專利名稱：通過影響先天性免疫系統(tǒng)改進非病毒輸送系統(tǒng)的轉(zhuǎn)染結(jié)果的制作方法
通過影響先天性免疫系統(tǒng)改進非病毒輸送系統(tǒng)的轉(zhuǎn)染結(jié)果
現(xiàn)有技術(shù)當機體對于感染性或者免疫學(xué)攻擊呈現(xiàn)免疫應(yīng)答時(Luke A. et al. ；Spektrum der Wissenschaft,August 2005,pages 68-75)，在先天性免疫應(yīng)答(先天性免疫)與獲得 性免疫應(yīng)答(抗原特異性獲得性免疫)之間有區(qū)別。獲得性免疫僅在感染病原體的事件中發(fā)生。這是一種記憶性免疫，由此由相同病 原體導(dǎo)致的二次感染通常不引起該疾病的發(fā)作。這是疫苗所基于的原理。如果僅存在獲得 性免疫，生物體則完全無對抗第一次感染的保護作用。然而不是這種情況，因為存在稱作先 天性免疫的非常原始的免疫，且在從果蠅至哺乳動物的范圍內(nèi)均發(fā)現(xiàn)這種免疫，甚至在植 物中也發(fā)現(xiàn)此免疫。先天性免疫是對抗病原體的第一道防線，且在進化期間是非常古老的系統(tǒng)。在先 天性免疫的情況中，所謂的病原體相關(guān)的分子模式(PAMP)的疾病相關(guān)分子模式由所謂的 Toll 樣受體(TLR)識另Ij (Heine H. et al.，Int. Arch. Allergy Immunol. 2003 ；130 ； 180-192 和 Uematsu S. et al.，J. Biol. Chem. 2007, May 25 ；282 (21) ；15319-23)以及由 RIG-I-樣 解旋酶(RLH)識別，且引發(fā)合適的炎癥和免疫反應(yīng)。結(jié)果，該生物體能區(qū)分自身和非自身物 質(zhì)。RLH在細胞溶質(zhì)內(nèi)遍在表達，在此其能識別在病毒感染情況下形成的dsRNA。TLR和RLH 屬于也稱作模式識別受體(PRR)的受體。Toll 樣受體(TLR)Toll樣受體最初在二十世紀九十年代中期發(fā)現(xiàn)(Zimmer A. et al. ；PNAS, 1999 ;96 (10) ,5780-5785)。其名稱得自由 Christiane NUsslein-Volhard 在黑腹果蠅 (Drosophila Melanogaster)中發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)，她將其命名為Toll。TLR蛋白類似該類型， 因此被稱作“Toll-樣”蛋白質(zhì)。它們是這樣的跨膜蛋白，具有細胞外“亮氨酸富集重復(fù)”結(jié) 構(gòu)域(LRR)以及與家族同源的細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。不同的TLR與不同的分子病毒和細菌成分選 擇性反應(yīng)，且通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)控制相應(yīng)的基因激活。在第一種情況中這通過所謂的適體 (adapter)分子及隨后通過最終激活轉(zhuǎn)錄因子(例如NF- κ B及IRF家族)的激酶發(fā)生，所 述激活轉(zhuǎn)錄因子通過其磷酸化或者那些轉(zhuǎn)錄因子的相應(yīng)細胞內(nèi)抑制劑而進行。最后，除了 大量具有抗微生物作用的特定基因之外，產(chǎn)生所謂的細胞因子。細胞因子反過來是獲得性 免疫的必要刺激物，且因此也將先天性免疫與獲得性免疫聯(lián)系起來。然而，對于配體識別、 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及信號傳送僅有初步認知。迄今為止已知13種不同的TLR(其中10種是人類TLR)，其數(shù)目足以識別從細菌至 真菌以及病毒的所有病原體。受體識別所有致病生物體共有的結(jié)構(gòu)，此外，還偶爾同時識別 許多組成成分，后者結(jié)構(gòu)不相似。例如，TLR4識別脂多糖，但是也識別紫杉醇(taxol)。迄 今為止還未知TLR怎樣能做到如此。TLR在物種與物種之間僅略有不同。迄今為止已知如下分子作為TLR的配體，其導(dǎo)致信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)的觸發(fā)TLRl 與TLR2形成異源二聚體，是來自酵母的三?；鞍缀徒湍妇厶堑氖荏w。TLR2
是某些肽聚糖、脂肽、糖脂和各種細菌的受體。TLR3 識別長dsRNA，在感染的細胞中病毒復(fù)制情況中發(fā)生。TLR4 是脂多糖(LPS，也稱作內(nèi)毒素)、各種外殼糖蛋白(也包括病毒的外殼糖蛋白)以 及紫杉醇的受體。LPS是細菌細胞壁的組成成分。TLR4受體發(fā)揮功能需要另外的膜結(jié)合蛋 白(TLR輔助蛋白)CD14，例如其結(jié)合LPS并提供給TLR4受體，與單獨CD14的結(jié)合不觸發(fā) 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)。TLR5 是鞭毛蛋白的受體，鞭毛蛋白是細菌借助其運動的纖毛(鞭毛)主要組成成分。TLR6 與TLR2形成異源二聚體，是二?；鞍缀湍承╇木厶堑氖荏w。一種特殊的脂蛋 白(MALP-2 =巨噬細胞激活脂肽)通過膜結(jié)合蛋白CD36(TLR輔助蛋白)的輔助得以檢測。TLR7 和 TLR8 是咪唑并喹啉和ssRNA/dsRNA的受體，例如RNA病毒的受體。TLR9 是細菌DNA或者非甲基化CpG基序的受體，其在許多細菌DNA中出現(xiàn)(比在哺乳 動物細胞中出現(xiàn)多20倍)。哺乳動物細胞中的CpG基序是高度甲基化的，結(jié)果是其可以被 區(qū)分。適用于細菌DNA的也適用于病毒DNA，其也通過TLR9檢測。細菌DNA的免疫刺激 性質(zhì)早在二十世紀八十年代即由Dr. Tokunaga研究小組報道。由Dr. Shizuo Akira領(lǐng)導(dǎo) 的小組鑒別TLR9受體是關(guān)聯(lián)受體(通過基因靶向澄清Toll-受體的作用及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級 !^,Robert Koch lecture by Dr.Shizuo Akira,General Press Information 2002 ；www, robert-koch. stiftung. de)。TLRlO 目前還未知的配體。TLRll ^fji^^it^^WicJSff(uropathogenic bacterium Escherichia coli) 和原生動物Toxoplasma gondii的profilin樣蛋白質(zhì)的受體。TLRl2 功能和配體仍未知。TLRl3 功能和配體仍未知。TLR 的位置TLR2、4、5和6特別位于單核細胞、天然殺傷細胞、肥大細胞或者骨髓樹突細胞 的漿膜中，而TLR7、8和9特別位于免疫細胞的內(nèi)涵體中(Siegmund-Schultze N.，www, aerzteblatt. de)。因此免疫應(yīng)答的激活需要通過胞吞作用和內(nèi)涵體的成熟而進行細胞內(nèi) 攝取。信號傳送在內(nèi)涵體區(qū)室內(nèi)開始。在TLR 3的情況中，表明其位于漿膜中，但是也有文 獻描述推測其位于內(nèi)涵體中。TLR通常成對起作用，且以各種組合出現(xiàn)在各種細胞類型中。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)
盡管各種TLR 的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(Perry Α. K. et al. ,Cell Research 2005 ；15(6)； 407-422 and Kawai Τ. et al. , J. Biochem. ；2007 ;141 ;137_145)具有一些相似性，但是 其也明確出現(xiàn)出相對較大的差異，最終導(dǎo)致不同的基因表達及因此不同的生物反應(yīng)。除了 TLR3之外，所有TLR傳送其信號至適體蛋白MyD88。MyD88在信號傳送中通過TLR/白細胞 介素-1受體起關(guān)鍵作用。TLR的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域與白細胞介素-1受體的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域呈現(xiàn)出顯 著相似性，因此該結(jié)構(gòu)域也被稱作Toll/IR-Ι受體結(jié)構(gòu)域(TIR)。例如，MyD88-缺陷的脾細 胞呈現(xiàn)出與白細胞介素-1、LPS或者CpG-DNA無反應(yīng)。此外，在MyD88_缺陷的細胞的情況 中，在與TLR2、TLR7、TLR9配體的反應(yīng)中觀測到無信號分子如NF- κ B或者MAP激酶激活。 這顯著表明TLR (除TLR3之外)的信號傳送對MyD88的競爭依賴性。其它適體分子是例如 TIRAP(含有適體蛋白(TLR1、TLR2、TLR4和TLR6)的Toll-白細胞介素_1受體(TIR)-結(jié) 構(gòu)域)、Mal (MyD88-適體樣分子)、TRIF (TLR3 和 TLR4)和 TRAM (TLR4)。除了適體分子之外，哪些蛋白質(zhì)也起作用依賴于所述TLR。簡而言之，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級 聯(lián)通常始于具有胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的在細胞表面的受體，該受體在具有合適配體時，通過胞質(zhì)適 體分子將其信號傳送至激酶，由此通過級聯(lián)激活轉(zhuǎn)錄因子。激活的轉(zhuǎn)錄因子位于細胞核，且 觸發(fā)蛋白質(zhì)主要是細胞因子的表達。通過TLR1/TLR2，TLR2/TLR2, TLR2/TLR6 的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)成對出現(xiàn)的受體在具有合適配體時，觸發(fā)相同信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)。最終激活轉(zhuǎn)錄因子 NF-kB和AP-1，其特別導(dǎo)致參與信號傳送的細胞因子、適體分子RAC-1、TIRAP, MyD88和 TRAF6 的表達。參與的激酶至少是 IRAKI、IRAK4、TAKUPI 3K、IKKa、ΙΚΚβ、IKK γ , JNK, Ρ38ΜΑΡΚ 禾口 ΜΚΚ。通過TLR4的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)受體需要膜結(jié)合蛋白CD14以充分發(fā)揮功能。CD14結(jié)合相應(yīng)的激動劑，并提供給受 體。所述受體在具有合適配體時，最終觸發(fā)轉(zhuǎn)錄因子NF-K B、AP-1、IRF3和IRF7的激活，由 此導(dǎo)致參與信號傳送的細胞因子、適體分子TIRAP、MyD88、TRAM、TRIF、TRAF3、TRAF6、NAPl 和 RIPl 的表達。參與的激酶至少是 IRAKl、IRAK4、TAKl、IKKa、ΙΚΚβ、ΙΚΚγ、ΙΚΚ ε、ΤΒΚ1、 ERK1、ERK2、JNK、ρ38ΜΑΡΚ、ΜΕΚ1、ΜΕΚ2 禾口 ΜΚΚ。 通過TLR5的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)受體在具有合適配體時，最終觸發(fā)轉(zhuǎn)錄因子NF- κ B和AP-I的激活，由此導(dǎo)致參與 信號傳送的細胞因子、適體分子MyD88和TRAF6的表達。參與的激酶至少是IRAK1、IRAK4、 TAKl、IKK a、IKK β、IKK γ、JNK、ρ38ΜΑΡΚ 禾口 ΜΚΚ。通過TLR10、11、12、13的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)受體在具有合適配體時，最終觸發(fā)轉(zhuǎn)錄因子NF- κ B和AP-I的激活，由此導(dǎo)致參與 信號傳送的細胞因子、適體分子MyD88和TRAF6的表達。參與的激酶至少是IRAK1、IRAK4、 TAKl、IKK a、IKK β、IKK γ 禾口 ΜΚΚ。通過TLR3的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)受體在具有合適配體時，最終觸發(fā)轉(zhuǎn)錄因子順-1^8、4 -1、11^3和IRF7的激活，再 次增加參與信號傳送的細胞因子、適體分子TRIF、TRAF6、TRAF3、NAPl和RIPl的表達。參 與的激酶至少是 IRAKI、IRAK4、TAK1、IKKa、ΙΚΚβ、IKK γ , IKK ε , TBKU PKR, PI Κ3、JNK、 Ρ38ΜΑΡΚ 禾口 ΜΚΚ。
通過TLR7、TLR8和TLR9的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)受體在具有合適配體時，最終觸發(fā)轉(zhuǎn)錄因子NF-K B、AP-I、IRFl、IRF5和IRF7的 激活，再次增加參與信號傳送的細胞因子、適體分子MyD88、TRAF6和TRAF3的表達。參與的 激Bl至少是 IRAKI、IRAK4、TAK1、IKK α、ΙΚΚβ、IKK γ、JNK、ρ38ΜΑΡΚ 禾Π ΜΚΚ。TLR有非常大的治療興趣。例如使用TLR激動劑在免疫接種或者在癌癥治療中作 為佐劑。例子包括通過TLR7/8激動劑咪喹莫特(imiquimod)/瑞喹莫德(resiquimod)治 療基底細胞癌，以及通過TLR2激動劑治療膀胱癌。TLR9受體通過合成的含有CpG的寡核苷 酸(CpG 7909和CpG 10101)激活，用以治療自身免疫疾病、癌癥和感染性疾病?；赥LR9 的治療策略可商購自Coley Pharmaceuticals οTLR7 和 TLR8 激動劑TLR7和TLR8受體的已知可商購的激動劑一般是咪唑并喹啉(SchSn etal.， Oncogene，2008，27，190-199)，如咪喹莫特(R837，1_(2_ 甲基丙基)_1Η_ 咪唑并[4，5_c] 喹啉-4-胺)、瑞喹莫德(R848，4-氨基-2-(乙氧基甲基)-a，a_ 二甲基-IH-咪唑并[4， 5-c]喹啉-1-乙醇)和GardiquimocKl-(4-氨基-2-乙基氨基甲基咪唑并[4，5_c]喹 啉-1-基)-2_甲基丙-2-醇)；鳥苷類似物例如洛索立賓(loxoribine) (7-烯丙基_7，8_二 氫-8-氧-鳥苷)及其它激動劑如溴匹立明(bropirimine) (2-氨基-5-溴-6-苯基-4-嘧 啶酮)。其它咪唑并喹啉在文獻中已經(jīng)有描述(Miller et al. ,Drug News&Perspectives, 2008，21(2)，69-87 ；Gorden etal.，J. Immunol.，2005，174，1259—1268 Jurk et al.，Eur. J. Immunol.，36，1815—1826 ；2006 ；Gorden et al.，J. Immunol.，2006，177，8164—8170)， 所述文獻在此并入作參考。一些同樣可商購的其它激動劑是噻唑并喹啉如CL075 (Gordon KB et al.，J. Immunol.，2005，174(3)，1259-68)和 CL097(Schindler U. et al.，Mol. Cell Biol.，1994，14 (9) ,5820-5831)以及鳥苷類似物艾沙托立賓(isatoribine) (7-硫代-8-氧 鳥苷)(Horsmans Y. et al.，Hepatology, 42 (3)，724-731)。TLR8的已知激動劑通常是ssRNA，特別是單鏈多尿苷以及具有富含U或者富含⑶ 序列的 ssRNA (Diebold et al. , Science, 2004, 303,1529-1531 ；Heil et al. , Science, 2004，303，1526-1529 ；Lund et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA,2004,101，5598-5603)， ssRNA也可以是硫代磷酸酯(phosphothioate)形式的。應(yīng)特別提及的是序列基序 UGUGU 和⑶CCUUCAA (Hornung et al.，Nat. Med.，2005，11，263—270 Judge et al. , Nat. Biotechnol.，2005，23，457-462)，其在長度為16bp的ssRNA是特別刺激的。ssRNA必須被 天然轉(zhuǎn)運進內(nèi)涵體中，以與TLR8反應(yīng)。一般而言，這通過常規(guī)轉(zhuǎn)染試劑完成。InvivoGen銷 售作為TLR8激動劑的與陽離子脂質(zhì)(LyoVec)復(fù)合的ssRNA40。然而，許多疾病也可以是由于先天性免疫的過度反應(yīng)而觸發(fā)，例如自身免疫疾病 如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和系統(tǒng)性紅斑狼瘡。在這種情況中，TLR與內(nèi)源細胞的降解產(chǎn)物反應(yīng)，并 因此誤導(dǎo)免疫。甚至懷疑TLR與心血管疾病的發(fā)生相關(guān)。心臟的炎癥反應(yīng)可導(dǎo)致動脈硬化斑形 成，最終由于血管阻塞而導(dǎo)致心肌梗塞。細胞因子細胞因子是多功能信號物質(zhì)。其是含有具有調(diào)節(jié)機體細胞生長和分化功能的蛋白 質(zhì)的糖。因此將其中一些也稱作生長因子。許多細胞因子在免疫反應(yīng)中也起重要作用，且因此也被稱作介體。細胞因子由細胞通過分泌釋放至其周圍介質(zhì)中，并且當其它細胞具有 合適受體時刺激該細胞。細胞因子被分為5種主要類型1.干擾素(IFN)干擾素指導(dǎo)細胞形成防止病毒感染的蛋白質(zhì)或者使這種感染更難以發(fā)生。干擾素 也可以具有抗腫瘤活性。2.白細胞介素(IL)白細胞介素特別用于免疫系統(tǒng)細胞之間的通訊，且因此增加對抗病原體和治療腫 瘤的協(xié)同作用。