp·)、曲霉 屬(Aspergillus sp.)，和細菌細胞例如乳桿菌屬(Lactobacillus sp.)、埃希氏桿菌屬 (Escherichia sp.)、棒桿菌屬(Corynebacterium sp.)、失顯桿菌屬(Brevibacterium sp.)、 假單胞菌屬(Pseudomonas sp·)、變形桿菌屬(Proteussp.)、腸桿菌屬(Enterobacter sp.)、檸檬酸細菌屬(Citrobacter sp.)、歐文氏菌屬(Erwinia sp.)、黃單胞桿菌屬 (Xanthomonas sp·)、黃桿菌屬(Flavobacterium sp·)、鏈球菌屬(Streptococcus sp.)、乳球菌屬(Lactococcussp.)、明串珠菌屬(Leuconostoc sp.)禾口腸球菌屬(Enterococcus sp.)。在一個實施方案中，宿主細胞是多形漢遜酵母(安格斯畢赤酵母)。在另一實施方案 中，宿主細胞是大腸桿菌(Escherichia coli)。在又一個實施方案中，宿主細胞是釀酒酵母。術語“多核苷酸”是指由磷酸二酯鍵連接的核苷酸的任何單鏈序列，或包含由氫鍵 保持在一起的兩條這樣的互補單鏈序列的任何雙鏈序列。除非另外指明，否則本文所列的 每條多核苷酸序列表示為脫氧核糖核苷酸(縮寫為A、G、C和T)序列。術語“多核苷酸”包 涵DNA分子或多核苷酸、脫氧核糖核苷酸的序列、和RNA分子或多聚核糖核苷酸和其組合。術語“啟動子”是指更大DNA序列中提供或界定RNA聚合酶可結(jié)合并起始轉(zhuǎn)錄的 位點的DNA序列。本文所述的啟動子可用于過表達或上調(diào)例如但不限于編碼在發(fā)酵條件改 變期間增加向乳酸、富馬酸鹽、和其它期望的代謝物的碳通量的酶的基因。給定的參考核苷酸序列或其中包含的元件的“等價物”是與參考核苷酸序列相比， 包含參考核苷酸序列的所有元件以使參考核酸或肽的典型功能保留的核苷酸序列。本領域 技術人員理解，由于遺傳密碼的簡并性，功能蛋白可能被等價DNA序列編碼。例如，可用一 個密碼子可被另一個密碼子取代，而編碼相同氨基酸，例如，例如但不限于，關于Ala密碼 子，用GCG取代GCA。在蛋白的情況，序列可包含代表保守氨基酸取代的氨基酸，包括但不限 于，保守取代組:Ser和Thr ；Leu、Ile和Val ；Glu和Asp ；以及Gln和Asn。由于遺傳密碼 的簡并性，因此本文所要求保護的序列包括所指的序列以及其等價物。保守取代還可由其 它方法確定，例如但不限于，BLAST (基本局部比對搜索工具)算法、BLOSUM取代評分矩陣 和BLOSUM 62矩陣所用的方法(還參見，例如Altschul等人，Methodsin Enzymology 266 460-479 (1996))。重要的是，參考核酸或肽/蛋白的“等價物”和“保守等價物”大致上保 持或增強參考核酸或肽/蛋白的功能。術語“載體”是指將外來核苷酸序列引入細胞的工具，包括但不限于質(zhì)粒或病毒。 這樣的載體可以在宿主細胞的基因表達機制控制下起作用。載體包含便于在宿主細胞中復 制和/或保持外來核酸區(qū)段的序列。通常，將載體引入宿主細胞以復制和/或表達外來DNA 區(qū)段或?qū)⑼鈦鞤NA遞送到宿主基因組中。典型的質(zhì)粒載體包含(i)復制起點，以使載體可 在宿主細胞中保持和/或復制；(ii)選擇標記，例如抗生素抗性基因以從無載體的細胞選 擇含有載體的細胞(轉(zhuǎn)化體)，和(iii)含有多個不同限制性核酸內(nèi)切酶識別和切割位點的 多接頭位點以便于克隆外來DNA序列。本文提供了可用于修飾宿主細胞的基因和遺傳元件。這些宿主細胞可包括例如微 生物。用于本發(fā)明的實施方案中的一種特別適合的微生物是酵母多形漢遜酵母(安格斯畢 赤酵母)。本發(fā)明的方法和組合物可用于提供具有增加的酶活性的微生物。本文提供的方法和組合物可能特別可用于利用SSF(同時糖化和發(fā)酵)發(fā)酵性產(chǎn) 生乙醇。本發(fā)明的菌株還可特別適于在高溫發(fā)酵性產(chǎn)生乙醇?！案邷亍笔侵咐?，在40°C至 60°C、40°C至 55°C、40°C至 50°C、45°C至 55°C、45°C至 50°C、48°C至 52°C和 48°C至 50°C 的溫 度進行發(fā)酵。用于發(fā)酵的典型溫度包括48°C和50°C。I .