專利名稱：用嵌合受體靈敏且快速鑒定自身免疫疾病的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供在自身免疫疾病診斷中有用的方法和組合物，尤其，本發(fā)明提供在格 雷夫斯病診斷和管理中使用的方法和組合物。例如，一種組合物包含具有對循環(huán)促甲狀腺 激素免疫球蛋白的提高的靈敏性和特異性的嵌合促甲狀腺激素受體?？稍谔瞧べ|(zhì)激素存在 下優(yōu)化使用所述嵌合受體的測定。
背景技術(shù)：
由于自身抗體對位于甲狀腺上受體的識別和結(jié)合作用而導(dǎo)致了腺體生長和甲狀 腺激素過度產(chǎn)生，格雷夫斯病(也稱為“彌漫性毒性甲狀腺腫”)成為甲狀腺機能亢進的主 要原因。據(jù)報道格雷夫斯病為兒童和青少年甲狀腺機能亢進的最常見原因(見Boter和 Brown, J.Pediatr. 132 :612_618(1998))。目前用于格雷夫斯病的診斷技術(shù)有許多不足之處?？偟膩碚f，商業(yè)化的方法是繁 瑣和辛苦的；其他方法需對需要進行診斷的人員施用放射性示蹤劑。但最重要的是，目前使 用的絕大多數(shù)方法缺乏足夠的靈敏性以便進行快速、準確和有成本效益的檢測。仍需建立用于格雷夫斯病的安全、易于使用、靈敏、特異和有成本效益的測定系 統(tǒng)。發(fā)明概述本發(fā)明提供在自身免疫疾病診斷和管理中有用的方法和組合物，尤其，本發(fā)明提 供了用于格雷夫斯病診斷和治療的方法和組合物。例如，一種組合物包含具有對循環(huán)促甲 狀腺激素免疫球蛋白的提高的靈敏性和特異性的嵌合促甲狀腺激素受體?？稍谔瞧べ|(zhì)激素 存在下優(yōu)化使用所述嵌合受體的測定。在一實施方式中，本發(fā)明涉及一種方法，其包括a)提供i)包含穩(wěn)定轉(zhuǎn)染編碼嵌 合TSH受體和熒光素酶基因的載體的細胞系；ii)源自疑似患有格雷夫斯病的患者的血清 樣品；和iii)含有糖皮質(zhì)激素的細胞培養(yǎng)基；b)在所述熒光素酶基因發(fā)出可檢測信號的條 件下將所述血清樣品與所述細胞系及所述培養(yǎng)基相接觸。在一實施方式中，所述方法還包 含步驟C)測量信號強度，其中所述強度與存在于樣品中的促甲狀腺激素受體自身抗體濃 度相關(guān)。在一實施方式中，所述糖皮質(zhì)激素選自地塞米松、潑尼松、氫化可的松、氟替卡松 或可的松。在一實施方式中，所述接觸還包含聚乙二醇。在一實施方式中，所述嵌合TSH受 體包含源自大鼠絨毛膜促性腺激素受體的氨基酸序列。在一實施方式中，所述氨基酸序列 包含對應(yīng)于人TSH受體氨基酸序列的第262 第335氨基酸殘基的73個氨基酸。在一實 施方式中，所述血清樣品包含TSH受體自身抗體。在一實施方式中，所述自身抗體包含TSH 刺激性自身抗體。在一實施方式中，所述自身抗體包含TSH阻斷性抗體。在一實施方式中，本發(fā)明涉及能夠檢測血清TSH自身抗體的包含嵌合TSH受體和 熒光素_熒光素酶系統(tǒng)的試劑盒，其中所述系統(tǒng)還包含糖皮質(zhì)激素。在一實施方式中，所述 糖皮質(zhì)激素選自地塞米松、潑尼松、氫化可的松、氟替卡松或可的松。在一實施方式中，所 述受體包含人TSH受體氨基酸序列。在一實施方式中，所述受體包含大鼠絨毛膜激素受體氨基酸序列。在一實施方式中，所述大鼠受體氨基酸序列包含第262 第335氨基酸殘基。 在一實施方式中，所述試劑盒還包含能夠表達嵌合TSH受體和熒光素-熒光素酶系統(tǒng)的細 胞系。在一實施方式中，所述試劑盒還包含聚乙二醇。在一實施方式中，所述試劑盒還包含 編碼嵌合TSH受體和熒光素酶基因的載體。在一實施方式中，所述載體還包含操控性連接 到載體上的啟動子。在一實施方式中，所述啟動子包含糖蛋白α亞基啟動子。在一實施方 式中，所述細胞系包含CHO細胞。在一實施方式中，所述細胞系包含RD細胞。在一實施方 式中，所述試劑盒還包含使用說明。在一實施方式中，本發(fā)明提供了確定測試樣品中存在甲狀腺刺激性自身抗體的方 法，包括a)提供i)疑似含有甲狀腺刺激性自身抗體的測試樣品；ii)包含在測試手段中 的含有糖皮質(zhì)激素的培養(yǎng)細胞，其中所述細胞表達嵌合TSH受體和熒光素_熒光素酶系統(tǒng)， 和iii)聚乙二醇；b)在使用熒光素-熒光素酶系統(tǒng)可檢測到甲狀腺刺激性抗體的條件下 使所述測試樣品接觸所述培養(yǎng)細胞和聚乙二醇；及c)觀察可檢測的甲狀腺刺激性抗體的 存在。在一實施方式中，所述糖皮質(zhì)激素選自地塞米松、潑尼松、氫化可的松、氟替卡松或 可的松。在一優(yōu)選的實施方式中，所述培養(yǎng)細胞選自=RDluc細胞和CHORluc細胞。在另一 實施方式中，使用光度計進行觀察。在進一步的實施方式中，通過熒光素_熒光素酶系統(tǒng)測 定cAMP濃度。在另一實施方式中，所述方法還包含生長培養(yǎng)基，而在其他實施方式中，所述 方法還包含刺激培養(yǎng)基。在一些特別優(yōu)選的實施方式中，在接觸測試樣品前使所述培養(yǎng)細 胞接觸生長培養(yǎng)基。在一再進一步的實施方式中，使所述培養(yǎng)細胞接觸含有測試樣品的刺 激培養(yǎng)基。在其他特別優(yōu)選的實施方式中，所述刺激培養(yǎng)基包含聚乙二醇。在一實施方式中，本發(fā)明還提供確定測試樣品中存在甲狀腺刺激性自身抗體的方 法，包括a)提供i)疑似含有甲狀腺刺激性自身抗體的測試樣品；ii)包含糖皮質(zhì)激素的 培養(yǎng)細胞，其中所述細胞選自在測試手段中含有的RD-Rluc細胞或CHO-Rluc細胞，其中所 述細胞表達嵌合TSH受體，和iii)聚乙二醇；b)在使用熒光素-熒光素酶系統(tǒng)可檢測到甲 狀腺刺激性抗體的條件下使測試樣品接觸所述培養(yǎng)細胞和所述聚乙二醇；及c)觀察可檢 測的甲狀腺刺激性抗體的存在，其中使用光度計進行觀察。在一實施方式中，所述糖皮質(zhì)激 素選自地塞米松、潑尼松、氫化可的松、氟替卡松或可的松。在進一步的實施方式中，通過 熒光素_熒光素酶系統(tǒng)測定cAMP濃度。在一些實施方式中，所述方法還包含生長培養(yǎng)基， 而在其他實施方式中，所述方法還包含刺激培養(yǎng)基。在一些特別優(yōu)選的實施方式中，在接觸 測試樣品前使所述培養(yǎng)細胞接觸生長培養(yǎng)基。在又進一步的實施方式中，使所述培養(yǎng)細胞 接觸含有測試樣品的刺激培養(yǎng)基。在其他優(yōu)選的實施方式中，所述刺激培養(yǎng)基包含聚乙二 在一實施方式中，本發(fā)明還提供確定測試樣品中存在甲狀腺刺激性自身抗體的方 法，其包括a)提供i)疑似含有甲狀腺刺激性自身抗體的測試樣品；ii)包含糖皮質(zhì)激素 的培養(yǎng)細胞，其中所述細胞選自在測試手段中含有的RD-Rluc細胞或CHO-Rluc細胞，其中 所述細胞表達嵌合TSH受體，iii)生長培養(yǎng)基，和iv)刺激培養(yǎng)基，其中所述刺激培養(yǎng)基包 含聚乙二醇；b)使所述培養(yǎng)細胞接觸生長培養(yǎng)基以生產(chǎn)生長的細胞；c)在使用熒光素-熒 光素酶系統(tǒng)可檢測到甲狀腺刺激性抗體的條件下使測試樣品接觸所述生長的細胞和刺激 培養(yǎng)基；及d)觀察可檢測的甲狀腺刺激性抗體的存在，其中使用光度計進行所述觀察。在 一實施方式中，所述糖皮質(zhì)激素選自地塞米松、潑尼松、氫化可的松、氟替卡松或可的松。在進一步的實施方式中，通過熒光素_熒光素酶系統(tǒng)測定cAMP濃度。附圖簡述