3.集落刺激因子集落刺激因子在腎中形成。它們是血細胞生長因子。4.腫瘤壞死因子(TNF)TNF的最重要功能是調(diào)節(jié)各種免疫細胞的活性。它們主要由巨噬細胞分泌。TNF 能刺激細胞死亡(凋亡)、細胞增殖、細胞分化及其它細胞因子的分泌。5.趨化因子趨化因子是化學(xué)引誘物，其通過趨化性使具有合適受體的細胞遷移至趨化因子的 來源。干擾素(IFN)、特別是I型干擾素，是特別重要的免疫過程介體。這種類型的第一 禾中干擾素由 Isaacs 禾口 Lindemann 在 1957 年發(fā)現(xiàn)(Isaacs, A. et al. ；J. Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 147,258-267)。其名稱源自該蛋白質(zhì)干擾病毒復(fù)制。I型干擾素是觸發(fā)細胞 抗病毒應(yīng)答、建立“抗病毒狀態(tài)”以及刺激免疫系統(tǒng)細胞抗病毒應(yīng)答的關(guān)鍵細胞因子。這 組干擾素結(jié)合受體，即所謂的IFN-α受體(IFNAR)，該受體由兩條蛋白質(zhì)鏈組成(IFNAR1 和IFNAR2)。干擾素被分為許多亞型。這些亞型被稱作IFN-α、IFN-β、IFN-κ、IFN- δ、 IFN- ε、IFN_ τ ,IFN-ω和IFN-ζ。在此特別重要的是α和β型干擾素由許多細胞分泌， 例如淋巴細胞、巨噬細胞、成纖維細胞、內(nèi)皮細胞和成骨細胞。IFN-α蛋白具有13個亞型，將這些亞型稱作IFNAX (χ = 1、2、4、5、6、7、8、10、13、 14、16、17和21)。所有其基因均簇狀位于染色體9上。在IFN-β蛋白中，已經(jīng)描述了其中兩種干擾素。它們是IFNBl和IFNB3。描述為 IFNB2的蛋白質(zhì)隨后被鑒別為已知的白細胞介素。通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)，即所謂的JAK/STAT途徑，在與位于外細胞膜中的I型干擾素 受體結(jié)合之后，轉(zhuǎn)錄因子“干擾素刺激基因因子3” (ISGF3)被誘導(dǎo)，其是轉(zhuǎn)錄因子STAT1、 STAT2與“IFN調(diào)節(jié)因子9”(IRF9)的異源三聚體，其遷移至細胞核中，并在此誘導(dǎo)數(shù)百個效 應(yīng)分子的轉(zhuǎn)錄(通過所謂的IFN可誘導(dǎo)基因進行)。那些效應(yīng)分子在建立所謂的“抗病毒 狀態(tài)”的過程中直接影響蛋白質(zhì)合成、細胞生長和生存。在這個狀態(tài)下，病毒的感染性被防 護或者至少被降低，例如通過降低復(fù)制速度實現(xiàn)。此外，適應(yīng)性免疫系統(tǒng)通過觸發(fā)樹突狀細胞的成熟以及激活抗體應(yīng)答B(yǎng)細胞和T 細胞應(yīng)答而被激活。淋巴細胞和單核細胞通過誘導(dǎo)的趨化因子被募集至感染部位。應(yīng)激(Stress)也可以發(fā)起信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，其導(dǎo)致抗病毒狀態(tài)。這些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián) 與TLR的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)交叉。應(yīng)激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑
細胞應(yīng)激可以由如下因素觸發(fā)-熱/ 冷-UV-機械應(yīng)激/剪切力-缺氧-營養(yǎng)缺乏-滲透性應(yīng)激-氧化應(yīng)激/自由基-炎癥-生物和化學(xué)物質(zhì)(例如TNFα、化療藥物)。細胞與應(yīng)激復(fù)雜反應(yīng)改變了信號鏈的活性，其中包含特異的MEK、MSK和MSAP激酶 以及各種轉(zhuǎn)錄因子(例如NH-κ B)、細胞凋亡調(diào)節(jié)物和細胞周期調(diào)節(jié)物。與膜結(jié)合的GTP結(jié) 合蛋白(Ras/Rho家族)在細胞與細胞應(yīng)激的反應(yīng)中起特殊作用。先天性免疫應(yīng)答在細胞內(nèi)和細胞間均發(fā)生。在細胞內(nèi)應(yīng)答的情況中，通過與病原 體接觸而受影響的細胞通過PRR如TLR和RLH觸發(fā)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)，導(dǎo)致生理狀態(tài)的細胞表 達譜改變。除此之外，還有細胞間應(yīng)答，其中通過與病原體接觸而受影響的細胞“通知”未 暴露于與所述病原體直接接觸的其它細胞關(guān)于病原體的“感染”情況，通過與病原體接觸而 受影響的細胞釋放細胞因子，該細胞因子由位于未與所述病原體接觸的其它細胞上的細胞 因子受體檢測。細胞因子與細胞因子受體的結(jié)合在未暴露于與所述病原體直接接觸的細胞 中觸發(fā)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)，結(jié)果是該細胞雖然未與所述病原體直接接觸，但是其生理狀態(tài)和表 達譜也被改變。所述細胞的生理狀態(tài)和表達譜的改變用以對抗病原性攻擊起保護作用以及 保證該細胞的存活。所述細胞間應(yīng)答與細胞內(nèi)應(yīng)答由于不同的受體和激動劑而有所不同。在細胞間應(yīng) 答的情況中是細胞因子受體，在細胞內(nèi)應(yīng)答的情況中PRR作為受體。細胞間應(yīng)答的激動劑 是細胞因子，在細胞內(nèi)應(yīng)答的情況中激動劑是致病模式?；蜉斔头椒ㄞD(zhuǎn)染，即將遺傳物質(zhì)導(dǎo)入真核細胞、特別是哺乳動物細胞中，這是一種現(xiàn)代研究不 nT^^W^fe (Domb A. J. ；Review in Molecules ；2005 ；10 ；34 and Xiang G ；Keun-Sik K. ；Dexi L. ；Review in The AAPS Journal ；2007 ；9 (I)Article 9 ；http//www, aaps j. org).沒有這種方法，事實上更難以闡明各個基因的功能。不能忘記的是使用這種方法可 以制備真正(true-to-original)真核細胞源的蛋白質(zhì)，因為真核細胞保證適當?shù)姆g后 修飾，與過去常用的原核細胞不同。此外，預(yù)期在不久的將來，將遺傳物質(zhì)導(dǎo)入人體細胞中 即所謂的基因治療將以臨床檢驗程序和治療成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的一部分。遺傳物質(zhì)的導(dǎo)入使得 例如在真核細胞中置換被破壞的DNA區(qū)域及因此校正缺陷的功能成為可能。另外，可以插 入自殺基因，其例如使癌細胞“自殺”。然而，基因的敲低(knock-down)也可以通過使用例 如siRNA(小干擾RNA)、核酶或者反義分子而實現(xiàn)。接觸細胞的遺傳控制裝置的可能性因此 給人類提供了有價值的工具，用于增加對細胞中天然發(fā)生過程的了解以及影響。在過去的幾年里，對于可在體外和體內(nèi)使用的所謂基因輸送方法(基因輸送系 統(tǒng))的研究已經(jīng)獲得巨大進展，因為其在基因治療中提供了實現(xiàn)突破的極佳前景。一個感
12興趣的基因治療研究焦點是使用病毒作為載體系統(tǒng)。由于將DNA或者RNA導(dǎo)入外來細胞中 是病毒復(fù)制周期的一個完整組成部分，這種能力已經(jīng)在病毒的發(fā)展歷史中通過天然的進化 過程改進至目前不再有有效的基因載體的程度。天然發(fā)生的病毒通過遺傳工程被操縱，由 此其喪失再生能力及其致病性，但是能感染具有重組導(dǎo)入的遺傳物質(zhì)的細胞。因為病毒除 了由遺傳物質(zhì)組成之外，主要是由蛋白質(zhì)組成，其為免疫系統(tǒng)提供大的攻擊靶位，且同時免 疫系統(tǒng)在同樣的進化適應(yīng)過程中產(chǎn)生保護其自身抵御這種入侵者攻擊的策略。因此，機體 的免疫應(yīng)答就失敗的基因治療研究而言被認為是特別顯著的因素。目前利用的基因輸送方法可以分為主要兩個組病毒系統(tǒng)和非病毒系統(tǒng)。非病毒 系統(tǒng)可以再分為化學(xué)方法和物理方法。基于化學(xué)方法的非病毒系統(tǒng)應(yīng)特別提及的方法是基于陽離子脂質(zhì)(所謂的脂染) 或者陽離子聚合物(所謂的polyfection)的那些方法。其效率通常遠落后于病毒系統(tǒng)。熟知的陽離子聚合物的例子是聚-L-賴氨酸(PLL)(EP 388758)，聚乙烯亞胺 (PEI) (J. P. Behr et al. ；Proc. Natl. Acad. Sci. USA ； 1995 ；92 ；7297 ；WO 9602655)，二乙 基氨基乙基葡聚糖(DEAE) (S. C. De Smedt et al.，Phar. Res. ；2000 ；17 ；113)，Starburst dendrimers(PAMAM)， (F. C. Szoka et al. ， Bioconjug. Chem. ；1996 ；7 ；703 ；WO 9502397)， 殼聚糖衍生物(W. GuangLiu et al. J. Control. Release ；2002 ；83 ； 1)以及聚二甲基 氨基乙基甲基丙烯酸酯(P. van de Wetering et al. J. Gene Med. ； 1999 ；1 ；156 ；WO 9715680)。廣泛使用的磷酸鈣沉淀方法在廣義范疇內(nèi)也使用“陽離子聚合物”，且因此可包 含在這個組中?？缮藤彽倪@種陽離子聚合物產(chǎn)品是例如Superfect，Polyfect (Qiagen)， ExGen500(Biomol)禾口 jetPEI (Qbiogene)。相似已知的陽離子脂質(zhì)(J.P. Behr ；Bioconjugate Chem. ； 1994 ；5 ；382)是例 如 DOTMA (US 4946787)、DOTAP (Leventis et al. ；Biochim. Biophys. Acta ；1990 ；1023 ； 124), DOGS(EP 394111)、DOSPA(W) 9405624)、D0SPER(W0 97002419)、DMRIE(US 5264618) 禾口 DC-Chol(Huang et al ；Biochem. Biophys. Res. Commun. ；1991 ；179 ；280 ；WO 9640067)。 那些或者相似的脂質(zhì)是如此配制的或者組合所謂的共脂質(zhì)(例如DOPE)，通常以微團 或者脂質(zhì)體形式存在于乙醇緩沖水溶液中。它們可以這種形式或者以自配制的油脂或 者固體物質(zhì)形式獲得，如可商購的試劑如Lipofectin、Lipofectamin、Lipofectamine 2000 (Invitrogen)、Fugene (Roche)、Effectene(Qiagen)、Transfectam(Promega)、 Metafectene (Biontex)等。在存在DNA或者RNA的條件下，陽離子脂質(zhì)和陽離子聚合物由于相反電荷的關(guān)系 的結(jié)果而自然形成所謂的脂復(fù)合物(lipoplexes)或者聚合復(fù)合物(polyplexes)。DNA通過 磷酸根上負電荷的補償而被濃縮，也就是說使其大小最小化。通常地，脂復(fù)合物或者聚合復(fù) 合物的轉(zhuǎn)染效率依賴于許多參數(shù)。最重要的是在脂復(fù)合物/聚合復(fù)合物制備中遺傳物質(zhì)與 陽離子成分的相對比例、在脂復(fù)合物/聚合復(fù)合物制備期間的離子濃度、每個細胞脂復(fù)合 物/聚合復(fù)合物的絕對數(shù)量、細胞類型、細胞的增殖狀態(tài)、細胞的生理狀態(tài)、細胞分裂速度、 保溫時間等。這些影響因素是復(fù)雜的轉(zhuǎn)染事件的表述，其中它們包含的脂復(fù)合物/聚合復(fù) 合物或者遺傳物質(zhì)必須越過大量細胞屏障。第一個屏障是外層帶負電細胞膜。假定轉(zhuǎn)染活性脂復(fù)合物需要具有凈正電荷，其通過吸附性胞吞作用或者液相胞吞作用進入細胞內(nèi)部。胞吞作用是細胞主動轉(zhuǎn)運過程，由 于胞吞作用的結(jié)果，細胞表面上的物質(zhì)圍繞在細胞膜周圍并作為囊泡(內(nèi)涵體)而內(nèi)在化。 通過與含有酶的復(fù)雜混合物的所謂溶酶體融合，內(nèi)涵體中含有的物質(zhì)被降解。由于低PH值 是降解所必需的，因此內(nèi)涵體具有質(zhì)子泵，其將質(zhì)子泵入內(nèi)涵體中直至獲得合適的PH值。 為了保證電荷中性，氯離子流入內(nèi)涵體至相同程度。為此，許多現(xiàn)代陽離子脂質(zhì)或者聚合物均具有緩沖性質(zhì)。由此，未達到地PH值，且 出現(xiàn)例子流入內(nèi)涵體中，由于產(chǎn)生的滲透壓而導(dǎo)致內(nèi)涵體破裂。由此，這些脂復(fù)合物/聚合 復(fù)合物進入細胞溶質(zhì)中。由于也已知許多不具有緩沖性質(zhì)的轉(zhuǎn)染活性脂質(zhì)和聚合物，因此 必須存在使得脂復(fù)合物/聚合復(fù)合物進入細胞溶質(zhì)中進一步機制。設(shè)想至少在脂質(zhì)情況 中，存在去穩(wěn)定化包含及與其相關(guān)的膜融合。目前還不清楚在這個過程中脂復(fù)合物或者含 有的DNA/RNA自身是否主要進入細胞溶質(zhì)中。然而，因為通過將脂復(fù)合物直接顯微注射進 細胞核中以實現(xiàn)蛋白質(zhì)表達的嘗試失敗，因此設(shè)想所述DNA在細胞溶質(zhì)中從脂復(fù)合物中釋 放?？雌饋碇瑥?fù)合物中結(jié)合的DNA不易受轉(zhuǎn)錄機制的影響。如果包含siRNA或者mRNA的反義分子，則達到作用的生物位點，且作用的持續(xù)時 間基本依賴于細胞溶質(zhì)RNase的濃度以及從脂復(fù)合物/聚合復(fù)合物中的釋放速度。DNA不 能滲入細胞核，這被稱作“核屏障”。然而，在細胞分裂期間其到達作用位點，并因此導(dǎo)致蛋 白質(zhì)表達。另一個基于化學(xué)方法的非病毒方法可以提及的是這樣的系統(tǒng)，其具有DNA結(jié)合 分子部分及能觸發(fā)受體介導(dǎo)的胞吞作用的配體(Example transferinfection ；Wagner et al. ；Proc. Natl. Acad. Sci. ； 1990 ;87 ;3410)。其它化合物由DNA-和/或RNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域以能觸發(fā)膜轉(zhuǎn)移的配體組成，例如 Penetratin, Derossi et al. ；Trends in Cell Biology ； 1998 ；8 ；84 or HIVTat Petid, Gratton et al. ；Nature Medicine ；2003 ；9 (3) ；357所述。膜轉(zhuǎn)移應(yīng)被理解為是指分子可 以從膜的一側(cè)轉(zhuǎn)移至另一側(cè)。作為DNA-和/或RNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域，需要考慮的是能通過靜 電作用(例如陽離子)或者氫鍵(例如肽核酸，PNA)結(jié)合DNA和/或RNA的化合物的所有 結(jié)構(gòu)元件。也可以使用插入化合物(例如吖啶)以結(jié)合RNA/DNA。然而，能觸發(fā)受體介導(dǎo)的 胞吞作用或者膜轉(zhuǎn)移的化合物也能與所述遺傳物質(zhì)共價結(jié)合，條件是所述生物作用不因此 被削弱或者僅略微削弱?；谖锢矸椒ǖ姆遣《痉椒ǖ淖铒@著的實例是電穿孔。在這種方法中，轉(zhuǎn)染的細 胞被導(dǎo)入兩個電極之間，對其應(yīng)用慣例的電壓梯度。以此方式，對細胞進行強電流振蕩(脈 沖)，導(dǎo)致細胞膜可逆的開放(孔)。由于這些孔的結(jié)果，例如與所述孔緊鄰的遺傳物質(zhì)能進 入細胞中。所述脈沖(即電壓梯度)是成功的最重要參數(shù)，必須針對每種細胞類型加以優(yōu) 化。許多電穿孔儀可商購自供應(yīng)商(例如Eppendorf/Multiporator，US 6008038,Biorad/ Gene pulser,US 4750100, Genetronics Inc. ,US 5869326，BTX/ECM series)，這些電穿孔 儀已經(jīng)特別針對真核細胞開發(fā)，使得所述脈沖參數(shù)與所述細胞類型匹配。事實上，現(xiàn)在也可 以獲得可以在體內(nèi)使用的裝置。在體外應(yīng)用的情況中，將懸浮于電穿孔懸浮液中的細胞與 轉(zhuǎn)染的DNA/RNA —起導(dǎo)入帶有電極的電穿孔試管中，進行一或多次脈沖。除了電壓梯度之 外，另外的重要參數(shù)是緩沖液的性質(zhì)、溫度、細胞濃度以及DNA濃度。在對細胞進行脈沖之 后，將其短時間靜置以使細胞膜再生。然后將細胞播種于培養(yǎng)皿中，以常規(guī)方式培養(yǎng)。