利用過度產(chǎn)生多形漢遜酵母的熱激蛋白104的多形漢遜酵母從D-木糖生產(chǎn) 乙醇的菌株和方法在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了多形漢遜酵母物種的產(chǎn)乙醇酵母，其中該酵母已被修飾以通過增加多形漢遜酵母熱激蛋白104在酵母中的表達量，在具有D-木糖作為 主要碳源的培養(yǎng)基中具有增加的乙醇產(chǎn)生。在本文報道的實例中，乙醇產(chǎn)生是相對于為多 形漢遜酵母轉(zhuǎn)化體NCYC4951eu 1-1 (ScLEU2)的對照菌株的乙醇產(chǎn)生。該轉(zhuǎn)化體是包含釀 酒酵母LEU2基因的菌株NCYC495 Ieu 1_1衍生物。在其它實施方案中，增加的產(chǎn)生是相對 于多形漢遜酵母的親株的產(chǎn)生。乙醇產(chǎn)生還可通過增加具有帶有對多形漢遜酵母的熱激蛋白104的氨基酸序列 的一種或多種缺失、取代、插入、倒轉(zhuǎn)或添加的氨基酸序列的蛋白的表達量而增加，其中所 述蛋白與野生型多形漢遜酵母熱激蛋白104至少90 %、至少95 %、至少98 %或至少99 %相 同。在一個實施方案中，熱激蛋白104的表達增加是通過增加多形漢遜酵母的熱激蛋 白104基因(HSP104)的拷貝數(shù)(在多形漢遜酵母菌株中)。在進一步的實施方案中，HSP 104被置于非天然啟動子的控制下。非天然啟動子可以是，例如，但不限于組成型啟動子。 在一個實施方案中，非天然啟動子是多形漢遜酵母的GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)基因 的啟動子?？梢栽黾親SP 104基因的拷貝數(shù)，例如通過以攜帶HSP 104基因的ORF的質(zhì)粒轉(zhuǎn) 化多形漢遜酵母的親株，或通過以攜帶在GAPDH啟動子控制下的HSP104基因的ORF的質(zhì)粒 轉(zhuǎn)化多形漢遜酵母的親株。啟動子選自，例如，GAPDH、PMAl (質(zhì)膜H+-ATP酶)、TEFl (翻譯 延伸因子1A)和PGKl (3-磷酸甘油酸酯激酶)基因的啟動子。本領域技術人員將知道以期 望的基因或基因/啟動子構(gòu)建體轉(zhuǎn)化多形漢遜酵母的多種方式?？蓪峒?04蛋白表達增加的酵母培養(yǎng)在含有D-木糖的培養(yǎng)基中以產(chǎn)生乙醇。根 據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，提供乙醇的方法包括以下步驟在含有D-木糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng) 熱激104蛋白表達增加的酵母以發(fā)酵D-木糖，在培養(yǎng)基中積聚乙醇，并從培養(yǎng)基收集乙醇。 發(fā)酵可以在12%木糖存在下在48-50°C溫度經(jīng)1-3天的時間段在半需氧條件(HOrpm)進 行。發(fā)酵在具有木糖的基本培養(yǎng)基(YNB)進行；木糖濃度是4%至12%;最佳乙醇產(chǎn)生 是在12%木糖時。pH是大約3至5，并定期檢查?！案倪M的生長”是指在升高的溫度(50°C) 更好的生物質(zhì)積聚。在600nm測量0D。在展示的所有實驗中，多形漢遜酵母轉(zhuǎn)化體NCYC495 leu l-l(ScLEU2)用作對照菌株。這種轉(zhuǎn)化體用作對照菌株，因為檢驗的所有重組菌株 (HSP104-8、Aathl-36、Aathl-36_XYL3)通過轉(zhuǎn)化攜帶ScLEU2的載體后獲得。因此，檢驗 的菌株包含基因(ScLEU2)。根據(jù)布達佩斯條約，菌株Δ athl-36_XYL3于2007年9月13日 保藏在NRRL ARS培養(yǎng)物保藏中心，Peoria, Illinois, USA，保藏號為NRRL Y-50061。II .利用缺少活性ATHl (酸性海藻糖酶)基因的多形漢遜酵母從D-木糖生產(chǎn)乙 醇的菌株和方法在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了多形漢遜酵母物種的產(chǎn)乙醇酵母，其中該酵 母已被修飾以通過將ATHl (酸性海藻糖酶)基因失活來增加從D-木糖產(chǎn)生乙醇。