圖1提供了利用含有6% PEG-8000的刺激培養(yǎng)基對三個格雷夫斯病IgG樣品(源 自未治療的格雷夫斯病患者)的連續(xù)3倍稀釋液進行測定而得到的結(jié)果。圖2提供了 35位未治療格雷夫斯病患者IgG的CHO-Rluc熒光素酶結(jié)果和 FRTL-5cAMP結(jié)果的比較。圖3提供了 35位未治療格雷夫斯病患者IgG的CHO-Rluc熒光素酶結(jié)果和CHO-R cAMP結(jié)果的比較。圖4提供了 35位未治療格雷夫斯病患者IgG的CHO-R cAMP結(jié)果和FRTL-5 cAMP 結(jié)果的比較。圖5示針對CHO-Rluc細胞的bTSH的應(yīng)答的線性關(guān)系。圖6示使用FRTL-5細胞(10 μ 1 LCA TSI樣本的樣品)而獲得已知TSI結(jié)果的一 組樣品的結(jié)果。圖7示一組正常樣品(10μ1 AML “正常”樣本)的結(jié)果。圖8示包含2，324個堿基對且編碼730個氨基酸的嵌合hTSH/mLH(Mc4)受體的 DNA序列的一實施方式。加下劃線的字母為人TSHR序列。斜體字母為大鼠LHR序列。大鼠 LHR序列中的“*”( Γ)在野生型序列中為G。所述G到T的突變導(dǎo)致了氨基酸由精氨酸變 為絲氨酸。圖9示包含環(huán)AMP (cAMP)調(diào)控元件(CRE) (AF401991)的236個核苷酸的糖蛋白α 亞基啟動子與從HEK細胞PCR擴增獲得的GPH啟動子進行序列比對的一實施方式。陰影區(qū) 表示同源。非突出區(qū)域指質(zhì)粒中啟動子的側(cè)翼區(qū)。圖10示顯示CH0-RMc4、RD-RMc4和CHO-RLuc細胞系對含TSI的陰性和陽性血清 的應(yīng)答的例示數(shù)據(jù)。圖IOA 對TSI陰性血清和陽性血清誘導(dǎo)的CHO-RLuc和CH0_RMc4細胞系的熒光
素酶測定。圖IOB 對TSI陰性血清和陽性血清誘導(dǎo)的CHO-RLuc和CH0_RMc4細胞系的熒光 素酶測定而得到的S/N比。圖IOC 對TSI陰性血清和陽性血清誘導(dǎo)的CHO-RLuc和RD_RMc4細胞系的熒光素
酶測定。圖IOD 對TSI陰性血清和陽性血清誘導(dǎo)的CHO-RLuc和RD_RMc4細胞系的熒光素 酶測定而得到的S/N比。圖IOE 對TSI陰性血清和陽性血清誘導(dǎo)的CHO-RLuc、CH0-RMc4和RD_RMc4細胞 系的熒光素酶測定而得到的S/N比。圖11示顯示應(yīng)答血清稀釋分布的RD_RMc4和CHO-RLuc細胞系的信噪(S/N)比的 例示數(shù)據(jù)。圖IlA 對相同的TSI陽性血清稀釋液誘導(dǎo)的CHO-RLuc和RD_RMc4細胞系的熒光 素酶測定而獲得的S/N比。圖IlB 對TSI陽性血清稀釋液誘導(dǎo)的CH0-RMc4細胞系的熒光素酶測定而獲得的
S/N 比。
圖IlC 對TSI陽性血清的較高倍稀釋液誘導(dǎo)的CH0-RMc4細胞系的熒光素酶測定 而獲得的S/N比。圖12顯示比較CH0_RMc4細胞系和CHO-RLuc細胞系之間TSH靈敏度的例示數(shù)據(jù)。圖13示顯示從使用CH0-RMc4和CHO-RLuc細胞系的人血清獲得的信噪比分布的 例示數(shù)據(jù)。圖14示顯示CH0-RMc4、RD-RMc4和CHO-RLuc細胞系對臨床患者血清樣品的相對 靈敏度的例示數(shù)據(jù)。圖15顯示例示氨基酸序列促黃體激素受體(lutenizing hormonereceptor)圖15A 狨毛猴(Callithrix jacchus)(白叢生耳狨猴)CAJ57370圖 15B 日本鵪鶉(Coturnix japonica)(日本鵪鶉)AAB32614圖 15C 原雞(Gallus gallus)(雞)NP 990267圖 15D 小家鼠(Mus musculus)(鼠)AAB24402圖 ΙδΕ 歐洲牛(Bos taurus)(牛)NPJ768O6
圖16示在測試板中的TSI樣品的代表性排列。圖17示顯示當(dāng)與40 μ M地塞米松相比時，替代性糖皮質(zhì)激素氟替卡松、潑尼松、 氫化可的松和可的松提供相等的CH0-RMc4測定信號強度的例示相對光單位(RLU)數(shù)據(jù)。圖18示顯示替代性糖皮質(zhì)激素氟替卡松、潑尼松、氫化可的松和可的松提供改 良的CH0-RMc4測定的例示血清參考單位百分比(SSR%)數(shù)據(jù)。^X本說明書和權(quán)利要求使用的術(shù)語“樣品”和“樣本”(specimen)有最廣泛的含義。 一方面，它們包括樣本或培養(yǎng)物；另一方面，它們兼包括生物樣品和環(huán)境樣品。這些術(shù)語包 含從人和其他動物獲得的所有類型樣品，其包括但不限于體液(如血液)及實體組織。生物樣品可為動物(包括人)體液或組織、奶制品之類的食品和配料、蔬菜、肉和 肉類副產(chǎn)品及廢物。這些例子不被視為限制適合應(yīng)用于本發(fā)明的樣品類型。本文所用術(shù)語“試劑盒”指試劑和其他材料的組合。本文所用術(shù)語“抗體”指任何與特異性抗原發(fā)生反應(yīng)的免疫球蛋白分子。所述術(shù) 語旨在包含從任何來源(例如人、嚙齒動物、非人靈長動物、山羊、牛、馬、綿羊等)獲得的任 何免疫球蛋白(例如IgG、IgM、IgA、IgE、IgD等)。本文所用術(shù)語“抗原”指能夠與抗體發(fā)生反應(yīng)的任何物質(zhì)。所述術(shù)語旨在包含任何 抗原和“免疫原”(即誘導(dǎo)抗體形成的物質(zhì))。因此，在免疫應(yīng)答中應(yīng)答抗原(免疫原)或 部分抗原的存在而產(chǎn)生抗體。本文所用術(shù)語“抗原片段”和“部分抗原”指抗原的一部分?？乖位虿糠挚沙?現(xiàn)各種尺寸，其可從整個抗原的小部分到整個抗原的大部分，但不是抗原的100%。然而，在 指定抗原的至少一部分的情況下，希望存在整個抗原。希望抗原片段或部分抗原可以、但不 必需包含抗體所識別的“表位”?？乖位虿糠诌€可具有或不具有免疫原性。本文所用術(shù)語“自身抗體”指能夠與個體自身組織或細胞的抗原要素反應(yīng)的抗體 (例如，識別和結(jié)合“自身”抗原的抗體)。本文所用術(shù)語“免疫測定”指使用抗體檢測抗原的任何方法。希望免疫測定的形 式由所述定義的范圍所涵蓋，其包括但不限于直接免疫測定、間接免疫測定和“夾心”免疫
