專利名稱：利用改進的酶再循環(huán)由木質纖維素生物質生產甜汁的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及被稱作“第二代”生物燃料的生物燃料的生產。其涉及一種甜汁的生 產方法，其中木質纖維素基質的酶促水解構成相關酶的使用和再循環(huán)的改進。因此，該得到 的甜汁被輸送到醇發(fā)酵階段，然后輸送到蒸餾階段，以生產來自生物質的醇。
背景技術：
木質纖維素生物質資源是一種相當可觀的可再生能量源，并且其由農業(yè)和林木殘 留物或由木質轉化副產物以及專用作物(木質的或草本的植物)得到。木質纖維素材料由 交聯(lián)為復雜的網絡的三種主要成分構成。這些成分是纖維素、半纖維素、木質素。它們各自 的比例根據生物質的確切來源而變化。由纖維素得到可發(fā)酵糖的常用工藝為酶促水解。將纖維素降解為葡萄糖要求三種 酶的協(xié)同作用，纖維素酶根據其活性分為-內切葡聚糖酶，在纖維素的非結晶帶的水平上隨機切割纖維素，-外切葡聚糖酶(或當它們生產纖維二糖時為纖維二糖水解酶)，逐步對纖維素鏈 的游離端起作用，釋放葡萄糖或纖維二糖，- β -葡萄糖苷酶(或纖維二糖酶)，將可溶的纖維糊精和纖維二糖水解為葡萄糖?，F(xiàn)在，限制該方法的工業(yè)發(fā)展的主要障礙之一在于生產纖維素酶伴隨的高成本。 為了提高商業(yè)的酶混合物的活性，有文獻描述用葡萄糖苷酶補充纖維素酶，以此消除 公知的纖維二糖對內切_和外切葡聚糖酶的活性的抑制效果。為了減少所使用的酶的量，已經提出各種方法以再循環(huán)這些酶。在該酶促水解工 序結束時，該酶在水解產物中部分地是游離形式，部分地結合至固體殘留物。在本申請人提交的專利FR-B-2，608，625中，提供一種在于回收大部分酶的方法 游離的酶通過吸附在待轉化的新的基質上而被回收，而結合的酶通過使固體殘留物與新的 基質重新接觸而得到重新使用。在用葡萄糖苷酶補充纖維素酶以提高酶混合物的活性 的情況中，但是該方法具有以下不足在再循環(huán)后，伴隨纖維二糖的累積，發(fā)現(xiàn)顯著的活性 損失(Ramos et al，Applied Biochemistry and Biotechnology，1994，45 (6)，193-207)。 事實上，該方法不能有效地再循環(huán)游離的β -葡萄糖苷酶，該酶對木質纖維素基質具有非 常弱的親和力。Woodward et al.描述了一種用承載的β _葡萄糖苷酶補充商業(yè)的纖維素酶的方 法("Use of Immobilized β -Glucosidase in the Hydrolysis ofCellulose，，，1993,ACS symposium series，533，240-250)，其在纖維素向葡萄糖的轉化中，重新使用數次β -葡萄 糖苷酶而無任何活性損失或明顯的降低。葡萄糖苷酶的固定化使得它們的穩(wěn)定性顯 著提高Aguadoet al. (Biotechnology and Applied Biochemistry, 1995,17 (1), 49-55) 表明，將繩狀青霉菌(Penicillium fimiculosum) β -葡萄糖苷酶固定于尼龍粉末可以得 到在50°C下1500分鐘的穩(wěn)定的活性，而游離狀態(tài)的相同的酶從40°C開始失活。黑曲霉 (Aspergillus niger) β -葡萄糖苷酶在游離狀態(tài)的穩(wěn)定的上限是45°C，而在Eupergit C上固定化形式中，它們的活性保持穩(wěn)定的上限是65°C (Tu et al,2006, Biotechnology Letters, 28 (3)，151-156)。