可以提及的其它物理方法是顯微注射、水動力方法、彈道方法(基因槍)或者使用 超聲方法，以及將裸DNA注射進不同器官中，導(dǎo)致基因極低表達。組合物理方法和化學(xué)方法的方法也特別包括磁轉(zhuǎn)染，其使用磁性納米粒子上的 DNA結(jié)合分子，通過磁場梯度增加細胞表面的DNA濃度以及觸發(fā)胞吞作用。針對各種方法的效率令人不滿意的問題設(shè)定由將遺傳物質(zhì)導(dǎo)入真核細胞所提供 的巨大機會。在目前存在的每種方法的情況中特別發(fā)生的缺點基本上涉及重要參數(shù)如效 率、毒性、免疫原性、靶向、遺傳物質(zhì)大小的限制、體內(nèi)/體外應(yīng)用范圍、高通量應(yīng)用的范圍、 危害潛力、方法的簡便性及方法的成本。沒有一種方法能充分符合所有這些參數(shù)。事實是 盡管取得相當可觀的研究成果，但是目前還不能確定基于基因治療的任何醫(yī)學(xué)治療可歸因 于合適的基因載體系統(tǒng)的缺失。特別地，真核細胞的先天性免疫系統(tǒng)可以代表對非病毒基因輸送系統(tǒng)的顯著屏 障。原因是真核細胞的先天性免疫系統(tǒng)能通過Toll樣受體識別外來遺傳物質(zhì)并起始信號 轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)，由此觸發(fā)細胞群的抗病毒狀態(tài)。細胞的這種抗病毒狀態(tài)也代表了對用非病毒基 因輸送系統(tǒng)進行轉(zhuǎn)染的屏障，這個屏障不可能或者非常難以克服。例如，在重復(fù)脂染實驗中，首先進行特異性針對某一蛋白質(zhì)的SiRNA轉(zhuǎn)染，然后使 用報道基因進行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，這個實驗示出盡管細胞看起來健康，但是未發(fā)生成功的質(zhì)粒轉(zhuǎn) 染。僅在siRNA的量非常低的情況中，可能檢測到少量報道蛋白質(zhì)。為了排除這是特異siRNA的脫靶效應(yīng)的可能性，使用針對人遺傳物質(zhì)進行“比對 (blasted)，，的非特異性siRNA重復(fù)進行實驗。然而獲得相同結(jié)果。因為已知細胞的增殖在脂染情況中也起作用，進行研究以探討細胞的增殖行為是 否由于siRNA預(yù)轉(zhuǎn)染而被削弱。研究表明在相對存在大量siRNA的情況中，增殖速度降低， 但是當在預(yù)轉(zhuǎn)染失敗后進行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染時，在該實驗中達到足夠的增殖。令人驚奇地，看起來 細胞似乎能保護其自身免于二次轉(zhuǎn)染。使用重復(fù)轉(zhuǎn)染實驗，其中相繼進行兩次質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，盡管未明確提及，但是獲得相似 結(jié)果。二次轉(zhuǎn)染步驟通常是非常低效或者是反效果的。在這種情況中，進行與上述那些相 似的研究，以保證不包含毒性作用。進一步研究示出分泌干擾素。觸發(fā)RNA干擾的siRNA的轉(zhuǎn)染當mRNA與插入的dsRNA具有序列同源性時，通過將dsRNA導(dǎo)入細胞中而選擇性關(guān) 閉基因。這個方法被稱作RNA 干擾(Fire et al.，Nature，1998，391，806-811)，通常如下 所述進行通過dicer酶將插入細胞中的具有細胞固有mRNA的同源序列的dsRNA切割成大 量具有 21-25 個核苷酸的小 dsRNA 片段(Bernstein etal.，Nature,2001,409, 363-366)。Dicer是ATP依賴性核糖核酸酶。所得核苷酸片段在3’末端具有2_3個核苷酸突 出端。所述小 RNA 片段被稱作“小干擾 RNA(siRNA) ” (Elbashiret al.，Nature，2001，411， 494-498)。雙鏈siRNA是不卷繞(unwound)的，推測其借助于解旋酶消耗ATP (Dalmay et al.，ΕΜΒ0，2001，J20，2069-2078)。然后單鏈被轉(zhuǎn)變?yōu)榈鞍踪|(zhì)復(fù)合物RISC(RNA_誘導(dǎo)的沉默 復(fù)合物)(Kuhlmann et al. , Biol, unserer Zeit，2004，3，142-150)。保持在 RISC 上的鏈 可以與互補RNA(靶RNA)雜交。然后所述靶RNA被完整的核酸內(nèi)切酶切割。由于基因僅能通過單鏈mRNA的迂回途徑(circuitous route)起作用，因此該基因?qū)嶋H上被關(guān)閉。盡管 其仍被轉(zhuǎn)錄，但是RNA干擾(RNAi)再次快速降解該mRNA。為此，RNA干擾也被稱作“轉(zhuǎn)錄 后基因沉默”(PTGS)。RNA干擾在原生動物、真菌、植物和動物中發(fā)現(xiàn)，但是各個機制彼此略有不同。原始 細菌和原核生物不具有該能力。目前還不十分清楚所述功能。推測其對抗RNA病毒起保護作用。例如，病毒感染的 植物能恢復(fù)以及在新生出的葉片中癥狀衰退。無癥狀的葉片可不再感染相關(guān)種類的病毒。 入侵的病毒或其RNA的互補拷貝產(chǎn)生，其作為合成原始RNA的基質(zhì)。病毒特異性dsRNA形 成，其觸發(fā)PTGS機制。由于最初dsRNA的濃度太低，因此植物能恢復(fù)且逐步控制病毒。推 測細胞固有的RNA依賴性RNA聚合酶(RdRP)識別單鏈病毒基因組，將其轉(zhuǎn)變?yōu)閐sRNA，然后 開始RNAi進程。PTGS對抗病毒起保護作用的理論通過在病毒中發(fā)現(xiàn)PTGS抑制劑而得以支 持。目前仍不十分清楚它們怎樣工作以及植物是否產(chǎn)生對抗這些抑制劑的機制。近年來RNA干擾方法已經(jīng)取得重大進展，因為其賦予關(guān)閉不希望的基因或者蛋白 質(zhì)的可能性，因此控制病毒性疾病及其它疾病。此外，其在揭示基因功能關(guān)系的研究中不可 或缺。使用RNA干擾方法的最常用的變化方法是合成產(chǎn)生的SiRNA分子的轉(zhuǎn)染，即具有 2-3個核苷酸的3’突出端的雙鏈RNA。在哺乳動物細胞中，具有30bp以上的插入dsRNA使 得所有mRNA被酶促破壞及終止蛋白質(zhì)合成(Kaufmann，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999， 96，11693-11695)。在注射較長的dsRNA之后，一些高等真核細胞可以與干擾素產(chǎn)物反應(yīng)， 這樣可抑制病毒基因的表達，并且操縱細胞凋亡。如果其被阻止，在哺乳動物細胞情況中所 述 siRNA 的長度必須小于 30bp (Tuschl et al.，Genes Dev.，2001，15，188-200)。作為轉(zhuǎn) 染方法，可利用從DNA轉(zhuǎn)染方法中獲知的方法。與DNA轉(zhuǎn)染的唯一不同之處是插入的遺傳 物質(zhì)的作用部位。在DNA轉(zhuǎn)染中，作用部位是細胞核。在siRNA轉(zhuǎn)染中，作用部位是細胞溶 質(zhì)。最常用的方法是電穿孔、通過陽離子聚合物轉(zhuǎn)染以及尤其是通過陽離子脂質(zhì)轉(zhuǎn) 染。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的最佳試劑非必須也是siRNA轉(zhuǎn)染的最佳試劑，反之亦然。適于siRNA轉(zhuǎn) 染的的具體試劑因此可商購。舉例的試劑是Interferrin(Polyplus)、X-treme Gene siRNA(Roche)、siPort(Ambion)、S ilentfect(Biorad)、Dharmafect(Dharmacon)禾口 Lipofectamin RNAiMax(Invitrogen)。在siRNA轉(zhuǎn)染情況中，成功轉(zhuǎn)染的測量應(yīng)理解為與未處理的樣品或者用非特異性 siRNA(無靶位的siRNA)轉(zhuǎn)染的樣品相比蛋白質(zhì)或者基因的相對敲低。在siRNA轉(zhuǎn)染中的 一個問題是所謂的脫靶效應(yīng)，其被理解為例如不是敲低靶位的基因的表達無意削弱。這例 如可以在序列相似性情況中出現(xiàn)。為了盡可能低地保持這種脫靶效應(yīng)以及由于毒性的原 因，這是潛在的siRNA轉(zhuǎn)染系統(tǒng)使用最小可能量的siRNA達到最高可能敲低所必需的。特 別是在體內(nèi)應(yīng)用的情況中，另一優(yōu)選的要求是除了靶蛋白質(zhì)表達之外，所述細胞的表達譜 盡可能小地改變。發(fā)明描述本發(fā)明提供了可以更有效轉(zhuǎn)染的方法。所述方法適用于單次轉(zhuǎn)染以及重復(fù)轉(zhuǎn)染， 即兩或多次轉(zhuǎn)染。本發(fā)明另一目的是盡可能小地影響細胞生理狀態(tài)，即細胞群的蛋白質(zhì)表因已經(jīng)插入細胞中的蛋白質(zhì)或其表達通過插入的遺傳物質(zhì)而被降低 或者阻斷的蛋白質(zhì)被改變。然而，在SiRNA轉(zhuǎn)染情況中，也可以有利地改變細胞的生理狀 態(tài)，以將細胞帶入“抗病毒狀態(tài)”，因為在這種情況中RNA干擾特別有效。此外，本發(fā)明提供 了組合物和試劑盒，其含有使用非病毒輸送系統(tǒng)更有效轉(zhuǎn)染真核細胞的成分。通過本發(fā)明的方法改進了非病毒基因輸送系統(tǒng)的轉(zhuǎn)染結(jié)果，所述方法特征在于a)將細胞在轉(zhuǎn)染之前和/或轉(zhuǎn)染期間用至少部分抑制先天性細胞內(nèi)和/或細胞間 免疫的至少一種工具(means)處理，以及在轉(zhuǎn)染期間將遺傳物質(zhì)、特別是修飾的和/或未修 飾的ssDNA、修飾的和/或未修飾的dsDNA、修飾的和/或未修飾的ssRNA、修飾的和/或未 修飾的dsRNA和/或修飾的和/或未修飾的siRNA導(dǎo)入該細胞中；或者b)將細胞在轉(zhuǎn)染之前和/或轉(zhuǎn)染期間和/或轉(zhuǎn)染之后用至少部分激活先天性細胞 內(nèi)和/或細胞間免疫的至少一種工具處理，以及在轉(zhuǎn)染期間將修飾的和/或未修飾的siRNA 導(dǎo)入細胞中。本發(fā)明的改進轉(zhuǎn)染結(jié)果的方法可以在體外和/或體內(nèi)進行。通過至少部分抑制先天性細胞內(nèi)和/或細胞間免疫，即先天性免疫的細胞內(nèi)和/ 或細胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)之一被中斷，轉(zhuǎn)染結(jié)果可得以改進和/或可以避免轉(zhuǎn)染的細胞中表 達譜中不希望的改變。也就是說，特別是通過適體分子、通過相應(yīng)的激酶(其隨之誘導(dǎo)細胞因子、特別是 干擾素)、通過激活轉(zhuǎn)錄因子自TLR開始的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)以及膜轉(zhuǎn)運過程可被負調(diào) 節(jié)、中斷或者削弱。此外，信號通過細胞之間的信使物質(zhì)的傳送可以被中斷。因為其均是蛋 白質(zhì)，而根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選使用活性增加或者活性降低的效應(yīng)物如所用蛋白質(zhì)的抗體、適體、 拮抗劑或者抑制劑。相應(yīng)的活性物質(zhì)可本身或者使用合適的輔助分子導(dǎo)入到細胞或細胞 中，這取決于細胞通透性或者靶位點。例如，可以通過脂質(zhì)體載體將活性物質(zhì)導(dǎo)入內(nèi)涵體 中。如果靶位點是細胞溶質(zhì)，可能使用的方法包括電穿孔或者能透過細胞壁的特殊肽序列。 如果所述活性物質(zhì)是肽或者蛋白質(zhì)，根據(jù)本發(fā)明其可以通過合適遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)染而在細胞 內(nèi)形成，且如果需要可以使用定位序列定向到相應(yīng)的細胞區(qū)室。如果通過編碼信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié) 構(gòu)關(guān)鍵的蛋白質(zhì)的siRNA基因?qū)崿F(xiàn)敲低，根據(jù)本發(fā)明可利用已知的轉(zhuǎn)染系統(tǒng)。可以使用本發(fā)明的方法，且本發(fā)明的方法可以在體外和體內(nèi)使用。其可用于在轉(zhuǎn) 染期間或者甚至提前預(yù)防細胞“抗病毒狀態(tài)”的發(fā)生。由于細胞在培養(yǎng)期間也可以與生物材 料接觸，例如與血清或者胰蛋白酶接觸，所述生物材料可含有一或多種TLR應(yīng)答的物質(zhì)(例 如DNA、RNA、LPS等)，因此可以發(fā)生細胞在轉(zhuǎn)染開始之前已經(jīng)處于抗病毒狀態(tài)。這也是為什 么轉(zhuǎn)染結(jié)果的再現(xiàn)難以實現(xiàn)的原因。轉(zhuǎn)染結(jié)果的質(zhì)量高度依賴于細胞的免疫學(xué)起始狀態(tài)， 這個狀態(tài)依賴于預(yù)處理情況(例如傳代培養(yǎng))。在本發(fā)明的方法中，所述非病毒基因輸送系統(tǒng)可包含陽離子脂質(zhì)、陽離子聚合物 或者陽離子蛋白；和/或可包含一種化合物，該化合物具有DNA-和/或RNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域， 且能觸發(fā)受體介導(dǎo)的胞吞作用或者膜轉(zhuǎn)移；和/或可包含一種化合物，該化合物與DNA和/ 或RNA共價結(jié)合，且能觸發(fā)受體介導(dǎo)的胞吞作用或者膜轉(zhuǎn)移；和/或可基于物理方法如電穿 孔、顯微注射、磁轉(zhuǎn)染(magnetofection)、超聲或者彈道或水動力方法。此外，在本發(fā)明方法中，轉(zhuǎn)染可以進行至少兩次，即進行兩或多次轉(zhuǎn)染(3、4、5、6 次等)。
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另外，在本發(fā)明的方法中，優(yōu)選陽離子脂質(zhì)可以包含于非病毒基因輸送系統(tǒng)中，特 別優(yōu)選如下式(I)所示陽離子脂質(zhì) 其中R1可以是 其中R2和R3獨立地是其它十二烷基、十二烯基、十四烷基、十四烯基、十六烷基、十六烯 基、十八烷基、十八烯基或其它烷基，在所有可能的組合中，它們可以是飽和的、不飽和的、 支鏈的、非支鏈的、氟化的或者非氟化的，并且可以由5-30個碳原子組成；X可以是 其中m = 0及n = 0 ；或者m = 及η =丄；或者m = ο及η = 2 ；或者m =丄及η =1;或者m=l及η = 2;或者m = 2及η = 2;以及8可以是1，2，3，4，5，6，7或者8溝可以是0，1，2，3，4，5或者6出可以是0，1，2，3， 4，5或者6;(可以是0，1，2，3，4，5或者6;(1可以是0，1，2，3，4，5或者6;6可以是0，1，2， 3，4，5或者6 ；以及f可以是0，1，2，3，4，5或者6。更優(yōu)選地，在本發(fā)明的方法中，可以使用包含如化學(xué)式(I)所示陽離子脂質(zhì)的非 病毒基因輸送系統(tǒng)，其中&和民獨立地是十二烷基、十二烯基、十四烷基、十四烯基、十六烷 基、十六烯基、十八烷基、十八烯基；m和η可以是1 ;g可以是1，2，3，4，5，6，7或者8 ;a可以 是0，1，2，3，4，5或者6出可以是0，1，2，3，4，5或者6 ；c可以是0，1，2，3，4，5或者6 ；d可 以是0，1，2，3，4，5或者6#可以是0，1，2，3，4，5或者6;以及€可以是0，1，2，3，4，5或者 6。在本發(fā)明的方法中，先天性細胞內(nèi)和/或細胞間免疫可以由至少一種抗體、胞內(nèi) 抗體、適體、拮抗劑、抑制劑和/或siRNA至少部分抑制，其阻斷先天性免疫的細胞內(nèi)和/或 細胞間信號的傳送。相應(yīng)的抗體、胞內(nèi)抗體、適體、拮抗劑和抑制劑可商購。此外，在本發(fā)明的方法中，可以使用siRNA敲低以關(guān)閉編碼信號轉(zhuǎn)導(dǎo)必需的蛋白 質(zhì)的至少一個基因。例如針對TLR、激酶和轉(zhuǎn)錄因子的相應(yīng)的siRNA或者質(zhì)粒、shRNA (短發(fā) 夾 RNA)可以商購(Imgenex/Invivogen) ο在本發(fā)明的方法中，為了至少部分抑制先天性細胞內(nèi)和/或細胞間免疫，可以阻 斷至少 TLR UTLR 2、TLR 3、TLR 4、TLR 5、TLR 6、TLR 7、TLR 8、TLR 9、TLR 10、TLR 11、TLR 12、TLR 13、CD14、CD38、RIG-I解旋酶和/或RIG-I-樣解旋酶之一。特別優(yōu)選阻斷 TLR UTLR 2、TLR 4和/或TLR 9。進一步可優(yōu)選阻斷多個上述受體或者蛋白質(zhì)。根據(jù) 本發(fā)明，合適的抗體是能阻斷TL受體的那些抗體。例如已知且可商購Toll樣受體TLR1、 TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9 和 CD14 的抗體。舉例的能阻斷人 TLR 的抗 體是小鼠抗人-CD282 抗體(=抗 TLR2)，單克隆抗體，AbD Serotec, Cat. No. :MCA2484EL ； 小鼠抗人-TLR3，抗體，單克隆抗體，Lifespan Biosciences Cat. No. :LS_C18685 ；小鼠 抗人-CD284 抗體(=抗 TLR4)，單克隆抗體，AbD Serotec, Cat. No. :MCA2061EL ；小鼠 抗人 TLRl 抗體(單克隆抗體，0.05% 疊氮化鈉，IOOyg lyophilisate)，Invivogen, No. Mab-htlrl ；兔抗人-TLR9 抗體(=抗 TLR9)，多克隆抗體，0. 5 μ g/μ 1 于 PBS、0.2% 凝 膠、0. 05%疊氮化鈉中，Lifespan Biosciences, Cat. No. :MCA2484EL。如果商購的抗體中 含有不希望的物質(zhì)如疊氮化鈉，在將該抗體用于本發(fā)明方法中之前必須除去這些物質(zhì)，例 如通過透析除去。能阻斷TLR的抗體可以與觸發(fā)胞吞作用的脂復(fù)合物或聚合復(fù)合物(本身或者包裝 于脂質(zhì)體中)一起插入內(nèi)涵體中，由此阻斷所述受體。然而，通常加入細胞外空間也是足夠 的。根據(jù)本發(fā)明，待阻斷的受體的選擇當然也依賴于待轉(zhuǎn)移的遺傳物質(zhì)的性質(zhì)。此外，轉(zhuǎn)染 劑也可以確定待阻斷的受體的選擇。檢測遺傳物質(zhì)的TLRjPTLR 3、TLR 7、TLR 8和TLR 9，通常位于內(nèi)涵體中。其它TLR位于漿膜上。例如，如果DNA待轉(zhuǎn)移，優(yōu)選可阻斷TLR 9。 如果所述DNA是細菌源的，可優(yōu)選除了阻斷TLR 9之外還阻斷TLR 4和/或TLR 5。在優(yōu)選的實施方案中，將濃度為0.01-100 μ g/ml的抗體加入培養(yǎng)基中。在進一步 優(yōu)選的實施方案中，抗體的濃度是0. 01-10 μ g/ml培養(yǎng)基，最優(yōu)選0. 01-5 μ g/ml?？贵w可以整合進轉(zhuǎn)染活性復(fù)合物如脂復(fù)合物中。在優(yōu)選的實施方案中，抗體與遺 傳物質(zhì)的比率是0.01 l(yg/yg)-10 l(yg/yg)。在更優(yōu)選的實施方案中，所述量 0. 01-1 μ g/ μ g遺傳物質(zhì)，在最優(yōu)選的實施方案中的量是0. 01-0. 3 μ g/ μ g遺傳物質(zhì)。如下論述適用于根據(jù)本發(fā)明可以用于至少部分抑制先天性細胞內(nèi)和/或細胞間 免疫的所有抗體使用的抗體通常必須針對待轉(zhuǎn)染的細胞的待阻斷的靶分子，例如受體如 TLR、細胞因子受體、干擾素受體等。例如，如果涉及人細胞的TLR，則抗體必須針對待阻斷 的人TLR受體。在許多情況中，由于不同物種靶分子如TLR之間的大相似性，所述抗體對其 存在交叉反應(yīng)性；即盡管已經(jīng)產(chǎn)生針對一個物種的靶分子的抗體，但是其對于另一物種的 相似靶分子也呈現(xiàn)其性質(zhì)。也優(yōu)選使用待轉(zhuǎn)染的相同物種細胞的抗體，因為在這種情況中 其呈現(xiàn)較小或者無免疫原性。所述抗體也可以重組制備。如果其用于人體細胞，其可以是 “人源化的”。優(yōu)選所用抗體以高親和性結(jié)合其靶分子。所用抗體可以是多克隆或者單克隆 抗體，優(yōu)選單克隆抗體。也可以使用修飾的抗體，例如在修飾的抗體情況中，F(xiàn)c片段可以不 存在，因為單獨通過Fab片段結(jié)合表靶分子/抗原。修飾的抗體也可以用疏水性基團修飾， 如脂質(zhì)，以促進其在膜和/或脂質(zhì)體中錨定。如果希望更簡單地檢測所用抗體，也可以用熒 光染料標記。也可以對抗體進行多個修飾。此外，所用抗體必須沒有禁用于活細胞的添加 劑，例如某些防腐劑。在本發(fā)明的方法中，也可以阻斷如下至少一種激酶IRF激酶、TBK1、MAP激酶、 MAPK 激酶、MAPK 激酶、MAPKK 激酶、MAPKKK 激酶、MEKl、MEK2、MEK5、MKK4/SEK、MKK5、MKK6、 MKK7、ERK1、ERK2、ERK3、ERK4、ERK5、ERK6、ERK7、ERK8、JAK、JNKl、JNK2、p38MAP 激酶、RK、