6測定；然而，希望本發(fā)明不限于任何特定形式。希望在本發(fā)明方法中的其他形式(包括放射 性免疫測定(RIA)、免疫熒光測定(IFA))和其他測定形式(包括但不限于ELISA、RIA和/ 或IFA方法的變化)是有用的。本文所用術(shù)語“捕獲抗體”指用來結(jié)合抗原的抗體，從而允許通過隨后應(yīng)用的抗體 識別抗原。例如，捕獲抗體可結(jié)合到微孔并用于結(jié)合添加到所述孔的樣品中存在的目的抗 原。然后使用另一種抗體(稱為“第一抗體”)結(jié)合到抗原-抗體復(fù)合物從而形成了由抗 體-抗原-抗體復(fù)合物組成的“夾心”?？赏ㄟ^許多方法進行這種復(fù)合物的檢測?？墒褂美?如生物素、酶、熒光標記物或放射性物質(zhì)之類的標記物制備所述第一抗體并可使用所述標 記物直接檢測。或者可添加識別第一抗體的經(jīng)標記的“第二抗體”或“報告抗體”從而形成 了由抗體_抗原_抗體_抗體復(fù)合物組成的復(fù)合物。此外，添加適當(dāng)?shù)膱蟾嬖噭┮詸z測經(jīng) 標記的抗體?？筛鶕?jù)需要添加任意數(shù)量的額外抗體。這些抗體也可用所述標記物(包括但 不限于酶、熒光標記物或放射性物質(zhì))進行標記。本文所用術(shù)語“報告試劑”或“報告分子”指能夠檢測到結(jié)合抗原的抗體存在的化 合物。例如，報告試劑可為附著到酶底物的比色物質(zhì)。當(dāng)抗體和抗原結(jié)合時，所述酶作用于 其底物，并導(dǎo)致顏色的產(chǎn)生。其他報告試劑包括但不限于熒光及放射性化合物或分子。所 述定義也包含使用生物素和基于親和素的化合物(例如，包括但不限于中性親和素和鏈酶 親和素)作為檢測系統(tǒng)的一部分。在本發(fā)明的一實施方式中，可聯(lián)用生物素化抗體與包被 親和素的固體支持物。本文所用術(shù)語“信號”指發(fā)生了反應(yīng)(例如抗體與抗原的結(jié)合)的指示物。希望 本發(fā)明使用的信號為放射反應(yīng)、熒光反應(yīng)、發(fā)光反應(yīng)和酶促反應(yīng)的形式。可對所述信號進行 定性及定量評估。本文所用術(shù)語“信號強度”指信號強度的大小，其中所述強度與反應(yīng)底物量相關(guān)。 例如，熒光素_熒光素酶系統(tǒng)產(chǎn)生的信號強度與促甲狀腺激素受體自身抗體產(chǎn)生的cAMP量 相關(guān)。本文所用術(shù)語“熒光素_熒光素酶系統(tǒng)”指在可檢測到產(chǎn)生的光的條件下在底物 (即，例如cAMP)存在下允許熒光素和熒光素酶接觸的過程或方法。在載體編碼的被感染的 宿主細胞內(nèi)包含這樣的系統(tǒng)或在獨立的試劑盒容器中提供這樣的系統(tǒng)，其中可將所述成分
混合在一起。本文所用術(shù)語“固體支持物”指可附著試劑(如抗體、抗原和其他化合物)的任何 固體載體。例如，在所述ELISA方法中，微孔板的所述孔經(jīng)常提供固體支持物。固體支持物 的其他例子包括顯微鏡載玻片、蓋玻片、珠、顆粒、細胞培養(yǎng)瓶以及許多其他物品。本文所用術(shù)語“細胞染色”指用于標記細胞或使細胞染色以提高其可見性的方法。 可通過各種化合物(包括但不限于熒光染料、酶、金和碘)的使用實現(xiàn)所述染色或標記。希 望所述定義包含“原位顯色測定”這樣的方法，在所述方法中可對樣品進行原位測試(即測 定)。也希望原位顯色測定也包括免疫測定(即ELISA)的使用。本文所用術(shù)語“生長培養(yǎng)基”指被配制為含有各種生長因子(包括但不限于維生 素、氨基酸、輔因子和其他任何適合的營養(yǎng)素)的培養(yǎng)基，以增強培養(yǎng)細胞的生長和復(fù)制。本文所用術(shù)語“刺激培養(yǎng)基”指配制為缺乏某種成分(例如氯化鈉)以提高由TSH 和/或TSI引發(fā)的刺激的培養(yǎng)基，從而提高所得的信號(例如CAMP和/或熒光素酶)。
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本文所用術(shù)語“饑餓培養(yǎng)基”指配制為缺乏生長培養(yǎng)基中含有的至少一種生長因 子的培養(yǎng)基。在一優(yōu)選的實施方式中，所述培養(yǎng)基僅含有短期維持細胞所需的鹽和葡萄糖。本文所用術(shù)語“生物(organism)，，和“微生物(microorganism)，，指微生物的任何 物種或類型，其包括但不限于病毒和細菌(包括立克次氏體和衣原體)。因此，所述術(shù)語包 括但不限于DNA和RNA病毒及立克次氏體目和衣原體目內(nèi)的生物。本文所用術(shù)語“培養(yǎng)物”指疑似含有一種或多種微生物的任何樣品或樣本。“純培 養(yǎng)物”為其中存在的生物僅為特定屬和種的一株的培養(yǎng)物。與之相反，“混合培養(yǎng)物”為其 中存在多于一種屬和/或種的微生物的培養(yǎng)物。本文所用術(shù)語“細胞類型”指不論來源或特征的任何細胞。本文所用術(shù)語“細胞系”指在體外培養(yǎng)的細胞，其包括原代細胞系、有限細胞系、傳 代細胞系和轉(zhuǎn)化細胞系。本文所用術(shù)語“原代細胞培養(yǎng)物”和“原代培養(yǎng)物”指從動物或昆蟲組織直接獲得 的細胞培養(yǎng)物。這些培養(yǎng)物可來源于成體及胚胎組織。本文所用術(shù)語“有限細胞系”指在衰老前細胞數(shù)量能夠有限倍增的細胞培養(yǎng)物。本文所用術(shù)語“傳代細胞系”指已經(jīng)歷了 “危機”階段的細胞培養(yǎng)物，在此期間， 在原代或有限細胞系中的一群細胞明顯停止了生長，但是還有一群細胞出現(xiàn)了細胞尺寸減 小、生長速度更快、克隆效率更高、致瘤性提高和染色體補體變化的一般特征。這些細胞通 常由自發(fā)體外轉(zhuǎn)化所致。這些細胞具有無限的壽命。本文所用術(shù)語“轉(zhuǎn)化細胞系”指已轉(zhuǎn)化為具有上述特征的傳代細胞系的細胞培養(yǎng) 物。轉(zhuǎn)化細胞系可直接來自腫瘤組織，也來自用全病毒(例如SV40或EBV)或源自使用載 體系統(tǒng)轉(zhuǎn)化的病毒的DNA片段通過體外轉(zhuǎn)化而獲得的細胞。本文所用術(shù)語“雜交瘤細胞”指通過將兩種類型的細胞融合在一起而產(chǎn)生的細胞。 常用的雜交瘤細胞包括通過來自免疫動物的分泌抗體的B細胞和能在體外無限生長的惡 性骨髓瘤細胞的融合而產(chǎn)生的那些細胞。克隆所述細胞并用于制備單克隆抗體。本文所用術(shù)語“混合細胞培養(yǎng)物”指兩種類型細胞的混合物。在一些優(yōu)選的實施 方式中，所述細胞為未經(jīng)基因工程改造的細胞系；而在其他優(yōu)選的實施方式中，所述細胞為 經(jīng)過基因工程改造的細胞系。