酵母釀 酒酵母中的酸性海藻糖酶基因在以下討論Jung，Y-J. & Park，H-D. "Antisense-mediated Inhibition of Acid Trehalase(ATHl) Gene Expression Promotes Ethanol Fermentation and Tolerance inSaccharomyces cerevisiae (反義介導的抑制酸性海藻糖酶(ATHl)基因 表達在釀酒酵母促進乙醇發(fā)酵和耐受)” Biotech. Lett. 27 1855-1859 (2005)；和Kim, J.，等人"Disruption ο the Yeast ATHl Gene Confers Better Survivalafter Dehydration, Freezing, and Ethanol Shock !Potential CommercialApplications(酵母 ATHl 基因 的破壞賦予在脫水、冷凍和乙醇休克后更好的存活可能的商業(yè)應用)”Appl.& Envir. Microbiol. 62 (5) :1563_1569 (1996)。術語“ATH1基因失活”、“失活的ATHl基因”、“ATH1基因的失活”和類似術語表示 ATHl基因被修飾以使該基因編碼突變蛋白。突變蛋白可能具有降低的活性或可能被完全失 活。ATHl基因還可被修飾以使其由于以下而不能提供酸性海藻糖酶蛋白的天然表達缺失 所有或部分ATHl基因、ATHl基因相鄰區(qū)域的修飾、或通過向ATHl基因添加一個或多個核 苷酸而破壞ATHl基因的一個或多個部分。受益于本公開內(nèi)容，本領域技術人員將認識到多種方式來將多形漢遜酵母中的 ATHl基因失活。這些例如包括但不限于，破壞、部分或完全缺失該基因。其中ATHl基因已被失活的酵母可被進一步修飾以增強在期望條件時的乙醇產(chǎn) 生。例如，可能增強乙醇產(chǎn)生中牽涉的一種或多種基因的表達。酵母中的一種或多種基因 可被失活以優(yōu)化碳源對發(fā)酵的分配。其中ATHl基因失活的酵母可以是野生型多形漢遜酵母，或可以是其中從D-木糖 的乙醇產(chǎn)生已增加超過野生型多形漢遜酵母的多形漢遜酵母菌株。根據(jù)本發(fā)明的其它實施 方案，酵母可被進一步修飾以增加從D-木糖產(chǎn)生乙醇。可將帶有失活的ATHl基因的酵母培養(yǎng)在含有D-木糖的培養(yǎng)基中以產(chǎn)生乙醇。根 據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，提供乙醇的方法包括以下步驟在含有D-木糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng) 帶有失活的ATHl基因的酵母以發(fā)酵D-木糖，在培養(yǎng)基中積聚乙醇，并從培養(yǎng)基收集乙醇。 發(fā)酵可以在12%木糖存在下在48-50°C溫度經(jīng)1-3天的時間段在半需氧條件(HOrpm)進 行。發(fā)酵在具有木糖的基本培養(yǎng)基(YNB)進行；木糖濃度是4%至12%;最佳乙醇產(chǎn)生 是在12%木糖時。pH是大約3至5，并定期檢查?！案倪M的生長”是指在升高的溫度(50°C) 更好的生物質(zhì)積聚。在600nm測量0D。在展示的所有實驗中，多形漢遜酵母轉(zhuǎn)化體NCYC495 Ieu 1-1 (ScLEU2)用作對照菌株。III.利用過度產(chǎn)生木酮糖激酶的多形漢遜酵母從D-木糖生產(chǎn)乙醇的菌株和方法在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了多形漢遜酵母物種的產(chǎn)乙醇酵母，其中該酵 母已被修飾以通過增加多形漢遜酵母的蛋白木酮糖激酶在酵母中的表達量，在具有D-木 糖作為主要碳源的培養(yǎng)基中具有增加的乙醇產(chǎn)生。在一個實施方案中，增加的乙醇產(chǎn)生是 相對于為野生型多形漢遜酵母的對照菌株的乙醇產(chǎn)生，在另一實施方案中，增加的產(chǎn)生是 相對于多形漢遜酵母的親株的產(chǎn)生。乙醇產(chǎn)生還可通過增加具有帶有對多形漢遜酵母的木酮糖激酶的氨基酸序列的 一種或多種缺失、取代、插入、倒轉(zhuǎn)或添加的氨基酸序列的蛋白的表達量而增加，其中所述 蛋白與野生型多形漢遜酵母的木酮糖激酶的氨基酸序列至少90%、至少95%、至少98%或 至少99%相同。在一個實施方案中，木酮糖激酶的表達通過增加多形漢遜酵母菌株中多形漢遜酵 母木酮糖激酶基因(XYL3)的拷貝數(shù)而增加。在進一步的實施方案中，XYL3被置于非天然 啟動子控制下。