19P38/RK MAP 激酶、p30/RK MAP 激酶、磷脂酰肌醇 3-激酶、IRAK-1、IRAK-4、IKK- α、IKK- β、 IKK γ , IKK δ , IKK ε、TAKl、PKB 激酶、PKDl、PKD2、MSKl 或者 PKR0 優(yōu)選阻斷選自 MEKl 和ΜΕΚ2的至少一種激酶。進一步優(yōu)選阻斷上述多種激酶。此外，根據(jù)本發(fā)明，激酶MEKl和/或ΜΕΚ2可以被IC50值低于IOOnM的化合物抑 制。另外，根據(jù)本發(fā)明，激酶MEKl和/或ΜΕΚ2可以由1，4_ 二氨基-2，3- 二氰_1，4_ 二 (ο-氨基苯基巰基)丁二烯(U0126)阻斷。在優(yōu)選的實施方案中，使用1-500 μ M的濃度。 在更優(yōu)選的實施方案中，所述濃度為1-100 μ Μ，在最優(yōu)選的實施方案中，濃度為1-30 μ Μ。在本發(fā)明的方法中，可以阻斷參與先天性細胞間免疫的至少一種細胞因子、至少 一種腫瘤壞死因子(TNF)、至少一種白細胞介素和/或至少一種干擾素?？梢钥紤]的待阻斷的干擾素例如是I型干擾素，特別是選自干擾素-α、干擾 素-β、干擾素-Y和干擾素-ω的至少一種干擾素。作為待阻斷的白細胞介素，可以考慮 的是白細胞介素-1。也可以阻斷至少一種細胞因子受體，特別是至少一種干擾素受體、特別是I型干 擾素受體，至少一種白細胞介素受體，和/或至少一種腫瘤壞死因子受體。舉例的針對I型 干擾素受體的合適抗體是針對人干擾素α/β受體第2鏈的小鼠單克隆抗體(CD118)，克 隆MMHAR-2，同種型Ig2a，濃度(C) = 0. 5mg/ml于含有牛血清白蛋白(BSA)的PBS (磷 酸鹽緩沖鹽水)中，PBLBiomedical Laboratories, Product No. 21385。特別地，白細胞 介素-1受體可以由抗體或者拮抗劑如IL_ra(人白細胞介素_1受體拮抗劑，Biomol. Cat. No. 54592)阻斷。特別優(yōu)選的靶是干擾素-Y受體。如下論述適用于在本發(fā)明中可用作至少部分抑制先天性細胞內(nèi)和/或細胞間免 疫的工具的所有拮抗劑所用拮抗劑通常必須針對待轉(zhuǎn)染的細胞的待阻斷的靶分子，例如 受體如白細胞介素受體、細胞因子受體、干擾素受體等。例如，如果包含人細胞的受體，所述 拮抗劑通常必須針對待阻斷的人受體。在許多情況中，由于不同物種靶分子如TLR之間的 大相似性，所述拮抗劑對其存在交叉反應(yīng)性；即盡管已經(jīng)產(chǎn)生針對一個物種的靶分子的拮 抗劑，但是其對于另一物種的相似靶分子也呈現(xiàn)其性質(zhì)。也優(yōu)選使用待轉(zhuǎn)染的相同物種細 胞的拮抗劑，因為在這種情況中其呈現(xiàn)較小或者無免疫原性。所述拮抗劑也可以重組制備 或者合成。優(yōu)選地，所用拮抗劑以高親和性結(jié)合其靶分子。根據(jù)本發(fā)明使用的拮抗劑也可 以與抗體修飾相似地被修飾。在本發(fā)明優(yōu)選的安排中，可以阻斷參與觸發(fā)先天性細胞內(nèi)和/或細胞間免疫的信 號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)的上述多個受體和/或蛋白質(zhì)。例如，可以組合多個TLR受體的抗體以利用其 加合作用和/或協(xié)同作用。同樣，例如也可以組合TLR受體和/或TLR輔助蛋白和/或適 體分子和/或激酶和/或轉(zhuǎn)錄因子和/或細胞因子和/或細胞因子受體的抑制劑和/或抗 體、和/或胞內(nèi)抗體、和/或適體、和/或拮抗劑、和/或siRNA，以至少部分中斷先天性免疫 的信號傳送級聯(lián)。本發(fā)明的方法也可用于通過一些方式改進使用非病毒基因輸送系統(tǒng)的siRNA轉(zhuǎn) 染結(jié)果，所述siRNA是修飾或者未修飾的。在本發(fā)明的方法中，激動劑可用作激活先天性免疫的工具。首先，本發(fā)明的方法可用于通過刺激先天性免疫系統(tǒng)的細胞內(nèi)部分而激活RNA干 擾機制。所述激活通過將相應(yīng)激動劑加樣于各種TLR受體而實現(xiàn)，但特別通過加樣(并因此激活)受體TLR7和TLR8進行。受體TLR7和TLR8位于內(nèi)涵體中且檢測ssRNA，如在RNA 病毒感染的情況中所預(yù)期的那樣。這些受體的激活導(dǎo)致特別高的“抗病毒狀態(tài)”，由此活性 RNA干擾機制可以分派于(allocated)該狀態(tài)。RNA-干擾是對抗病毒起保護作用的機制的 設(shè)想可以很容易適合整體構(gòu)想。siRNA轉(zhuǎn)染結(jié)果的改進不同于其它遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)染，良好的 轉(zhuǎn)染結(jié)果需要活性RNAi機制，其是先天性免疫系統(tǒng)的一部分，活性RNAi機制過度代償先天 性免疫系統(tǒng)對于siRNA吸收的不利作用。優(yōu)選地，在本發(fā)明的方法中，先天性細胞內(nèi)和/或細胞間免疫可以由TL受體的至 少一種激動劑、特別是TLR7和/或TLR8的至少一種激動劑至少部分激活。根據(jù)本發(fā)明，TLR7和/或TLR8的至少一種激動劑可選自溴匹立明(2_氨 基-5-溴-6-苯基-4-嘧啶酮)、咪唑并喹啉、噻唑并喹啉、鳥苷類似物和ssRNA。優(yōu)選地，在本發(fā)明方法中，所述至少一種激動劑可以是咪喹莫特(R837，l-(2_甲 基丙基)-IH-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺)、瑞喹莫德(1 848，4-氨基-2-(乙氧基甲基)-￡1， a-二甲基-IH-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-乙醇)或者Gardiquimod(1-(4-氨基-2-乙基 氨基甲基咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基)-2_甲基丙-2-醇)；或者CL075或CL097 ；或者洛 索立賓(7-烯丙基-7，8-二氫-8-氧-鳥苷)或者艾沙托立賓(7-硫代-8-氧鳥苷)；或 者具有富含U的和/或富含GU的序列的ssRNA，特別是具有基序UGUGU和/或GUCCUUCAA 的ssRNA。咪喹莫特的濃度可以是0. 1-100 μ g/ml，優(yōu)選濃度為0. 1-20 μ g/ml，最優(yōu)選濃度 為0. l-10yg/ml。優(yōu)選在轉(zhuǎn)染同時和/或轉(zhuǎn)染后加入。優(yōu)選地，所述ssRNA長度為至少 15個堿基。此外，ssRNA可具有硫代磷酸酯主鏈。例如，長度為20個核苷酸的ssRNA可以 0. 1-100 μ g/ml濃度使用，優(yōu)選0. 1-20 μ g/ml，最優(yōu)選0. 1-10 μ g/ml 0優(yōu)選在轉(zhuǎn)染同時和/ 或轉(zhuǎn)染后加入。優(yōu)選地，所述免疫刺激性ssRNA可包含于轉(zhuǎn)染活性復(fù)合物中，所述復(fù)合物包 含非病毒基因輸送系統(tǒng)以及在其上shRNA已經(jīng)編碼的siRNA或者質(zhì)粒-DNA。可透過細胞的激動劑可以在實際siRNA轉(zhuǎn)染步驟之前、期間或者之后直接加入細 胞培養(yǎng)基中，其是ssRNA及其類似物與合適的轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合所必需的，因為這些試劑不是 天然可透過細胞的，因此不能到達位于內(nèi)涵體中的TLR。也可以將激動劑與siRNA —起摻入 脂復(fù)合物或者聚合復(fù)合物種，或者通過烷基鏈衍生化，將所述激動劑摻入脂質(zhì)體或者脂復(fù) 合物的脂質(zhì)膜中，其由轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染活性陽離子脂質(zhì)及可能的共脂質(zhì)如DOPE組成。激動劑也可 以與陽離子聚合物共價結(jié)合。其次，本發(fā)明的方法可用于通過刺激先天性免疫系統(tǒng)的細胞間部分而激活RNA干 擾機制。所述激活通過加樣抗病毒細胞因子的受體與合適的激動劑而實現(xiàn)。在優(yōu)選的安排 中，使用的干擾素-β和/或干擾素-Y的濃度是l-10000U/ml。在更優(yōu)選的實施方案中， 所述濃度是l_5000U/ml，在最優(yōu)選的實施方案中，所述濃度是l-2000U/ml。所述添加優(yōu)選 在轉(zhuǎn)染同時和/或在轉(zhuǎn)染后進行。另一方面，本發(fā)明的方法可用于刺激適于激活siRNA機制獲得性免疫系統(tǒng)那部 分，且同時阻斷影響導(dǎo)入的siRNA量的其它部分，例如通過負調(diào)節(jié)胞吞作用進行，這可能是 利用協(xié)同作用。在本發(fā)明的方法中，可以將細胞在轉(zhuǎn)染前用至少部分激活先天性細胞內(nèi)和/或細 胞間免疫的至少一種工具處理直至4天，優(yōu)選直至18小時，特別優(yōu)選直至6小時。此外，在本發(fā)明的方法中，將細胞在轉(zhuǎn)染之后用至少部分激活先天性細胞內(nèi)和/或細胞間免疫的至少一種工具處理直至2天，優(yōu)選直至12小時，特別優(yōu)選直至6小時。另外，在本發(fā)明的方法中，可以將細胞用至少部分抑制或激活先天性細胞內(nèi)和/ 或細胞間免疫的至少一種工具處理，并且同時與非病毒基因輸送系統(tǒng)接觸。本發(fā)明的方法也可用于防止不希望的先天性免疫系統(tǒng)的反應(yīng)，及因此防止細胞修 飾的基因表達。特別有意義的是在體內(nèi)應(yīng)用及在在復(fù)雜信號途徑中通過siRNA轉(zhuǎn)染澄清蛋 白質(zhì)功能。細胞的不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑通常也與先天性免疫系統(tǒng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑結(jié)合。在 蛋白質(zhì)敲低的情況中，其同時對于細胞的生理狀態(tài)具有嚴重影響，更難以分派對蛋白質(zhì)的 功能。為了可以避免這個問題，本發(fā)明的方法可用于部分或者全部阻斷先天性免疫系統(tǒng)的 應(yīng)答。本發(fā)明的方法適于轉(zhuǎn)染真核細胞。如果在體外轉(zhuǎn)染真核細胞，則細胞可以貼壁或 者懸浮于合適培養(yǎng)基中。優(yōu)選地，如果包含DNA轉(zhuǎn)染，則細胞在轉(zhuǎn)染時處于增殖對數(shù)期。如 果RNA待轉(zhuǎn)染，則細胞在轉(zhuǎn)染時優(yōu)選處于延滯期或者對數(shù)期。如果轉(zhuǎn)染針對表達蛋白質(zhì)進 行，需要考慮的是遺傳物質(zhì)是具有可表達為RNA或者肽/蛋白質(zhì)的成分的dsDNA或者具有 可表達為肽/蛋白質(zhì)的成分的ssRNA(在每種情況中是修飾或未修飾的)。如果為了通過RNA-干擾實現(xiàn)基因的敲低而進行轉(zhuǎn)染，可以使用具有可表達為小 發(fā)夾RNA成分的修飾的或未修飾的dsDNA或者修飾的或未修飾的siRNA ；只有在后者的情 況中，TLR 7和/或TLR 8的激活是可取的。然而，另外阻斷TLR和/或細胞因子受體和/ 或通過阻斷MEKl和/或MEK2中斷信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是有利的，特別是盡可能不影響細胞的表達譜。本發(fā)明的方法可優(yōu)選具有如下步驟(a)提供第一種溶液，其含有靶分子的抗體、拮抗劑、抑制劑或者激動劑；提供第 二種溶液，其含有非病毒基因輸送系統(tǒng)；以及提供第三種溶液，其含有待轉(zhuǎn)染的遺傳物質(zhì)；(b)將含有靶分子的抗體、拮抗劑或者抑制劑的第一種溶液加入細胞培養(yǎng)基中待 轉(zhuǎn)染的細胞中；(c)將含有非病毒基因輸送系統(tǒng)的第二種溶液與含有待轉(zhuǎn)染的遺傳物質(zhì)的第三種 溶液混合；(d)保溫得自步驟(C)的混合物；(e)將得自步驟(d)的保溫的混合物加入得自步驟(b)的用第一種溶液預(yù)處理的 待轉(zhuǎn)染的細胞中。根據(jù)本發(fā)明，第一種溶液可含有作為靶分子的細胞因子受體或者TLR UTLR 2、 TLR 3,TLR 4,TLR 5,TLR 6,TLR 7,TLR 8或者TLR 9的拮抗劑或者抗體；靶分子MEKl和/ 或MEK2的抑制劑；或者TLR 7和/或TLR 8的激動劑；特別是上述那些之一。拮抗劑或者 抗體可優(yōu)選溶解于緩沖鹽溶液中例如PBS、基本培養(yǎng)基等，生理pH值為6. 8-7. 45，生理克分 子滲透壓濃度為270-310mOSmOl/kgH20，或者在水或者pH值為5_9的非緩沖鹽溶液中。在存 在溶解性問題的情況中，所述抑制劑也可以在合適的生理可接受的溶劑中稀釋，例如乙醇/ DMS0。第一種溶液中拮抗劑、抗體或者抑制劑的濃度可以是0. 01-1 μ g/μ 1。根據(jù)本發(fā)明，在步驟(b)中將第一種溶液加入細胞培養(yǎng)基中待轉(zhuǎn)染的細胞中是在 用轉(zhuǎn)染復(fù)合物處理細胞(步驟(e))之前24小時至1秒鐘期間進行，優(yōu)選在從0. 5-5小時 期間進行。這特別適用于當?shù)谝环N溶液含有MEKl-和/或MEK2-抑制劑或者TLR UTLR 2、 TLR 3,TLR 4,TLR 5或TLR 6或者細胞因子受體的抗體或者拮抗劑時。將適量第一種溶液加入待轉(zhuǎn)染的細胞培養(yǎng)基中。所得待轉(zhuǎn)染的細胞培養(yǎng)基中抗體或者拮抗劑的濃度可以是 0.01 μ g/ml-50 μ g/ml，優(yōu)選0. 05-12 μ g/ml，特別優(yōu)選0. 1-5 μ g/ml。所得待轉(zhuǎn)染細胞培養(yǎng) 基中抑制劑濃度可以是ΙηΜ-500 μ Μ，優(yōu)選5-100 μ Μ，特別優(yōu)選10-50 μ Μ。在本發(fā)明方法中，通過移液混合含有非病毒基因輸送系統(tǒng)的第二種溶液和含有待 轉(zhuǎn)染的遺傳物質(zhì)的第三種溶液(步驟(c))。對于每個待轉(zhuǎn)染的細胞，待轉(zhuǎn)染的遺傳物質(zhì)的 量為0. 1皮克/細胞-300皮克/細胞，優(yōu)選0. 2-50皮克/細胞，特別是1-10皮克/細胞， 可以使用待轉(zhuǎn)染的遺傳物質(zhì)。非病毒基因輸送系統(tǒng)的量由遺傳物質(zhì)的量決定。在非病毒基 因輸送系統(tǒng)與遺傳物質(zhì)靜電結(jié)合的情況中，所述量由基因輸送系統(tǒng)與遺傳物質(zhì)之間的電荷 比率(+/_)決定?；蜉斔拖到y(tǒng)遺傳物質(zhì)的電荷比率(+/_)可以是0. 1 1至100 1， 優(yōu)選1 1至20 1，特別優(yōu)選4 1至10 1。在非靜電結(jié)合的情況中，非病毒基因輸 送系統(tǒng)的量由與遺傳物質(zhì)的化學(xué)當量比率決定。非病毒基因輸送系統(tǒng)遺傳物質(zhì)的化學(xué)當 量比率可以是0.1 1至1000 1，優(yōu)選1 1?？梢詫⒑蟹遣《净蜉斔拖到y(tǒng)的第二種溶液與含有待轉(zhuǎn)染的遺傳物質(zhì)的第三 種溶液的混合物保溫1分鐘至30分鐘，優(yōu)選10-15分鐘。優(yōu)選地，在本發(fā)明的方法中，可以使用非病毒基因輸送系統(tǒng)，其包含陽離子脂質(zhì)， 特別是如上述化學(xué)式(I)所示陽離子脂質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明，在24小時后，可以重復(fù)進行步驟(a)-(e)，以再次用遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)染細 胞。優(yōu)選地，在第二次或者進一步轉(zhuǎn)染之前，應(yīng)用新鮮培養(yǎng)基置換其中待轉(zhuǎn)染細胞位于其中 的含有添加物的培養(yǎng)基。在本發(fā)明的方法中，可以將含有TLR 3、TLR 7、TLR 8或者TLR 9的拮抗劑或抗 體的第一種溶液與含有非病毒基因輸送系統(tǒng)的第二種溶液及含有待轉(zhuǎn)染的第三種溶液混 合。優(yōu)選地，將含有抗體/拮抗劑的第一種溶液加入含有非病毒基因輸送系統(tǒng)的第二種溶 液中并進行混合。抗體的使用量基于非病毒基因輸送系統(tǒng)量為0.1%-50% (重量)，優(yōu)選 0. 1-10% (重量)。非病毒基因輸送系統(tǒng)的量由使用的遺傳物質(zhì)的量決定。在非病毒基因 輸送系統(tǒng)與遺傳物質(zhì)靜電結(jié)合的情況中，所述量由基因輸送系統(tǒng)與遺傳物質(zhì)之間的電荷比 率(+/-)決定?；蜉斔拖到y(tǒng)遺傳物質(zhì)的電荷比率(+/-)可以是0. 1 1至100 1，優(yōu) 選1 1至20 1，特別優(yōu)選4 1至10 1。在非靜電結(jié)合的情況中，非病毒基因輸送 系統(tǒng)的量由相對于遺傳物質(zhì)的化學(xué)當量比率決定。非病毒基因輸送系統(tǒng)遺傳物質(zhì)的化學(xué) 當量比率可以是0.1 1至1000 1，優(yōu)選1 1。優(yōu)選將第一種溶液與第二種溶液的混 合物保溫至少5分鐘。然后將含有待轉(zhuǎn)染的遺傳物質(zhì)的第三種溶液加入第一種和第二種溶 液的保溫混合物中并進行混合。對于每個待轉(zhuǎn)染的細胞，待轉(zhuǎn)染的遺傳物質(zhì)的量是0. 1皮 克/細胞至300皮克/細胞，優(yōu)選0. 2-50皮克/細胞，特別優(yōu)選1-10皮克/細胞，可以使 用轉(zhuǎn)染的遺傳物質(zhì)，抗體/拮抗劑摻入包含非病毒基因輸送系統(tǒng)和遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)染活性復(fù) 合物中。優(yōu)選使用已經(jīng)用親脂性分子成分修飾以促進抗體/拮抗劑結(jié)合進脂復(fù)合物中的抗 體/拮抗劑。也可以使用已經(jīng)通過抗生物素蛋白/鏈霉抗生物素蛋白和生物素與非病毒基 因輸送系統(tǒng)連接的抗體。在這種情況中，基因輸送系統(tǒng)和抗體需要預(yù)先適當修飾。也可以 使用與非病毒基因輸送系統(tǒng)共價連接的TLR 3、TLR 7、TLR 8和TLR 9的抗體。本領(lǐng)域已知提供包含陽離子脂質(zhì)或者脂復(fù)合物的脂質(zhì)體的陽離子免疫脂質(zhì)體即 含有與抗體或者抗體片段共價結(jié)合的DNA和陽離子脂質(zhì)的復(fù)合物的方法。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)所述方