在一些實施方式中，一種或更多的細胞類型是“允許的”(即 病毒能夠在所述培養(yǎng)物中復(fù)制和在細胞間擴散)。本發(fā)明包含適于樣品中病毒的檢測、鑒定 和/或定量的任何細胞類型的組合，其包括其中使用的全部類型的細胞未經(jīng)基因工程改造 的混合細胞培養(yǎng)物、其中的一種或多種類型的細胞經(jīng)基因工程改造且剩下的細胞類型未經(jīng) 基因工程改造的混合物、及其中全部類型的細胞經(jīng)基因工程改造的混合物。本文所用術(shù)語“適于檢測細胞內(nèi)的寄生物”指可成功使用細胞培養(yǎng)物以檢測樣品 中細胞內(nèi)寄生物的存在。在優(yōu)選的實施方式中，所述細胞培養(yǎng)物能夠維持對感染的易感性 和/或支持細胞內(nèi)寄生物的復(fù)制。不希望本發(fā)明限于特定的細胞類型或細胞內(nèi)寄生物。本文所用術(shù)語“易受感染”指細胞易被病毒或其他細胞內(nèi)生物感染的能力。雖然 其包含“允許”感染，但不希望所述術(shù)語限于此；雖然希望所述術(shù)語包含細胞被感染的情況， 但所述生物不需要復(fù)制和/或由感染的細胞擴散到其他細胞。本文所述“病毒擴散”是指 感染性病毒從允許類型的細胞擴散或傳代至另外的具有允許或易感特征的細胞。本文所用術(shù)語“單層細胞”、“單層培養(yǎng)物”和“單層細胞培養(yǎng)物”指已粘附到底層
8并長成一個細胞厚的層。單層細胞可在各種容器(包括但不限于瓶、管、蓋玻片(如殼瓶 (shell vials))、滾瓶等)中生長。細胞也可生長粘附到微載體(包括但不限于珠)上。本文所用術(shù)語“懸液”和“懸浮培養(yǎng)物”指未附著到底層而生存和增殖的細胞。通 常使用造血細胞、轉(zhuǎn)化細胞系和來自惡性腫瘤的細胞生產(chǎn)懸浮培養(yǎng)物。本文所用術(shù)語“培養(yǎng)基”和“細胞培養(yǎng)基”指適于支持細胞體外生長(即細胞培養(yǎng) 物)的培養(yǎng)基。不希望所述術(shù)語限于任何特定的培養(yǎng)基。例如，希望所述定義包含外生長 (outgrowth)及維持培養(yǎng)基。甚至希望所述術(shù)語包含適于目的細胞培養(yǎng)物生長的任何培養(yǎng) 基。本文所用術(shù)語“專性細胞內(nèi)寄生物”(或?qū)Ｐ约毎麅?nèi)生物)指需要用于其生存和/ 或復(fù)制的細胞內(nèi)環(huán)境的任何生物。專性細胞內(nèi)寄生物包括病毒及許多其他生物(包括某些 細菌(包括但不限于所述目的大多數(shù)成員i)立克次氏體目例如考克斯氏體、立克次氏體 和埃利希氏體；和ii)衣原體目例如沙眼衣原體、鸚鵡熱衣原體))。所述術(shù)語“細胞內(nèi)寄 生物”指可見于宿主動物細胞內(nèi)的任何生物，其包括但不限于上文所簡述的專性細胞內(nèi)寄 生物。例如，細胞內(nèi)寄生物包括例如布魯氏菌、李斯特菌、分枝桿菌(如結(jié)核分枝桿菌和麻 風(fēng)分枝桿菌)、和瘧原蟲及羅克利馬體菌之類的生物。本文所用術(shù)語“抗微生物劑”指抑制微生物生長或殺死微生物的任何化合物。希 望使用的所述術(shù)語有最廣泛的含義且其包括但不限于化合物(如天然產(chǎn)生或合成產(chǎn)生的 抗生素)。也希望所述術(shù)語包括對抑制微生物生長或殺死微生物有用的化合物和元素。本文所用術(shù)語“顯色化合物”和“顯色底物”指由于其光吸收和光發(fā)射特征而在檢 測系統(tǒng)中有用的任何化合物。希望所述術(shù)語包含任何酶裂解產(chǎn)物、可溶物及不可溶物，其可 通過肉眼檢測或可通過光學(xué)儀器檢測。包括在名稱中的“顯色物”是指所有的酶底物，其產(chǎn) 生可檢測到顏色變化的最終產(chǎn)物。其包括但不限于正如以傳統(tǒng)含義使用的“顏色”的任何 顏色(如靛藍、藍、紅、黃、綠、橙、棕等)及可產(chǎn)生可檢測的熒光(如黃綠色的熒光素、紅色 的羅丹明等)的熒光染料(fluorochromic)或熒光(fluorogenic)化合物。希望其他的指 示劑(如染料(如PH)和發(fā)光化合物)包含在所述定義內(nèi)。本文所用的術(shù)語“pH指示劑”和“氧化還原指示劑(redoxindicator) ”和“氧 化還原指示劑(oxidation-reduction indicator) ”為通常所用的含義。因此，“pH指 示劑”包含常用的用于檢測PH變化的所有化合物，其包括但不限于酚紅、中性紅、溴百里 酚藍、溴甲酚紫、溴甲酚綠、溴氯酚藍、間甲酚紫、百里酚藍、溴甲酚紫、二甲酚藍、甲基紅、 甲基橙和甲酚紅。所述術(shù)語“氧化還原指示劑(redoxindicator)”和“氧化還原指示劑 (oxidation-reduction indicator) ”包含常用于檢測氧化/還原電位(即“eH”)的所有 化合物，其包括但不限于四唑、刃天青和亞甲基藍的各種類型或形式。本文所用術(shù)語“接種懸液”或“接種物”指可對待測生物接種的懸液。不希望所述 術(shù)語“接種懸液”限于特定的流體或液體物質(zhì)。例如，接種懸液可包括水、鹽和水溶液。也 希望接種懸液包括添加了水、鹽或任何水性材料的組分。希望在一實施方式中所述組分包 含至少一種對目的微生物有用的成分。不希望本發(fā)明限于特定的組分。本文所用術(shù)語“原代分離”指培養(yǎng)直接來自樣品的生物的過程。本文所用術(shù)語“分 離”指生物的任何培養(yǎng)，無論為原代分離或任何隨后培養(yǎng)，其包括維持和/或使用的生物的 儲用培養(yǎng)物的“傳代”或“轉(zhuǎn)移”。
本文所用術(shù)語“推定診斷”指為治療醫(yī)生提供一些指導(dǎo)以得到在患者疾病中涉及 的致病生物的初步診斷。推定診斷通?；诒疚乃玫摹巴贫ㄨb定，，，其用于本文指微生物 的初步鑒定。本文所用術(shù)語“確定診斷”指確定患者疾病病因的最終診斷。本文所用術(shù)語“確定 鑒定”指最終鑒定生物至屬和/或種的水平。本文所用術(shù)語“重組DNA分子”指通過分子生物學(xué)技術(shù)的方法將DNA片段連接到 一起而組成的DNA分子。所述的DNA分子具有“5'末端”和“3'末端”，因為單核苷酸以一個單核苷酸戊糖 環(huán)的5'磷酸經(jīng)磷酸二酯連接以一個方向連接到相鄰的核苷酸的3'氧的方式反應(yīng)從而形 成寡核苷酸。因此，寡核苷酸的末端指，如果其5'磷酸未連接到單核苷酸戊糖環(huán)的3'氧， 則稱為5'末端；而如果其3'氧未連接到下一個單核苷酸戊糖環(huán)的5'磷酸，則稱為3' 末端。本文所用的核酸序列，即使在更大的寡核苷酸內(nèi)，也被人為具有5'末端和3'末端。 在線性或環(huán)狀的DNA分子中，離散的元件稱為“下游”或3'元件的“上游”或5'。