另一方面，在這樣的溫度下，該纖維素酶幾乎不表現(xiàn)出穩(wěn)定性并 且它們快速地失活，這影響水解效率。再循環(huán)承載的β-葡萄糖苷酶要求將它們由包含固體殘留物的反應混合物中抽 提，當纖維素酶和β-葡萄糖苷酶在相同反應器中使用時其難以進行。另一方面，在木質素上非生產性的吸附葡萄糖苷酶是限制酶促水解的公知的 原因。一種公知的用于限制該吸附的方法在于添加表面活性劑和/或蛋白質例如牛血清白 蛋白(BSA) (Yang et al.，2006，Biotechnology and Bioengineering，94 (4)，611-617)。通過實施本發(fā)明的甜汁生產方法可以改善這些主要限制。

發(fā)明內容
本發(fā)明的方法在于通過在反應器中用承載的葡萄糖苷酶進行纖維素酶的補 充經由木質纖維素基質的酶促水解來生產甜汁，所述反應器獨立于木質纖維素酶促水解反 應器，在反應器(1)的出口得到的水解產物Hl被輸送到分離裝置，以在輸送到反應器(2) 之前抽提纖維素酶。本發(fā)明還公開一種設備，在其中進行該酶促水解。


圖1是對應于木質纖維素轉化階段的本發(fā)明的方法的流程圖。圖2是對應于連續(xù)的甜汁生產階段的本發(fā)明的方法的流程圖。圖3對應于以分批模式實施本發(fā)明的甜汁生產方法的流程圖，圖3Α對應于排空兩 個反應器的階段，圖3Β是填充反應器的階段。圖4是對應于完全排空木質纖維素酶促水解反應器的階段的本發(fā)明的方法的流 程圖。
具體實施例方式本發(fā)明涉及一種由木質纖維素基質通過酶促水解生產甜汁的方法，其中纖維素酶 的補充是在反應器(2)中用承載的葡萄糖苷酶進行的，所述反應器(2)獨立于木質纖 維素酶促水解反應器(1)，其中預先進行了預處理的所述基質與纖維素酶溶液接觸，在反應 器(1)的出口得到的水解產物Hl輸送到獨立的裝置，以使在輸送到反應器(2)之前抽提纖 維素酶，所述方法包括木質纖維素轉化階段、甜汁生產階段和完全排空反應器的階段。本發(fā)明的方法顯著地通過使由反應介質中抽提葡萄糖苷酶變得容易來提高 酶的再循環(huán)。本發(fā)明的方法的另一個優(yōu)點在于，能夠分離兩個反應器的操作條件(溫度和可能 地PH值)，并由此能夠在葡萄糖苷酶特有的第二反應器中優(yōu)化操作條件。該纖維素酶 在反應器(1)的出口處被抽提，而且它們不被輸送到第二反應器。而且，在本發(fā)明的方法中，該承載的葡萄糖苷酶不與木質素接觸，所述木質素 保留在專用于木質纖維素酶促水解的反應器中。本發(fā)明的方法允許由木質纖維素基質生產富含葡萄糖的甜汁。
所使用的基質選自麥稈、木材、森林作物、生產醇的作物、糖類作物和谷類作物殘 留物、造紙工業(yè)殘留物、纖維素和木質纖維素材料轉化產品。在本發(fā)明的方法中，在反應器(1)的出口處得到的水解產物(Hl)被輸送到超濾膜 (7)，以抽提該纖維素酶。本發(fā)明的甜汁生產方法包括木質纖維素轉化階段、甜汁生產階段和完全排空反應 器的階段。為實施本發(fā)明的方法，使預先預處理的木質纖維素基質(S)在反應器(1)中在稀 釋、溫度和PH條件有利于木質纖維素的酶促水解的條件下與纖維素酶溶液(E)接觸。預處 理根據本領域技術人員公知的技術進行，以提高基質對酶促水解的敏感性。當基質開始液化(圖1)時，木質纖維素轉化階段產生水解產物，該水解產物被連 續(xù)的由反應器(1)抽提入過濾介質(3)和分離設備(7)，由此在反應混合物中存在的固體部 分(酶促水解固體殘留物)和纖維素酶保留在反應器(1)中。