23法以使得基因輸送系統(tǒng)靶向機體中的靶細胞。大多數(shù)方法使用所謂的交聯(lián)劑。交聯(lián)劑是雙 功能分子，其在具有相應(yīng)官能團的兩個分子之間產(chǎn)生共價鍵連接。例如，Pierce提供了廣 泛選擇的水溶性和不溶于水的異雙功能(即適于連接兩個不同官能團)和同雙功能(適于 連接兩個相同官能團)交聯(lián)劑。羧基基團和氨基基團可用于連接抗體；在Fab片段的情況 中，可以使用硫醇基團連接。陽離子脂質(zhì)和聚合物含有氨基用以連接。在陽離子肽的情況 中，羧基和氨基基團可用于連接。陽離子免疫脂質(zhì)體可以通過與常規(guī)脂質(zhì)體相同方式配制，通過在配制之前 用脂質(zhì)衍生化抗體以及將其加入陽離子脂質(zhì)(可以是共脂質(zhì))中。對于通過同雙 功能交聯(lián)劑共價連接，例如DSP (dithiobis [succinimidylpropionate])氨基官能 團可用于連接具有與抗體共價連接的氨基官能團的脂質(zhì)。對于Fab片段與脂質(zhì)的 共價連接，可以使用硫醇官能團和交聯(lián)劑N-succinimidyl-4-(p-maleimidophenyl) butyrate(Martin et al. ;J. Biol. Chem. ； 1982257 (1)，286)或者 SPDP(N—succinimidyl 3- (2-pyridyldithio) -propionate).如果交聯(lián)劑不溶于水，必須在有機溶劑中進行抗體與 脂質(zhì)之間的這些結(jié)合反應(yīng)及純化，即必須在轉(zhuǎn)染之前除去所述有機溶劑。透析可用于純化。 如果加交聯(lián)劑如DSP可溶于水，在水溶液中脂質(zhì)與抗體之間通過例如氨基功能連接可以形 成共價鍵，在轉(zhuǎn)染之間純化不是絕對必要的。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知制備這種脂復(fù)合物的方法，所述脂復(fù)合物具有與脂質(zhì)共價結(jié) 合的修飾的抗體。然后所述脂復(fù)合物吸收修飾的抗體(Lee et al. ,J. Biomed. Sci. ；2003 ； 10 ；337)。技術(shù)人員也已知將陽離子聚合物例如PEI或者dendrimers或者陽離子蛋白質(zhì)如 聚賴氨酸與抗體或者抗體片段共價連接的方法(Chen et al.，F(xiàn)EBS Letters ； 1994 ；338 ； 167 ；Suh et al. J. ControlledRelease ；2001 ；72 ；171)；例如 PEI 與在 DMSO 中的 DPS 反 應(yīng)，加入于PBS中的抗體溶液中。在透析后，獲得與抗體結(jié)合的非病毒基因輸送系統(tǒng)(Chiu et al. , J. Controlled Release ；2004 ；97 ；357)。在本發(fā)明的方法中，第一種溶液可含有激動劑以激活TLR 7和/或TLR 8，特別是 上述那些激動劑之一。激動劑可溶解于緩沖鹽溶液中例如PBS、基本培養(yǎng)基等中，生理pH值 為6. 8-7. 45，生理克分子滲透壓濃度為270-310mOSmOl/kgH20，在水或者未緩沖的鹽溶液中 PH值為5-9。激動劑的濃度可以是0. 01-1 μ g/ μ 1。含有TLR 7和/或TLR 8激動劑的第 一種溶液可以在轉(zhuǎn)染之前、期間或者之后加入培養(yǎng)基中待轉(zhuǎn)染的細胞中。激動劑的處理時 間應(yīng)根據(jù)激動劑的性質(zhì)加以選擇，由此盡可能活性的先天性免疫系統(tǒng)遭遇盡可能高的大量 siRNA。優(yōu)選地，在將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入待轉(zhuǎn)染細胞的同時加入含有激動劑的第一種溶液，通 過將相應(yīng)量的第一種溶液加入培養(yǎng)基中進行。激動劑的量由細胞的量決定。優(yōu)選使用0. Ipg 激動劑/細胞至25ng激動劑/細胞，特別是l-500pg激動劑/細胞，更優(yōu)選10_250pg激動 劑/細胞。本發(fā)明的方法，即本發(fā)明的轉(zhuǎn)染方法，也可以在體內(nèi)實現(xiàn)，所述方法的步驟相應(yīng)于 在體外轉(zhuǎn)染的各個步驟，除外的是通過如下途徑加入各個溶液或者混合物經(jīng)口(P. O.)、 經(jīng)皮膚、舌下(s. 1.)、經(jīng)鼻、靜脈內(nèi)(i. v.)、關(guān)節(jié)內(nèi)、動脈內(nèi)(i. a.)、淋巴內(nèi)、肌內(nèi)(i.m.)、 intra-ossallyG.o.)、皮下(s.c.)、皮內(nèi)(i. c.)、經(jīng)皮膚、經(jīng)直腸、經(jīng)陰道、吸入(p. i.= per inhalation)、經(jīng)肺內(nèi)、支氣管內(nèi)(e.b.)、腹膜內(nèi)(i. p.)、心臟內(nèi)、神經(jīng)內(nèi)、神經(jīng)周圍、硬 腦膜周圍、鞘內(nèi)、胸膜內(nèi)、玻璃體內(nèi)、腸道外、經(jīng)腸道或者經(jīng)面頰給予。遺傳物質(zhì)的量由遺傳物質(zhì)的性質(zhì)、靶位如血液、組織的細胞外液、細胞組織等、給予形式以及給予模式如注入、注 射或者吸入等因素決定，所述量為0. 01-500mg/kg體重。在將第一種溶液直接給予個體的 情況中，抗體、拮抗劑或者激動劑的量可以是0. lmg/kg-500mg/kg體重，優(yōu)選1-lOOmg/kg， 特別優(yōu)選5-10mg/kg。在將第一種溶液直接給予個體的情況中，抑制劑的量可以是0. Img/ kg-500mg/kg體重，優(yōu)選10-300mg/kg，特別優(yōu)選100_200mg/kg。加入第一種溶液的時間和 持續(xù)時間由靶位決定，例如由血液、組織的細胞外液、細胞組織等、給予形式和給予模式如 注入、注射、吸入等因素決定。在體內(nèi)應(yīng)用的情況中，兩次轉(zhuǎn)染之間的時間間隔可以是直至6周。本發(fā)明提供了包含至少兩種如下成分的組合物a)非病毒基因輸送系統(tǒng)，C)遺傳物質(zhì)，以及b)至少部分抑制或者激活先天性細胞內(nèi)和/或細胞間免疫的工具。本發(fā)明還提供了包含至少兩種如下成分的試劑盒a)非病毒基因輸送系統(tǒng)，C)遺傳物質(zhì)，以及b)至少部分抑制或者激活先天性細胞內(nèi)和/或細胞間免疫的工具。。根據(jù)本發(fā)明，所述非病毒基因輸送系統(tǒng)包含陽離子脂質(zhì)、陽離子聚合物、陽離子蛋 白質(zhì)；和/或包含一種化合物，該化合物具有DNA-和/或RNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域，且能觸發(fā)受體 介導(dǎo)的胞吞作用或者膜轉(zhuǎn)移；和/或包含一種化合物，其與DNA和/或RNA共價結(jié)合，且能 觸發(fā)受體介導(dǎo)的胞吞作用或者膜轉(zhuǎn)移。根據(jù)本發(fā)明，使用的遺傳物質(zhì)可以是例如修復(fù)基因缺陷的遺傳物質(zhì)，例如遺傳物 質(zhì)，特別是修飾的或者未修飾的ssDNA、修飾的或者未修飾的dsDNA、修飾的或者未修飾的 ssRNA、修飾的或者未修飾的dsRNA和/或修飾的或者未修飾的siRNA。根據(jù)本發(fā)明，用于至少部分抑制和/或激活先天性細胞內(nèi)和/或細胞間免疫的工 具可以是至少一種活性降低或者活性增加效應(yīng)物。此外，本發(fā)明用于至少部分抑制先天性細胞內(nèi)和/或細胞間免疫的工具可以是抗 體、胞內(nèi)抗體、適體、拮抗劑、抑制劑和/或siRNA。優(yōu)選地，用作至少部分抑制先天性細胞內(nèi)和/或細胞間免疫的工具的抗體、胞內(nèi) 抗體、適體、拮抗劑、抑制劑和/或siRNA能阻斷先天性免疫系統(tǒng)的至少一個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)。此外，根據(jù)本發(fā)明，用于至少部分激活先天性細胞內(nèi)和/或細胞間免疫的工具可 以是激動劑。優(yōu)選地，用作至少部分激活先天性細胞內(nèi)和/或細胞間免疫的工具的激動劑能激 活先天性免疫系統(tǒng)的至少一個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)。本發(fā)明的至少部分抑制先天性細胞內(nèi)和/或細胞間免疫的工具包含能實現(xiàn)先天 性免疫系統(tǒng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)的蛋白質(zhì)敲低的遺傳物質(zhì)。另外，本發(fā)明的至少部分抑制先天性細胞內(nèi)和/或細胞間免疫的工具可以包含可 導(dǎo)致蛋白質(zhì)表達的遺傳物質(zhì)，能阻斷先天性免疫系統(tǒng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)中蛋白質(zhì)的活性。優(yōu)選地，本發(fā)明的用于轉(zhuǎn)染的組合物可包含(a)非病毒基因輸送系統(tǒng)以及(b)至 少部分抑制和/或激活先天性細胞內(nèi)和/或細胞間免疫的工具，所述非病毒基因輸送系統(tǒng)
25可以是(i)包含陽離子脂質(zhì)、陽離子聚合物或者陽離子蛋白質(zhì)；和/或(ii)包含一種化合物，該化合物具有DNA-和/或RNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域，且能觸發(fā)受體 介導(dǎo)的胞吞作用或者膜轉(zhuǎn)移；和/或(iii)包含一種化合物，該化合物與DNA和/或RNA共價結(jié)合，且能觸發(fā)受體介導(dǎo) 的胞吞作用或者膜轉(zhuǎn)移；對于至少部分抑制和/或激活先天性細胞內(nèi)和/或細胞間免疫的工具，其可以選 自(i)TLR UTLR 2、TLR 3、TLR 4、TLR 5、TLR 6、TLR 7、TLR 8、TLR 9、TLR 10、TLR 11、TLR 12或者TLR 13的抗體；(ii)細胞因子受體的抗體或者細胞因子受體拮抗劑；(iii)激酶MEKl和/或MEK2的抑制劑；(iv) TLR7和/或TLR8的激動劑，選自溴匹立明(2_氨基_5_溴_6_苯基_4_嘧啶 酮)、咪唑并喹啉、噻唑并喹啉和鳥苷類似物；以及(ν)其組合。本發(fā)明的用于轉(zhuǎn)染的試劑盒可優(yōu)選包含(a)非病毒基因輸送系統(tǒng)以及(b)至少部 分抑制和/或激活先天性細胞內(nèi)和/或細胞間免疫的工具，對于非病毒基因輸送系統(tǒng)，其可 以是(i)包含陽離子脂質(zhì)、陽離子聚合物或者陽離子蛋白質(zhì)；和/或 (ii)包含一種化合物，該化合物具有DNA-和/或RNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域，且能觸發(fā)受體 介導(dǎo)的胞吞作用或者膜轉(zhuǎn)移；和/或(iii)包含一種化合物，該化合物與DNA和/或RNA共價結(jié)合，且能觸發(fā)受體介導(dǎo) 的胞吞作用或者膜轉(zhuǎn)移；對于至少部分抑制和/或激活先天性細胞內(nèi)和/或細胞間免疫的工具，其可以選 自(i)TLR UTLR 2、TLR 3、TLR 4、TLR 5、TLR 6、TLR 7、TLR 8、TLR 9、TLR 10、TLR 11、TLR 12或者TLR 13的抗體；(ii)細胞因子受體的抗體或者細胞因子受體拮抗劑；(iii)激酶MEKl和/或MEK2的抑制劑；(iv) TLR7和/或TLR8的激動劑，選自溴匹立明(2_氨基_5_溴_6_苯基_4_嘧啶 酮)、咪唑并喹啉、噻唑并喹啉和鳥苷類似物；以及(ν)其組合。更優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物或者試劑盒包含含有陽離子脂質(zhì)的非病毒基因輸送系 統(tǒng)。此外，本發(fā)明的組合物或者試劑盒可包含含有如下化學(xué)式所示陽離子脂質(zhì)的非病 毒基因輸送系統(tǒng) 其中R1可以是 其中R2和R3獨立地是十二烷基、十二烯基、十四烷基、十四烯基、十六烷基、十六烯基、 十八烷基、十八烯基或其它烷基，在所有可能的組合中，它們可以是飽和的、不飽和的、支鏈 的、非支鏈的、氟化的或者非氟化的，且可以由5-30個碳原子組成；X可以是 其中m = 0 及 η = 0 ；或者 m = 0 及 η = 1 ；或者 m = 0 及 η = 2 ；或者 m = 1 及 η = 1 ； 或者m= 1及η = 2 ；或者m = 2及η = 2 ；以及g可以是1，2，3，4，5，6，7或8 ;a可以是0， 1，2，3，4，5 或 6 ;b 可以是 0，1，2，3，4，5 或 6 ；c 可以是 0，1，2，3，4，5 或 6 ;d 可以是 0，1，2， 3，4，5 或 6 ;e 可以是 0，1，2，3，4，5 或 6 ;f 可以是 0，1，2，3，4，5 或 6。優(yōu)選地，在陽離子脂質(zhì)中，R2和R3獨立地是十二烷基、十二烯基、十四烷基、十四烯 基、十六烷基、十六烯基、十八烷基、十八烯基；m和η可以是1 ；g可以是1，2，3，4，5，6，7或 8 ；a可以是0，1，2，3，4，5 或6 ；b 可以是 0，1，2，3，4，5 或 6 ；c 可以是 0，1，2，3，4，5 或 6 ;d 可 以是 0，1，2，3，4，5 或 6 ;e 可以是 0，1，2，3，4，5 或 6 ;f 可以是 0，1，2，3，4，5 或 6。根據(jù)本發(fā)明，所述組合物或者試劑盒可含有修飾的或者未修飾的遺傳物質(zhì)，特別 是修飾的或未修飾的ssDNA，修飾的或者未修飾的dsDNA，修飾的或者未修飾的ssRNA，修飾 的或者未修飾的dsRNA和/或修飾的或者未修飾的siRNA。優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物或者試劑盒可含有如下成分作為至少部分抑制和/或 激活先天性細胞內(nèi)和/或細胞間免疫的工具1，4_ 二氨基-2，3- 二氰-1，4- 二(ο-氨基 苯基巰基)丁二烯(U0126)；咪喹莫特(R837，l-(2-甲基丙基)-IH-咪唑并[4，5_c]喹 啉-4-胺)；瑞喹莫德(R848，4-氨基-2-(乙氧基甲基)_a，a_ 二甲基-IH-咪唑并[4， 5-c]喹啉-1-乙醇)；Gardiquimod (1- (4-氨基-2-乙基氨基甲基咪唑并[4，5_c]喹 啉-1-基)-2-甲基丙-2-醇)；CL075 ；CL097 ；洛索立賓(7-烯丙基-7，8- 二氫_8_氧-鳥 苷)；艾沙托立賓(7-硫代-8-氧鳥苷)；溴匹立明(2-氨基-5-溴-6-苯基-4-嘧啶酮)； 或其任何組合。此外，本發(fā)明的組合物或者試劑盒可含有TLR 3、TLR 7、TLR 8或者TLR 9的抗體
((
CH2-)-N-
4 I
27作為至少部分抑制和/或激活先天性細胞內(nèi)和/或細胞間免疫的工具。另外，本發(fā)明的組合物或者試劑盒可含有抗體或者拮抗劑作為至少部分抑制和/ 或激活先天性細胞內(nèi)和/或細胞間免疫的工具，所述抗體或者拮抗劑是白細胞介素-ι-受 體的抗體或者拮抗劑，特別是IL-ra的抗體或者拮抗劑；I型干擾素受體的抗體或者拮抗 劑；干擾素-Y受體的抗體或者拮抗劑或者腫瘤壞死因子受體的抗體或拮抗劑。在優(yōu)選的實施方案中，至少部分抑制和/或激活免疫的多個上述工具可以彼此組 合，也就是說根據(jù)本發(fā)明可以使用兩個、三個或者多個成分以至少部分抑制和/或激活先 天性細胞內(nèi)和/或細胞間免疫。同樣可以使用多個上述成分a)和/或b)和/或c)。在本發(fā)明的試劑盒中，可以是-所有成分彼此單獨存在，或者-成分a)和b)存在于一起，或者-成分a)和c)存在于一起，或者
