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本申請要求于2014年9月4日提交的新加坡專利申請no.10201405497u的優(yōu)先權權益，其內容出于所有目的而在此通過引用整體并入。

本發(fā)明一般性地涉及癌癥免疫治療。特別地，本發(fā)明涉及使用經重編程的結腸直腸癌干細胞來激活免疫系統細胞對抗癌細胞。

背景技術：

結腸直腸癌(colorectalcancer，crc)是世界范圍內最常診斷的癌癥之一，并且在很多工業(yè)化國家是癌癥相關致死率的第二或第三主要原因。最初診斷患有局部化crc的患者中有超過50％最終發(fā)展成伴隨遠端轉移或復發(fā)的iv期crc。已發(fā)現，高腫瘤發(fā)生性(或腫瘤引發(fā)性)細胞(即，結腸直腸癌干細胞(cancerstemcell，csc))的小亞群存在于多種人惡性腫瘤例如crc中。csc使干細胞保持自我更新并且產生表型多樣的腫瘤細胞群的能力。這些腫瘤發(fā)生性細胞在維持腫瘤生長并且引發(fā)遠端轉移中是關鍵的。csc還被認為導致腫瘤對主要常規(guī)治療策略(例如化學治療和放射治療)的抗性。認為這些常規(guī)策略盡管去除原發(fā)性腫瘤和減小腫瘤體積但是未能完全消除csc使得腫瘤復發(fā)和轉移。因此，認為csc導致腫瘤發(fā)生、癌癥復發(fā)、轉移和crc治療失效。

因此，需要靶向csc的新治療方法來防止crc轉移和腫瘤發(fā)生。探索的一種方法是基于癌干細胞的癌癥免疫治療。然而，開發(fā)該策略的限制之處在于：缺乏足夠量的腫瘤細胞來提供用于激活針對crc細胞的免疫系統細胞的腫瘤特異性抗原(tumor-specificantigen，tsa)和腫瘤相關抗原(tumor-associatedantigen，taa)。

因此，本發(fā)明的一個目的是提供針對結腸直腸癌的經改進的癌癥免疫治療，其克服或至少改善上述一個或更多個缺點。

本發(fā)明的另一個目的是提供足夠量的攜帶腫瘤特異性抗原(tsa)和腫瘤相關抗原(taa)的腫瘤細胞來激活針對crc細胞的免疫系統細胞以用于癌癥治療。

本發(fā)明的又一個目的是提供足夠量的抗原(例如腫瘤特異性抗原(tsa)和腫瘤相關抗原(taa))來激活針對crc細胞的免疫系統細胞以用于癌癥治療。

技術實現要素：

在第一方面，提供了一種組合物，其包含通過與至少一種結腸直腸癌干細胞或其碎片接觸而脈沖的至少一種分離的免疫系統細胞，其中所述結腸直腸癌干細胞通過使至少一種分化的結腸直腸瘤細胞逆轉以具有未分化的結腸直腸干細胞狀態(tài)來獲得。

在第二方面，提供了用于刺激對象的免疫系統的組合物，其包含通過與從結腸直腸癌干細胞獲得的一種或更多種抗原接觸而脈沖的至少一種抗原呈遞細胞，其中所述結腸直腸癌干細胞通過使至少一種分化的結腸直腸瘤細胞逆轉以具有未分化的結腸直腸干細胞狀態(tài)來獲得，其中所述逆轉通過用選自oct4和sox2的細胞重編程因子或轉錄因子重編程從該對象獲得的分化結腸直腸瘤細胞來實現。

在第三方面，提供了一種用于脈沖樹突細胞使得所述樹突細胞能夠誘導細胞毒性t淋巴細胞針對體外結腸直腸癌干細胞的特異性免疫應答的組合物，所述組合物包含已從經重編程的體外結腸直腸癌細胞富集的至少一種體外結腸直腸癌干細胞樣細胞或其碎片。

在第四方面，提供了一種產生經刺激的免疫系統細胞的方法，其包括：使結腸直腸癌干細胞或其碎片與至少一種免疫系統細胞接觸，其中所述結腸直腸癌干細胞通過使至少一種分化的結腸直腸瘤細胞逆轉至其未分化的干細胞狀態(tài)來獲得。

在第五方面，提供了一種疫苗，其包含用如本文中限定的方法刺激的至少一種免疫細胞。

在第六方面，提供了通過如本文中限定的方法獲得的經刺激的免疫細胞。

在第七方面提供了一種在對象中治療結腸直腸癌的方法，其包括：用本文中限定的組合物或本文中限定的疫苗或通過如本文中限定的方法刺激的免疫細胞免疫所述對象。

在第八方面，提供了本文中限定的組合物或本文中限定的疫苗或通過如本文中限定的方法刺激的免疫細胞在制備用于治療對象中結腸直腸癌的藥物中的用途。

在第九方面，提供了一種制備用于對象的包含自體同源樹突細胞的抗結腸直腸癌疫苗的方法，其包括以下步驟：(a)提取并純化從來自所述對象的樣品獲得的外周血單個核細胞(單核細胞)；(b)將所述單核細胞在有效地誘導單核細胞向樹突細胞分化的條件下培養(yǎng)；(c)使(b)中的經培養(yǎng)未成熟樹突細胞與癌干細胞或其碎片接觸，所述癌干細胞或其碎片通過使至少一種分化的結腸直腸瘤細胞逆轉至其未分化的結腸直腸干細胞狀態(tài)來獲得；(d)用樹突細胞成熟誘導劑培養(yǎng)(c)中裝載有結腸直腸癌干細胞的樹突細胞；以及(e)收獲裝載有結腸直腸癌干細胞的成熟樹突細胞作為抗癌疫苗。

附圖說明

在參照發(fā)明詳述的同時結合非限制性實施例和附圖考慮將更好地理解本發(fā)明，在附圖中：

圖1

[圖1]示出了結腸直腸癌(crc)細胞產生誘導多能癌(inducedpluripotentcancer，ipc)細胞的重編程。(a)是顯示根據bv-zfn誘導的dnadbs由桿狀病毒(bv)dna供體bv-oskm提供的oskm表達盒的aavs1基因座整合。hr(l)&hr(r)：hr的左臂和右臂。fp&rp：用于pcr基因分型的pcr正向和反向引物的結合位點。(b)示出了bv轉導之后的ipc細胞產生。觀察到在絲裂霉素c失活小鼠胚胎成纖維細胞(mouseembryonicfibroblast，mef)上形成ips細胞樣集落。示出了由hct8細胞衍生的集落的相差圖像(左)和egfp熒光圖像(右)。細胞在人ips細胞培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。示出了來自人crchct8亞克隆的結果。(c)示出了pcr基因分型的結果以確定oskm盒靶向地整合到aavs1基因座中。利用(a)中所示的3-kbdna碎片的擴增來鑒定所靶向插入。(d)示出了由hct-8細胞衍生的ipc細胞中多能性標志物的表達。進行了免疫染色以檢測ipc細胞集落中nanog、ssea-4和tra-1-60的表達。(e)示出了由所衍生ipc細胞形成的崎胎瘤的組織切片的蘇木精和伊紅染色。該畸胎瘤中發(fā)現的分化組織的組織學顯示了未成熟的神經膠質組織和神經上皮玫瑰花結(外胚層)、軟骨(中胚層)和腺(內胚層)。

圖2

[圖2]顯示oskm的異位表達導致人crc中的csc樣特性提高。(a)是顯示通過rt-qpcr量化的oskm基因表達的圖。引物設計成擴增內源和外源oskm基因二者。使用gapdh基因表達來歸一化和計算倍數變化。(b)是舉例說明腫瘤球形成效率的圖。測試了兩個oskm表達克隆hct3.11和sw1.9的效率。將結果相對于其親代細胞的歸一化。(c)是量化csc標志物陽性細胞的百分比的流式細胞術分析的結果。所示結果是三個實驗的平均值±sd。

圖3

[圖3]描述了通過定量rtpcr分析的oskm表達結腸直腸csc樣細胞的分子表征。(a)是顯示結腸直腸csc標志物的結果的圖。(b)是顯示上皮-間充質轉化(epithelial-to-mesenchymaltransition，emt)標志物的結果的圖。(c)是顯示常用的crc臨床生物標志物的結果的圖。(d)是顯示通過gwas鑒定的與crc高風險基因座相關的基因的結果的圖。使用進行oskm遺傳修飾的野生型hct-8衍生單細胞克隆作為對照。所有倍數變化均相對于gapdh表達水平歸一化。

圖4

[圖4]示出了通過用裝載有oskm基因表達crc細胞的裂解物的樹突細胞致敏cd8+初始t細胞的來自人pbmc的oct反應性t細胞的產生。(a)是該方案的示意圖：開發(fā)了dc并且cd8+初始t細胞選自健康供體的hla-a2+人pbmc。在用腫瘤裂解物進行dc脈沖和dc成熟之后，使用dc來刺激體外自體同源t細胞持續(xù)連續(xù)兩周。然后，收獲活t細胞并在ifn-γelispot測定中評價其抗原特異性ifn-γ應答。(b)示出了分化期間以及用腫瘤裂解物脈沖和成熟之后的dc形態(tài)。(c)示出了在脈沖和成熟前后通過流式細胞術分析的dc表征?？梢钥闯觯诔墒熘?，cd83和cd40的表達顯著提高。(d)示出了在選擇前后通過流式細胞術分析的初始t細胞表征。觀察到cd8+群增加，以及cd45ro+和cd57+記憶t細胞消耗。(e)中的圖顯示，經hct3.11腫瘤裂解物脈沖的dc刺激體外自體同源oct4反應性t細胞應答。通過裝載有oct4和gfp(陽性對照)肽的t2細胞重新刺激來在ifn-γelispot中檢測t細胞針對腫瘤抗原的反應性。示出了預先用以下刺激的t細胞的ifn-γ應答：未經脈沖的dc、經野生型(wt)hct8細胞的裂解物脈沖的dc以及經oct4-和gfp-表達hct3.1克隆、t細胞單獨和t2細胞單獨的裂解物脈沖的dc。***,p<0.001相對于t2單獨，通過方差分析。

圖5

[圖5]示出了用經熱激腫瘤細胞進行dc脈沖對結腸直腸csc反應性t細胞的產生的作用。(a)示出了oskm表達的hct3.11細胞中熱激上調的hsp70而不影響oct4表達。樣品#1和#2：在具有(#1)或不具有(#2)熱激下在cellgro培養(yǎng)基中的細胞。樣品#3和#4：在具有(#4)或不具有(#3)熱激下在pbs中的細胞。(b)顯示，在用從經熱激hct3.11細胞收集的上清液脈沖之后不影響成熟dc(mdc)上的dc標志物表達。dc表征用流式細胞術來進行。(c)是通過流式細胞術分析在dc致敏之后表征t細胞的結果。(d)顯示，用從經熱激hct3.11細胞收集的上清液脈沖的dc在體外刺激針對結腸直腸csc的自體同源t細胞應答。通過裝載指定肽的t細胞重新刺激來在ifn-γelispot中檢測t細胞針對腫瘤抗原的反應性。包括以下用于進行比較：無dc致敏下的t細胞、用經未經脈沖dc刺激的t細胞和用經未熱激hct3.11的全裂解物脈沖之后的dc刺激的t細胞。

圖6

[圖6]概括了采用crc細胞的oskm重編程來進行針對crccsc的dc疫苗接種的策略。oskm:oct4、sox2、klf4和c-myc；ctl：細胞毒性t淋巴細胞。

發(fā)明內容

癌細胞重編程是csc分化成腫瘤細胞的逆轉過程。該過程有利于非腫瘤發(fā)生性癌細胞向較不分化的狀態(tài)去分化，從而產生具有腫瘤引發(fā)能力的細胞群。

在第一個方面，提供了一種組合物，其包含通過與至少一種結腸直腸癌干細胞或其碎片接觸而脈沖的至少一種分離的免疫系統細胞，其中所述結腸直腸癌干細胞通過使至少一種分化的結腸直腸瘤細胞逆轉以具有未分化的結腸直腸干細胞狀態(tài)獲得。

所述分離的免疫系統細胞可以是抗原呈遞細胞。示例性的抗原呈遞細胞包括但不限于樹突細胞、巨噬細胞、b細胞、活化上皮細胞等。

在一個實例中，所述抗原呈遞細胞是樹突細胞。dc作為最有效抗原呈遞細胞的鑒定和重組已經是癌癥免疫治療中的顯著進展之一。外源抗原可通過dc胞吞被捕獲，釋放到其細胞質隔室中并路由至mhc-i抗原呈遞途徑。dc疫苗接種基于該抗原交叉呈遞過程，并且可誘導cd8+腫瘤抗原特異性細胞毒性t淋巴細胞(ctl)，代表癌癥的潛在有效治療方案。dc還通過直接或間接地經來源于效應細胞的細胞因子促進免疫效應細胞(例如，常規(guī)αβt細胞、γδt細胞、nk細胞和非變體nkt細胞)和dc之間的串擾而在橋連先天免疫和獲得性免疫中其關鍵作用。