所述術(shù) 語反映轉(zhuǎn)錄沿著DNA鏈以5'到3'的方式進行。指導(dǎo)連接基因轉(zhuǎn)錄的啟動子和增強子元 件通常位于編碼區(qū)的5'或上游(增強子元件即使位于啟動子元件和編碼區(qū)的3'也可發(fā) 揮作用)。轉(zhuǎn)錄終止和多聚腺苷酸信號位于編碼區(qū)的3'或下游。術(shù)語“具有編碼基因的核苷酸序列的寡核苷酸”指包含基因編碼區(qū)的DNA序列，或 換言之，編碼基因產(chǎn)物的DNA序列。編碼區(qū)可以cDNA或基因組DNA的形式存在。如果需要 可將適當(dāng)?shù)目刂圃?如增強子、啟動子、剪接點、多聚腺苷酸信號等)置于比鄰基因編碼 區(qū)，以允許轉(zhuǎn)錄的正確起始和/或初級RNA轉(zhuǎn)錄物的正確加工。另外，本發(fā)明的載體利用的 編碼區(qū)可含有內(nèi)源的增強子和/或啟動子、剪接點、插入序列、多聚腺苷酸信號等，或內(nèi)源 性和外源性控制元件的組合。本文所用術(shù)語“轉(zhuǎn)錄單位”指轉(zhuǎn)錄起始和終止位點之間的DNA區(qū)段和有效的起始 和終止所必需的調(diào)控元件。例如，包含增強子/啟動子、編碼區(qū)及終止和多聚腺苷酸信號的 DNA區(qū)段組成轉(zhuǎn)錄單位。本文所用術(shù)語“調(diào)控元件”指控制核苷酸序列表達的某些方面的基因元件。例如， 啟動子為輔助操控性連接的編碼區(qū)的轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)控元件。其他調(diào)控元件為剪接信號、多 聚腺苷酸信號、終止信號等(下文定義)。本文所用術(shù)語“報告基因構(gòu)建體”或“報告基因載體”指含有編碼報告基因產(chǎn)物的 序列和在特定的宿主中表達操控性連接的編碼序列所必需的適當(dāng)核酸序列的重組DNA分 子。已知真核細胞利用啟動子、增強子及終止和多聚腺苷酸信號。本文所用術(shù)語“報告基因”指具有編碼基因產(chǎn)物(通常為酶)所序列的寡核苷酸； 當(dāng)將包含操控性連接到異源啟動子和/或增強子的報告基因序列的構(gòu)建體導(dǎo)入到含有(或 可被制成含有)激活啟動子和/或增強子元件所必需因子的細胞內(nèi)，易于并定量測定所述 基因產(chǎn)物。報告基因的例子包括但不限于編碼半乳糖苷酶(IacZ)的細菌基因、細菌的 氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(cat)基因、螢火蟲熒光素酶基因和編碼葡萄糖醛酸酶(GUS)的基 因。在真核生物中的轉(zhuǎn)錄控制信號包含“啟動子”和“增強子”元件。啟動子和增強子由 與參與轉(zhuǎn)錄的細胞蛋白特異性互作的DNA序列的短序列組成(Maniatis，et al.，Science
10236 1237 (1987))。從包括酵母、昆蟲和哺乳動物細胞及病毒(在原核生物中也發(fā)現(xiàn)類似的 控制元件即啟動子)的各種真核生物來源分離啟動子和增強子元件。特定啟動子和增強子 的選擇依賴于使用何種細胞類型表達目的蛋白。一些真核生物啟動子和增強子有廣泛的宿 主范圍，而其他在有限的細胞類型子集中有功能(參考見Voss，et al.，Trends Biochem. Sci.，11 287(1986)、和 Maniatis，et al.，supra (1987))。例如，SV40 早期基因增強子在廣 泛的來自許多哺乳動物物種的各種細胞類型中非常有活性，并被廣泛使用于哺乳動物細胞 中的蛋白表達(Dijkema,et al.，EMBO J. 4 :761 (1985))。其他兩種在廣泛的哺乳動物細胞 類型范圍中有活性的啟動子/增強子元件的例子是來自人延伸因子Ia基因(Uetsuki et al. , J. Biol. Chem. ,264:5791(1989) ；Kim et al.，Gene 91 217(1990)；禾口 Mizushima and Nagata, Nuc. Acids. Res. ,18 5322(1990))及勞斯肉瘤病毒(Gorman et aL, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 6777(1982))和人巨細胞病毒(Boshart et aL，Cell 41 521 (1985))的 長末端重復(fù)序列的啟動子/增強子。術(shù)語“啟動子/增強子”指包含能夠提供啟動子和增強子功能的序列的DNA區(qū)段 (例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒的長末端重復(fù)序列兼含啟動子和增強子功能)。所述啟動子/增強子可 為“內(nèi)源性”或“外源性”或“異源性”的。內(nèi)源性啟動子/增強子是天然連接至基因組中特 定基因的啟動子/增強子。通過基因操作(即分子生物學(xué)技術(shù))的方法置于鄰近基因的為 外源性(異源性)啟動子/增強子。在表達載體上的“剪接”信號的存在通常導(dǎo)致重組轉(zhuǎn)錄本的更高水平表達。剪接信 號介導(dǎo)從初級RNA轉(zhuǎn)錄物移除內(nèi)含子，且由剪接供體位點和剪接受體位點組成(Sambrook et al. , Molecular Cloning :ALaboratory Manual,2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York(1989)，pp. 16. 7-16. 8)。常用的剪接供體位點和剪接受體位 點為來自SV40的16S RNA的剪接位點。真核生物細胞中重組DNA序列的有效表達需要指導(dǎo)所得轉(zhuǎn)錄物有效終止和多聚 腺苷酸化的信號。轉(zhuǎn)錄終止信號一般見于多聚腺苷酸信號的下游，且其長度為幾百個核苷 酸。本文所用術(shù)語“多聚A位點”或“多聚A序列”指指導(dǎo)新生RNA轉(zhuǎn)錄物終止和多聚腺苷 酸化的DNA序列。因為缺乏多聚A尾的轉(zhuǎn)錄物不穩(wěn)定且快速被降解，需要重組轉(zhuǎn)錄物的有 效多聚腺苷酸化。在表達載體中使用的多聚A信號可為“異源性”或“內(nèi)源性”的。內(nèi)源性 多聚A信號是天然情況下見于基因組特定基因編碼區(qū)3'末端的多聚A信號。異源性多聚 A信號是從一個基因中分離且置于另一個基因的3'端的多聚A信號。常用的異源性多聚A 信號為SV40多聚A信號。所述SV40多聚A信號包含在237bp的BamHI/Bc II限制性酶切 片段上，且兼指導(dǎo)終止和多聚腺苷酸化(Sambrook, supra, at 16.6-16.7)。所述237bp片 段包含在671bp的BamHI/PstI限制性酶切片段內(nèi)。術(shù)語“經(jīng)基因工程改造的細胞系”指含有通過分子生物學(xué)技術(shù)(即重組DNA技術(shù)) 的方法導(dǎo)入細胞系的異源DNA的細胞系。本文所用術(shù)語“載體”指至少包含啟動子和目的基因的核苷酸序列。所述目的基 因可編碼氨基酸序列以達到表達氨基酸序列(即，例如TSH受體氨基酸序列)的目的。載 體具有整合進外源DNA以形成穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞的能力。術(shù)語“穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染”或“穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的”指將外源DNA導(dǎo)入和整合到轉(zhuǎn)染細胞的基因 組內(nèi)。