-成分b)和C)存在于一起。優(yōu)選地，所述試劑盒中可以是-所有成分完全彼此單獨存在，或者-成分a)和b)彼此單獨存在，或者-成分a)和b)存在于一起。例如，所述成分可以彼此單獨存在，例如在包裝在一起的玻璃或者塑料容器中，或 者兩種成分一起或者多種成分一起在合適的容器中。本發(fā)明的試劑盒可含有非病毒基因輸送系統(tǒng)，該系統(tǒng)是鹽形式，特別是配制為脂 質(zhì)體/微團形式；溶液形式，特別是水溶液、鹽溶液、緩沖的鹽溶液如HEPES緩沖鹽溶液，或 者在生理可接受的溶劑如乙醇/DMSO中的溶液凍干形式；固體形式或者膜形式。非病毒基 因輸送系統(tǒng)的溶液優(yōu)選PH值為5-9。培養(yǎng)基中非病毒基因輸送系統(tǒng)的終濃度為0. Ol-IOmg/ ml ο至少部分抑制和/或激活先天性細胞內(nèi)和/或細胞間免疫的工具如抗體、拮抗劑 或者抑制劑，可以包含于本發(fā)明的試劑盒中，可以是凍干形式、溶解于水中、鹽溶液、緩沖的 鹽溶液如PBS緩沖鹽溶液或者合適的有機溶劑如乙醇DMSO等中的形式。溶液優(yōu)選pH值為 5-9。任選可以存在穩(wěn)定劑。至少部分抑制和/或激活先天性細胞內(nèi)和/或細胞間免疫的 工具優(yōu)選濃度為0. 01-10mg/ml。含有遺傳物質(zhì)的試劑盒可含有凍干形式、溶解于水中、鹽溶液或者緩沖的鹽溶液 如TE緩沖鹽溶液形式的遺傳物質(zhì)。遺傳物質(zhì)的溶液優(yōu)選pH值為5-9。培養(yǎng)基中遺傳物質(zhì) 的終濃度優(yōu)選為0. 01-10mg/ml。本發(fā)明的組合物和/或本發(fā)明的試劑盒可用于進行本發(fā)明的方法。此外本發(fā)明的組合物可以是藥物組合物形式，本發(fā)明的試劑盒可以是藥物試劑盒 形式。另外，本發(fā)明的組合物和試劑盒可用于通過基因療法治療疾病。所述疾病可以是例如囊性纖維化、肌營養(yǎng)不良癥、苯丙酮尿癥、楓糖漿病、 Propionazidaemia,甲基丙二酸血癥、腺苷脫氨酶缺乏癥、高膽固醇血癥、血友病、β -地中 海貧血、癌癥、病毒性疾病、黃斑變性、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化和/或炎癥疾病。
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本發(fā)明還可用于進行轉(zhuǎn)染，不用將細胞的表達譜改變?yōu)椴幌Ｍ某潭?。這在體內(nèi) 應(yīng)用中特別有意義，其中免疫系統(tǒng)的激活通常存在問題。在通過SiRNA敲低參與的蛋白質(zhì)研究信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的情況中，細胞表達譜的不必 要的改變特別不合適，尤其因為已知信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)通常彼此影響。
實施例一般材料l.Hela 細胞2. Metafectene Pro, T040-1. 0, Biontex Laboratories3. 24-孔平板，TPP, Product No. 920244. 48-孑L平板，Corning Inc.，Costar, Product No. 35485. DMEM，PAA，Cat. No. E15-8836. FCS Mycoplex, PAA, Cat. No. E15—7737. pCMV-lacZ, Product No. PF462-060207, PlasmidFactory, c = lmg/mlin WFI8. β -半乳糖苷酶測定試劑盒，Stratagene9. Hela-Luc細胞(用熒光素酶穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞)10.熒光素酶測定試劑盒，Promega11. BCA 蛋白質(zhì)測定試劑盒，Thermo Scientific, Product No. 2322712. 二甲基亞砜(分子生物學(xué) DMS0)，F(xiàn)luka ；No. 4163913. siRNA，脫鹽的，30ρΜο1/μ 1于通用緩沖液中(siMAX，得自MWG)針對熒光素酶GL3(抗熒光素酶-siRNA)有義序列CUUACGCUGAGUACUUCGAtt反義序列UCGAAGUACUCAGCGUAAGtt非特異性對照物有義序列AGGUAGUGUAAUCGCCUUGtt反義序列CAAGGCGAUUACACUACCUtt實施例1材料1.抗人IFN β的綿羊多克隆抗體，PBL Biomedical Laboratories,產(chǎn)品號 31400-1，0. 25mg/ml (估計)，2 X IO4 單位 /ml。實驗的詳細描述第一天將HeLa細胞接種于24孔平板中，細胞以500 μ 1完全培養(yǎng)基(10% FCS) 的2. 3XIO5細胞/孔的細胞計數(shù)鋪板。然后在CO2溫箱(10% )中保溫24小時。第二天首先解凍抗體(綿羊抗人IFNii多克隆抗體)。然后加入400 μ 1的PBS (磷酸鹽 緩沖鹽水)，輕輕混合。目前抗體濃度為0.05 μ g/μ 1。然后在該24孔平板的孔中提供如 下量的抗體123456A0μ g(0p 1)0. 25 μ g (5 μ 1)0. 5μ g(10p 1)1μ g(20p 1)1. 5μ g(30p 1)3μ g(60p 1)B0μ g(0p 1)0. 25 μ g (5 μ 1)0.5pg(10pl)1μ g(20p 1)1. 5μ g(30p 1)3μ g(60p 1)C0μ g(0p 1)0. 25 μ g (5 μ 1)0.5pg(10pl)1μ g(20p 1)1. 5μ g(30p 1)3μ g(60p 1)D0μ g(0p 1)0. 25 μ g (5 μ 1)0.5pg(10pl)lpg(20pl)1. 5μ g(30p 1)3μ g(60p 1)然后在溫箱中保溫0.5小時。在此期間制備脂復(fù)合物。為此，將26μ1的 DNA(pCMV-lacZ)移液至1300 μ 1的PBS中，通過輕輕上下移液混合。同樣將104 μ 1的 Metafectene Pro移液至1300 μ 1的PBS中，通過輕輕上下移液混合。然后將這兩個溶液混 合，保溫15分鐘。最后，在每個孔中加入100 μ 1的脂復(fù)合物溶液。在CO2溫箱(10% )中保溫24小 時。第三天在第三天，更新C和D行的培養(yǎng)基。對這些行重復(fù)脂復(fù)合物制備和轉(zhuǎn)染步驟。然 后在CO2溫箱(10% )保溫24小時。第四天報道基因測定使用半乳糖苷酶測定試劑盒根據(jù)廠商指導(dǎo)獲得轉(zhuǎn)染效率。使平板顯色，直至 在微平板讀數(shù)器中測量到吸光度1-2的黃色，然后立即停止。記錄保溫時間。使用微平板 讀數(shù)器讀取數(shù)值，計算平均值。結(jié)果保溫時間9. 5分鐘3次測量的平均值
123456A0. 7170. 6890. 6500. 6520. 6350. 509B0. 6680. 6720. 6900. 6790. 7140. 525C0. 8580. 8231. 2281. 6901. 8520. 975D1. 5011. 8051. 5181. 8862. 0171. 909A和B行是一式兩份的單次轉(zhuǎn)染結(jié)果。C和D行是一式兩份重復(fù)轉(zhuǎn)染結(jié)果。計算 平均值。
123456 圖 1實施例2材料1.小鼠抗人干擾素α / β受體第2鏈單克隆抗體(⑶118)，克隆MMHAR-2，同種型 Ig2a，濃度(C) = 0. 5mg/ml于含有0. 1 %牛血清白蛋白(BSA)的PBS (磷酸鹽緩沖鹽水) 中，PBL Biomedical Laboratories, Product No. 21385。實驗的詳細描述與實施例1類似不同之處首先在400μ1的PBS (磷酸鹽緩沖鹽水)中加入所述抗體(小鼠抗人干擾素α/ β受體鏈單克隆抗體)，輕輕混合。目前抗體濃度為0.1 μ g/μ 1。在24孔平板孔中加入如 下量的抗體 在與抗體保溫5小時之后加入脂復(fù)合物。結(jié)果保溫時間4分鐘。3次測量的平均值
123456A1. 2691. 1131. 1631. 1851. 2141. 084B1. 1321. 1021. 0881. 2291. 1131. 154C1. 1271. 4381. 5331. 3781. 5041. 367D1. 3951. 3931. 3771. 4171. 4591. 467
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A和B行是一式兩份的單次轉(zhuǎn)染結(jié)果。C和D行是一式兩份重復(fù)轉(zhuǎn)染結(jié)果。計算 平均值。 圖 2實施例3使用受體和細胞因子的抗體進一步實驗。實驗的詳細描述第一天將HeLa細胞接種于48孔平板中，細胞以250 μ 1完全培養(yǎng)基(10% FCS) 的1.2Χ IO5細胞/孔的細胞計數(shù)鋪板。然后在CO2溫箱(10%)中保溫24小時。第二天將抗體濃度用PBS調(diào)節(jié)為0. 05 μ g/ μ 1。然后在48孔平板的孔中加入如下量的抗 體 然后根據(jù)抗體情況在溫箱中保溫5小時或者0.5小時。制備脂復(fù)合物。為此，將 13 μ 1的DNA (pCMV-lacZ)移液至650 μ 1的PBS中，通過輕輕上下移液混合。同樣將52 μ 1 的Metafectene Pro移液至650 μ 1的PBS中，通過輕輕上下移液混合。然后將這兩個溶液 混合，保溫15分鐘。最后，在每個孔中加入50 μ 1的脂復(fù)合物溶液。在CO2溫箱(10%)中 保溫24小時。第三天在第三天，更新C和D行的培養(yǎng)基。對這些行重復(fù)脂復(fù)合物制備和轉(zhuǎn)染步驟。然 后在CO2溫箱(10% )保溫24小時。
第四天報道基因測定與實施例1類似(這個實驗使用實施例1的半量)結(jié)果抗體小鼠抗人-CD282抗體(=抗-TLR2)，單克隆抗體 AbD Serotec，Cat. No. MC2484E。在轉(zhuǎn)染之前與抗體的預(yù)保溫時間5小時報道基因測定時間5分鐘3次測量的平均值 第1列和第2列是一式兩份單次轉(zhuǎn)染結(jié)果。第3列和第4列是一式兩份重復(fù)轉(zhuǎn)染 結(jié)果。計算平均值。 圖 3抗體小鼠抗人TLR3 抗體，單克隆抗體，Lifespan Biosciences Cat. No. LS-C18685在轉(zhuǎn)染之前與抗體預(yù)保溫時間5小時。報道基因測定時間5. 5分鐘。3次測量的平均值 第1列和第2列是一式兩份單次轉(zhuǎn)染結(jié)果。第3列和第4列是一式兩份重復(fù)轉(zhuǎn)染 結(jié)果。計算平均值。 圖 4抗體小鼠抗人CD284 抗體(=抗 TLR4)，單克隆抗體，AbD Serotec. Cat. No. MCA2061EL在轉(zhuǎn)染之前與抗體預(yù)保溫時間5小時。報道基因測定時間5. 5分鐘。3次測量的平均值 第1列和第2列是一式兩份單次轉(zhuǎn)染結(jié)果。第3列和第4列是一式兩份重復(fù)轉(zhuǎn)染 結(jié)果。計算平均值。 圖 5抗體小鼠抗人TLRl抗體(單克隆抗體，0. 05%疊氮化鈉，lOOyglyophilisate)； Invivogen,No.Mab—htlrl為了除去疊氮化鈉，將該抗體用PBS透析透析膜Spectra/PorDispoDialyser (500 μ 1，纖維素酯膜，25000Da 分子量截斷 值)；Spectrum Laboratories ；No. 135492，Lot 3224004在轉(zhuǎn)染之前與抗體預(yù)保溫時間5小時。報道基因測定時間4分鐘。3次測量的平均值 第1列和第2列是一式兩份單次轉(zhuǎn)染結(jié)果。第3列和第4列是一式兩份重復(fù)轉(zhuǎn)染 結(jié)果。計算平均值。 圖 6實施例4使用拮抗劑進一步實驗。實驗的詳細描述第一天與實施例3類似。第二天將拮抗劑濃度用PBS調(diào)節(jié)為0. 025 μ g/ μ 1。然后在48孔平板的孔中加入如下量
的抗體。 在溫箱中保溫7小時。制備脂復(fù)合物。為此，將13 μ 1的DNA(pCMV-lacZ)移液至 650 μ 1的PBS中，通過輕輕上下移液混合。同樣將52 μ 1的Metafectene Pro移液至650 μ 1 的PBS中，通過輕輕上下移液混合。然后將這兩個溶液混合，保溫15分鐘。最后，在每個孔 中加入50 μ 1的脂復(fù)合物溶液。在CO2溫箱(10% )中保溫24小時。第三天與實施例3類似。第四天報道基因測定與實施例1類似(使用實施例1的半量)結(jié)果拮抗劑
人白細胞介素-1受體拮抗劑(人 ILl-ra)，Biomol，Cat. No. 54592在轉(zhuǎn)染之前與抗體預(yù)保溫時間7小時報道基因測定時間10分鐘。3次測量的平均值 第1列和第2列是一式兩份單次轉(zhuǎn)染結(jié)果。第3列和第4列是一式兩份重復(fù)轉(zhuǎn)染 結(jié)果。計算平均值。 圖 7實施例5使用激酶抑制劑進一步實驗。MEKl 和 MEK2 抑制劑皿126，1，4-二氨基-2，3-二氰-1，4_二(0-氨基苯基巰基)丁二烯，分子量= 380. 5, Invivogen, Cat. No. :tlr_u0126o實驗的詳細描述第一天將HeLa細胞接種于48孔平板中，細胞以250 μ 1完全培養(yǎng)基(10% FCS) 的0. 8Χ IO5細胞/孔的細胞計數(shù)鋪板。然后在CO2溫箱(10% )中保溫24小時。第二天將Img抑制劑溶解于100 μ 1的DMSO中(原液)。然后用PBS以1 20稀釋(工
作溶液)。然后在48孔平板的孔中加入如下量的抑制劑。 在溫箱中保溫2小時。然后制備脂復(fù)合物。為此，將5 μ 1的DNA(pCMV-lacZ)移 液至250 μ 1的PBS中，通過輕輕上下移液混合。同樣將20 μ 1的Metafectene Pro移液至 250 μ 1的PBS中，通過輕輕上下移液混合。然后將這兩個溶液混合，保溫15分鐘。最后，在每個孔中加入50 μ 1的脂復(fù)合物溶液。在CO2溫箱(10% )中保溫48小時。第三天在第三天更新培養(yǎng)基，用表中指示量的抑制劑置換。重復(fù)脂復(fù)合物制備和轉(zhuǎn)染步 驟，不進行保溫。然后在0)2溫箱(10%)中保溫24小時。第四天報道基因測定與實施例1類似(使用實施例1的半量)。結(jié)果在轉(zhuǎn)染之前與抑制劑的預(yù)保溫時間2小時。報道基因測定時間10分鐘。3次測量的平均值 圖 8實施例6使用！fepG2細胞進一步實驗程序與實施例3類似。不同之處!fepG2細胞，抗體濃度0. 1 μ g/ μ 1代替在PBS中0. 05 μ g/μ 1。在無血清DMEM中代替在PBS中形成脂復(fù)合物?？贵w小鼠抗人-CD282抗體(=抗 TLR2)，單克隆抗體，AbD Serotec，Cat. No. MC2484EL。在轉(zhuǎn)染之前與抗體的預(yù)保溫時間5小時。報道基因測定時間4分鐘。3次測量的平均值 第1列和第2列是一式兩份單次轉(zhuǎn)染結(jié)果。第3列和第4列是一式兩份重復(fù)轉(zhuǎn)染 結(jié)果。計算平均值。 圖 9實施例7使用摻入脂復(fù)合物中TLR9抗體進一步實驗?？贵w兔抗人-TLR9抗體(=抗TLR9)，多克隆抗體，0. 5 μ g/μ 1于PBS、0. 2%凝膠、 0. 05%疊氮化鈉中，Lifespan Biosciences Cat. No. :MCA2484EL。為了除去疊氮化鈉，將抗體用PBS透析。透析膜Spectra/PorDispoDialyser (500 μ 1，纖維素酯膜，25000Da 分子量截斷 值)；Spectrum Laboratories ；No. 135492, Lot 3224004。實驗的詳細描述第一天將HeLa細胞接種于48孔平板中，細胞以250 μ 1完全培養(yǎng)基(10% FCS) 的1.0Χ IO5細胞/孔的細胞計數(shù)鋪板。然后在CO2溫箱(10%)中保溫24小時。第二天將抗體用PBS 調(diào)節(jié)為濃度 0. 1 μ g/ μ 1。將 15mg 的 DNA (pCMV β Gal)禾Π 60 μ 1 的 Metafectene Pro均溶解于300 μ 1無血清DMEM中。通過輕輕上下移液混合各個溶液。制
備如下成分的脂復(fù)合物。
首先將Metafectene Pro溶液與抗體溶液組合，在室溫(RT)保溫5分鐘。然后加 入DNA溶液和無血清DMEM，在室溫再保溫15分鐘。 將50 μ 1的DNA-抗體-脂質(zhì)復(fù)合物移液至每個孔中，溶液1移液至第1列的4個 孔中，溶液2移液至第2列的4個孔中，如此類推。在CO2溫箱(10%)中保溫24小時。第三天更新所有行的培養(yǎng)基。C和D行進行與第一天的轉(zhuǎn)染類似的二次轉(zhuǎn)染。第四天報道基因測定=與實施例1類似(使用實施例1的半量)。結(jié)果3次測量的平均值 第1列和第2列是一式兩份單次轉(zhuǎn)染結(jié)果。第3列和第4列是一式兩份重復(fù)轉(zhuǎn)染 結(jié)果。計算平均值。 抗體的添加量相應(yīng)于如下每孔的抗體量 圖 10實施例8在存在激酶抑制劑的條件下SiRNA轉(zhuǎn)染-p38/RK MAPK 抑制劑SB203580，Invivogen ；No. tirl_sb20