先前的癌癥免疫治療涉及靶向表達分化的腫瘤抗原的細胞。最近來自動物研究、培養(yǎng)人腫瘤細胞和臨床血樣的發(fā)現支持以下觀念：基于dc的csc疫苗接種通過選擇性靶向csc而賦予優(yōu)越的保護性抗腫瘤免疫?；赿c的csc疫苗可引發(fā)針對干細胞抗原的體液和細胞免疫應答并且與誘導高效的保護性抗csc免疫相關。例如，與靶向主體腫瘤細胞相比，dc介導的膠質瘤csc神經球靶向在小鼠中產生更大的抗腫瘤免疫。這些研究表明，盡管可能csc和正常成體干細胞之間共有的途徑產生免疫耐受，但是免疫系統仍然可識別這兩種類型干細胞之間的差異且對此作出反應，并且隨后消除csc。由于csc公認地對涉及化學和放射的傳統治療失效，因此作為靶向tsa和/或taa并且較不依賴于癌細胞的代謝或增殖狀況的治療平臺的免疫干預變得特別地有吸引力。csc對常規(guī)治療的抗性表明，這些癌癥引發(fā)細胞除了包含干細胞抗原之外還可包含多個編碼腫瘤特異性新抗原的突變。因此，使用csc作為dc疫苗制劑的腫瘤抗原源提供刺激針對未鑒定到的新抗原和與csc相關的腫瘤發(fā)生性抗原的免疫應答從而導致csc殺死且具有持久益處的方式。

對于dc癌癥免疫治療，重要的是，有大量的腫瘤細胞可用于提供用于dc脈沖的腫瘤特異性抗原(tsa)和腫瘤相關抗原(taa)。從原發(fā)性腫瘤分離的csc在體外可容易地分化成代表腫瘤中大部分細胞的非csc。這是減慢發(fā)現靶向csc藥物的一個主要限制性因素，也是阻止大規(guī)模生產csc用于臨床癌癥免疫治療的一個技術障礙。

本公開內容的免疫系統細胞是“分離的”。本文中使用的術語分離的意指“人工地”由其天然狀態(tài)改變而來；即，如果其天然存在，則其已發(fā)生改變或從其原始環(huán)境移出，或者二者。分離的免疫系統細胞可通過與至少一種結腸直腸csc或其碎片接觸而脈沖。分離的免疫系統細胞可以是例如未成熟的樹突細胞。術語“脈沖”指向未成熟的樹突細胞裝載抗原，或者使未成熟的樹突細胞暴露于抗原一段短時間。因此，任選地在如本文中所述的一種或多種成熟誘導劑存在下，“脈沖”未成熟樹突細胞可導致未成熟樹突細胞成熟為成熟樹突細胞。

通過“接觸”，細胞可與其他細胞或其碎片物理結合。例如，分離的免疫系統細胞可以通過與結腸直腸癌干細胞或其碎片緊密接近或者通過與其物理結合而“接觸”結腸直腸癌干細胞或細胞碎片。接觸可以是直接接觸，或者通過中間劑來進行?？梢酝ㄟ^用腫瘤抗原“脈沖”未成熟樹突細胞來使其與腫瘤抗原接觸，所述腫瘤抗原例如經熱激的腫瘤裂解物中存在的那些。

因此，在一個實例中，所述結腸直腸癌干細胞可以是經熱激的結腸直腸癌干細胞或其碎片。所述碎片可以是經熱激的結腸直腸干細胞的裂解物。垂死腫瘤細胞提供腫瘤抗原源和能夠觸發(fā)細胞活化的內源性危險信號。因此，可使用熱應激來誘導腫瘤細胞死亡，之后使用其裂解物，例如用于dc脈沖。熱激通常涉及使細胞經受比細胞體內的正常生理溫度更高的溫度。熱激的過程可以在多種介質，例如在co2培養(yǎng)箱、o2培養(yǎng)箱中或在熱水浴中進行。例如，可以在約42℃下將細胞熱處理約60分鐘。有利地，如下文實施例4所述，結腸直腸癌干細胞的熱激過程使得產生更擅長引發(fā)csc抗原特異性ctl的成熟樹突細胞。

在一個實例中，所述樹突細胞可以是未成熟的樹突細胞。例如，未成熟樹突細胞可如本文中所述由外周血單個核細胞(pbmc)產生。在用至少一種csc或其碎片脈沖之后，未成熟樹突細胞可變?yōu)槌墒鞓渫患毎芜x地如本文中所述在暴露于一種或多種成熟誘導劑之后。成熟樹突細胞可具有上調的cd83、cd40和cd86表達。有利地，本發(fā)明的成熟樹突細胞能夠誘導細胞毒性t淋巴細胞針對癌癥干細胞抗原(例如結腸直腸癌干細胞抗原)的特異性免疫應答。

所述結腸直腸癌干細胞可以是通過在體外使至少一種分化的腫瘤細胞逆轉為未分化的干細胞狀態(tài)而獲得的體外(試管衍生的)結腸直腸干細胞。術語“體外結腸直腸干細胞”、“試管結腸直腸干細胞”和“試管衍生的結直腸干細胞”在本文中可互換使用。

術語“逆轉”或“重編程”可指將分化的腫瘤細胞轉化回未分化或非完全分化的細胞，即癌干細胞。例如，可將分化的結腸直腸腫瘤細胞(例如sw480或hct-9細胞)“逆轉”或“重編程”為結腸直腸癌干細胞。

術語“分化的結腸直腸腫瘤細胞”可指完全分化(即其不具有進一步分化的能力)的初始結腸直腸腫瘤細胞(即，直接從對象獲得的結腸直腸腫瘤細胞)。其還可指完全分化的結腸直腸腫瘤細胞系。示例性的分化結腸直腸腫瘤細胞包括人腸腺癌hct-9細胞或人結腸腺癌sw480細胞。分化的結腸直腸腫瘤細胞還可包括但不限于人結腸腺癌sw620細胞、人結腸腺癌caco-2細胞、人結腸腺癌lovo細胞、人結腸腺癌colo205細胞、人結腸癌ht55細胞和人結腸癌ht155細胞。

術語“未分化的”當在提及細胞使用時指能夠分化成一種或多種特化細胞類型的細胞。因此，“未分化”細胞是未分化的細胞或未完全分化的細胞。“未分化細胞”可以是干細胞、誘導多能干細胞或去分化細胞。例如，“未分化”細胞可以是已經重編程為未分化結腸直腸干細胞狀態(tài)的結腸直腸腫瘤細胞?！拔捶只奔毎梢允嵌嗄艿?、多潛能的、寡能的或單能的。

“結腸直腸癌干細胞”可指未分化的、去分化的或未完全(部分)分化的結腸直腸癌細胞。在一個實例中，“結腸直腸癌干細胞”處于“未分化結腸直腸干細胞狀態(tài)”。因此，“結腸直腸癌干細胞”可具有分化成多種分化結腸直腸癌細胞的潛力。其還可具有繼續(xù)增殖并產生更多“結腸直腸癌干細胞”的能力。

在一個實例中，所述結腸直腸癌干細胞是表達能夠在體外將分化結腸直腸瘤細胞逆轉或重編程為未分化結腸直腸癌干細胞狀態(tài)的轉錄因子的未分化結腸直腸癌干細胞。

在一個實例中，所述未分化結腸直腸癌干細胞通過用能夠將分化結腸直腸瘤細胞逆轉或重編程為未分化結腸直腸癌干細胞的轉錄因子重編程分化結腸直腸瘤細胞而獲得。

在另一個實例中，所述結腸直腸癌干細胞通過用細胞重編程因子或轉錄因子逆轉或重編程分化結腸直腸瘤細胞來獲得。所述細胞重編程因子或轉錄因子可包括但不限于oct4和sox2。

“結腸直腸癌干細胞”可表達多種結腸直腸干細胞標志物或“腫瘤相關”抗原，例如oct4和sox2。這些標志物中的有一些可能是維持細胞的癌干細胞樣特性所必需的?！敖Y腸直腸癌干細胞”可以是結腸直腸csc樣細胞。結腸直腸csc樣細胞可如下獲得：將結腸直腸癌細胞(crc)oskm重編程為誘導多能癌(ipc)細胞并在癌癥干細胞(csc)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)誘導多能癌(ipc)細胞以產生結腸直腸csc樣細胞，如圖6所示。

本公開內容的結腸直腸癌干細胞可以在體外制備。換言之，所述結腸直腸癌干細胞可在試管中制備，因此術語“體外結腸直腸干細胞”、“試管結腸直腸干細胞”和“試管衍生的結直腸干細胞”。以此方式制備結腸直腸癌干細胞克服了在使用癌干細胞進行dc癌癥免疫治療中的兩個主要技術障礙。這兩個障礙是：1)癌干細胞在原發(fā)性腫瘤中罕見，因此難以分離和獲得足夠的用于dc疫苗接種的細胞；和2)從原發(fā)性腫瘤分離的癌干細胞將在體外迅速地分化成代表腫瘤中大多數細胞的非csc，因此不能提供用于dc疫苗接種的癌干細胞抗原。因此，本公開內容能夠大規(guī)模生產用于臨床癌癥免疫治療的癌干細胞。

本公開內容的特別令人驚訝的優(yōu)點是試管癌干細胞可提供足夠量和廣譜的腫瘤抗原，其可分為三類：1)多能性相關抗原，包括oct4和sox2：編碼多能性相關抗原的基因被位點特異性地引入癌細胞基因組中穩(wěn)定且高水平地表達，這在從原發(fā)性腫瘤分離的癌干細胞中很少見到；2)癌干細胞相關基因：試管癌干細胞表達許多癌干細胞相關的腫瘤發(fā)生性抗原，其由于多能性基因介導的細胞重編程而產生；和3)試管癌干細胞由分化的腫瘤細胞衍生，因此其還攜帶原始體細胞突變、內部缺失、親代癌細胞中的染色體易位和與親代癌細胞相關的許多未鑒定的新抗原。

使用可作為穩(wěn)定癌細胞系培養(yǎng)的試管癌干細胞為疫苗制備和應用提供許多技術優(yōu)勢。以此方式，可提供針對未被免疫系統識別為自體抗原的抗原的免疫保護。首先，使用已建立的細胞系有助于規(guī)避耗時且成本高的患者個體化gmp生產，并且消除連續(xù)生產定制的單獨疫苗的需求。其次，使用已建立的細胞系簡化物流、降低疫苗生產和遞送過程的勞力并且提高其成本效用。第三，使用已建立的細胞系允許高度標準化地大規(guī)模生產適合于具有特定腫瘤類型的所有患者的同種異體疫苗，所謂的“現成”產品。最后，與hla單倍型無關，使用單一批次的同種異體疫苗消除疫苗在質量和組成方面的變化，有利于臨床結果的可靠比較分析。

在第二方面，提供了用于刺激對象的免疫系統的組合物，其包含通過與從結腸直腸癌干細胞獲得的一種或多種抗原接觸而被脈沖的至少一種抗原呈遞細胞，其中所述結腸直腸癌干細胞通過使至少一種分化結腸直腸腫瘤細胞逆轉以具有未分化結腸直腸干細胞狀態(tài)獲得，其中所述逆轉是通過用包括但不限于oct4和sox2的細胞重編程因子或轉錄因子重編程從對象獲得的分化結腸直腸瘤細胞獲得。

術語“刺激”免疫系統指激活免疫系統的多種組分，例如，如激活細胞毒性t細胞淋巴細胞，以針對特定的威脅作出反應。例如，可刺激免疫系統以靶向和除去癌細胞。一種或多種抗原或疫苗可刺激免疫系統以針對這樣的威脅作出反應。

抗原呈遞細胞和結腸直腸瘤細胞都可從相同或不同的對象獲得。換言之，抗原呈遞細胞和結腸直腸瘤細胞二者均可以是自體同源細胞，或者其可以是同種異體細胞。在一個實例中，抗原呈遞細胞和結腸直腸瘤細胞二者均從同一對象獲得。因此，抗原呈遞細胞和結腸直腸瘤細胞二者均是自體同源細胞。在另一個實例中，抗原呈遞細胞和結腸直腸瘤細胞從不同的對象獲得。因此，抗原呈遞細胞和結腸直腸腫瘤細胞是同種異體細胞。這些同種異體細胞在遺傳上是不相似的并且因此可能是免疫不相容的，即使兩個對象是同一物種。