在通過過濾介質(3)和分離 設備(7)后，包含不可發(fā)酵的可溶性葡萄糖低聚物的水解產物(Hl)被注入反應器(2)，在其 中在溫度條件有利于可溶性葡萄糖低聚物(纖維二糖、纖維三糖...)水解為葡萄糖的條件 下，它與承載的葡萄糖苷酶接觸。以在反應器(2)的出口處得到的水解產物中殘留的 可溶性低聚物比例非常低(優(yōu)選為低于lg/Ι)的方式，調節(jié)甜汁(Hl)在反應器(2)中的保 留時間。反應器(1)的溫度優(yōu)選為40°C 55°C的范圍，反應器(2)的溫度為40°C 70°C。反應器⑴和反應器(2)的溫度和/或pH操作條件可以不同或相同。反應器(1)和反應器(2)的操作條件優(yōu)選是不同的。更優(yōu)選的是，反應器(1)的 溫度為45°C 55°C的范圍，并且反應器(2)的溫度為60°C 70°C的范圍。分離裝置(7)優(yōu)選為超濾膜。在該膜的出口處，不含纖維素酶的滲透液被輸送到 反應器(2)，而截留物與離開反應器(2)的流(H2)混合。該實施方式明顯允許例如在比通 常用于纖維素酶高的溫度下操作反應器(2)。缺乏可溶性低聚物(H2)的水解產物以在反應混合物中存在的承載的β-葡萄糖 苷酶保留在反應器(2)中的方式被連續(xù)地由反應器(2)抽提入過濾介質(4)根據用于固 定化該承載的酶而選擇的載體粒徑選擇過濾介質(4)。在轉化階段，流(Η2)的主要部分，優(yōu)選流(Η2)的全部被重新注入反應器(1)。當認為充分轉化時，S卩，當進行測定表明在水解產物(Η2)中達到期望的糖濃度 時，開始圖2和3所示的甜汁生產階段。甜汁生產階段能夠根據兩種模式進行連續(xù)模式或分批模式。根據第一實施方式，該生產階段以連續(xù)模式進行。來自反應器(2)的水解產物流 (Η2)被分成至少兩股流(H2a)和(H2b)。流(H2a)被連續(xù)地投入接觸器(5)。該水解產物(H2a)在設備(5)中與新的木質 纖維素基質(S)接觸，以使在水解產物(H2a)中存在的纖維素酶吸附在新的基質上。缺乏可溶性低聚物的流(H2b)被重新注入反應器(1)，由此可以提高反應器中的 混合條件并且可以通過誘導的稀釋效應提高纖維素酶的活性，事實上可溶性低聚物已知為 纖維素酶活性抑制產物。由接觸器(5)的纖維素酶浸漬的新的基質(SE)在被輸送到反應器⑴之前與水解產物(H3)分離。在接觸器(5)的出口處收集的水解產物(H3)對應于通過該方法生產的甜汁流。根據本發(fā)明的方法的第二實施方式，生產階段以分批的模式在兩步中進行(圖3A 和3B)，第一步在于排空反應器，第二步在于重新開始它們。反應器首先被排空來自反應器(2)的流(H2)被輸送到接觸器(5)，在其中它與 新的木質纖維素基質(S)接觸，以使在分離裝置(7)的出口處投入水解產物(H2)的纖維素 酶吸附在新的基質上。在接觸器的出口處得到的水解產物(H3)對應于通過該方法生產的 甜汁流。在反應器排空階段結束時，生產階段以分批模式重新開始(圖3B)，通過將纖維素 酶浸漬的新的基質投入反應器(1)。當在反應器(1)中累積的固體殘留物的量變的過大時，該反應器被完全排空(圖 4)?；厥盏姆磻旌衔锉惠斔偷竭^濾介質(6)，以分離對應于酶促水解殘留物的固體部分 (殘留物R)，然后輸送到分離裝置(7)，在其出口處得到液體部分(H4)。該液體部分(H4)為甜汁。為了優(yōu)化葡萄糖的生產，如果該部分(H4)包含殘留的 可溶性低聚物，在抽提它之前可以將其輸送到反應器(2)。在排空階段通過該方法生產的流對應的部分(H4)能夠在酶促水解起始階段可能 地被部分地或全部地重新引入反應器(1)，通過重新引入新鮮的纖維素酶和新的基質，或者 其可以被用于在接觸器(5)中浸漬新的基質。