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術(shù)語“穩(wěn)定轉(zhuǎn)染體”指基因組DNA中穩(wěn)定整合外源DNA的細胞。術(shù)語“穩(wěn)定轉(zhuǎn)染”(或“穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的”)指將外源DNA導(dǎo)入和整合到轉(zhuǎn)染細胞的基 因組內(nèi)。術(shù)語“穩(wěn)定轉(zhuǎn)染體”指基因組DNA中穩(wěn)定整合外源DNA的細胞。術(shù)語“RDluc”指已用熒光素酶基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的RD細胞系。此外，RD-Rluc指已用 熒光素酶基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染且展示外源受體(即，例如包括但不限于Mc4受體的TSH受體)的 RD細胞系。術(shù)語“CHOluc”已用熒光素酶基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO細胞系。此外，CHO-Rluc指已 用熒光素酶基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染且展示外源受體(即，例如包括但不限于野生型受體的TSH受體) 的CHO細胞系。另外，CH0-RMC41UC指已用熒光素酶基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染且展示嵌合受體(即，例 如包含源自大鼠絨毛膜促性腺激素受體的氨基酸序列的TSH受體)的CHO細胞系。本文所用術(shù)語“篩選標記物”指編碼酶活性的基因的使用，其給予表達篩選標記物 的細胞抵抗抗生素或藥物的抗性。篩選標記物可為“顯性的”；顯性篩選標記物編碼可在任 何哺乳動物細胞系中檢測到的酶活性。顯性篩選標記物的例子包括給予哺乳動物細胞抵 抗藥物G418的抗性的細菌氨基糖苷3'磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(也稱為neo基因)、給予抵抗抗 生素潮霉素的抗性的細菌潮霉素G磷酸轉(zhuǎn)移酶(hyg)基因和給予在霉酚酸的存在下能生長 的能力的細菌黃嘌呤_鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因(也稱為gpt基因)。其他篩選標記物 為非顯性的，且其必需與缺乏相應(yīng)酶活性的細胞系結(jié)合使用。非顯性篩選標記物的例子包 括與tk細胞系結(jié)合使用的胸苷激酶(tk)基因、與CAD缺陷細胞結(jié)合使用的CAD基因和 與hprt細胞系結(jié)合使用的哺乳動物次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(hprt)基因。在 Sambrook et al.，supra atpp. 16.9-16. 15中提供了在哺乳動物細胞系中使用篩選標記物 的綜述。術(shù)語“編碼的核苷酸分子”、“編碼的DNA序列”和“編碼的DNA”指沿著脫氧核糖核 酸鏈的脫氧核糖核苷酸順序或序列。所述脫氧核糖核苷酸的順序決定了沿著多肽(蛋白) 鏈的氨基酸順序。因此DNA序列編碼氨基酸序列。本文所用術(shù)語“匯合的”或“匯合”指貼壁細胞定義了一種條件，其中經(jīng)培養(yǎng)的細 胞互相接觸產(chǎn)生了呈現(xiàn)連成一片或“單層”的細胞。本文所用術(shù)語“細胞病變效應(yīng)”或“CPE”描述由病毒之類的外部介質(zhì)所致的細胞 結(jié)構(gòu)變化(即病理效應(yīng))。通常的細胞病變包括細胞破壞、合胞體(即融合的巨大細胞)形 成、環(huán)繞細胞的空泡形成和包涵體的形成。由病毒作用于允許細胞所導(dǎo)致的CPE消極地影 響允許細胞宿主進行所需功能以維持生存的能力。在體外細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中，當(dāng)作為匯合的 單層細胞一部分的細胞與含有病毒的樣本接觸后顯示出非匯合區(qū)，則證明有CPE。觀察到的 細微作用通常為病灶，且所述病灶由單個病毒顆粒起始。然而隨著在樣品上載入病毒，經(jīng)過 足夠的溫育期后可在整個單層細胞觀察到CPE。顯示出病毒誘導(dǎo)CPE的細胞通常改變形態(tài) 成圓形，且經(jīng)延長的時間后其會死亡，并從單層細胞中其固著點釋放出。當(dāng)許多細胞到達病 灶破壞點時，所述區(qū)域稱為病毒空斑，其在單層細胞中以洞的形式出現(xiàn)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可 輕易的辨別和區(qū)分出細胞病變效應(yīng)?？s寫詞“0NPG”為鄰硝基苯-13-D-半乳糖苷。ONPG為酶β -半乳糖苷酶(β -gal) 的底物。ONPG和β-gal的反應(yīng)產(chǎn)生黃色產(chǎn)物，其可在405nm處分光光度定量。縮寫詞“X-gal”為化合物5-溴-4-氯_3_吲哚-(3_D_半乳糖苷，其為酶β -半乳糖苷酶的底物。X-gal和半乳糖苷酶的反應(yīng)導(dǎo)致肉眼可辨的藍色沉淀的形成。術(shù)語“hybriwix”為Diagnostic Hybrids, Inc. ,Athens,Ohio 的產(chǎn)品，其允許通過 DNA雜交在感染的單層細胞中進行某種病毒DNA的定量?！癉NA雜交”為依據(jù)堿基互補原則 堿基序列配對的兩個互補DNA分子的退火。使用DNA雜交通過已知的DNA或“探針”雜交 以鑒定或定量未知或“靶”DNA。所述探針通常用1251、放射性同位素之類的報告分子標記， 其可用伽馬射線檢測和定量。本文所用術(shù)語“空斑減少實驗”或“PRA”指用于通過統(tǒng)計在接觸藥物的單層細胞 中空斑形成的減少來確定抗病毒藥物效力的標準方法。