可使用本領域已知的多種方法例如通過使用載體來將細胞重編程因子或轉錄因子遞送到結腸直腸瘤細胞中。所述載體可包括核酸，包括表達控制元件，例如轉錄/翻譯控制信號、復制起點、多聚腺苷酸化信號、內部核糖體進入位點、啟動子、增強子等，其中所述控制元件與編碼基因產物例如oct4和sox2的核酸可操縱地相連。這些及其他共有載體元件的選擇是常規(guī)的，并且很多這樣的序列可從市售載體獲得。所述載體可以是質粒載體、病毒載體或任何其他適于插入外來序列并導入真核細胞(例如結腸直腸癌細胞)中的合適載體。優(yōu)選地，所述載體是能夠指導細胞重編程因子或轉錄因子的dna序列轉錄的表達載體。病毒表達載體包括例如基于桿狀病毒、前列腺病毒、牛乳頭瘤病毒、腺病毒和腺相關病毒的載體。在一個實例中，通過使用桿狀病毒載體促進遞送。

在一個實例中，使用包含以下的桿狀病毒載體來將細胞重編程因子或轉錄因子遞送到結腸直腸瘤細胞中：鋅指核酸酶編碼序列和包含細胞重編程因子或轉錄因子的融合基因。本領域技術人員還將理解，可使用其他載體，例如細菌載體(即質粒)或其他病毒載體(例如上述腺病毒載體)來將細胞重編程因子或轉錄因子遞送到細胞中。

已經重編程的結腸直腸干細胞的未分化狀態(tài)可基于癌干細胞特有的多種特征來鑒定。例如，未分化的結腸直腸干細胞可以以上皮特征喪失且e-鈣粘蛋白表達降低為特征?？商孢x地或另外地，未分化的結腸直腸干細胞狀態(tài)還可以以獲得間充質特性且例如波形蛋白(vim)、纖連蛋白(fn1)、玻連蛋白(vtn)、n-鈣粘蛋白(cdh2)、snail(snai1)、twist(twist1)、鋅指e盒結合同源框1(zeb1)、轉化生長因子β1(tgfb1)、slug(snai2)和sox4差異表達為特征。仍然可替選地或另外地，未分化的結腸直腸干細胞狀態(tài)可以以表達包括但不限于以下的癌干細胞標志物為特征：cd24、cs133、cd144、cd166、醛脫氫酶1(aldh1a1)、含有富亮氨酸重復序列的g蛋白偶聯受體5(lgr5)、二肽基肽酶4(dpp4)、連環(huán)蛋白β-1(ctnnb1)、atp結合盒亞家族g成員5(abcg5)和整聯蛋白β-1(itgb1)。

在一個實例中，提供了如本文中限定的組合物，其中所述未分化的結腸直腸干細胞狀態(tài)以下列至少一項為特征：(a)上皮特征喪失且e-鈣粘蛋白表達降低；(b)獲得間充質特性且波形蛋白(vim)、纖連蛋白(fn1)、玻連蛋白(vtn)、n-鈣粘蛋白(cdh2)、snail(snai1)、twist(twist1)、鋅指e盒結合同源框1(zeb1)、轉化生長因子β1(tgfb1)、slug(snai2)和sox4差異表達；以及(c)表達選自以下的癌干細胞標志物：cd24、cs133、cd144、cd166、醛脫氫酶1(aldh1a1)、含有富亮氨酸重復序列的g蛋白偶聯受體5(lgr5)、二肽基肽酶4(dpp4)、連環(huán)蛋白β-1(ctnnb1)、atp結合盒亞家族g成員5(abcg5)和整聯蛋白β-1(itgb1)。

在第三方面，提供了用于脈沖樹突細胞使得樹突細胞能夠誘導細胞毒性t淋巴細胞針對體外結腸直腸癌干細胞的特異性免疫應答的組合物，所述組合物包含已從經重編程的體外結腸直腸癌細胞富集的至少一種體外結腸直腸癌干細胞樣細胞或其碎片。

術語“富集”或其語法上的變化形式指在混合物中提高一個實體相對于其他實體的量的過程。例如，在細胞混合物中，可“富集”特定的細胞類型(例如體外結腸直腸癌干細胞樣細胞)使得其在混合物中以比其他細胞類型(例如不具有干細胞樣特性的結腸直腸癌細胞)更高的量(即更高的數量)存在。體外結腸直腸癌干細胞樣細胞或其碎片可以是如上所述的。

在第四方面，提供了產生經刺激的免疫系統細胞的方法，其包括使結腸直腸癌干細胞或其碎片與至少一種免疫系統細胞接觸，其中所述結腸直腸癌干細胞通過使至少一種分化的結腸直腸瘤細胞逆轉至其未分化的干細胞狀態(tài)獲得。

所述結腸直腸癌干細胞可以是表達能夠將分化結腸直腸瘤細胞逆轉或重編程為未分化癌干細胞狀態(tài)的轉錄因子的未分化癌干細胞。所述未分化結腸直腸癌干細胞可通過用能夠將分化結腸直腸瘤細胞逆轉成未分化結腸直腸癌干細胞的重編程因子或轉錄因子重編程分化結腸直腸瘤細胞獲得。

分化結腸直腸瘤細胞向其未分化干細胞狀態(tài)的逆轉可通過如上所述的用選自oct4和sox2的細胞重編程因子或轉錄因子重編程結腸直腸瘤細胞來實現。結腸直腸瘤細胞和免疫細胞可如上所述是自體同源細胞或同種異體細胞。所述免疫系統細胞可以是抗原呈遞細胞，例如樹突細胞。在一個實例中，所述樹突細胞是未成熟的樹突細胞。在一個實例中，所述未成熟樹突細胞在暴露于經重編程的結腸直腸瘤細胞之后并且任選地在暴露于如上所述的成熟誘導劑之后可變成cd83、cd40和cd86表達上調的成熟樹突細胞。

在所公開方法中使用的結腸直腸干細胞可以是如上所述的體外(或試管衍生的)結腸直腸干細胞。所述癌干細胞可以進一步是經熱激的癌干細胞或其碎片。所述碎片可以是經熱激癌干細胞的裂解物?？墒┘拥臒峒l件如上文和實施例中所述。

本文中限定的方法可以是體內、離體或體外方法。

可使用如上文和實施例中所述的載體將細胞重編程因子或轉錄因子遞送到腫瘤細胞中。所述載體可以是包含鋅指核酸酶編碼序列和含有細胞重編程因子的融合基因的桿狀病毒載體。

如上所述，所述方法中使用的結腸直腸癌干細胞的未分化干細胞狀態(tài)可通過多種特征來鑒定，所述特征例如下列至少一項：

(a)上皮特征喪失且e-鈣粘蛋白表達降低；(b)獲得間充質特性且波形蛋白(vim)、纖連蛋白(fn1)、玻連蛋白(vtn)、n-鈣粘蛋白(cdh2)、snail(snai1)、twist(twist1)、鋅指e盒結合同源框1(zeb1)、轉化生長因子β1(tgfb1)、slug(snai2)和sox4差異表達；以及(c)表達選自以下的癌干細胞標志物：cd24、cs133、cd144、cd166、醛脫氫酶1(aldh1a1)、含有富亮氨酸重復序列的g蛋白偶聯受體5(lgr5)、二肽基肽酶4(dpp4)、連環(huán)蛋白β-1(ctnnb1)、atp結合盒亞家族g成員5(abcg5)和整聯蛋白β-1(itgb1)。

在第五方面，提供了一種疫苗，其包含用本文中限定的方法刺激的至少一種免疫細胞。所述免疫細胞可以是抗原呈遞細胞。所述抗原呈遞細胞可以是樹突細胞。在一個實例中，所述免疫細胞和腫瘤細胞是從接受疫苗的對象獲得的自體同源細胞。在另一個實例中，免疫細胞和腫瘤細胞是從接受疫苗的不同對象獲得的同種異體細胞。

所述疫苗可包含可藥用載體。所述疫苗還可包含佐劑，所述佐劑增加對象對疫苗的免疫應答。合適的佐劑包括但不限于氫氧化鋁(明礬)、免疫刺激復合物(immunostimulatingcomplex，iscoms)、非離子嵌段聚合物或共聚物、細胞因子(如il-1、il-2、il-7、ifn-α、ifn-β、ifn-γ等)、皂苷、單磷酰脂質a(monophosphoryllipida，mla)、胞壁酰二肽(muramyldipeptide，mdp)等。其他合適的佐劑包括例如硫酸鋁鉀、從大腸桿菌(escherichiacoli)分離的熱不穩(wěn)定性或熱穩(wěn)定性腸毒素、霍亂毒素或其b亞基、白喉毒素、破傷風毒素、百日咳毒素、弗氏不完全佐劑或完全佐劑?；诙舅氐淖魟?，例如白喉毒素、破傷風毒素和百日咳毒素可以在使用前例如通過用甲醛處理滅活。

在第六方面，提供了從如本文中限定的方法獲得的經刺激免疫細胞。所述經刺激的免疫細胞可以是抗原呈遞細胞，例如樹突細胞。

如上所述的組合物、疫苗或經刺激免疫細胞可用于治療，例如用于治療癌癥，例如結腸直腸癌。

在第七方面，提供了在對象中治療結腸直腸癌的方法，其包括用如本文中限定的組合物或如本文中限定的疫苗或通過如本文中限定的方法刺激的免疫細胞免疫對象。

在第八方面，提供了如本文中限定的組合物或如本文中限定的疫苗或通過如本文中限定的方法刺激的免疫細胞在制備用于在對象中治療結腸直腸癌的藥物中的用途。

術語“對象”指人或其他哺乳動物，并且包括期望使用本發(fā)明的方法、組合物、疫苗和/或經刺激免疫細胞來檢查或治療的任何個體。然而，應當理解，“對象”并非暗示存在癥狀。在本發(fā)明范圍內的合適對象包括但不限于靈長類動物、家畜動物(例如綿羊、牛、馬、驢、豬)、實驗室試驗動物(例如兔、小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠)、伴侶動物(例如貓、狗)和捕獲的野生動物(例如狐貍、鹿)。所述術語不指示特定的年齡。因此，期望涵蓋成年和新生個體。所述對象優(yōu)選地是人，但還可以是家畜、實驗室對象或寵物動物。在一個實例中，所述對象是癌癥患者，例如結腸直腸癌患者。所述患者可以是處于癌癥的任何階段例如i期、ii期、iii期或iv期的患者。所述患者可以是遭受癌癥復發(fā)或再發(fā)的患者。

本文中使用的術語“治療”或其變化形式包括無論如何補救疾病狀態(tài)或癥狀、預防疾病建立或以其他方式預防、阻止、延遲或逆轉疾病或其他不期望癥狀以任何方式進展的任何和所有用途。因此，“治療”包括預防性治療和治療性治療。

在第九方面，提供了產生用于對象的包含自體同源樹突細胞的抗結腸直腸癌疫苗的方法，其包括以下步驟：(a)提取并純化從來自對象的樣品獲得的外周血單個核細胞(單核細胞)；(b)在有效誘導單核細胞向樹突細胞分化的條件下培養(yǎng)單核細胞；(c)使(b)中的經培養(yǎng)未成熟樹突細胞與癌干細胞或其碎片接觸，所述癌干細胞或其碎片通過將至少一種分化結腸直腸瘤細胞逆轉至其未分化結腸直腸干細胞狀態(tài)獲得；和(d)用樹突細胞成熟誘導劑培養(yǎng)(c)中裝載有結腸直腸癌干細胞的樹突細胞；以及(e)收獲裝載有結腸直腸癌干細胞的成熟樹突細胞作為抗癌疫苗。

“外周血單個核細胞”可以是具有圓形核的任何血細胞。例如，外周血單個核細胞可以是淋巴細胞、單核細胞或巨噬細胞。外周血單個核細胞可通過本領域已知的技術例如通過ficoll-paque^tm技術和/或通過細胞分選技術例如磁激活細胞分選(magnetic-activatedcellsorting，macs)從取自對象的血樣中提取并純化。由這些技術獲得的單核細胞可在“有效誘導單核細胞向樹突細胞分化的條件”下培養(yǎng)。例如，可如下所述用粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophagecolony-stimulatingfactor，gm-csf)和白介素-4(interleukin-4，il4)培養(yǎng)hla-a2+人外周血單個核細胞以獲得未成熟樹突細胞。因此，在一個實例中，第九方面的方法中(b)的條件包括在包含gm-csf和il-4的培養(yǎng)基中培養(yǎng)單核細胞。

如本文中限定的“樹突細胞成熟誘導劑”指能夠誘導或引起樹突細胞從未成熟狀態(tài)成熟的制劑。樹突細胞成熟誘導劑的實例包括但不限于如下所述的脂多糖(lps)和干擾素-γ。

在一個實例中，提供了包含通過與如上所述的至少一種結腸直腸癌干細胞或其碎片接觸而致敏的至少一種分離的免疫系統細胞的組合物，其中如上所述的結腸直腸癌干細胞如上所述通過使至少一種分化結腸直腸瘤細胞逆轉以具有未分化結腸直腸干細胞狀態(tài)獲得。在該實例中，分離的免疫系統細胞可以是例如t細胞，并且所述接觸可以是間接接觸，例如經由已經用上述結腸直腸癌干細胞或其碎片脈沖的樹突細胞接觸。