本發(fā)明還描述一種設備，在其中實施上述的甜汁生產方法。所述設備用于由木質纖維素基質通過酶促水解生產甜汁，其包括_至少一個第 一木質纖維素酶促水解反應器(1)，所述反應器(1)裝備了以下用于引入基質和纖維素酶 溶液的至少一條管線，用于排出轉化的汁(Hl)并將其輸送到在反應器(1)出口配置的至少 一個過濾介質(3)的至少一條管線，和至少一個分離裝置(7)，其優(yōu)選是用于由水解產物抽 提纖維素酶的超濾膜，-可能地在第一反應器出口處的熱交換器(附圖未示出)，_至少一個第二反應器(2)，其包括承載的β-葡萄糖苷酶，通過至少一條管線連 接所述分離裝置(7)，所述反應器(2)在其出口處裝備了至少一個過濾介質(4)和用于抽提 流(Η2)的至少一條管線，所述流(Η2)由缺乏可溶性低聚物的水解產物構成，-用于將至少部分流(Η2)投入接觸器(5)的至少一條管線，和用于將至少部分流 (Η2)返回到反應器(1)的至少一條管線，-至少一個接觸器(5)，其裝備了以下用于引入新的基質的至少一條管線，用于 抽提所生產的甜汁(Η3)的至少一條管線，和用于排出纖維素酶浸漬的新的基質并將其投 入反應器(1)的至少一條管線。所述設備包含在完全排空反應器(1)的階段使用的至少一個過濾介質(6)，用于 抽提固體殘留物R的至少一條管線，用于抽提所生產的甜汁流(Η4)的至少一條管線，和可 能地用于將流(Η4)投入反應器(2)的至少一條管線。反應器(1)可以是機械攪拌罐，也可以不是。攪拌可以全部地或部分地通過在反 應器(1)周圍的甜汁循環(huán)回路提供(流H2b或流H2)，其使用高注射速度。允許由反應混合物抽提液體部分的過濾介質(3)和(6)適合于固體木質纖維素基質的粒徑?？梢允褂帽绢I域技術人員公知的任何設備以達到該分離安裝于反應器內部或 外部的過濾系統(tǒng)，包含聯(lián)合的逆洗或清潔系統(tǒng)(濾棒、機械刮擦格柵.· ·)，將固體部分重新 注入反應器的外部分離模塊(壓濾機、離心機···)。這些設備的尺寸應當適合于所處理的 體積。這些過濾介質(3)、(6)和分離設備(7)可以可能地是一個且是相同的。在反應器(2)中固定化的酶的實施可以在固定床或移動床，或在攪動漿料型反應 器中進行。過濾介質(4)的目的在于在反應器(2)中保持該承載的酶。在固定床的情況中，其是優(yōu)選的實施方式，該介質(4)可以是在反應器中配置的 格柵或防護床。對于其它實施方式(移動床或攪動漿料型反應器)，上述用于過濾介質(3)的設備 也可適用于過濾介質(4)。為了補償失活承載的β -葡萄糖苷酶，當使用移動或漿料床時，可以隨著連續(xù)地 補充新鮮的酶，排出失活的酶。在固定床的情況中，例如在排空反應器(1)和(2)的階段， 以分批模式通過新的酶代替失活的酶。在設備(5)中的纖維素的再循環(huán)可以通過使水解產物(H2a)或(H4)與預處理的 新鮮的木質纖維素基質接觸進行，所述接觸可以根據本領域技術人員公知的任何方法，例 如通過滲透或再懸浮和分離進行，以通過吸附回收纖維素酶。因此，設備(5)可以是與用于 構成反應器(1)和過濾介質(3)的部件相似的設備，其中可以進行基質再懸浮和過濾。設備(5)還可以是通過以分批模式或優(yōu)選的是以連續(xù)模式使液體在固體上滲透 來實現(xiàn)液-固接觸的任何技術類型。在滲透接觸的情況中，設備(5)也可以包括壓濾系統(tǒng)， 以減少重新引入反應器(1)的甜汁的量。