非天然啟動子可以是，例如，但不限于組成型啟動子。在一個實施方案中，非天然 啟動子是多形漢遜酵母的GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)基因的啟動子。啟動子選自，例 如，GAPDH、PMA1 (質(zhì)膜H+-ATP酶)、TEF1 (翻譯延伸因子1A) ,PGKl (3-磷酸甘油酸酯激酶) 基因的啟動子。可以增加XYL3基因的拷貝數(shù)，例如通過以攜帶在GAPDH啟動子(GenBank #AY550078)控制下的XYL3基因的ORF的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化多形漢遜酵母的親株?？梢栽黾親SP 104 基因的拷貝數(shù)，例如通過以攜帶在GAPDH啟動子(GenBank #AY550078)控制下的HSP104基 因的ORF的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化多形漢遜酵母的親株。本領域技術人員將知道以期望的基因或基因/ 啟動子構(gòu)建體轉(zhuǎn)化多形漢遜酵母的多種方式?？蓪⒛就羌っ副磉_增加的酵母培養(yǎng)在含有D-木糖的培養(yǎng)基中以產(chǎn)生乙醇。根 據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，提供乙醇的方法包括以下步驟在含有D-木糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng) 木酮糖激酶表達增加的酵母以發(fā)酵D-木糖，在培養(yǎng)基中積聚乙醇，并從培養(yǎng)基收集乙醇。 發(fā)酵可以例如在12%木糖存在下在48-50°C溫度經(jīng)1-3天的時間段在半需氧條件(140rpm) 進行。IV.另外的實施方案在本發(fā)明的進一步實施方案中，在部分I、部分II和部分III描述的一個或多個方 面可以組合使用以提供從D-木糖產(chǎn)生乙醇增加的多形漢遜酵母菌株。例如，一個實施方案 可能提供其中ATHl基因是失活的但XYL3基因過表達和/或具有增加的拷貝數(shù)的多形漢遜 酵母菌株。另一實施方案可能提供具有失活的ATHl基因、過表達和/或增加的拷貝數(shù)的 XYL3基因、以及過表達和/或增加的拷貝數(shù)的HSP104基因的多形漢遜酵母菌株。又另一實 施方案提供具有過表達和/或增加的拷貝數(shù)的XYL3基因和具有增加的拷貝數(shù)和/或過表 達的HSP104基因的多形漢遜酵母菌株。本發(fā)明的又另一實施方案提供具有失活的ATHl基 因和增加的拷貝數(shù)和/或過表達的HSP104基因的多形漢遜酵母菌株。受益于本公開內(nèi)容，本領域技術人員將認識到可對本發(fā)明的宿主細胞進行進一步 修飾，這允許改變乙醇和/或其它化學品的產(chǎn)生的進一步的營養(yǎng)需求。例如，通過增加的 熱激蛋白104表達、失活ATHl和增加的木酮糖激酶表達的任何組合，人們可以產(chǎn)生適于在 D-木糖是主要能量源的培養(yǎng)基中產(chǎn)生乙醇的多形漢遜酵母菌株。除了本文教導的那些以 外，可使用本領域技術人員已知的修飾、以及以后開發(fā)的修飾。菌株和質(zhì)粒用于本發(fā)明的實施方案中的微生物菌株和質(zhì)粒提供在表1。表 1
菌株描述來源多形漢遜酵母NCYC495 leul-KATCC ΜΥΑ-335)leu2, P-異丙基蘋果酸脫氫 酶缺陷ATCC, USA
權利要求
1.一種分離的多形漢遜酵母物種的產(chǎn)乙醇酵母，其中所述酵母包含選自以下組成的組 的至少一種修飾(a)ATHl (酸性海藻糖酶)基因失活；(b)與親株相比過表達多形漢遜酵母的蛋白木酮糖激酶；和(c)與親株相比過表達多形漢遜酵母的蛋白熱激蛋白104。
2.一種生產(chǎn)乙醇的方法，包括以下步驟a)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)權利要求1的酵母以在所述培養(yǎng)基中產(chǎn)生和積聚乙醇；并b)從所述培養(yǎng)基收集乙醇。
3.根據(jù)權利要求2所述的方法，其中所述培養(yǎng)基包含D-木糖。
4.根據(jù)權利要求2所述的方法，其中所述產(chǎn)生在高于約48°C的溫度發(fā)生。