本文中舉例說明性地描述的本發(fā)明可適當地在不存在任何要素、限制下實施，雖然在本文中未具體公開。因此，例如，術語“包括”、“包括”及其變化形式等將被廣泛地且無限制地理解。另外，本文中采用的術語和表達用作描述性而不是限制性術語，并且在使用這些術語和表達時并不意在排除所示和所描述的特征或其部分的任何等同物，而是認識到在所要求保護的本發(fā)明的范圍內多種修改是可能的。因此，應當理解，雖然本發(fā)明已經通過優(yōu)選實施方案和可選特征具體公開，但是本領域技術人員仍可采用本文中體現的本發(fā)明的變化方案和改變方案，并且認為這樣的變化方案和改變方案在本發(fā)明的范圍內。

本文中已廣泛且一般性地描述了本發(fā)明。落入一般性公開內容中的每個較窄種類和亞屬群組也形成本發(fā)明的一部分。這包括具有從屬中移除任何主題的附帶條件或否定限制的本發(fā)明的一般性描述，而不管所排除的材料是否在本文中具體描述。

其他實施方案在所附權利要求書和非限制性實例內。此外，當用馬庫什組描述在發(fā)明的特征或方面時，本領域技術人員將認識到，因此還根據馬庫什組的任何單獨成員或亞組成員描述本發(fā)明。

除非上下文明確地另外指出，否則本申請中使用的沒有數量詞修飾的名詞包括復數參考。例如，術語“制劑”包括多種試劑，包括其混合物。

在本公開內容通篇，本發(fā)明的各個方面可以以范圍形式示出。應當理解，范圍形式的描述僅僅是為了方便和簡潔，并且不應被解釋為對本發(fā)明范圍的不靈活限制。因此，范圍的描述應認為已經具體公開了所有可能的子范圍以及在該范圍內的單獨數值。例如，例如1至6的范圍描述應認為已經具體公開了例如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3到6等的子范圍，以及在該范圍內的單獨數值，例如1、2、3、4、5和6。不管范圍的寬度，這均適用。

本文中使用的關于數值平均值使用的術語“約”指例如數值的+50％或+30％，優(yōu)選+20％，更優(yōu)選+10％，仍更優(yōu)選+5％，并且最優(yōu)選+1％。在必要時，詞語“約”可以從本發(fā)明的定義中省略。

實施例

實施例1材料和方法

使用鋅指核酸酶技術來將稱為oskm因子(oct4、sox2、klf4和cmyc)的一組細胞重編程因子插入crc細胞基因組中用于這些癌細胞的誘導重編程。使用腫瘤球形成方法，從經重編程的crc細胞富集csc樣細胞。這些csc樣細胞一致地顯示出cd24和許多其他結腸直腸csc相關抗原的上調表達。然后，將這些csc樣細胞用于樹突細胞(dc)疫苗接種，其已經被測試作為crc的輔助治療。在用經oskm表達crc的細胞裂解物脈沖的dc致敏自體同源初始t細胞之后，通過用裝載有csc抗原相關肽的t2細胞再刺激來在ifn-γelispot測定中檢測t細胞。顯著增加的ifn-γ陽性斑點證明，經脈沖的dc能夠在自體同源t細胞中引發(fā)抗csc抗原應答。因此，oskm表達crc細胞系可用作提供dc疫苗接種的csc相關抗原的容易獲得的來源，這是可提高患有crc的患者的治療效果的方法。

質粒和重組bv載體

使用允許目的基因通過轉座轉移到桿狀病毒穿梭載體(桿粒)中的供體質粒pfastbac1(invitrogen,carlsbad,ca)作為構建用于產生桿狀病毒的重組質粒的質粒骨架。如前所述，將鋅指核酸酶(zfn)編碼序列亞克隆到pfastbac1供體質粒中(phang等,2013；tay等,2013)。為了構建pfb-zfn，使用基因合成服務(lifetechnologies,carlsbad,ca)基于先前報道的氨基酸序列(hockemeyer等,2009)來合成編碼右側和左側zfn的兩個dna片段，其各自為993bp。工程化的zfn包含屬于與foki內切核酸酶的專性異二聚體形式融合的aavs1基因座的右和左同源臂(miller等,2007)。將合成的構建體克隆到pma(ampr)(lifetechnologies)中。然后，通過pcr擴增兩個片段，并分別使用noti/xbai(對于右側zfn)和kpni/hindiii(對于左側zfn)將其亞克隆到pfastbac1中。然后，從pfb-ef1α-egfp-hyg-lox(ramachandra等,2011)擴增1.1kb人延伸因子1α(ef1α)啟動子，并使用bamhi/noti克隆到上述構建體中以驅動zfn表達。最后，從pires(clontech,mountainviewca)擴增0.6kb內部核糖體進入位點(ires)，并使用xbai/kpni插入在右側和左側zfnorf之間。aavs1開始于ppp1r12c基因的外顯子1的5’端上游424bp，并且結束于在3’端下游3.35kb。使用pfbzfn來靶向ppp1r12c基因的內含子1內的區(qū)域。

攜帶aavs1同源臂的供體載體pfb-oskm和pfb-egfp-oskm的構建先前已有報道(phang等,2013；zhu等,2013)。oskm表達盒含有ef1a啟動子；由與自切割2a序列和ires連接的人oct4、klf4、sox2和c-myc基因組成的融合基因(oskm)；以及土撥鼠肝炎病毒轉錄后調節(jié)元件(wpre)。為了構建具有重編程因子的供體質粒pfb-oskm，從pzdonor-aavs1(sigma-aldrich,stlouis,mo)擴增屬于aavs1基因座的810bp左同源臂和837bp右同源臂，并使用snabbi/sali(對于左同源臂)和notq/bstbq(對于右同源臂)插入其是先前構建的pfastbac1載體pfb-pgk-neo-egfp-loxp(ramachandra等,2011)中，其包含異種特異性或野生型loxp位點。在去除egfp編碼序列后，使用ecori和sbfi將攜帶ecori-asci-sbfi限制性位點的63bp銜接子序列引入pfb-aavs1。然后，通過asci和sbfi限制性位點插入sv40聚(a)信號。

最后，從phage-ef1a-stemcca(millipore,bedford,ma)擴增含有ef1a啟動子、4個ipsc轉錄因子基因(與自切割2a序列和ires連接作為融合基因人oct4、klf4、sox2和c-myc基因)和土撥鼠肝炎病毒轉錄后調控元件的多順反子盒并使用ecori/asci插入到經修飾的pfb-aavs1質粒中以構建pfb-oskm。為了構建pfb-egfp-oskm，通過單ecori限制性酶將完整的egfp編碼序列引入pfb-oksm并重新連接。添加小牛腸堿性磷酸酶(ciap)以防止消化的骨架載體自連接。用于載體構建的引物列于下面的補充表1中。

分別使用pfbzfn、pfb-oskm和pfb-egfp-oskm＝產生重組bv，包括bv-zfn、bv-oskm和bv-egfp-oskm，并且根據invitrogen的bac-to-bac桿狀病毒表達系統的方案在sf9昆蟲細胞中增殖。本研究中的重組dna研究遵循國家衛(wèi)生研究院(nationalinstitutesofhealth)的指南。

人誘導多能癌細胞的產生和結腸直腸csc的衍生

人腸腺癌hct-8細胞和人結腸腺癌sw480細胞最初由新加坡國立大學(nationaluniversityofsingapore)的linqinsong博士提供，并且在具有10％胎牛血清(fbs；invitrogen,carlsbad,ca)的dulbecco改良的eagle培養(yǎng)基(dmem)(高葡萄糖)中進行培養(yǎng)。使用有限稀釋法進行單細胞克隆。使用隨機選擇的hct-8和sw480亞克隆進行遺傳修飾以將oskm基因引入aavs1基因座中。具體地，在桿狀病毒轉導的前一天，將1×10⁴個癌細胞接種在6孔板的一個孔中完全生長培養(yǎng)基中。用bv-zfn和bvegfp-oskm(或bv-oskm)載體以每個細胞100空斑形成單位(pfu)的感染復數(moi)共轉染細胞，各自持續(xù)6小時。第二天，在上述相同條件下再次轉導細胞。在轉導后第3天開始400μg/ml下的g418選擇，并且每天更換培養(yǎng)基持續(xù)7天。在第10天，將轉導的癌細胞解離并且將1×10³個細胞重新鋪板在接種有絲裂霉素c失活小鼠胚胎成纖維細胞(mef)的新鮮的孔板中一個孔中的人ipsc培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基由80％dmem/f12、20％knockout血清替代品(invitrogen)、2mml-谷氨酰胺、0.1mmβ-巰基乙醇(sigma-aldrich)、0.1mm非必需氨基酸(invitrogen)、10ng/mlbfgf(peprotech，rockyhill，nj)和青霉素/鏈霉素組成。每天更換培養(yǎng)基。在第20天至25天，機械地分離具有限定邊界的緊湊的ips細胞樣集落，并在人ips細胞培養(yǎng)基中的mef上擴增成ipc細胞克隆。每7天人工地傳代這些hct-8和sw480衍生的ipc細胞集落。通過用移液管刮取分化細胞或通過機械地傳代未分化細胞的單個菌落來使細胞維持在未分化狀態(tài)。

在將hct-8和sw480衍生的ipc細胞分化成結腸直腸csc之前，在無飼養(yǎng)條件下在matrigel包被的板(bdscience,franklinlakes,nj)上用mtesr培養(yǎng)基(stemcelltechnology,bc,canada)在標準細胞培養(yǎng)條件(37℃，5％co2)在加濕培養(yǎng)箱中擴增ipc細胞集落。使用accumax(millipore,bedford,ma)將擴增的細胞解離為單細胞，并以每孔1×10⁴的密度接種在0.1％明膠包被的六孔細胞培養(yǎng)板(nalgenuncinternational,rochester,ny)上。將細胞在由補充有以下的dmem/f12(1:1混合物)培養(yǎng)基構成的csc培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)：1％fbs、2％b27(invitrogen)、2mml-谷氨酰胺、50單位/ml青霉素、50μg/ml鏈霉素和20ng/ml人表皮生長因子(egf)(sigma-aldrich)。傳代1個月之后，獲得均質細胞群用于csc表征。對于傳代，將細胞用1×dulbecco磷酸鹽緩沖鹽水(invitrogen)洗滌，用0.25％(w/v)胰蛋白酶-0.53mmedta處理，并在未經包被的t25培養(yǎng)瓶上以1:10的分傳比(splitratio)進行傳代培養(yǎng)?？蓪⑦@些細胞冷凍保存在含有10％dmso的csc完全生長培養(yǎng)基中，并且其在從液氮儲存中解凍后保持存活。

基因組dna提取和基因分型

使用dneasy血液和組織試劑盒(qiagen,hilden,germany)分離細胞的基因組dna。使用pcr基因分型來驗證oskm表達盒在由zfn介導的同源重組驅動的aavs1位點的位點特異性整合。優(yōu)化的反應緩沖液由以下組成：21.5μltaqdna聚合酶高保真度主混合物(invitrogen)、0.5μl的10μm每種正向和反向引物、1.5μldmso和1μl200ng/μldna模板?；蚪Mdna的pcr擴增使用以下參數進行：初始變性步驟：94℃下5分鐘；隨后是35個循環(huán)：94℃下25秒，65℃下45秒和72℃下150秒；最后是延伸步驟：72℃下10分鐘。在1％瓊脂糖凝膠上分析擴增產物。用于pcr擴增的引物列于下面的補充表1中。

對于southern印跡分析，用ecori消化基因組dna(10μg)過夜。將消化的dna上樣到1％瓊脂糖凝膠上，并在25v下電泳10小時。然后，使用干印跡系統(invitrogen)將dna轉移至包含帶正電荷的尼龍膜的dna轉移堆(invitrogen)。在轉移后立即將膜在1.5mnacl/0.5mnaoh變性溶液中溫育10分鐘并風干。在130mj/cm²下進行uv交聯之后，將膜與digeasyhyb(roche,indianapolis,in)雜交過夜。使用pcrdig探針合成試劑盒(roche)合成靶向oksm表達盒的wpre區(qū)的dig標記的探針。在雜交之后，將膜嚴格洗滌，封閉，然后與由即用型(roche)cdp-star檢測的抗地高辛-ap綴合物(digdna標記和檢測試劑盒，roche)孵育。首先，將膜在40℃下用2xssc/0.1％sds洗滌兩次，然后在65℃下用0.1×ssc/0.1％sds洗滌兩次。使用dig洗滌和封閉緩沖液套裝(roche)進行封閉和洗滌。使攜帶dna的膜暴露于化學發(fā)光成像分析儀(chemiluminescentimageanalyzer；imagequantlas4000mini,gehealthcarebiosciences,pittsburgh,pa)15分鐘。用于合成dig-標記的探針的引物列于下面的補充表1中。

pcr定量實時pcr

提取總rna，并使用superscriptiiifirst-strandsynthesissystem(invitrogen)逆轉錄。對于rt-pcr分析，使用以下參數進行pcr擴增：初始變性步驟：94℃下5分鐘；之后是25至30個循環(huán)：94℃下15秒，60℃下45秒和72℃下30秒；最后是延伸步驟：72℃下5分鐘。在2.5％瓊脂糖凝膠上分析擴增產物。用于內源、外源和總oskm(人oct4、sox2、klf4和c-myc基因)分析的pcr引物組列于下面的補充表1中。