承載的或固定化的葡萄糖苷酶的制備由通過真菌菌株制造的葡萄糖 苷酶進行，所述真菌菌株屬于木霉屬(Trichoderma)，曲霉屬(Aspergillus)，青霉屬 (Penicillium)或裂褶菌屬(Schizophyllum)，例如通過黑曲霉(Asperigillus niger)，繩 狀青霉菌(Penicilliumfuniculosum)或雷氏木霉(Trichoderma reesei)。這些菌株可以 是基因修飾的。它們的固定化使用本領域技術人員公知的任何類型的載體(固體或凝膠) 進行(樹脂、EupergitC、活化碳納米管、用聚合物基質涂布的氧化鋁、活化的尼龍粉末、藻 酸鈣、殼聚糖...)。以下實施例說明本發(fā)明，但不限定本發(fā)明的范圍。實施例1 根據專利FR-B-2，608，625的教導，利用酶再循環(huán)的酶促水解小麥稈 (非承載的葡萄糖苷酶)在硫酸存在下，通過蒸氣噴發(fā)預處理小麥稈，以促進其消化性，即對酶促水解的反 應性。該預處理并洗滌的樣品組成如下56. 5%纖維素，14. 6%半纖維素，25. 6%木質素和 可提取化合物(以％干物質表示)。在用Novozyme銷售β -葡萄糖苷酶(參考號SP-188) 補充的SAF-ISIS銷售的商業(yè)的纖維素酶(參考號XL-E508)的存在下，進行該樣品的酶促 水解。在該試驗中的使用的纖維素酶的量用國際濾紙單位(FPU)表示，葡萄糖苷酶的 量用國際單位(IU) (1IU =每分鐘由纖維二糖產生1 μ mol葡萄糖)表示。第一系列試驗(Al，Bi，Cl分別對應于在條件1下進行的試驗A，B，C)在3個攪拌 反應器中進行，所述反應器終體積為1升，各含有IOOg基質(用干物質表示)，480FPU (纖維素酶)，1000 υ(β-葡萄糖苷酶)。ρΗ值調節(jié)為4.8并且溫度調整為501。在水解72小時 后，通過離心分離固體殘留物并且在水解產物中形成的糖通過高效液相色譜(HPLC)測定。 在與第一系列試驗相同的條件下進行第二系列試驗(Α2，Β2, C2)，除了以下方面-試驗Β2不添加新鮮酶，但是通過使在試驗Bl結束時獲得的水解產物與新的基質 再接觸來使可溶的酶再循環(huán)，并且在試驗Bl結束時獲得的固體殘留物的100%被再循環(huán)，-試驗C2通過加入1000IU的新鮮β-葡萄糖苷酶與試驗Β2同樣地進行。在與第二系列試驗嚴格相同的條件下進行第三和最后系列試驗(A3，Β3, C3)。得到的結果如表1所示。由在最終水解產物中存在的測定的糖測量每個系列試驗 后所生產的糖。對于系列B和C，通過對酶促水解開始時存在的糖計量來進行在第2和第3 系列試驗所生產的糖的定量(在固體殘留物中所含的糖)。
權利要求
一種由木質纖維素基質通過酶促水解生產甜汁的方法，其中纖維素酶的補充是在反應器(2)中用承載的β 葡萄糖苷酶進行的，所述反應器(2)獨立于木質纖維素酶促水解反應器(1)，其中預先進行了預處理的所述基質與纖維素酶溶液接觸，在反應器(1)的出口得到的水解產物H1輸送到獨立的裝置，以在輸送到反應器(2)之前抽提纖維素酶，所述方法包括木質纖維素轉化階段、甜汁生產階段和完全排空反應器的階段。
2.根據權利要求1所述的方法，在反應器(1)的出口得到的水解產物輸送到超濾膜 (7)，以抽提纖維素酶。
3.根據權利要求1或2任一項所述的方法，其中在轉化階段來自反應器(2)的水解產物流(Η2)的主要部分，優(yōu)選來自反應器(2)的水解產物流(Η2)的全部被重新注入反應器 ⑴。
4.根據權利要求1 3任一項所述的方法，其中甜汁生產階段以連續(xù)或分批模式進行。
5.根據權利要求1 4任一項所述的方法，其中甜汁生產階段以連續(xù)模式進行，水解 產物(Η2)被分成至少兩股流(H2a)和(H2b)，流(H2a)被連續(xù)地投入接觸器(5)，并且流 (H2b)被重新注入反應器(1)。