-MEK 抑制劑U0126，Invivogen, No. tlr-u0126實驗的詳細描述第一天將HeLa-Luc細胞接種于48孔平板中，細胞以250 μ 1完全培養(yǎng)基(10% FCS)的1. 5X IO5細胞/孔的細胞計數(shù)鋪板。然后在CO2溫箱(10% )中保溫24小時。第二天首先制備抑制劑SB203580 (Μ = 377. 43g/mol)將其 Img 溶解于 20 μ 1 DMSO 中。將該原液用 PBS 1 105稀釋。UO126 (Μ = 380. 49g/mol)將 Img 抑制劑溶解于 100 μ 1 DMSO 中。將該原液用 PBS 1 20稀釋。為48孔平板的孔提供如下量的抑制劑 在溫箱中保溫2小時。然后制備脂復(fù)合物。為此，將1 μ 1的抗熒光素酶-SiRNA 原液移液至300 μ 1的PBS中，通過輕輕上下移液混合。對于該溶液，僅進一步使用240 μ 1。 將1 μ 1的非特異性對照siRNA移液至300 μ 1的PBS中，通過輕輕上下移液混合。對于該 溶液，僅進一步使用40 μ 1。將3 μ 1的Metafectene Pro移液至225 μ 1的PBS中，同樣通過輕輕上下移液混 合。然后將190 μ 1移液至抗熒光素酶-SiRNA工作溶液中，將35 μ 1移液至非特異性對 照-siRNA工作溶液中。將溶液混合，保溫15分鐘。獲得siRNA試劑比率為1 5 μ g/μ 1 的脂復(fù)合物。最后，將15 μ 1抗熒光素酶-siRNA-脂復(fù)合物溶液移液至平板的前6行中。將 15 μ 1非特異性對照-siRNA-脂復(fù)合物溶液導(dǎo)入該平板的第7行。獲得IpMol/孔的siRNA 量。第8行保持未轉(zhuǎn)染。然后在CO2溫箱(10%)中保溫24小時。第三天在第三天，更新所有孔的培養(yǎng)基，用表中指示量的抑制劑置換。在加入抑制劑之 后，對E和C列重復(fù)脂復(fù)合物制備和轉(zhuǎn)染步驟。然后在CO2溫箱(10%)中再保溫24小時。第四天熒光素酶測定和BCA蛋白質(zhì)測定這兩個測定均根據(jù)廠商指導(dǎo)進行。評估
從48孔平板中除去培養(yǎng)基，將細胞用100 μ 1的PBS洗滌。然后加入120 μ 1熒光 素酶裂解緩沖液。將該平板在冰上保溫大約30分鐘，通過小心振蕩(叩擊)20-30秒混合。 然后從該48孔平板的每個孔中取出25μ 1，導(dǎo)入另一個相似48孔平板中。使用第一個平板 進行熒光素酶測定，使用第二個平板進行BCA測試。熒光素酶測定光度計的參數(shù)設(shè)置-測量時間15秒-溶液注射間隔時間0.5秒-溶液注射與測量間隔時間0.1秒。BCA蛋白質(zhì)測定-在562nm波長評估。所有測量均進行3次。在熒光素酶測定中，三次測量使用三個新的細胞提取物。得 自熒光素酶測定(RLU)的數(shù)值根據(jù)1細胞提取物和1秒鐘測量時間標準化。得自BCA 蛋白質(zhì)測定的數(shù)值同樣根據(jù)1 μ 1細胞提取物標準化。熒光素酶測定RLU/ μ 1細胞提取物/秒3x3次測量的平均值 BCA 測定ABS/ μ 1細胞提取物3次測量的平均值 圖 11實施例9在存在TLR7/8激動劑條件下siRNA轉(zhuǎn)染-咪喹莫特，InvivoGen,Cat. No. :tirl_imq-ssRNA40/LyoVec, InvivoGen, Cat. No. :tirl-Irna-40實驗的詳細描述第一天細胞的制備將細胞以250 μ 1完全培養(yǎng)基的2Χ IO4細胞/cm2/孔的細胞計數(shù)鋪板。脂復(fù)合物的制備首先，將48孔平板前3排的前5個孔均填充30 μ 1的PBS。用PBS將抗熒光素酶-siRNA和非特異性對照-siRNA的原液調(diào)節(jié)為濃度 lpmol/10 μ 1。然后將10 μ 1抗熒光素酶-siRNA工作溶液移液至所述48孔平板的前三排 的前三個孔中。將10 μ 1非特異性對照-siRNA工作溶液移液至每個第四個孔中。將Metafectene Pro試劑用PBS以1 300稀釋。將20 μ 1該稀釋液導(dǎo)入含有 siRNA的每個孔中。將脂復(fù)合物在室溫保溫20分鐘。然后將250 μ 1細胞懸浮液加入每個孔中。類似充填第二個平板。激動劑的添加將兩種不同的激動劑加入這兩個48孔平板的前2列中，使用三種不同工作濃度的 激動劑。所述激動劑是凍干形式。將其用無內(nèi)毒素水溶解，形成濃度為100yg/ml的原液。 將該原液用水1 10稀釋，產(chǎn)生工作溶液。
對于咪喹莫特工作溶液，將0. 78 μ 1 ( = 0. 25 μ g/ml終濃度)移液至Al，將 15. 5 μ 1 ( = 5 μ g/ml)移液至 A2，以及將 31 μ 1 (= 10 μ g/ml)移液至 A3。
對于 ssRNA40/LyoVec 工作溶液，將 0. 78 μ 1 ( = 0. 5 μ g/ml 終濃度 ssRNA40)移液 至 Bi，將 15·5μ 1( = 5 μ g/ml)移液至 B2 以及將 31 μ 1( = 10 μ g/ml)移液至 B3。在加入激動劑之后，將這兩個48孔平板在CO2溫箱中保溫48小時。第三天牛存率確定在保溫48小時后，將平板的細胞用胰蛋白酶消化，使用Neubauer計數(shù)板對用臺盼 藍染色的每個孔進行生存率測量。熒光素_測丨定禾口 BCA蛋白質(zhì)測丨定13類似。結(jié)果臺盼藍染色評估40-70個細胞。 熒光素酶測定RLU/ μ 1細胞提取物/秒
3x3次測量的平均值 BCA測定ABS/ μ 1細胞提取物3x3次測量的平均值 圖 12本發(fā)明實施例的結(jié)果也使得可以得出結(jié)論，即不僅遺傳物質(zhì)而且化學(xué)物質(zhì)如陽離 子脂質(zhì)和陽離子聚合物也被TLR檢測。根據(jù)本發(fā)明的結(jié)果，必須假定在Hela細胞、作為轉(zhuǎn)染 劑的Metafectene Pro及高品質(zhì)DNA(質(zhì)粒)的情況中，包括如下TLR。TLR 4檢測質(zhì)粒溶 液中LPS的蹤跡。TLR9和TLR3檢測遺傳物質(zhì)，即在這種情況中質(zhì)?；蛘呦鄳?yīng)的雜質(zhì)。TLRl 和TLR2檢測轉(zhuǎn)染劑。因此一種可能的但不確切的解釋也可能是不同的細胞與不同比率的遺傳物質(zhì)和 轉(zhuǎn)染劑呈現(xiàn)最佳結(jié)果。例如對于轉(zhuǎn)染劑而言表達大量TLR9和少量TLR的細胞應(yīng)因此呈現(xiàn) 最佳結(jié)果，其中小量DNA遇到大量轉(zhuǎn)染劑。顯然在轉(zhuǎn)染之前和期間TLR的激活依賴于大量因子。例如，根據(jù)靶細胞的表達譜， 所述細胞可以對于某些PAMP特別敏感。此外，不同試劑和不同遺傳物質(zhì)可以激活不同TLR。 甚至不同DNA序列也可以根據(jù)CpG含量而對于轉(zhuǎn)染結(jié)果起作用。最后但并非最不重要的一 點是，不可低估雜質(zhì)所起作用。例如，細菌源的DNA可以污染例如LPS或者鞭毛蛋白或者 RNA。ssRNA可以污染dsRNA，且因此除了 TLR7/8之外，TLR3也可以應(yīng)答，反之亦然。對于 細胞的不同處理由于應(yīng)激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)而可以導(dǎo)致不同結(jié)果。概括而言，可以說對于不同 的轉(zhuǎn)染實驗需要不同的阻斷策略。可以同樣解釋關(guān)于單次和重復(fù)轉(zhuǎn)染阻斷先天性免疫系統(tǒng)的不同轉(zhuǎn)染結(jié)果。已知胞 吞作用(即外膜轉(zhuǎn)運)很大程度上受激酶調(diào)節(jié)。通過快速磷酸化途徑，在檢測病原性相關(guān) 模式時，細胞可以負調(diào)節(jié)胞吞作用且因此關(guān)閉病原體的入口。由于信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)也通過激酶傳導(dǎo)信號，因此在此可以設(shè)想是相關(guān)的。在早如第一次轉(zhuǎn)染時即出現(xiàn)轉(zhuǎn)染效率顯著增加 表明快速防御機制已經(jīng)被抑制，即大概也是膜轉(zhuǎn)運所致。通過特定蛋白質(zhì)或者細胞因子的 表達進行的防御機制相當持久，且在僅可用于雙重轉(zhuǎn)染的時間范圍內(nèi)有效。在重復(fù)轉(zhuǎn)染之 后一天出現(xiàn)轉(zhuǎn)染效率增加表明對于防御機制重要的一或多個蛋白質(zhì)的表達降低。只有在SiRNA轉(zhuǎn)染的情況中，通過TLR激活可以實現(xiàn)轉(zhuǎn)染結(jié)果得以改進，因為在這 種情況中必需的RNAi機制是先天性免疫系統(tǒng)的組成成分。然而，在這種情況中，各個信號 轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的阻斷也是有利的(ExampIeUO 126)。正如所提及的，本發(fā)明可用于治療目的。特別地，本發(fā)明可用于如下疾病的基因治 療例如囊性纖維化、肌營養(yǎng)不良癥、苯丙酮尿癥、楓糖漿病、Propionazidaemia、甲基丙二 酸血癥、腺苷脫氨酶缺乏癥、高膽固醇血癥、血友病、β _地中海貧血和癌癥。當激素、生長因 子、細胞毒素或者具有免疫調(diào)節(jié)作用的蛋白質(zhì)在生物體內(nèi)合成時，基因治療方法也是感興 趣的。對于上述目的，通過本發(fā)明可以將DNA片段有效地導(dǎo)入細胞中，在此這個DNA能展示 希望的作用而不引起不希望的副作用。希望的作用可以是代替患病的細胞類型中缺失或缺 陷的DNA區(qū)域或者抑制觸發(fā)該疾病的DNA區(qū)域(例如通過反義-DNA/RNA或者siRNA)。以 此方式，例如可以用于癌癥治療中的腫瘤抑制基因，或者通過導(dǎo)入調(diào)節(jié)膽固醇的基因防止 心血管疾病。此外，編碼核酶、siRNA或者shRNA的DNA、或者核酶或者siRNA自身可以插入 患病細胞中。DNA的翻譯產(chǎn)生活性核酶或者siRNA，其在特定位點催化裂解m-RNA，及以此方 式阻止轉(zhuǎn)錄。以此方式，例如病毒m-RNA可以被裂解，而不影響其它細胞m-RNA。以此方式 可以中斷病毒(HIV、皰疹病毒、乙型和丙型肝炎病毒、呼吸道合包病毒)的復(fù)制周期?？梢?通過siRNA治療明確治愈的其它疾病是年齡相關(guān)的黃斑變性(眼部疾病)、肝癌癌癥、實體 腫瘤、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化和炎癥疾病。轉(zhuǎn)染在癌癥治療中也起發(fā)揮越來越多的作用，例 如制備癌癥疫苗，這也是本發(fā)明的可能應(yīng)用領(lǐng)域。本發(fā)明也可以用于例如免疫接種方法中，其基于編碼免疫原性肽的DNA在人或者 動物機體內(nèi)表達而起作用。為此，例如脂質(zhì)/DNA復(fù)合物用作疫苗。DNA插入機體細胞中導(dǎo) 致免疫原性肽表達，且因此觸發(fā)獲得性免疫應(yīng)答。根據(jù)本發(fā)明給出如下定義只是舉例說明而無限制之意。轉(zhuǎn)染遺傳物質(zhì)插入真核細胞中。轉(zhuǎn)染結(jié)果/轉(zhuǎn)染效率使用特別編碼表達的蛋白質(zhì)的遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)染方法獲得的細胞群的蛋白質(zhì)表達量; 或者細胞群的蛋白質(zhì)表達由于使用遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)染所致敲低程度，所述遺傳物質(zhì)能觸發(fā)這種 敲低，特別是siRNA或者核酶或者編碼shRNA或者核酶的DNA ；或者總細胞群中由于轉(zhuǎn)染結(jié) 果呈現(xiàn)插入的遺傳物質(zhì)的生物活性的細胞的比例。同時，細胞群的生理狀態(tài)應(yīng)盡可能小地 受影響，也就是說細胞群的蛋白質(zhì)表達譜應(yīng)理想地僅對于其基因已經(jīng)插入細胞中或其表達 由于插入的遺傳物質(zhì)而降低或阻止的蛋白質(zhì)發(fā)生改變。非病毒基因輸送系統(tǒng)非病毒基因輸送系統(tǒng)不是通過重組天然發(fā)生的病毒的遺傳物質(zhì)而產(chǎn)生的。它們能 將遺傳物質(zhì)插入真核細胞中。非病毒基因輸送系統(tǒng)特別是物理方法和化學(xué)方法。物理方法 至少將遺傳物質(zhì)定位于相比的鄰近；然而在特殊的物理方法中，利用提供能量、特別是熱、動力、電或其它能量介導(dǎo)遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)運通過細胞膜?；瘜W(xué)方法基于核酸的化學(xué)修飾或者衍 生化，其特別使其細胞可通透，或者特別有結(jié)合DNA的物質(zhì)組成且能介導(dǎo)通過細胞膜的轉(zhuǎn) 運。特別地，其使用靜電力或者氫鍵結(jié)合核酸。隨之，由于細胞的主動轉(zhuǎn)運機制即胞吞的結(jié) 果，DNA轉(zhuǎn)運通過細胞膜。具有那些性質(zhì)的物質(zhì)特別包含陽離子脂質(zhì)、陽離子聚合物、陽離 子肽，或者具有能結(jié)合DNA或者RNA的結(jié)構(gòu)域且同時具有含有配體的第二個結(jié)構(gòu)域的分子， 所述配體由細胞表面受體識別且由于該識別過程而觸發(fā)胞吞作用。第二種可能性是所述配 體能觸發(fā)膜轉(zhuǎn)移，即介導(dǎo)轉(zhuǎn)運至膜的另一側(cè)。所述物質(zhì)也可以是特殊配制的，特別是微團或 者脂質(zhì)體形式，也也可以由多個成分組成，特別是具有不同功能的多個成分?；蛑委熤斡蛘邷p輕疾病的治療方法，其中修飾的或者未修飾的核酸用作活性物質(zhì)。先天性免疫先天性免疫與獲得性免疫不同，其對抗病原體而不需要先與病原體接觸以訓(xùn)練免 疫系統(tǒng)。先天性免疫是大多數(shù)細胞類型的固有性質(zhì)，由兩部分組成細胞內(nèi)成分和細胞間成 分。細胞內(nèi)成分利用受體的歸因于病原體的分子結(jié)構(gòu)識別機制。這種受體通過大量細胞內(nèi) 源基因的表達以及重要蛋白質(zhì)的磷酸化刺激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)，導(dǎo)致直接參與的細胞的生理狀 態(tài)改變(例如抗病毒狀態(tài))。此外，分泌細胞因子。通過先天性免疫系統(tǒng)的細胞間成分，受影響的細胞通過信使物質(zhì)(細胞因子)通 知未受影響的細胞，也觸發(fā)改變的生理狀態(tài)(例如抗病毒狀態(tài))，細胞因子?？?dock)其它 細胞的細胞因子受體，由此觸發(fā)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)。因此細胞間成分與細胞內(nèi)成分通過不同的 受體(細胞因子受體而不是PRR(模式識別受體)和激動劑(細胞因子而不是致病模式)) 而區(qū)分?？共《緺顟B(tài)通過細胞試圖通過對策阻止外來遺傳物質(zhì)的可能的生物活性而辨別的細胞狀態(tài)。體內(nèi)轉(zhuǎn)染在活的生物體內(nèi)發(fā)生的遺傳物質(zhì)插入真核細胞中。體外轉(zhuǎn)染在活的生物體外發(fā)生的遺傳物質(zhì)插入真核細胞中，特別是在適于培養(yǎng)真核細胞的 容器中。遺傳物質(zhì)核酸、特別是核糖核酸或者脫氧核糖核酸，其基本上由兩個至少部分互補的鏈組 成(雙鏈=ds)，例如dsDNA和dsRNA ；或者其特別由一個鏈組成(單鏈=ss)，例如ssDNA 和ssRNA，其可以具有通過氫鍵彼此結(jié)合的部分互補的區(qū)域。在DNA情況中，所述遺傳物質(zhì) 用以產(chǎn)生RNA和/或蛋白質(zhì)。在ssRNA情況中，其用以產(chǎn)生蛋白質(zhì)。在dsRNA情況中，所述 遺傳物質(zhì)通過RNA-干擾實現(xiàn)基因的敲低。修飾的遺傳物質(zhì)其性質(zhì)通過修飾被改變的天然核酸。這些修飾可以是涉及磷酸酯結(jié)構(gòu)、糖或者堿 基的化學(xué)修飾，用于增加核酸對于核酸酶和核糖核酸酶的穩(wěn)定性。此外，分子(標記)可以 共價或者非共價附著于核酸，使得核酸具有新的性質(zhì)，特別是通過熒光標記或者將核酸定 位于細胞特定部位的標記(定位元件)或者介導(dǎo)核酸通過細胞膜使得核酸成為例如可透過細胞的核酸的光學(xué)監(jiān)測能力。舉例的修飾是在磷酸酯結(jié)構(gòu)中將氧置換為硫，在RNA情況中核糖的2' -OH基團 的甲基化，或者2' -OH基團由氟完全取代，以增加對于核酸酶的穩(wěn)定性。再一實例是附著 FITC(異硫氰酸熒光素)作為熒光標記，以能在顯微鏡下監(jiān)測遺傳物質(zhì)在細胞中的路徑，或 者附著所謂的NLS(核定為信號，例如PKKKRKVG)，以實現(xiàn)轉(zhuǎn)運至細胞核中。siRNA (小干擾 RNA)小dsRNA(直至28bp)能通過RNA干擾敲低蛋白質(zhì)。shRNA (短的發(fā)夾 RNA)小ssRNA在3’末端和5’末端具有互補區(qū)，由此能通過氫鍵雜交及形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。 shRNA能通過RNA干擾敲低蛋白質(zhì)。受體能檢測物質(zhì)(激動劑)并因此觸發(fā)生物反應(yīng)的分子；受體特別是蛋白質(zhì)。阻斷生物功能、特別是蛋白質(zhì)生物功能的阻止。抑制免疫、特別是先天性免疫細胞內(nèi)和/或細胞間的通訊網(wǎng)絡(luò)的中斷，即觸發(fā)免疫應(yīng) 答的一或多個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)中斷。由于中斷的結(jié)果，免疫被削弱，導(dǎo)致免疫應(yīng)答降低。DNA/RNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域分子中具有共價結(jié)合的或者通過非共價相互作用結(jié)合的DNA的區(qū)域；特別地，所 述非共價相互作用是靜電力和氫鍵。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)從受體開始，通過將物質(zhì)附著于受體而檢測該物質(zhì)的存在，關(guān)于該物質(zhì)存在的信 息被轉(zhuǎn)換為信號，并且通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子鏈傳導(dǎo)。在結(jié)束時，存在生物反應(yīng)。特別地，由受 體產(chǎn)生的信號被適體分子獲取并傳導(dǎo)，特別是通過激酶傳到至轉(zhuǎn)錄因子。轉(zhuǎn)錄因子刺激介 導(dǎo)所述生物反應(yīng)的基因表達。敲低在蛋白質(zhì)生物合成期間，削弱或者關(guān)閉mRNA翻譯成蛋白質(zhì)?？贵w能識別分子結(jié)構(gòu)、特別是其它蛋白質(zhì)及通過結(jié)合影響其生物功能的分子，特別是 蛋白質(zhì)。在本發(fā)明中，它們可以是阻斷抗體，即在先天性免疫系統(tǒng)的受體中，信號傳送被降 低或者阻止。所述抗體可以是多克隆抗體或者單克隆抗體。所述抗體可以是人源化的。其 通常是待轉(zhuǎn)染的細胞的受體。然而，由于受體的相似性的結(jié)果，也可以出現(xiàn)抗體是交叉反應(yīng) 性的情況。此外，抗體可以是已經(jīng)被修飾，即例如一部分分子可以被分裂(例如Fc片段，由 此僅剩下Fab片段)，條件是其生物功能不由此而降低。此外，可以將賦予另外性質(zhì)的分子的抗體部分附于所述抗體上，條件是其生物功 能不因此而降低。一個實例是熒光標記的附著或者疏水性基團的附著(例如磷脂，A. Schnyder et al. J. Am. Soc. for Exp. NeuroTherapeutics ；2005 ；2 ；99-107)，以便于錨定膜和 / 或脂質(zhì)體。