對于定量實時pcr(qpcr)分析，使用rt實時sybrgreenpcr主混合物來擴增合成的cdna。使用管家基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶(gapdh)來進行內部歸一化。使用2xquantitectsybrgreenpcr主混合物在兩步rt-pcr中擴增cdna。目的基因的表達水平的歸一化通過將其相對表達水平除以gapdh的相對表達水平來進行。每個基因的相對基因表達水平通過一式三份實驗獲得。使用δδct方法來評價基因表達的相對量化。通過計算2^-δδct來確定相對基因表達的倍數變化。進行qpcr分析以量化結腸直腸csc標志物、上皮間充質轉化(emt)標志物、常用結腸直腸癌診斷和預后標志物物和在全基因組關聯研究中鑒定的最顯著結腸直腸癌相關基因座(gwas)的表達。

熒光染色、western印跡分析和流式細胞術分析

將ipc細胞集落接種在matrigel包被的24孔室載玻片上，并在室溫下在4％多聚甲醛中固定30分鐘。為了誘導細胞的通透性，添加0.1％triton并孵育10分鐘。在用pbs洗滌之后，將細胞在封閉溶液(5％bsa)中孵育1小時。使用的一抗是針對nanog(1:100,r&dsystems,minneapolis,mn)、tra1-60(1:100,millipore)和ssea-4(1:200,santacruz)的那些。使用山羊抗兔igg-fitc或小鼠抗兔igg-羅丹明(santacruzbiotechnology)作為二抗。在抗體孵育之后，通過dapi(1:1000，chemicon)染色樣品以用于細胞核染色。然后，通過熒光顯微鏡拍攝圖像。

對于western印跡分析，用包含蛋白酶抑制劑混合物(nacalaitesque)的ripa緩沖液裂解細胞。使用xmark微板分光計(biorad)用蛋白質測定染料試劑(biorad)來測量裂解物的蛋白質濃度。上樣蛋白裂解物用于進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectrophoresis，sds-page)，并轉移至硝酸纖維素膜(biorad)。將膜在室溫下封閉1小時，然后在4℃下用小鼠抗-cd24(beckmancoulter)、兔抗sox2(abcam)和兔抗-oct4(abcam)抗體孵育過夜，之后用hrp綴合的二抗孵育。使用pierceeclwestern印跡底物(thermoscientific)使免疫反應條帶可視化。使用β-肌動蛋白抗體來確定相等上樣。

對于流式細胞術分析，使用以下單克隆抗體來鑒定和計數csc：藻紅蛋白(pe)-或別藻藍蛋白(apc)標記的抗-cd133(克隆ac133/1；miltenyibiotec)、apc標記的抗-cd24(克隆32d12；miltenyibiotec)、apc標記的抗-cd44(克隆db105；miltenyibiotec)和pe標記的抗-cd166(克隆3a6；bdpharmingen)。添加10μl每種抗體綴合物多至每100μlmacs緩沖液(pbs,ph7.2,0.5％bsa,and2mmedta)10⁷個有核細胞以用于標記細胞并隨后通過流式細胞術進行分析。為了校正與熒光團fitc和pe的光譜重疊，egfp陽性細胞的流式細胞術分析需要顏色補償。

腫瘤球形成測定、集落形成測定、軟瓊脂集落形成測定、創(chuàng)傷愈合測定和細胞遷移/侵入測定

腫瘤球形成測定如前所述但稍作修改來進行(lo等,2012)。將細胞在無血清的非粘附條件下在96孔超低附著板(corning,corning,ny)中的csc培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。將200個細胞接種到96孔板的每個孔中，并對每個克隆測試20個孔(總共4,000個細胞)。在培養(yǎng)1周之后，使用40x放大倍率透鏡在相差顯微鏡下計數腫瘤球的數目。腫瘤球應具有實體的圓形結構，尺寸為50微米至250微米不等。

對于集落形成測定，將rpmi-1640培養(yǎng)基加10％fbs中的細胞(400個細胞/2ml)分配到6孔培養(yǎng)板中并培養(yǎng)3周。用giemsa染色溶液(invitrogen)染色可視化形成的集落數，并在相差顯微鏡下計數。

對于軟瓊脂集落形成測定，將細胞以每孔1e4的密度一式三份地鋪板在具有0.6％基礎瓊脂和0.4％頂層瓊脂的6孔板中，并在37℃，5％co2中孵育一個月。將集落用mtt染色2小時，拍照，并用imagej量化。

對于創(chuàng)傷愈合測定，將細胞以一式三份接種在6孔板中，并在形成匯合單層之后使用200-μl尖端刮擦。在孵育后0小時和48小時，在相差顯微鏡下捕獲圖像，并分析刮擦的閉合。

對于細胞遷移和侵入測定，將細胞懸浮在無血清dmem中，并以5×10⁴/孔的密度接種到8-μm孔徑transwell室(bdbioscience)的頂室中。用geltrex(lifetechnologies)包被室用于侵入測定，同時使用未經包被的室進行遷移測定。用鈣黃綠素-am(5μg/ml)(lifetechnologies)通過在37℃下孵育30分鐘預標記細胞，并將其接種到頂室。用15％fbs作為化學引誘物制備底室。在37℃下孵育24小時后，用固定/染色溶液(0.1％結晶紫、1％福爾馬林和20％乙醇)固定將遷移且通過膜侵入并固定至膜下表面的細胞以用于可視化并在顯微鏡下計數。通過用通過geltrex侵入的細胞數除以遷移通過未包被的插入膜的細胞數來計算細胞侵入率。

畸胎瘤形成測定

為了測試ipc細胞的畸胎瘤形成能力，使用accutase(millipore)解離1×10⁶個細胞，并與pbs中的0.5×10⁶經絲裂霉素處理的hff混合至總體積為50μl。在移植之前，向制備的細胞中添加50μl未經稀釋的冷matrigel(bectondickinson,franklinlakes,nj)。將細胞注射到5周齡nod/scidil2rg(裸)(nsg)小鼠的后腿中。在注射后兩個月，取出所得畸胎瘤并固定在4％多聚甲醛中，包埋在石蠟中，切成5μm切片，并用蘇木精和伊紅染色。動物的所有處理和護理均根據由新加坡國家實驗動物研究委員會(nationaladvisorycommitteeforlaboratoryanimalresearch，singapore)發(fā)布的用于科學目的的動物護理和使用指南進行。

實施例2

通過穩(wěn)定表達oskm基因產生結腸直腸癌ipc細胞

最近開發(fā)了用于oskm因子基因的位點特異性整合的基于桿狀病毒轉導的工程化鋅指核酸酶(zfn)技術(phang等,2013)。該技術涉及使用兩種非整合型桿狀病毒載體：一種表達zfn(bv-zfn)，另一種作為供體載體編碼oskm轉錄因子基因(bv-oskm)。bv-oskm攜帶含有與自切割2a序列和ires連接作為融合基因并由ef1a啟動子驅動的人oct4、klf4、sox2和c-myc基因的表達盒。所述表達盒在兩側以與aavs1基因座同源的序列為側翼。在用bv-zfn和bv-oskm共轉導之后(圖1a)，可將表達盒有效地引入人染色體19中的aavs1基因座中，這是具有側翼為保護所整合轉基因免于基因沉默從而促進經修飾細胞中的穩(wěn)健和持續(xù)轉基因表達的絕緣子元件的開放染色質結構的位點。用該技術來測試人crchct-8和sw480細胞的單細胞衍生亞克隆中的癌細胞重編程。

在轉導后第15天將轉導的細胞轉移到絲裂霉素c失活小鼠胚胎成纖維細胞(mef)的飼養(yǎng)層并將其在人ips細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)之后，在第20天左右觀察到早期集落的形成。集落呈現出邊界尖銳的緊湊細胞形態(tài)(圖1b)，并且對ap染色呈陽性。pcr基因分型證明在6個受檢樣品中5個中oskm盒的aavs1位點整合(圖1c)，其通過southern印跡分析得到進一步證實。產生的集落表達典型的胚胎干細胞標志物，如通過免疫染色(圖1d)、rt-pcr分析和流式細胞術分析所證明的。為了檢測其分化潛力，將從集落收集的細胞注射到nsg小鼠的后腿中以形成畸胎瘤。通過組織學檢查評估形成的畸胎瘤的分化譜，并證明在畸胎瘤中來自所有三個胚胎胚層的細胞的存在(圖1e)。這些發(fā)現證明，crc細胞可重編程為ipc細胞，并且一些重編程細胞顯示出多能性。

實施例3

oskm的異位表達賦予人crc細胞以csc樣特性

將hct8和sw480衍生的ipc細胞在由補充有1％fbs和20ng/ml人表皮生長因子(egf)的dmem/f12的1:1混合物組成的csc培養(yǎng)基中擴增。使用rtqpcr方法，確定所選擇的克隆中oskm基因的相對表達水平(圖2a)。與野生型(wt)細胞相比，在所有受檢hct8和sw480克隆中觀察到8倍至400倍的sox2過表達。在5個受檢克隆中的4個中觀察到oct4的上調2倍至100倍。western印跡分析證實了這些克隆中oct4和sox2蛋白的表達上調。c-myc和klf4的上調不是那么明顯，可能是因為hct8和sw480crc亞克隆中的內源基因的高水平表達。

試圖闡明oskm基因的異位表達在csc的表型特征中的作用。形成腫瘤球的能力是csc的一個特征。當將hct3.11和sw1.9克隆解離成單細胞懸浮液并在超低附著板中培養(yǎng)時，與wthct8和sw480亞克隆相比，檢測到在第14天形成顯著更高數量的腫瘤球數(圖2b)。通過流式細胞術在數個oskm表達的hct8和sw480克隆中分析常用于crc的四種充分研究的csc表面標志物的表達：prominin1(cd133)、cd44抗原(cd44)、小細胞肺癌簇4抗原(cd24)和活化白細胞細胞粘附分子(cd166)。在所有受檢克隆中一致地觀察到cd24上調，甚至在僅顯示sox2上調的克隆(hct1.8)中也如此(圖2c)。確定csc表型的關鍵實驗是通過將系列稀釋物注射到免疫缺陷小鼠中來檢查受試細胞的體內腫瘤發(fā)生性。通過在nodscid小鼠中皮下注射10,000個腫瘤細胞來進行體內腫瘤發(fā)生性測試，并檢測到在hct3.11接種后10只小鼠中有6只中形成腫瘤，而在接種hct/wt細胞后在10只小鼠中根本沒有腫瘤形成。用hct3.11和sw1.9克隆進行的體外測定還證明集落形成、細胞侵入和細胞運動性提高。因此，oct4和sox2的過表達足以在crc細胞中誘導csc特性。

為了進一步表征所衍生的oskm表達細胞，用實時rt-pcr分析對以下三種hct克隆進行標志物基因表達的深度評估：無oskm修飾的單細胞克隆(hct/wt)、其中oct4和sox2二者均上調的hct3.11，以及僅sox2上調的hct1.8。除cd24、cd133、cd44和cd166之外，其他的受試結腸直腸csc標志物包括醛脫氫酶1(aldh1a1)、含富亮氨酸重復序列的g蛋白偶聯受體5(lgr5)、二肽基肽酶4(dpp4)、連環(huán)蛋白β-1(ctnnb1)、atp結合盒亞家族g成員5(abcg5)和整聯蛋白β-1(itgb1)。值得注意的是，檢測到hct3.11中的aldh1a1基因表達上調10倍(圖3a)。已經發(fā)現，在白血病和數種類型的實體瘤中表達高水平aldh1a1的腫瘤細胞顯示出歸因于csc的特性。由于csc樣細胞可通過異常激活上皮-間充質轉化(emt)而產生，因此進行定量rt-pcr分析以確定emt標志物的表達。上皮特征的喪失可通過e-鈣粘蛋白表達來檢測，而間充質特性的獲得可通過以下的表達來確定：波形蛋白(vim)、纖連蛋白(fn1)、玻連蛋白(vtn)、n-鈣粘蛋白(cdh2)、snail(snai1)、twist(twist1)、鋅指e盒結合同源框1(zeb1)、轉化生長因子β1(tgfb1)、slug(snai2)和sox4。發(fā)現在hct1.8中波形蛋白、zeb1和slug上調，在hct3.11中纖連蛋白和slug重新調節(jié)(圖3b)。還進行實時rt-pcr分析以檢測通常用于診斷和預后的臨床設置的crc標志物的基因表達水平，所述標志物包括癌胚抗原(cea)、ca19-9(b3galt5和st6galnac6)、胸苷酸合酶(ts)、胸苷磷酸化酶(tp)、二氫嘧啶脫氫酶(dpd)、gtp酶kras(kras)和腫瘤抑制子p53(tp53)。在hct3.11中dpd顯著上調，高達30倍(圖3c)。已知腫瘤組織中dpd的過表達與對化學治療的不敏感性相關。進一步量化與在gwas中鑒定的最顯著crc相關基因座相關的14個基因的表達。檢測到在hct3.11中多梳復合蛋白(polycombcomplexprotein，bmi-1)基因、mothersagainstdecapentaplegichomolog7(smad7)基因和神經內分泌7b2(scg5)基因上調和在hct1.8中bmi1和formin-1(fmn1)基因的上調(圖3d)。oskm表達對多種與crc相關的病理標志物的影響表明這些轉錄因子在腫瘤發(fā)生和crc發(fā)育中的重要作用。