6.根據權利要求5所述的方法，其中流(H2a)在設備(5)中與新的木質纖維素基質接觸。
7.根據權利要求6所述的方法，其中來自接觸器(5)的用纖維素酶(SE)浸漬的新的基 質在被輸送到反應器(1)之前與水解產物(H3)分離。
8.根據權利要求1 4任一項所述的方法，其中甜汁生產階段以分批模式進行，第一階 段在于排空反應器，在此階段來自反應器(2)的水解產物流(H2)被輸送 到接觸器(5)，在其 中它與新的木質纖維素基質接觸，并且第二階段在于通過將用纖維素酶(SE)浸漬的新的 基質投入反應器(1)重新開始。
9.根據權利要求1 8任一項所述的方法，其中在完全排空反應器(1)的階段，在反應 器(1)中包含的反應混合物被輸送到過濾介質(6)，在其中固體殘留物(R)被分離，然后輸 送到分離裝置(7)，在其出口由甜汁構成的液體部分(H4)被獲得并且可能地被輸送到反應 器(2) ο
10.根據權利要求9所述的方法，其中在酶促水解起始階段通過重新引入新鮮的纖維 素酶和新的基質，液體部分(H4)被全部地或部分地重新引入反應器(1)。
11.根據權利要求9所述的方法，其中液體部分(H4)被輸送到接觸器(5)以浸漬新的基質。
12.根據權利要求1 11任一項所述的方法，其中反應器(1)和(2)的溫度和/或pH 操作條件是不同的。
13.用于由木質纖維素基質通過酶促水解生產甜汁的裝置，其包括-至少一個第一木質纖維素酶促水解反應器(1)，所述反應器(1)裝備了以下用于引 入基質和纖維素酶溶液的至少一條管線，用于排出轉化的汁(Hl)并將其輸送到在反應器 (1)出口配置的至少一個過濾介質(3)的至少一條管線，和至少一個分離裝置(7)，其優(yōu)選 是用于由水解產物抽提纖維素酶的超濾膜， -可能地在第一反應器出口處的熱交換器，-至少一個第二反應器(2)，其包括承載的葡萄糖苷酶，通過至少一條管線連接至少一個分離裝置(7)，所述反應器(2)在其出口處配備了至少一個過濾介質(4)和用于抽提 流(H2)的至少一條管線，所述流(H2)由缺乏可溶性低聚物的水解產物構成，-用于將至少部分流(H2)投入接觸器(5)的至少一條管線，和用于將至少部分流(H2) 返回到反應器(1)的至少一條管線，-至少一個接觸器(5)，其裝備了以下用于引入新的基質的至少一條管線，用于抽提 所生產的甜汁(H3)的至少一條管線，和用于排出纖維素酶浸漬的新的基質并將其投入反 應器(1)的至少一條管線。
14.根據權利要求13的裝置，其特征在于，其包含在完全排空反應器(1)的階段使用的 至少一個過濾介質(6)，用于抽提固體殘留物(R)的至少一條管線，用于抽提所生產的甜汁 流(H4)的至少一條管線，和可能地用于將流(H4)投入反應器(2)的至少一條管線。
15.根據權利要求13或14任一項所述的設備，其中包含β-葡萄糖苷酶的反應器(2) 為移動床或攪動漿料型反應器，或固定床反應器。
16.根據權利要求15所述的設備，其中過濾介質(4)是在反應器(2)中配置的格柵或 防護床。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種由木質纖維素基質生產甜汁的方法，其中，酶促水解通過在反應器中用承載的β-葡萄糖苷酶補充纖維素酶進行，所述反應器獨立于木質纖維素酶促水解反應器。
文檔編號C12P7/02GK101998996SQ200880120889
公開日2011年3月30日 申請日期2008年12月10日 優(yōu)先權日2007年12月20日
發(fā)明者D·卡薩納夫, N·洛佩茲弗雷拉 申請人:Ifp公司