胞內(nèi)抗體在細胞內(nèi)表達的抗體。適體RNA分子，其通過三級結(jié)構(gòu)的形成而與抗體相似地能識別分子結(jié)構(gòu)、特別是蛋白 質(zhì)，以及通過結(jié)合影響其生物功能。適體可以由修飾的或者未修飾的RNA或者DNA組成。拮抗劑不是自己觸發(fā)而是通過阻斷相應(yīng)受體作用而抑制激動劑的物質(zhì)。激動劑通過結(jié)合受體能實現(xiàn)生物作用的激動劑?？共《炯毎蜃釉谡婧思毎腥静《臼录斜磉_的細胞因子。舉例的細胞因子是干擾素α、干擾 素β、干擾素Y、TNF α、TFN β、白細胞介素6，8，15，28和29。抑制劑能抑制另一分子、特別是蛋白質(zhì)的生物功能的分子。特別地，所述抑制劑自身即是 蛋白質(zhì)，修飾的或者未修飾的核酸或者小的有機分子。TLR、RIG-I-解旋酶、RIG-I-樣解旋酶根據(jù)其功能在物種之間交叉組合的受體。適體分子接受受體信號及根據(jù)其功能在物種之間交叉組合的分子?？s略語AP-I =激活的蛋白質(zhì)-1ERK =細胞外信號調(diào)節(jié)激酶IkB =抑制性結(jié)合蛋白kBIKK = I κ B激酶=抑制性結(jié)合蛋白κ B激酶IKKa = Ikk α = I κ K α = IKKlIKKb = IKKβ = I κ Κβ = ΙΚΚ2IKKd = IKK δ = I κ K δIKKe = IKKepsilon = I κ KepsilonIKKg = IKKy =IkKy = ΙΚΚ3IKKi = IKK 印siIonIRAKI =白細胞介素1受體相關(guān)激酶1IRAK4 =白細胞介素_1受體相關(guān)激酶4IRF=干擾素調(diào)節(jié)因子JNK = c-Jun N-末端激酶
JAK = Janus激活的激酶Mal = TIRAP = MyD88_ 適體樣MAPK =絲裂原活化蛋白激酶MEK = MAPK/ERK 激酶MKK = MAP 激酶激酶
MKK =絲裂原活化蛋白激酶激酶MSK =絲裂原和應(yīng)激活化激酶MyD88 =骨髓分化因子88NAPl = Nck-相關(guān)蛋白 1NEMO = IKK γNF-κ B=核因子 κ BΡ13Κ =磷酸肌醇-3-激酶PKR =蛋白激酶R =蛋白激酶RNA-激活的PKB=蛋白激酶BPDKl =磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1PDK2 =磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1Racl = Ras-相關(guān)C3肉毒桿菌毒素底物1RIPl =受體相互作用蛋白1STAT =轉(zhuǎn)錄的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)物和激活物TAKl =轉(zhuǎn)化生長因子_ β _激活的激酶TBKl = IKKd = TANK 結(jié)合激酶TIRAP = Mal =含有適體蛋白的Toll-白細胞介素1受體(TIR)結(jié)構(gòu)域TRAF3 = TNF受體相關(guān)因子3TRAF6 = TNF受體相關(guān)因子6TRAM = TRIF-相關(guān)適體分子TRIF =含有誘導(dǎo)干擾素- β適體蛋白的適體的Toll/IL-Ι受體結(jié)構(gòu)域
權(quán)利要求
轉(zhuǎn)染組合物，其包含a)非病毒基因輸送系統(tǒng)，所述非病毒基因輸送系統(tǒng)包含(i)陽離子脂質(zhì)、陽離子聚合物或者陽離子蛋白質(zhì)；和/或(ii)一種化合物，其具有DNA 和/或RNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域，且能觸發(fā)受體介導(dǎo)的胞吞作用或者膜轉(zhuǎn)移；和/或(iii)一種化合物，其與DNA和/或RNA共價結(jié)合，且能觸發(fā)受體介導(dǎo)的胞吞作用或者膜轉(zhuǎn)移；以及b)至少部分抑制和/或激活先天性細胞內(nèi)和/或細胞間免疫的工具，所述工具選自(i)TLR 1、TLR 2、TLR 3、TLR 4、TLR 5、TLR 6、TLR 7、TLR 8、TLR 9、TLR 10、TLR 11、TLR 12或者TLR 13的抗體；(ii)細胞因子受體的抗體或者細胞因子受體拮抗劑；(iii)激酶MEK1和/或MEK2的抑制劑；(iv)TLR7和/或TLR8的激動劑，選自溴匹立明(2 氨基 5 溴 6 苯基 4 嘧啶酮)、咪唑并喹啉(imidazoquinolines)、噻唑并喹啉(thiazoloquinolines)和鳥苷類似物；以及(v)其組合。
2.轉(zhuǎn)染試劑盒，其包含a)非病毒基因輸送系統(tǒng)，所述非病毒基因輸送系統(tǒng)包含 (i)陽離子脂質(zhì)、陽離子聚合物或者陽離子蛋白質(zhì)；和/或( ) 一種化合物，其具有DNA-和/或RNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域，且能觸發(fā)受體介導(dǎo)的胞吞作用 或者膜轉(zhuǎn)移；和/或(iii) 一種化合物，其共價結(jié)合DNA和/或RNA，且能觸發(fā)受體介導(dǎo)的胞吞作用或者膜 轉(zhuǎn)移；以及b)至少部分抑制和/或激活先天性細胞內(nèi)和/或細胞間免疫的工具，所述工具選自 (i)TLR UTLR 2、TLR 3、TLR 4、TLR 5、TLR 6、TLR 7、TLR 8、TLR 9、TLR 10、TLR 11、TLR 12或者TLR 13的抗體；( )細胞因子受體的抗體或者細胞因子受體拮抗劑；(iii)激酶MEKl和/或MEK2的抑制劑；(iv)TLR7和/或TLR8的激動劑，選自溴匹立明(2-氨基-5-溴-6-苯基-4-嘧啶酮)、 咪唑并喹啉、噻唑并喹啉和鳥苷類似物；以及(ν)其組合。
3.權(quán)利要求1或2的組合物或者試劑盒，特征在于所述非病毒基因輸送系統(tǒng)包含陽離 子脂質(zhì)。
4.權(quán)利要求1-3任一項的組合物或者試劑盒，特征在于在a)中所述非病毒基因輸送系 統(tǒng)包含如下式所示陽離子脂質(zhì) 中是 其Rl 其中&和民獨立地是其它十二烷基、十二烯基、十四烷基、十四烯基、十六烷基、十六烯 基、十八烷基、十八烯基或其它烷基，在所有可能的組合中，它們是飽和的、不飽和的、支鏈 的、非支鏈的、氟化的或非氟化的，并由5-30個碳原子組成； X是 且其中m = 0 及 η =0;或者m = 0 及 η =1 ；或者m = 0 及 η =2;或者m = 1 及 η =1 ；或者m = 1 及 η =2;或者m = 2 及 η =2;以及g 是 1、2、3、4、5、6、7 或者 8 ；a 是 0、1、2、3、4、5或者6 ；b 是 0、1、2、3、4、5或者6 ；c 是 0、1、2、3、4、5或者6 ；d 是 0、1、2、3、4、5或者6 ；e 是 0、1、2、3、4、5或者6，以及f 是 0、1、2、3、4、5或者6。
5.權(quán)利要求4的組合物或者試劑盒，特征在于R2和R3獨立地是其它十二烷基、十二烯 基、十四烷基、十四烯基、十六烷基、十六烯基、十八烷基、或者十八烯基；m禾口 η是1 ；g 是 1、2、3、4、5、6、7 或者 8 ； a 是 0、1、2、3、4、5 或者 6 b 是 0、1、2、3、4、5 或者 6 c 是 0、1、2、3、4、5 或者 6 d 是 0、1、2、3、4、5 或者 6 e是0、1、2、3、4、5或者6，以及 f 是 0、1、2、3、4、5 或者 6。
6.權(quán)利要求1-5任一項的組合物或者試劑盒，其含有修飾的或者未修飾的遺傳物質(zhì)，尤其是修飾的或者未修飾的ssDNA，修飾的或者未修飾的dsDNA，修飾的或者未修飾的 ssRNA，修飾的或者未修飾的dsRNA和/或修飾的或者未修飾的siRNA。
7.權(quán)利要求1-6至少一項的組合物或者試劑盒，特征在于其中至少部分抑制和/或 激活先天性細胞內(nèi)和/或細胞間免疫的工具是1，4_ 二氨基-2，3- 二氰-1，4- 二(ο-氨 基苯基巰基)丁二烯(U0126)；咪喹莫特(R837，l-(2-甲基丙基)-IH-咪唑并[4，5_c]喹 啉-4-胺)；瑞喹莫德(R848，4-氨基-2-(乙氧基甲基)_a，a_ 二甲基-IH-咪唑并[4， 5-c]喹啉-1-乙醇)；GardiquimocKl-(4-氨基-2-乙基氨基甲基咪唑并[4，5_c]喹 啉-1-基)-2-甲基丙-2-醇)；CL075 ；CL097 ；洛索立賓(7-烯丙基-7，8- 二氫_8_氧-鳥 苷)；艾沙托立賓(7-硫代-8-氧鳥苷)；溴匹立明(2-氨基-5-溴-6-苯基-4-嘧啶酮)； 或其任何組合。
8.權(quán)利要求1-7至少一項的組合物或者試劑盒，特征在于至少部分抑制和/或激活先 天性細胞內(nèi)和/或細胞間免疫的工具是TLR 3、TLR 7、TLR 8或者TLR 9的抗體。
9.權(quán)利要求1-8至少一項的組合物或者試劑盒，特征在于至少部分抑制和/或激活 先天性細胞內(nèi)和/或細胞間免疫的工具是白細胞介素-1受體的抗體或者拮抗劑，特別是 IL-ra的抗體或者拮抗劑；I型干擾素受體的抗體或者拮抗劑；Y _干擾素受體的抗體或者 拮抗劑或者腫瘤壞死因子受體的抗體或者拮抗劑。
10.權(quán)利要求2-9任一項的試劑盒，其中 (i)所有成分均彼此完全獨立存在； ( )成分a)和b)彼此獨立存在；或者 (iii)成分a)和b) —起存在。
11.包含權(quán)利要求1-9任一項的組合物的藥物組合物。
12.包含權(quán)利要求2-10任一項的試劑盒的藥物試劑盒。
13.權(quán)利要求1-12任一項的組合物或者試劑盒在通過基因治療方法治療疾病中的應(yīng)用。
14.權(quán)利要求13的應(yīng)用，其中所述疾病是囊性纖維化、肌營養(yǎng)不良癥、苯丙酮尿癥、楓 糖漿病、Propionazidaemia,甲基丙二酸血癥、腺苷脫氨酶缺乏癥、高膽固醇血癥、血友病、 β -地中海貧血、癌癥、病毒性疾病、黃斑變性、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化和/或炎癥疾病。
15.改進非病毒基因輸送系統(tǒng)的轉(zhuǎn)染結(jié)果的方法，特征在于a)將細胞在轉(zhuǎn)染之前和/或轉(zhuǎn)染期間用至少部分抑制先天性細胞內(nèi)和/或細胞間免疫 的至少一種工具處理，以及在轉(zhuǎn)染期間將遺傳物質(zhì)，特別是修飾的和/或未修飾的ssDNA、 修飾的和/或未修飾的dsDNA、修飾的和/或未修飾的ssRNA、修飾的和/或未修飾的dsRNA 和/或修飾的和/或未修飾的siRNA，導(dǎo)入細胞中；或者b)將細胞在轉(zhuǎn)染之前和/或轉(zhuǎn)染期間和/或轉(zhuǎn)染之后用至少部分激活先天性細胞內(nèi)和 /或細胞間免疫的至少一種工具處理，以及在轉(zhuǎn)染期間將修飾的和/或未修飾的siRNA導(dǎo)入 細胞中。
16.權(quán)利要求15的方法，特征在于所述非病毒基因輸送系統(tǒng) (i)包含陽離子脂質(zhì)、陽離子聚合物或者陽離子蛋白質(zhì)；和/或( )包含一種化合物，其具有DNA和/或RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，且能觸發(fā)受體介導(dǎo)的胞吞作 用或者膜轉(zhuǎn)移；和/或(iii)包含一種化合物，其與DNA和/或RNA共價結(jié)合，且能觸發(fā)受體介導(dǎo)的胞吞作用 或者膜轉(zhuǎn)移；和/或(iv)基于物理方法如電穿孔、顯微注射、磁轉(zhuǎn)染、超聲或者彈道或水力方法。
17.權(quán)利要求15或16的方法，特征在于將細胞在轉(zhuǎn)染之前用至少部分抑制或者激活先 天性細胞內(nèi)和/或細胞間免疫的至少一種工具處理直至4天，優(yōu)選直至18小時，特別是直 至6小時。
18.權(quán)利要求15-17任一項的方法，特征在于將細胞用至少部分抑制或者激活先天性 細胞內(nèi)和/或細胞間免疫的至少一種工具處理及同時與所述非病毒基因輸送系統(tǒng)接觸。
19.權(quán)利要求15-18任一項的方法，特征在于所述至少部分抑制先天性細胞內(nèi)和/或細 胞間免疫的工具包含抗體、胞內(nèi)抗體、適體、拮抗劑、抑制劑和/或siRNA。
20.權(quán)利要求15-19至少一項的方法，特征在于通過用siRNA敲低，編碼通過TLR進行 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)必需的蛋白質(zhì)的至少一個基因被關(guān)閉。
21.權(quán)利要求15-20至少一項的方法，特征在于先天性細胞內(nèi)和/或細胞間免疫通過 阻斷 TLR UTLR 2、TLR 3、TLR 4、TLR 5、TLR 6、TLR 7、TLR 8、TLR 9、TLR 10、TLR 11、TLR 12、TLR 13、⑶14、⑶38、RIG-I解旋酶和RIG-I-樣解旋酶中的至少一個、特別是通過阻斷 TLR UTLR 2、TLR 4和TLR 9中的至少一個而被至少部分抑制。
22.權(quán)利要求15-21至少一項的方法，特征在于先天性細胞內(nèi)和/或細胞間免疫通過阻 斷選自MEKl和MEK2的至少一種激酶而被至少部分抑制。
23.權(quán)利要求22的方法，特征在于所述激酶MEKl和/或MEK2被1，4-二氨基-2，3- 二 氰-1，4-二(ο-氨基苯基巰基)丁二烯(U0126)阻斷。
24.權(quán)利要求15-23至少一項的方法，特征在于通過至少阻斷細胞因子、腫瘤壞死因 子、白細胞介素或者干擾素而至少部分抑制先天性細胞內(nèi)免疫。
25.權(quán)利要求24的方法，特征在于I型干擾素、特別是α-干擾素、干擾素、Y-干 擾素和ω-干擾素被阻斷。
26.權(quán)利要求15-25至少一項的方法，特征在于先天性細胞內(nèi)免疫通過阻斷至少一種 受體而被至少部分抑制，所述受體是細胞因子受體、干擾素受體、特別是I型干擾素受體、 白細胞介素受體和腫瘤壞死因子受體。
27.權(quán)利要求15-18至少一項的方法，特征在于激活先天性免疫的工具是激動劑。
28.權(quán)利要求15-18和27至少一項的方法，特征在于先天性細胞內(nèi)和/或細胞間免疫 通過至少一種TL受體激動劑而被至少部分激活，特別是被TLR7和/或TLR8的至少一種激 動劑至少部分激活。
29.權(quán)利要求28的方法，特征在于TLR7和/或TLR8的至少一種激動劑選自溴匹立明 (2-氨基-5-溴-6-苯基-4-嘧啶酮)、咪唑并喹啉、噻唑并喹啉、鳥苷類似物和ssRNA。
30.權(quán)利要求29的方法，特征在于所述至少一種激動劑是⑴咪喹莫特(R837，l-(2-甲基丙基)-1Η-咪唑并[4，5_c]喹啉_4_胺)、瑞喹莫 德(R848，4-氨基-2-(乙氧基甲基)_a，a_ 二甲基-IH-咪唑并[4，5_c]喹啉-1-乙醇) 或者Gardiquimod(1-(4-氨基-2-乙基氨基甲基咪唑并[4，5_c]喹啉基)_2_甲基 丙-2-醇)；或者(ii)CL075 或者 CL097 ；或者(iii)洛索立賓(7-烯丙基-7，8-二氫-8-氧-鳥苷)或者艾沙托立賓(7-硫代-8-氧 鳥苷)；或者(iv)具有U富集和/或GU富集序列的ssRNA，特別是具有序列基序UGUGU和/或 ⑶CCUUCAA 的 ssRNA。
31.權(quán)利要求15-18和27-30至少一項的方法，特征在于先天性細胞間免疫通過至少一 種抗病毒細胞因子受體激動劑而被至少部分激活，特別是被干擾素-β或干擾素-Y至少 部分激活。
32.權(quán)利要求15、16和27-31至少一項的方法，特征在于在轉(zhuǎn)染后將細胞用至少部分激 活先天性細胞內(nèi)和/或細胞間免疫的至少一種工具處理直至2天，優(yōu)選直至12小時，特別 是直至6小時。
33.權(quán)利要求15-32至少一項的方法，特征在于所述非病毒基因輸送系統(tǒng)包含權(quán)利要 求4和5任一項的陽離子脂質(zhì)。
全文摘要
真核細胞的先天性免疫系統(tǒng)能通過Toll樣受體識別外來遺傳物質(zhì)，且能起始信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)，由此通過干擾素應(yīng)答觸發(fā)細胞群的抗病毒狀態(tài)。所述抗病毒狀態(tài)也是非病毒基因輸送系統(tǒng)的屏障。如果信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)在細胞內(nèi)或者細胞間被中斷，則可以增加非病毒基因輸送系統(tǒng)的轉(zhuǎn)染效率并可以避免表達譜的不希望的改變。由于RNA干擾有助于抗病毒狀態(tài)，因此RNAi機構(gòu)在先天性免疫系統(tǒng)活化后也被激活。在這種情況中，可以增加siRNA轉(zhuǎn)染的敲低效率。
文檔編號C12N15/87GK101918566SQ200880117341
公開日2010年12月15日 申請日期2008年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月22日
發(fā)明者R·克勒澤, S·柯尼希 申請人:Biontex實驗室有限公司