實施例4

裝載有oskm表達crc的裂解物的人樹突細胞在體外致敏自體同源t細胞之后引發(fā)結腸直腸csc抗原特異性t細胞應答

鑒于oskm表達crc細胞中的csc樣特性增加，對用這些細胞脈沖的dc進行評估以確定其是否可用于致敏對oct4抗原具有反應性的人t細胞(圖4a)。用粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(gm-csf)和白介素-4(il-4)由hla-a2+人外周血單個核細胞(pbmc)產生未成熟dc(圖4b)。這些dc對dc標志物例如cd11c、cd86和dc-sign呈陽性，但顯示t細胞共刺激分子cd40的表達水平低并且cd83幾乎不表達，cd83是對刺激t細胞重要的分子(圖4c)。為了引發(fā)免疫應答，dc應從抗原加工細胞成熟為抗原呈遞細胞(apc)。在用脂多糖(lps)和干擾素-γ(inf-γ)成熟之后，pbmc衍生的dc上調cd83和cd40以及cd86的表達：對于cd83和cd40而言，分別從未成熟dc中的0.96％和48.97％上調至成熟dc中的98.76％和99.30％(圖4b、圖4c)。還使用macs從pbmc中選擇初始t細胞，其使cd8+細胞從28％增加至98％，并顯著減少cd45ro+和cd57+記憶t細胞(圖4d)。然后，用hct3.11腫瘤細胞裂解物脈沖的dc致敏這些初始t細胞以產生ctl。免疫后識別個別抗原的特異性t細胞的頻率通常非常低。檢測個體細胞因子分泌細胞的方法elispot技術在測量t細胞免疫中高度靈敏，可能在1:10,000至1:1,000,000的頻率范圍內檢測抗原特異性t細胞。因此,進行ifn-γelispot測定以分析針對oct4的抗原特異性t細胞應答。用裝載有oct4和gfp(陽性對照)肽的t2細胞再刺激后t細胞反應性顯著提高(圖4e)證明，裝載有oskm表達crc的裂解物的人dc能夠在自體同源t細胞中引發(fā)抗csc抗原應答。

由于垂死腫瘤細胞提供腫瘤抗原源和能夠觸發(fā)抗原呈遞細胞活化的內源危險信號二者，已經使用熱應激來誘導腫瘤細胞死亡，之后使用其裂解物用于dc脈沖。熱應激強烈地提高熱激蛋白(heatshockprotein，hsp)的水平，熱激蛋白是在低水平組成型表達并在細胞應激條件下顯著誘導的獨特蛋白的超家族。在免疫系統中，這些蛋白質可誘導dc的成熟并提供用于特異性觸發(fā)獲得性免疫應答的伴侶多肽。為了測試是否受應激的垂死腫瘤細胞能夠用作dc脈沖的優(yōu)越抗原源，將oskm表達的hct3.11細胞在42℃熱處理60分鐘。在37℃下培養(yǎng)2小時進行細胞回收之后，將經熱處理的細胞冷凍并解凍6個循環(huán)，收集細胞上清液用于dc脈沖。在經熱處理的細胞中觀察到hsp70蛋白的上調且不影響oct4表達(圖5a)。在使用從熱激細胞收集的上清液脈沖dc之后，檢測dc表面標志物表達，并且在腫瘤上清液脈沖的dc和在未脈沖而成熟的dc之間沒有觀察到差異(圖5b)。然后，將這些dc用于t細胞致敏。在與dc共培養(yǎng)連續(xù)兩周之后，cd8+t細胞擴增9倍，而對于使用未經脈沖dc致敏的t細胞，觀察到6倍擴增。在用dc致敏細胞之后，進一步檢測t細胞標志物表達。用從熱激細胞收集的上清液脈沖的dc致敏的t細胞已變成效應t細胞，并且其中一些檢測為記憶t細胞(圖5c)。使用ifn-γelispot測定，與用未經熱激的hct3.11的全裂解物致敏的t細胞相比，在用從熱激細胞收集的上清液脈沖的dc致敏t細胞之后，檢測到針對oct4、sox2以及數種其他csc-和crc-相關抗原的抗原特異性t細胞應答提高(圖5d)。這些研究表明，攝取熱激腫瘤細胞的凋亡小體可產生更擅長引發(fā)csc抗原特異性ctl的成熟dc。

實施例5

很多臨床試驗已證明基于自體同源樹突細胞(dc)的細胞免疫治療的安全性和功效。鑒于oct4、sox2、cd24以及很多其他csc標志物的上調與多種人癌癥類型中的不良預后相關的臨床觀察，在此已開發(fā)了針對csc的dc疫苗接種的新策略(圖6)，其中已證明oskm表達的crc細胞的細胞裂解物可用作與未分化csc相關的抗原的可及來源，未分化csc用于dc脈沖以誘導針對結腸直腸csc的特異性免疫應答。如圖6中所示，首先對結腸直腸癌細胞(crc)進行“oskm重編程”(即使用包含oct4、sox2、klf4和c-myc基因的oskm表達盒重編程)變?yōu)檎T導多能癌(ipc)細胞。如本文所述將ipc細胞在癌干細胞(csc)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)以獲得結腸直腸csc樣細胞。然后，對csc樣細胞進行熱激處理并裂解以產生包含期望腫瘤抗原的裂解物。使用經熱激的裂解物脈沖由已使用本文中所述的方法從患者獲得的外周血單個核細胞制備的未成熟dc(pbmc)。然后，將經脈沖的dc注射回患者內以誘導體內t細胞致敏和擴增。這產生對結腸直腸csc具有特異性的cd8+ctls。

oct4和sox2基因在癌干細胞中的表達

干細胞生物學領域的一項顯著發(fā)展是通過用oskm轉錄因子重編程分化的體細胞產生誘導多能干(ips)細胞。oct4和sox2以及nanog是編碼負責維持胚胎干(es)細胞多能性的調控線路中核心元件的三個基因。klf4在癌發(fā)生和正常發(fā)育二者中均起重要作用，尤其是在對es細胞和ips細胞的自我更新和多能性重要的轉錄調控網絡中起重要作用。myc是得到充分研究的典型癌基因，并且是很多不同人癌癥中最高度擴增的癌基因之一。

已注意到通過重編程的ips細胞衍生和致癌性轉化之間具有高相似性：二者均可通過一系列遺傳修飾和表觀遺傳修飾來誘導并且利用類似的轉錄網絡。在由分化體細胞變?yōu)閕ps細胞的過程期間，細胞獲得無限的增殖特性和自我更新活性，這兩個特征對癌細胞最重要。事實上，研究已經表明，ips基因在多種類型的腫瘤中均表達并且參與其發(fā)育，支持細胞重編程和腫瘤轉化利用共同機制的觀念。oct4的異位表達可劑量依賴性地提高胚胎干細胞的惡性潛能，并且足以在小鼠中誘導腫瘤。sox2已被鑒定為肺和食管鱗狀細胞癌中擴增的譜系存活癌基因。在低分化實體瘤中可頻繁地檢測到多能性相關因子的表達提高，表明這些惡性細胞已獲得未分化的干細胞特性。在臨床上，癌癥亞型中oct4和sox2的表達提高與侵襲性疾病進程例如未分化組織學、對治療的抗性、轉移、復發(fā)和較短的患者存活率相關。由于所述相關性，已提出這兩種蛋白質為癌癥患者中遠端復發(fā)和預后不良的新預示物。

最近，已出現將oct4和sox2基因與csc聯系起來的直接證據。發(fā)現，與具有相同衍生的相對分化的癌細胞相比，這兩種蛋白在數種癌癥的csc中富集。在肺癌衍生的cd133陽性細胞中，需要oct-4表達以維持細胞的癌干細胞樣特性。在膠質母細胞瘤中，sox2的敲減導致膠質瘤csc的增殖受到抑制并且腫瘤發(fā)生性喪失。在骨肉瘤中，已鑒定到這樣的腫瘤細胞亞群，其能夠激活外源性oct4報道子并且與用oct4陽性細胞和oct4陰性細胞重建異源性腫瘤的對應物相比更具腫瘤發(fā)生性。在乳腺癌中，oct4在正常乳腺細胞中的異位表達導致在裸鼠中產生具有腫瘤引發(fā)和移生能力的細胞并且發(fā)生高級的低分化的乳腺癌。在上皮卵巢癌中，從卵巢原發(fā)性腫瘤分離的csc具有增強的oct4表達。在crc中，ips基因的異位表達促進人crc細胞的球體形成、增殖、集落形成和遷移，并且crc中ips基因表達的標志可用于預測癌癥患者的存活。

這些發(fā)現表明，ips基因可能是csc誘導的主要調控基因和維持csc身份的關鍵因子。作為在csc上過表達或在這些腫瘤發(fā)生性細胞中具有高活性但在正常組織中表達受限的蛋白質，oct4和sox2產物是免疫干預的潛在靶標。

作為腫瘤抗原源oskm表達csc樣細胞

本研究的主要目的是研究用經oskm表達crc細胞脈沖的人dc是否可誘導sox2/oct4特異性ctl和結腸直腸csc抗原特異性ctl。這些crc細胞具有在細胞表面上以高密度表達的oskm基因產物作為過表達的“腫瘤相關”抗原。多能性相關抗原作為癌癥免疫治療靶標是有吸引力的，因為這類抗原可能對可限制體內存在的反應性t細胞，尤其是是高親合力t細胞的庫的免疫耐受機制較不易感。在臨床上，靶向csc上多能性相關基因的疫苗可用于針對具有低分化特征的多種癌癥，而不是靶向限定的癌癥亞群。因此，這些疫苗可用作通用的癌癥免疫治療平臺，特別是在維持治療以預防或延遲癌癥復發(fā)的情況下。已經研究了人免疫系統介導針對多能性相關基因的t細胞應答的能力。

當測試人白細胞抗原(hla)-a*0201-限制性sox2衍生肽對膠質瘤反應性cd8+ctl的活化時，可產生針對該肽的特異性ctl并且其能夠裂解膠質瘤細胞，證明sox2為ctl的靶抗原。雖然可在健康人的外周血中容易地檢測到oct4特異性記憶cd4+t細胞，但是僅在患有新診斷的生殖細胞腫瘤的患者的35％中檢測到針對oct4的免疫。

然而，生殖細胞腫瘤的化學治療導致在這些患者中體內誘導抗oct4免疫，表明人中缺乏對oct4的免疫耐受。除多能性相關基因之外，oskm工程化crc細胞還表達很多csc相關的腫瘤發(fā)生性抗原，并且因此用作由于oskm基因介導的重編程產生的csc抗原的豐富來源。由于其還攜帶原始體細胞突變、內部缺失、親代癌細胞中的染色體易位和與變化相關的很多未鑒定到的新抗原，因此這些oskm表達crc細胞將提供廣譜的腫瘤抗原。

穩(wěn)定癌細胞系的使用為疫苗制備和應用提供了很多優(yōu)點。首先，使用已建立的細胞系的使用有助于規(guī)避耗時和成本高的患者個體化gmp生產，并且消除對連續(xù)生產定制的單獨疫苗的需求。其次，使用已建立的細胞系簡化物流、降低疫苗生產和遞送過程的勞力并且提高其成本效用。第三，使用已建立的細胞系允許高度標準化地大規(guī)模生產適于具有特定腫瘤類型的所有患者的同種異體疫苗，所謂的“現成”產品。最后，與hla單倍型無關，對所有疫苗使用單一批次的同種異體疫苗消除疫苗在質量和組成方面的變化，有利于臨床結果的可靠比較分析。