5.根據(jù)權利要求2所述的方法，其中所述ATHl基因由于所述酵母的ATHl基因的突變、 破壞、部分缺失和/或缺失而被失活。
6.根據(jù)權利要求2所述的方法，其中所述ATHl基因由于控制所述ATHl基因表達的至 少一種調(diào)控元件的突變、破壞、部分缺失和/或缺失而被失活。
7.根據(jù)權利要求1所述的酵母，其中所述酵母包含失活的ATHl基因。
8.一種生產(chǎn)乙醇的方法，包括a)在含有D-木糖作為碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)權利要求8的酵母，允許乙醇積聚；并b)從所述培養(yǎng)基收集乙醇，其中所述多形漢遜酵母產(chǎn)生乙醇的水平高于具有活性 ATHl基因的多形漢遜酵母產(chǎn)生乙醇的水平。
9.根據(jù)權利要求1所述的酵母，其中在含有D-木糖作為主要碳源的培養(yǎng)基中所述酵母 產(chǎn)生乙醇的量和/或產(chǎn)率大于親本多形漢遜酵母菌株產(chǎn)生乙醇的量和/或產(chǎn)率。
10.根據(jù)權利要求1所述的酵母，其中所述酵母包含比對照菌株更高拷貝數(shù)的多形漢 遜酵母木酮糖激酶(XYU)基因。
11.根據(jù)權利要求1所述的酵母，其中所述酵母包含處于非天然啟動子控制下的至少 一個XYL3基因。
12.根據(jù)權利要求12所述的酵母，其中所述非天然啟動子選自多形漢遜酵母的甘油 醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)啟動子(GenBank#AY550078)組成的組。
13.根據(jù)權利要求1所述的酵母，其中所述酵母與親株相比過表達多形漢遜酵母的木 酮糖激酶，其中在含有D-木糖作為主要碳源的培養(yǎng)基中所述酵母產(chǎn)生乙醇的量和/或產(chǎn)率 大于親本多形漢遜酵母菌株產(chǎn)生乙醇的量和/或產(chǎn)率。
14.一種生產(chǎn)乙醇的方法，包括a)在含有D-木糖作為碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)權利要求14的酵母，允許乙醇積聚；并b)從所述培養(yǎng)基收集乙醇，其中所述多形漢遜酵母產(chǎn)生乙醇的水平高于不過表達多形 漢遜酵母的木酮糖激酶蛋白的多形漢遜酵母產(chǎn)生乙醇的水平。
15.根據(jù)權利要求2所述的方法，其中所述酵母包含比對照菌株更高拷貝數(shù)的多形漢 遜酵母熱激蛋白(HSP104)基因。
16.根據(jù)權利要求2所述的方法，其中所述酵母包含處于非天然啟動子控制下的至少 一個HSP104基因。
17.根據(jù)權利要求17所述的方法，其中所述非天然啟動子選自多形漢遜酵母的甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)啟動子(GenBank#AY550078)組成的組。
18.根據(jù)權利要求1所述的酵母，其中所述酵母與親株相比過表達多形漢遜酵母的蛋 白熱激104蛋白，其中在含有D-木糖作為主要碳源的培養(yǎng)基中所述酵母產(chǎn)生乙醇的量和/ 或產(chǎn)率大于親本多形漢遜酵母菌株產(chǎn)生乙醇的量和/或產(chǎn)率。
19.一種生產(chǎn)乙醇的方法，包括a)在含有D-木糖作為碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)權利要求19的酵母，允許乙醇積聚；并b)從所述培養(yǎng)基收集乙醇，其中所述多形漢遜酵母產(chǎn)生乙醇的水平高于不過表達多形 漢遜酵母的熱激104蛋白的多形漢遜酵母產(chǎn)生乙醇的水平。
20.一種多形漢遜酵母菌株，保藏號為NRRL Y-50061。
全文摘要
本文提供了從木質(zhì)纖維起始材料產(chǎn)生乙醇的方法和組合物。多種實施方案提供了多形漢遜酵母物種的帶有一個或多個修飾的酵母細胞，所述修飾包括例如失活的酸性海藻糖酶基因、過表達木酮糖激酶、和/或過表達熱激蛋白104。
文檔編號C12P7/06GK102119218SQ200880120927
公開日2011年7月6日 申請日期2008年12月9日 優(yōu)先權日2007年12月13日
發(fā)明者奧萊納·P·伊修克, 安德烈·A·希博尼, 安德烈·Y·沃羅諾夫斯基, 查爾斯·A·阿巴斯 申請人:阿徹-丹尼爾斯-米德蘭德公司