“空斑”為“CPE”的確定區(qū)域。其通 常為用單個感染性病毒感染細胞單層的結(jié)果，然后其可復(fù)制且擴散至單層的相鄰細胞?？?斑也可指作“病毒感染的病灶”。本文所用術(shù)語“允許”描述了病毒和其推定的宿主細胞間的互作作用過程。所述過 程以病毒被吸收至宿主細胞表面開始，并以釋放感染性病毒顆粒結(jié)束。如果細胞易于允許 病毒擴散至其他細胞，所述細胞為“允許”的。許多方法可用于確定特定細胞系的允許性， 其包括但不限于空斑減少實驗、基于凝膠電泳所獲得結(jié)果的病毒蛋白的制備和/或定量進 行比較、使用雜交分析進行相對比較以分析DNA或RNA內(nèi)容等。本文所用術(shù)語“易感”描述了允許或非允許細胞可吸收和被病毒穿透的程度。細 胞系在不為允許的情況下可為易感的，其中所述細胞可被穿透但不釋放病毒顆粒。但允許 細胞系必為易感的。本文所用術(shù)語“接種于...上(seed on) ”指將懸浮細胞的水溶液移進含有粘附 到表面的細胞的容器中的動作，此后，將所述容器保存充足的時間以允許懸浮細胞或“接種 物”通過重力下沉并以相對均勻的形式附著到貼壁細胞上從而整合成最終的作為混合物的 單層細胞。“混合的單層細胞”由“接種于...上”過程所致。本文所用術(shù)語“接種入(seed in) ”描述了兩種或更多懸浮組織培養(yǎng)細胞水溶液的 混合，各細胞懸液都有不同的細胞特性，并將所述細胞混合物移進容器中，所述容器保存充 足的時間以允許懸浮細胞通過重力下沉并以相對均勻的形式附著，以便用任何單個細胞類 型的分布指示原始混合物中細胞的相對比例。本文所用術(shù)語“起始物(starts)”指表示病毒初次感染的報告細胞。所述病毒感 染報告細胞(經(jīng)基因工程改造的細胞)并誘導(dǎo)報告基因的表達。報告細胞可為非允許的 (即不需要報告細胞的允許性)且仍生產(chǎn)起始物。本文所用術(shù)語“嵌合”指包含兩個或更多不同物種的一部分的任何核苷酸和/或 氨基酸序列。如果一級氨基酸序列包含兩個或更多不同物種的一部分(即，例如hTSH/ rLH-R或RMc4)，所述蛋白可為嵌合的。如果一級氨基酸序列包含兩個或更多不同蛋白的一 部分，無論其來自相同的物種或不同的物種，所述蛋白也可為嵌合的。如果四級氨基酸結(jié)構(gòu) 包含兩個或更多不同物種的蛋白，所述蛋白也可為嵌合的。此外，如果一級核苷酸序列包含 兩個或更多不同物種的一部分，所述核苷酸可為嵌合的。如果一級核苷酸序列包含兩個或 更多不同蛋白的一部分，無論其來自相同的物種或不同的物種，所述核酸也可為嵌合的。本文所用術(shù)語“糖皮質(zhì)激素”指增加糖異生、提高肝糖原和血糖濃度的任何化合物 任何皮質(zhì)類固醇；其包括但不限于地塞米松、潑尼松、氫化可的松、氟替卡松、皮質(zhì)醇、可 的松或皮質(zhì)酮。
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發(fā)明詳述本發(fā)明提供在自身免疫疾病診斷中有用的方法和組合物。尤其，本發(fā)明提供了在 格雷夫斯病診斷和管理中使用的方法和組合物。例如，一種組合物包含具有對循環(huán)促甲狀 腺激素免疫球蛋白的提高的靈敏性和特異性的嵌合促甲狀腺激素受體。在糖皮質(zhì)激素存在 下可對使用所述嵌合受體的測定進行優(yōu)化。另外，本發(fā)明提供了用于監(jiān)測個體的免疫狀態(tài)和免疫應(yīng)答的方法和組合物。尤其， 本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了監(jiān)測疫苗受體的免疫應(yīng)答的用途。本發(fā)明還提供用于加快和增強病毒附著到 細胞表面受體的方法和化合物，從而在檢測和定量樣品中病毒的測定中提高靈敏性。I.格雷夫斯病通常上，青壯年格雷夫斯病的臨床表現(xiàn)非常容易識別。女性患者比男性患者更 常見且報道的癥狀包括但不限于出汗、心悸、神經(jīng)質(zhì)、易怒、失眠、震顫、便頻、盡管食欲良 好體重仍減輕。體格檢查通常顯示出輕度突眼、瞪眼、眼瞼遲滯、平滑(smooth)、彌漫、無 觸痛甲狀腺腫、伴隨著心音亢進的心動過速(尤其在運動后)、及經(jīng)常的收縮期雜音或左 胸骨緣摩擦音、震顫、甲剝離、及掌紅斑；甲狀腺處經(jīng)常聽到雜音、及幾乎總存在頸部的嗡 嗡聲。在具有這些癥狀的患者中，容易識別出格雷夫斯病且可用實驗室的實驗確認。(見 Federman, Thyroid, in Dale and Federman(eds. ), Scientific American Medicine,3: 1-6, Scientific American, New York, NY, (1997))雖然上述的跡象和癥狀是麻煩的，但所述疾病的其他癥狀更加危險。最令人不安 的癥狀之一為伴隨著嚴重眼球突出的眼肌麻痹、濾泡性結(jié)膜炎、結(jié)膜水腫和失明。其他的癥 狀包括但不限于皮膚病、脛前粘液性水腫、杵狀變和在最嚴重的情況下為杵狀指。這些體征 和癥狀指示了格雷夫斯病自身免疫代表性的病因。盡管格雷夫斯病的典型臨床表型，仍需要確認所述診斷和提供用于管理和治療的 預(yù)后指標的方法。另外，當(dāng)甲狀腺機能亢進的原因未明時，必需利用診斷測試的方法確定 病因。盡管在格雷夫斯病患者的診斷和監(jiān)測中可使用放射性碘攝取(RAIU)之類的體內(nèi)方 法(見例如 Baldet et al.，Acta Endocrinol. (Copenh) 116 :7_12 (1987))，但為所述目 的開發(fā)出兩組基本的體外測定系統(tǒng)。一種依賴于甲狀腺刺激的某些指標(如cAMP的生 成)的測量，而另一種評估甲狀腺刺激性自身受體(TSAb)抑制經(jīng)放射性標記的甲狀腺激 素(TSH)結(jié)合其受體的能力。這些方法包括TSAb的生物測定和體外測定，但是，還未報道 廣泛應(yīng)用的方法以在格雷夫斯病診斷中測量甲狀腺刺激性免疫球蛋白(TSI或TSAb)(見例 如 Rapoport et aL, J. Clin. Endocrinol. Metabol.，58 :332_338 (1984))。另外，認識到在 格雷夫斯病患者的血清中有識別甲狀腺激素受體的異源免疫球蛋白G(IgG)群(見，例如 Yokoyama et aL，J. Clin. Endocrinol. Metabol.，64 :215_218 (1987))。此外，TSH-結(jié)合抑 制測定勿需反映甲狀腺刺激活性使在所述測定的臨床應(yīng)用上達到一致的嘗試更迷茫(見， 例如 McKenzieand Zakarija, J. Clin. Endocrinol. Metabol. ,69 1093-1096 (1989))。對靈 敏性和特異性的限制也是問題。實際上，有關(guān)可用的測定系統(tǒng)的問題導(dǎo)致了甲狀腺過氧化 物酶抗體的測量是否為下文甲狀腺自身免疫的足夠靈敏的標記物的爭論(見Botero and Brown， supra)0如Rapoport等所指出，以標準化的方式對大量的樣品輕易進行的可用的測定在 靈敏性和/或特異性上有顯著的限制，從而使所述測試在臨床應(yīng)用上不可信。這些問題主