結論

在切除原發(fā)性腫瘤之后，在未接受化學治療的患有iv期crc的患者中生存中值為8個月，在接受化學治療的患者中為21個月。已引入例如伊立替康(cpt-11)和奧沙利鉑(ohp)的活性化學治療性藥物來治療患有轉移性crc的患者。然而，受副作用和累積毒性的限制，連續(xù)化學治療的時長很少超過6個月。作為典型方式，以預定數量的周期(3至6個月)進行化學治療，隨后完全中斷或用毒性較低的藥物維持。當前的研究有可能導致開發(fā)基于自體同源免疫細胞的治療方案，即靶向csc的基于dc的免疫治療，希望該方案可用作crc維持治療的選擇方案。雖然數個實驗室已經針對crc對dc癌癥免疫治療進行了測試，但是使用dc方案來靶向csc的努力仍然是之前尚未探索的開創(chuàng)性工作。當前的研究是有吸引力的，因為其利用基因工程方法來增強crc細胞的csc性質，之后將其用于dc脈沖。本文中關于通過oskm因子來轉錄調節(jié)csc基因表達而公開的發(fā)現不僅揭示了對csc中的分子調控機制的基本了解，并且還為開發(fā)新的crc治療提供了重要線索。

補充表1

用于靶向oksm轉基因整合和過表達的引物

補充表1(繼續(xù))

用于dna甲基化分析的引物

補充表1(繼續(xù))

用于人結腸直腸癌干細胞標志物的引物

補充表1(繼續(xù))

用于上皮-間充質轉化(emt)標志物的引物

補充表1(繼續(xù))

用于結腸直腸癌預后生物標志物的引物

補充表1(繼續(xù))

用于在gwas中鑒定的結腸直腸癌高風險基因座的引物

補充表1(繼續(xù))

用cd24核心啟動子的轉錄轉錄調控的引物

補充表1(繼續(xù))

用于emsa測定的經生物素標記的寡核苷酸

補充表1(繼續(xù))

用于敲除cd243’-utr上的mir-205結合位點的引物

補充表1(繼續(xù))

用于敲除cd24orf的引物

參考文獻

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ccaaaagacggcaatatggt20

<210>15

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>量化外源c-myc表達(正向引物)

<400>15

aagaggacttgttgcggaaa20

<210>16

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>量化外源c-myc表達(反向引物)

<400>16

ggcattaaagcagcgtatcc20

<210>17

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>量化內源oct4表達(正向引物)

<400>17

aaggaattgggaacacaaagg21

<210>18

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>量化內源oct4表達(反向引物)

<400>18

caagagcatcattgaacttcac22

<210>19

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>量化內源sox2表達(正向引物)

<400>19

gggaaatgggaggggtgcaaaagagg26

<210>20

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>量化內源sox2表達(反向引物)

<400>20

ttgcgtgagtgtggatgggattggtg26

<210>21

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>量化內源klf4表達(正向引物)

<400>21

tggtgcttggtgagtcttg19

<210>22

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>量化內源klf4表達(反向引物)

<400>22

aggtcataaatgttgatcggaag23

<210>23

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>量化內源c-myc表達(正向引物)

<400>23

ccttgccgcatccacgaaac20

<210>24

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>量化內源c-myc表達(反向引物)

<400>24

ccttgctcgggtgttgtaagttc23

<210>25

<211>34

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>攜帶ecori-asci-sbfi限制性位點的銜接子序列

<400>25

acagaattcctgcgcgccaagttacggcgcgccc34

<210>26

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>攜帶ecori-asci-sbfi限制性位點的銜接子序列

<400>26

ttagcatacattatacctgcaggcac26

<210>27

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>檢測oksm-egfp供體在aavs1基因座處的位點特異性整合(正向引物)

<400>27

gctacgtcccttcggccctcaatc24

<210>28

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>oksm-egfp供體在aavs1基因座處的位點特異性整合(反向引物)

<400>28

gcctccctaagacccagaagtccag25

<210>29

<211>27

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>檢測oksm-egfp盒在基因組中的多重整合的southern印跡的探針設計(正向引物)

<400>29

gactggtattcttaactatgttgctcc27

<210>30

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>檢測oksm-egfp盒在基因組中的多重整合的southern印跡的探針設計(反向引物)

<400>30

caaagggagatccgactcgtctga24

<210>31

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增經二硫化物處理的oct3/4啟動子(正向引物)

<400>31

gaggttggagtagaaggattgttttggttt30

<210>32

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增經二硫化物處理的oct3/4啟動子(反向引物)

<400>32

cccccctaacccatcacctccaccacctaa30

<210>33

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增未經二硫化物處理的oct3/4啟動子(正向引物)

<400>33

gaggctggagcagaaggattgctttggccc30

<210>34

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增未經二硫化物處理的oct3/4啟動子(反向引物)

<400>34

cccccctggcccatcacctccaccacctgg30

<210>35

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增經二硫化物處理的nanog啟動子(正向引物)

<400>35

tggttaggttggttttaaatttttg25

<210>36

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增經二硫化物處理的nanog啟動子(反向引物)

<400>36

aacccacccttataaattctcaatta26

<210>37

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增未經二硫化物處理的nanog啟動子(正向引物)

<400>37

tggccaggctggtttcaaactcctg25

<210>38

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增未經二硫化物處理的nanog啟動子(反向引物)

<400>38

gacccacccttgtgaattctcagtta26

<210>39

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增經二硫化物處理的rex1啟動子(正向引物)

<400>39

ggtttaaaagggtaaatgtgattatattta30

<210>40

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增經二硫化物處理的rex1啟動子(反向引物)

<400>40

caaactacaaccacccatcaac22

<210>41

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增未經二硫化物處理的rex1啟動子(正向引物)

<400>41

ggcctaaaagggtaaatgtgattacaccca30

<210>42

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增未經二硫化物處理的rex1啟動子(反向引物)

<400>42

caggctacagccacccatcagc22

<210>43

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnacd133(正向引物)

<400>43

cttcatccacagatgctcctaag23

<210>44

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnacd133(反向引物)

<400>44

tggattcatatgccttctgtaaga24

<210>45

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnacd44(正向引物)

<400>45

agggatcctccagctcctttcg22

<210>46

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnacd44(反向引物)

<400>46

cgtccgagagatgctgtagcga22

<210>47

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnacd166(正向引物)

<400>47

gtgtgtctgggagaagacgctg22

<210>48

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnacd166(反向引物)

<400>48

ggtacgtcaagtcggcaaggtatg24

<210>49

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnaabcb5(正向引物)

<400>49

atccacaagccagactagaaggc23

<210>50

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnaabcb5(反向引物)

<400>50

agatccaactgcttcctttctcag24

<210>51

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnaaldh1a1(正向引物)

<400>51

tgagccagtcacctgtgttcca22

<210>52

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnaaldh1a1(反向引物)

<400>52

tggcagagctcctcctcagttg22

<210>53

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnacd29(正向引物)

<400>53

atcagacgcgcagaggaggc20

<210>54

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnacd29(反向引物)

<400>54

gagcaaacacacagcaaactgaactg26

<210>55

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnactnnb1(正向引物)

<400>55

acggaggaaggtctgaggagca22

<210>56

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnactnnb1(反向引物)

<400>56

tgagtagccattgtccacgctgg23

<210>57

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnalgr5(正向引物)

<400>57

acagtgcggcagacgtaaggat22

<210>58

<211>27

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnalgr5(反向引物)

<400>58

ggagcagctgactgatgttgttcatac27

<210>59

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnacd26(正向引物)

<400>59

gtggaaggttcttctgggact21

<210>60

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnacd26(反向引物)

<400>60

actgcccatcaggagatattgaat24

<210>61

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnae-鈣粘蛋白(正向引物)

<400>61

gggtgactacaaaatcaatc20

<210>62

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnae-鈣粘蛋白(反向引物)

<400>62

gggggcagtaagggctcttt20

<210>63

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrna波形蛋白(正向引物)

<400>63

tgaaggaggaaatggctcgtc21

<210>64

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrna波形蛋白(反向引物)

<400>64

gtttggaagaggcagagaaatcc23

<210>65

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrna纖連蛋白(正向引物)

<400>65

ggagtttcctgagggttt18

<210>66

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrna纖連蛋白(反向引物)

<400>66

gcagaagtgtttgggtga18

<210>67

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnan-鈣粘蛋白(正向引物)

<400>67

cgaatggatgaaagacccatcc22

<210>68

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnan-鈣粘蛋白(反向引物)

<400>68

ggagccactgccttcatagtcaa23

<210>69

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnasnail(正向引物)

<400>69

atcggaagcctaactacagcgagc24

<210>70

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnasnail(反向引物)

<400>70

cagagtcccagatgagcattgg22

<210>71

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnatwist(正向引物)

<400>71

ggagtccgcagtcttacgag20

<210>72

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnatwist(反向引物)

<400>72

tctggaggacctggtagagg20

<210>73

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnazeb1(正向引物)

<400>73

acccttgaaagtgatccagc20

<210>74

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnazeb1(反向引物)

<400>74

cattccattttctgtcttccgc22

<210>75

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnaslug(正向引物)

<400>75

agatgcatattcggacccac20

<210>76

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnaslug(反向引物)

<400>76

cctcatgtttgtgcaggaga20

<210>77

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnatgfb1(正向引物)

<400>77

attcctggcgatacctcagc20

<210>78

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnatgfb1(反向引物)

<400>78

acccgttgatgtccacttgc20

<210>79

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnasox4(正向引物)

<400>79

ggcctcgagctgggaatcgc20

<210>80

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnasox4(反向引物)

<400>80

gcccactcggggtcttgcac20

<210>81

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnacea(正向引物)

<400>81

aacttctcctggtctctcagct22

<210>82

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnacea(反向引物)

<400>82

gcaaatgctttaaggaagaag21

<210>83

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnab3galt5(ca19-9)(正向引物)

<400>83

caaaccaagcccagaacctg20

<210>84

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnab3galt5(ca19-9)(反向引物)

<400>84

tcaatctcatcttcgggaaagc22

<210>85

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnast6galnac6(ca19-9)(正向引物)

<400>85

gccggagatgaggaaactga20

<210>86

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnast6galnac6(ca19-9)(反向引物)

<400>86

gatcacgaacactgctgacc20

<210>87

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnats(正向引物)

<400>87

acctgaatcacatcgagcca20

<210>88

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnats(反向引物)

<400>88

ttggatgcggattgtaccct20

<210>89

<211>17

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnatp(正向引物)

<400>89

cgcctggtgacttctcc17

<210>90

<211>17

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnatp(反向引物)

<400>90

tgggtcagcaccgaggt17

<210>91

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnadpd(正向引物)

<400>91

gttgtggctatgattgatga20

<210>92

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnadpd(反向引物)

<400>92

attcacagataagggtacgc20

<210>93

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnadcc(正向引物)

<400>93

ttccgccatggtttttaaatca22

<210>94

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnadcc(反向引物)

<400>94

agcctcattttcagccacaca21

<210>95

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnakras(正向引物)

<400>95

actggggagggctttctttg20

<210>96

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnakras(反向引物)

<400>96

ggcatcatcaacaccctgtct21

<210>97

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnatp53(正向引物)

<400>97

ggtggtgccctatgagccg19

<210>98

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnatp53(反向引物)

<400>98

tcctctgtgcgccggtctc19

<210>99

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnagpa33(正向引物)

<400>99

ccaatcaaaggagggctcacc21

<210>100

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnagpa33(反向引物)

<400>100

ttctcttagctgctctggtggc22

<210>101

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnabmi-1(正向引物)

<400>101

tggctcgcattcattttctg20

<210>102

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnabmi-1(反向引物)

<400>102

agtagtggtctggtcttgtg20

<210>103

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnaapc(正向引物)

<400>103

ggaagcagagaaagtactgga21

<210>104

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnaapc(反向引物)

<400>104

ctgaagttgagcgtaataccag22

<210>105

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnasmad4(正向引物)

<400>105

ctgctgctggaattggtgttga22

<210>106

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnasmad4(反向引物)

<400>106

ctggagggcccggtgtaagt20

<210>107

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnaaxin2(正向引物)

<400>107

ctggctccagaagatcacaaag22

<210>108

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnaaxin2(反向引物)

<400>108

atctcctcaaacaccgctcca21

<210>109

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnapold1(正向引物)

<400>109

gactacacgggagccactgtca22

<210>110

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnapold1(反向引物)

<400>110

gtaacacaggttgtgggccatc22

<210>111

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnastk11(正向引物)

<400>111

gaagtcggaacacaaggaag20

<210>112

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnastk11(反向引物)

<400>112

ccgtaacctcctcagtagtt20

<210>113

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnabmpr1a(正向引物)

<400>113

gtcagaaaatggagtaacctta22

<210>114

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnabmpr1a(反向引物)

<400>114

tagttcgctgaaccaataaagg22

<210>115

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnamutyh(正向引物)

<400>115

ggcctctgtctccccatatcat22

<210>116

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnamutyh(反向引物)

<400>116

ctgctgtagggtctctgctgta22

<210>117

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnasmad7(正向引物)

<400>117

ctgcaacccccatcacctta20

<210>118

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnasmad7(反向引物)

<400>118

ccctgtttcagcggaggaa19

<210>119

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnabmp2(正向引物)

