一種酵母重組表達可溶性中國對蝦swd抗菌肽的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種酵母重組表達可溶性中國對蝦SWD抗菌肽的方法，屬于基因工程
技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著抗生素的廣泛應(yīng)用甚至濫用，抗生素殘留和細菌耐藥性問題越來越受到全世 界的關(guān)注，盡快研發(fā)新型的抗菌藥物來替代傳統(tǒng)抗生素也成為世界性的攻關(guān)課題。
[0003] 抗菌肽是上世紀(jì)70年代在昆蟲體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一類具有抗菌作用的小分子多肽，在 大多數(shù)生物體內(nèi)都有存在，它在無脊椎動物抵抗細菌、病毒、真菌等病原菌入侵中發(fā)揮著非 常重要的作用?？咕囊蚱淇咕V廣、不易產(chǎn)生耐藥性、對正常真核細胞無毒害等優(yōu)勢，除 了可以用于藥業(yè)，還可以用于食品、畜牧、水產(chǎn)養(yǎng)殖、日用化工等領(lǐng)域，所以，抗菌肽產(chǎn)品的 研發(fā)不僅對促進經(jīng)濟和社會的發(fā)展意義重大，而且也成為了抗生素替代品新藥研發(fā)的熱 點。
[0004] 盡管抗菌肽表現(xiàn)出巨大的新藥發(fā)展?jié)摿?，但大多?shù)抗菌肽作為藥物生產(chǎn)還存在著 很多問題，比如無蛋白酶抑制活性而容易被蛋白酶水解、生物體內(nèi)含量太低直接從生物組 織中分離純化困難、原核表達的重組蛋白難溶、產(chǎn)量與活性不高等。目前，開發(fā)成功的抗菌 肽藥物還非常少。
[0005] 2007年，在中國對蝦中發(fā)現(xiàn)了 一種含單一乳清酸性蛋白結(jié)構(gòu)域的抗菌肽（a single whey acidic protein domain-containing peptide，SWD)，具有廣譜抗菌和蛋白酉每 抑制活性雙重功能，顯示出很好的藥物研發(fā)前景。山東大學(xué)的王金星教授公開了該基因的 序列（見專利20051004458888)，并進行了原核表達。
[0006] 然而，原核表達產(chǎn)生的SWD重組蛋白是以不溶的包涵體形式存在(見論文Jia Y P， Sun Y D, Wang Z H, Wang Q, Wang X ff, Zhao X F, Wang J X. A single whey acidic protein domain (SffD)-containing peptide from fleshy prawn with antimicrobial and proteinase inhibitory activities. Aquaeulture, 2008, 284: 246-259)，要想利 用它必須經(jīng)過復(fù)雜的變性、復(fù)性步驟，既降低了產(chǎn)率，也增加了工業(yè)化生產(chǎn)難度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明旨在克服原核表達方法的不足，提供一種畢赤酵母重組表達可溶性SWD抗 菌肽的方法，可以簡單方便地生產(chǎn)SWD抗菌肽，利于SWD抗菌肽產(chǎn)品的產(chǎn)業(yè)化與應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明的技術(shù)方案包括畢赤酵母重組表達載體的構(gòu)建、酵母轉(zhuǎn)化與陽性表達菌株 的篩選、SWD重組蛋白在畢赤酵母中的高密度分泌表達與純化、表達蛋白的活性檢測與應(yīng) 用。
[0009] (1)畢赤酵母重組表達載體的構(gòu)建：根據(jù)公開的中國對蝦SWD抗菌肽基因的CDNA 序列（GenBank接收號EF216349)，設(shè)id 對上下游引物swd_f與swd_r，（所述兩個引物的 5'端分別引入及I與Abi I酶切位點，同時，在下游引物swd-r的5'端引入6個組氨酸 密碼子標(biāo)簽）；以其為模板，PCR擴增sro基因片段，將sro基因片段與表達載體pGAPZa -A 分別用此冰I與Afci I雙酶切，把酶切產(chǎn)物純化連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn) 化子在含有0. lmg/ml的Zeocin的低鹽LB平板上生長，經(jīng)PCR篩選陽性克隆、搖菌提質(zhì)粒、 進行PCR與測序驗證質(zhì)粒中插入的基因序列正確后，即為構(gòu)建好的iJ/pGAPZ a -A重組表 達質(zhì)粒。 (2) 酵母轉(zhuǎn)化與陽性表達菌株的篩選：新制備畢赤酵母GS115感受態(tài)細胞，用BspH I 酶切構(gòu)建好的srJ/pGAPZ a -A重組表達質(zhì)粒，使其線性化，酚氯仿抽提并乙醇沉淀回收線 性化的質(zhì)粒，用脈沖電轉(zhuǎn)化儀電轉(zhuǎn)化新制備的畢赤酵母GS115感受態(tài)細胞，然后接種至含 有0. lmg/ml的Zeocin的YPD平板上，PCR篩選陽性克隆，轉(zhuǎn)接陽性克隆到含0. lmg/ml的 Zeocin的YH)液體培養(yǎng)基里，30°C，270rpm振蕩培養(yǎng)24h，按1:100比例轉(zhuǎn)接到新的YPD 液體培養(yǎng)基中，同樣條件下繼續(xù)培養(yǎng)72h，離心收集酵母發(fā)酵液上清，經(jīng)TCA沉淀的上清用 SDS-PAGE檢測，有SWD目標(biāo)蛋白表達帶的陽性克隆即為σ -J/GS115陽性表達菌 株。 (3) SWD重組蛋白的表達與純化：將篩選出的陽性表達菌株接種到含Zeocin 0.1 mg/ m的YH)液體培養(yǎng)基中，30°C，270rpm振蕩培養(yǎng)至12h，按1:100比例轉(zhuǎn)接到含Zeocin 0. lmg/ml的YPD液體培養(yǎng)基中，同樣條件下繼續(xù)培養(yǎng)24h，離心收集細胞，制備種子，轉(zhuǎn) 接到新鮮YH)培養(yǎng)基里，同樣條件下繼續(xù)培養(yǎng)到表達高峰出現(xiàn)，將發(fā)酵液12000rpm離心 15min，4°C，收集上清，可以經(jīng)凍干濃縮，用SDS-PAGE檢測，有表達重組SWD抗菌肽的上清也 可以經(jīng)His-tag凝膠親和純化柱純化，獲得比較純和比較濃的SWD重組蛋白。
[0010] (4)表達蛋白的活性檢測：1)抑菌活性檢測：將濃縮的含SWD重組蛋白的發(fā)酵上 清液抽濾除菌為待測液，取10 μ 1待測液浸透直徑約〇. 5cm的濾紙片，加蓋到菌板（由處于 對數(shù)期的菌液8 μ 1與8ml的PB培養(yǎng)基混勻制成)上，37°C培養(yǎng)18h，揭掉濾紙片，結(jié)果發(fā)現(xiàn) 發(fā)酵上清液對多種革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌有抑菌活性，出現(xiàn)了抑菌圈。2)抑蛋白酶 活性檢測：接種枯草芽孢桿菌于5ml液體LB中，37°C搖床培養(yǎng)12h，稀釋后取10 μ 1涂LB 平板，37°C過夜培養(yǎng)長出單菌落。挑枯草芽孢桿菌的單菌落于奶粉固體培養(yǎng)基(脫脂奶粉和 瓊脂粉各1%)上，取10 μ 1待測液浸透直徑約〇. 5cm的濾紙片，蓋到菌落上，28°C培養(yǎng)24h， 結(jié)果有抑蛋白酶的透明帶。也可以用96孔酶標(biāo)板法檢測待測液對枯草蛋白酶A的抑制活 性。本發(fā)明的畢赤酵母高密度分泌表達的SWD重組蛋白不僅對金黃色葡萄球菌、藤黃微球 菌、枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、大腸桿菌、綠膿桿菌有抑菌活性，還對枯草芽孢桿菌生長 過程中分泌的蛋白酶以及枯草蛋白酶A酶制劑有抑制活性。
[0011] 畢赤酵母表達系統(tǒng)是應(yīng)用廣泛的一種真核表達系統(tǒng)，可胞外表達外源蛋白。相比 大腸桿菌等原核表達系統(tǒng)，它具有完整的蛋白表達、加工和修飾功能，而相比桿狀病毒、哺 乳動物細胞的表達系統(tǒng)，它又具有培養(yǎng)成本低、產(chǎn)量高、便于產(chǎn)物分離純化等優(yōu)點。酵母表 達載體pGAPZ a -A是一種非誘導(dǎo)分泌型表達載體，表達的融合蛋白的N-端帶有釀酒酵母 的α-因子分泌信號肽，能夠使外源蛋白分泌到培養(yǎng)基中，且不需要甲醇誘導(dǎo)，而且，表達 的蛋白在分泌中能夠自發(fā)切除所帶的α-因子分泌信號肽，獲得純的外源蛋白，另外，含有 甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動子（GAP)，比以往的醇氧化酶（AOX)啟動子表達重組蛋白的水 平高，還帶有Zeocin抗性標(biāo)記，可以進行插入基因的高拷貝篩選。因此，把外源基因重組到 pGAPZ a -A中，再利用畢赤酵母表達外源蛋白，具有高表達、高穩(wěn)定、高分泌的特點。另外，畢 赤酵母自身蛋白分泌量少，高活性外源蛋白的分泌量大，有利于外源蛋白的分離純化，加上 培養(yǎng)基價格低廉，便于實現(xiàn)工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)。
[0012] 本發(fā)明的優(yōu)點在于建立了一種酵母重組表達可溶性中國對蝦SWD抗菌肽的方法。 本發(fā)明通過酵母發(fā)酵直接把SWD重組蛋白分泌在酵母的發(fā)酵液里，省去了添加誘導(dǎo)劑誘導(dǎo) 表達的繁雜步驟，使SWD重組蛋白便于工業(yè)化生產(chǎn)，獲得的產(chǎn)品也避免了誘導(dǎo)劑的毒性，可 以直接利用，比如用作飼料添加劑應(yīng)用到畜禽、水產(chǎn)等養(yǎng)殖業(yè)，也可以通過SWD重組蛋白上 的His標(biāo)簽進行親和層析純化，獲得更純的產(chǎn)品應(yīng)用到食品、衛(wèi)生、日用化工與醫(yī)藥業(yè)。
【附圖說明】
[0013] 圖1為用載體前引物a -Factor與基因后引物swd-r進行PCR鑒定連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 DH5a 的陽性克隆。其中，泳道 1 為 DNA marker (100, 250, 500, 750 最亮，1000, 2000bp)。 泳道2~13為301bp的克隆PCR產(chǎn)物。
[0014] 圖2為本發(fā)明的sro/pGAPZ a -A重組質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定的結(jié)果。其中，泳道1為載 體前引物a -Factor與swd-r基因后引物的擴增帶，2為基因特異引物swd-f與swd-r的 擴增帶，3為載體后引物3' A0X-