<400>119

ggtggaatgactggattg18

<210>120

<211>17

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnabmp2(反向引物)

<400>120

gcatcgagatagcactg17

<210>121

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnabmp4(正向引物)

<400>121

ctggtccaccacaatgtgac20

<210>122

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnabmp4(反向引物)

<400>122

cgatcggctaatcctgacat20

<210>123

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnarhpn2(正向引物)

<400>123

gagaacgacggctactttcgga22

<210>124

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnarhpn2(反向引物)

<400>124

agctcttccttgagcatctgca22

<210>125

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnascg5(正向引物)

<400>125

atatccagctcaccaggccatgaa24

<210>126

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnascg5(反向引物)

<400>126

tgttgtctccagtcaactctgcca24

<210>127

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnagrem1(正向引物)

<400>127

gtcacactcaactgccctga20

<210>128

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnagrem1(反向引物)

<400>128

ggtgaggtgggtttctggta20

<210>129

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnafmn1(正向引物)

<400>129

cagcatctctgttcctccatca22

<210>130

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnafmn1(反向引物)

<400>130

agtgccttccattatgcctacc22

<210>131

<211>32

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>構建pgk-luc-內含子以檢測cd24的內含子2（2.4kb）轉錄調控活性(正向引物)

<400>131

gcgctctagactgcagggattagcgcctggag32

<210>132

<211>37

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>構建pgk-luc-內含子以檢測cd24的內含子2（2.4kb）轉錄調控活性(反向引物)

<400>132

atatggccggccccacatcacagctacctccatgtac37

<210>133

<211>31

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>構建cd24-衍生的螢光素酶報道子以檢測cd24的核心啟動子活性(正向引物)

<400>133

gatgatatcgataccagccgggtaccagcag31

<210>134

<211>31

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>構建cd24-衍生的螢光素酶報道子以檢測cd24的核心啟動子活性(反向引物)

<400>134

gataagctttcaggatgctgggtgcttggag31

<210>135

<211>33

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>構建cd24-衍生的螢光素酶報道子以檢測cd24的核心啟動子活性(正向引物)

<400>135

gatgatatcgcagtctgagtggcaatgcacttg33

<210>136

<211>31

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>構建cd24-衍生的螢光素酶報道子以檢測cd24的核心啟動子活性(反向引物)

<400>136

gataagctttcaggatgctgggtgcttggag31

<210>137

<211>32

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>構建cd24-衍生的螢光素酶報道子以檢測cd24的核心啟動子活性(正向引物)

<400>137

gatgatatccctgtagtttgcagcgtcaggca32

<210>138

<211>31

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>構建cd24-衍生的螢光素酶報道子以檢測cd24的核心啟動子活性(反向引物)

<400>138

gataagctttcaggatgctgggtgcttggag31

<210>139

<211>31

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>構建cd24-衍生的螢光素酶報道子以檢測cd24的核心啟動子活性(正向引物)

<400>139

gatgatatcccacgcccggccaaagtatttc31

<210>140

<211>31

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>構建cd24-衍生的螢光素酶報道子以檢測cd24的核心啟動子活性(反向引物)

<400>140

gataagctttcaggatgctgggtgcttggag31

<210>141

<211>38

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>sox2結合位點的cd24啟動子區(qū)(正向引物)

<400>141

tggcaggtcccgggaaacaaaggaaacttgggcccggc38

<210>142

<211>38

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>攜帶sox2結合位點的cd24啟動子區(qū)(反向引物)

<400>142

gccgggcccaagtttcctttgtttcccgggacctgcca38

<210>143

<211>38

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>攜帶兩個sox2結合位點的cd24啟動子區(qū)正向引物)

<400>143

ccgggaaacaaaggaaactccgggaaacaaaggaaact38

<210>144

<211>38

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>攜帶兩個sox2結合位點的cd24啟動子區(qū)（陽性對照）(反向引物)

<400>144

agtttcctttgtttcccggagtttcctttgtttcccgg38

<210>145

<211>38

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>不攜帶sox2結合位點的cd24啟動子區(qū)（非相關序列1）(正向引物)

<400>145

ccagccgggtaccagcagccggcggcgcccgcccacct38

<210>146

<211>38

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>不攜帶sox2結合位點的cd24啟動子區(qū)（非相關序列1）(反向引物)

<400>146

aggtgggcgggcgccgccggctgctggtacccggctgg38

<210>147

<211>38

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>不攜帶sox2結合位點的cd24啟動子區(qū)（非相關序列2）(正向引物)

<400>147

gctttcctggtatataaggtctcgccggctcgccgcgc38

<210>148

<211>38

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>不攜帶sox2結合位點的cd24啟動子區(qū)（非相關序列2）(反向引物)

<400>148

gcgcggcgagccggcgagaccttatataccaggaaagc38

<210>149

<211>38

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>攜帶突變的sox2結合位點的cd24啟動子區(qū)(正向引物)

<400>149

tggcaggtcccgggaaaaggaggaaacttgggcccggc38

<210>150

<211>38

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>攜帶突變的sox2結合位點的cd24啟動子區(qū)(反向引物)

<400>150

gccgggcccaagtttcctccttttcccgggacctgcca38

<210>151

<211>38

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>攜帶共有sox2結合位點的cd24啟動子區(qū)（陽性對照）(正向引物)

<400>151

tggcaggtccatttgcataacaaagagttgggcccggc38

<210>152

<211>38

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>攜帶共有sox2結合位點的cd24啟動子區(qū)（陽性對照）(反向引物)

<400>152

gccgggcccaactctttgttatgcaaatggacctgcca38

<210>153

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>構建crispr以敲減cd243’-utr上的mir205結合位點

(正向引物)

<400>153

aaacgagtttcatgtacaagatgagt26

<210>154

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>構建crispr以敲減cd243’-utr上的mir205結合位點(反向引物)

<400>154

taaaactcatcttgtacatgaaactc26

<210>155

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>t7e1測定以量化對所靶向cd24位點的crispr介導的切割效率(正向引物)

<400>155

cagtcaacagccagtctcttcgtg24

<210>156

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>t7e1測定以量化對所靶向cd24位點的crispr介導的切割效率(反向引物)

<400>156

catcattgccctggcacatgtca23

<210>157

<211>34

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>構建攜帶cd24序列的左同源臂(正向引物)

<400>157

gcgctacgtaccaggatagacagtgacccaatga34

<210>158

<211>34

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>構建攜帶cd24序列的左同源臂(反向引物)

<400>158

atatgtcgaccttgtacatgaaactccagcagat34

<210>159

<211>37

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>構建攜帶cd24序列的右同源臂(正向

引物)

<400>159

atatgcggccgcgaaggagaggcaacatccaaaatag37

<210>160

<211>35

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>構建攜帶cd24序列的右同源臂(反向

引物)

<400>160

gcgcttcgaatcaagcctgtaatcccagcactttg35

<210>161

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>檢測mcherry轉基因在cd24上的位點特異性整合(正向引物)

<400>161

gacatcacctcccacaacgaggact25

<210>162

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>檢測mcherry轉基因在cd24上的位點特異性整合(反向引物)

<400>162

agcatcagtgtgtgaccatgcgaac25

<210>163

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增6號染色體上的mrnacd24(正向引物)

<400>163

gagcaatggtggccaggctc20

<210>164

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增6號染色體上的mrnacd24(反向引物)

<400>164

ggattgggtttagaagatggggaaa25

<210>165

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增y染色體上的mrnacd24(正向引物)

<400>165

gagcaatggtggccaggctt20

<210>166

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增y染色體上的mrnacd24(反向引物)

<400>166

ggattgggtttagaagatggggaag25

<210>167

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增15號染色體上的mrnacd24(正向引物)

<400>167

atccagccagacacgctgca20

<210>168

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增15號染色體上的mrnacd24(反向引物)

<400>168

cagtagctggatttggggcagtc23

<210>169

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增由6號染色體表達的截短mrnacd24(正向

引物)

<400>169

tctggaagtccaatgtggcaag22

<210>170

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增由6號染色體表達的截短mrnacd24(反向

引物)

<400>170

cactggaagttcccttctcatgtac25

<210>171

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>量化前體莖環(huán)hsa-mir-205表達(正向引物)

<400>171

agatcctcagacaatccatgtgct24

<210>172

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>量化前體莖環(huán)hsa-mir-205表達(反向引物)

<400>172

agctccatgcctcctgaact20

<210>173

<211>28

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>成熟mir205-5p的cdna合成(銜接子)

<400>173

tccgtcgttctaatgcgaacagactccg28

<210>174

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>量化成熟mir205-5p表達(正向引物)

<400>174

cctccatccttcattccaccg21

<210>175

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>量化成熟mir205-5p表達(反向引物)

<400>175

gtttccgtcgttctaatgcgaa22

<210>176

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>量化mir205hg表達(正向引物)

<400>176

ctcaagtacccatcttggaggg22

<210>177

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>量化mir205hg表達(反向引物)

<400>177

cacgcacactccagatgtctc21

<210>178

<211>36

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>構建cmv-mir205(正向引物)

<400>178

gcgcgaattcaaagatcctcagacaatccatgtgct36

<210>179

<211>33

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>構建cmv-mir205(反向引物)

<400>179

atatactagttgtcagctccatgcctcctgaac33

<210>180

<211>32

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>構建cmv-mir205hg(共表達mir205)(正向引物)

<400>180

gcgcgaattcgaaatgggctgagtccctcttg32

<210>181

<211>36

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>構建cmv-mir205hg(共表達mir205)(反向引物)

<400>181

atatactagttttttcagtagacaagcaacttttag36

<210>182

<211>35

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>構建pgk-luc-utr以檢測cd24的3’-utr（211bp）轉錄調控活性正向引物)

<400>182

gcgctctagacttaagagactcaggccaagaaacg35

<210>183

<211>37

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>構建pgk-luc-utr以檢測cd24的3’-utr（211bp）轉錄調控活性(反向引物)

<400>183

atatggccggccggcatccatcatctagtcaaacctc37

<210>184

<211>35

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>構建pgk-luc-utr以檢測cd24的3’-utr（211bp）轉錄調控活性(正向引物)

<400>184

gcgctctagacttaagagactcaggccaagaaacg35

<210>185

<211>39

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>構建pgk-luc-utr以檢測cd24的3’-utr（211bp）轉錄調控活性(反向引物)

<400>185

atatggccggcccaagccacattcaaggaaatcatgtct39

<210>186

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>構建crispr以敲除cd24orf(正向引物)

<400>186

aaacggacatgggcagagcaatgggt26

<210>187

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>構建crispr以敲除cd24orf(反向引物)

<400>187

taaaacccattgctctgcccatgtcc26

<210>188

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>t7e1測定以量化對所靶向cd24位點的crispr介導的切割效率(正向引物)

<400>188

cacgtcacggctattgtggctttc24

<210>189

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>t7e1測定以量化對所靶向cd24位點的crispr介導的切割效率(反向引物)

<400>189

gcctctgggtgaaagtgggaagtag25

<210>190

<211>35

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>構建攜帶cd24序列的左同源臂(正向引物)

<400>190

gcgctacgtagctcacagaacaaagcaagggcttc35

<210>191

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>構建攜帶cd24序列的左同源臂(反向引物)

<400>191

atatgtcgacttgctctgcccatgtcccct30

<210>192

<211>31

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>構建攜帶cd24序列的右同源臂(正向引物)

<400>192

atatgcggccgctggtggccaggctcgggct31

<210>193

<211>36

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>構建攜帶cd24序列的右同源臂(反向引物)

<400>193

gcgcttcgaaaggatctagggagaccgcgctggtag36

<210>194

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>檢測mcherry轉基因在cd24上的位點特異性整合

(正向引物)

<400>194

gacatcacctcccacaacgaggact25

<210>195

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>檢測mcherry轉基因在cd24上的位點特異性整合

(反向引物)

<400>195

atcctccaaacccgaactgaccca24

<210>196

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnacd24(fowrad引物)

<400>196

gagcaatggtggccaggctc20

<210>197

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnacd24(反向引物)

<400>197

ggattgggtttagaagatggggaaa25

<210>198

<211>31

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnadpp4(正向引物)

<400>198

cattcacttttgaaaagttctccctagaaag31

<210>199

<211>28

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnadpp4(反向引物)

<400>199

cgtttttgtgcagttttaaaatgtgtgc28

<210>200

<211>28

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnaitgb1(正向引物)

<400>200

ggttctcatatgaacctaactggtcaaa28

<210>201

<211>32

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnaitgb1(反向引物)

<400>201

atcatgtttataaaagcaatagaaggtacggt32

<210>202

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnakit(正向引物)

<400>202

aaggtgatctatttttccctttctcc26

<210>203

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnakit(反向引物)

<400>203

tttcatactgaccaaaactcagcct25

<210>204

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnamet(正向引物)

<400>204

gactcctacaacccgaatactgc23

<210>205

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴增mrnamet(反向引物)

<400>205

catagtgctccccaatgaaagtagag26