14要適用于測量TSI抑制經(jīng)放射性標記的TSH結(jié)合人甲狀腺質(zhì)膜的能力的測定(即所述測 定不測量TSI活性本身)。另外，不是所有的抗TSH受體抗體都為刺激性的。Rapoport等 還指出在人甲狀腺質(zhì)膜使用腺苷酸環(huán)化酶的TSI刺激活性的測定嚴重缺乏靈敏性。一些 測定對包括依賴于新鮮人甲狀腺組織使用的那些一般的臨床應(yīng)用是不實用的，涉及極其困 難的技術(shù)及有限的樣品容納能力，且非常費人力和/或不經(jīng)濟(見，例如Rapoport et al, supra)。使用培養(yǎng)的犬和豬甲狀腺細胞以測量cAMP對TSH的反應(yīng)的測定的開發(fā)隨后被采用 以使用于可提供潛在的較好結(jié)果的人甲狀腺細胞。除了在一些所述方法中需要新鮮的甲狀 腺細胞(例如Rapoport等所述的方法)，在測定樣本前許多也需要繁瑣和耗時的樣品準備。 例如，一些方案需要費人力和耗時的透析方法和/或用硫酸銨或聚乙二醇在測試血清中沉 淀免疫球蛋白(見例如 Rapoport et al. , supra 禾口 Kasagi et al. , J. Clin. Endocrinol. Metabol.，62 :855_862(1986))。由于所述測定系統(tǒng)中遇到問題，研究了其他方法以努力開發(fā)出針對格雷夫斯病自 身抗體的易于進行、可信、靈敏和特異的測定。例如，測量cAMP產(chǎn)生的生物測定的使用依賴 于連續(xù)培養(yǎng)中生長的非人源的細胞的使用，或者依賴于作為原代培養(yǎng)或等量冷凍備用的人 細胞。使用人甲狀腺細胞的問題包括手術(shù)獲得的甲狀腺組織應(yīng)答的可變性。因此，非人源收 到歡迎，包括大鼠甲狀腺細胞系(FRTL-5)。其為經(jīng)過良好研究和表征的非轉(zhuǎn)化且分化的細 胞系(見，例如Bidey et al.，J. Endocrinol.，105 :7_15 (1985)；禾口Michelangeli et al.， Clin. Endocrinol. ,40 :645_652 (1994))。但是，一些缺點使所述細胞對格雷夫斯病的測定 不夠理想。例如，所述細胞生長緩慢并具有過于挑剔的生長需求(包括對TSH的需求)。結(jié) 果，需要在測定前剝奪TSH細胞至少5天，以達到合理的靈敏度水平。隨后的細胞的研制(如JP09細胞(用功能性的人TSH受體轉(zhuǎn)染的中國倉鼠卵巢細 胞)和其他能穩(wěn)定表達人TSH受體的細胞系)已極大的提高了可用于檢測格雷夫斯病自身 抗體的測定系統(tǒng)。所述細胞具有與天然甲狀腺細胞類似的TSH受體，且具有涉及應(yīng)答TSH和 甲狀腺刺激性抗體(TSAb)的G蛋白偶聯(lián)、腺苷酸環(huán)化酶的激活及cAMP生成的功能性信號 轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)(見，例如Michelangeli et al.，supra)。因為與FRTL-5細胞相比，報道的這些細 胞提供相似的診斷信息，但是更靈敏、生長更快、不過分挑剔的生長需求，及可應(yīng)答非提取 的血清，所述細胞優(yōu)于FRTL-5 細胞(Michelangeli et al.，supra ；也見，Kakinuma et al.， J. Clin. Endocrinol. Metabol. ,82 :212902134 (1997))。此外，所述方法更快速和更好重 復(fù)，且對于人自身抗體抗人受體的檢測可能跟特異。此外，與使用FRTL-5細胞系進行的測 定相比，所述測定更容易且較不繁瑣的進行(見，例如Vitti etal.，J. Clin. Endocrinol. Metabol. ,76 :499_503 (1993))。但是，所述測定依賴于放射性物質(zhì)的使用(例如，放射性免 疫測定)以檢測和定量cAMP，結(jié)果其仍然繁瑣。II.對格雷夫斯病的診斷測定格雷夫斯病是由抗體介導(dǎo)的自身免疫應(yīng)答引發(fā)的甲狀腺疾病。在格雷夫斯病患者 中，識別TSHR的自身抗體(TRAbs)是異源性的，主要包括甲狀腺刺激性抗體(TSAbs)和甲 狀腺阻斷性抗體(TBAbs)。TSAbs作為引發(fā)甲狀腺機能亢進的TSH激動劑，而TBAbs起到引 發(fā)甲狀腺機能減退的TSH拮抗劑作用。當(dāng)TSAb與TBAb結(jié)合到TSHR上的不同表位時，TBAb 的結(jié)合可“抵消” TSAb的刺激作用。當(dāng)TSAb結(jié)合到TSHR時，其誘導(dǎo)所述cAMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通 路，TBAb不具有這種作用。
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目前，使用許多生物測定以診斷格雷夫斯病。Kronus 放射性受體測定(RRA)試 劑盒被用于確定TRAbs并檢測TSAbs和TBAbs，但不能區(qū)分這兩者。Diagnostic Hybrids Inc. (DHI)先研制了檢測患者血清中TRAbs的格雷夫斯病診斷性CHO-Luc細胞系。所述細 胞系共表達由人糖蛋白α亞基啟動子驅(qū)動的野生型TSH受體基因和螢火蟲熒光素酶基因。 所述野生型TSHR具有結(jié)合TSAbs和TBAbs的表位。TBAb與受體的結(jié)合可調(diào)節(jié)TSAbs的結(jié) 合，從而導(dǎo)致由TSAbs引發(fā)的較低刺激。針對促甲狀腺激素(TSH)受體的甲狀腺刺激性自身抗體(TSAb)能夠刺激甲狀腺 腺苷酸環(huán)化酶，所述酶可負責(zé)生產(chǎn)環(huán)腺苷酸(cAMP)。因為所述自身抗體可對在所述疾病患 者中所發(fā)現(xiàn)的甲狀腺機能亢進負責(zé)，已使用所述自身抗體作為檢測和鑒定患有格雷夫斯病 的患者的診斷標記物。然而，更多的細節(jié)如下所述，常用的檢測和測量所述TSAbs的方法是 復(fù)雜和耗時的。A. cAMP 檢測測量TSAbs的一方法利用被稱作“FRTL-5”的大鼠甲狀腺細胞系。從Interthyroid Research Foundation (Baltimore, MD)獲得的所述細胞系表達與人TSAbs交叉反應(yīng)的受 體。在TSAbs存在下(即，例如，將所述細胞與從含有所述抗體的格雷夫斯病患者獲得的血 清接觸)，刺激FRTL-5細胞以產(chǎn)生cAMP。然后使用放射性免疫測定法在一部分的裂解的細 胞或浸浴細胞的培養(yǎng)基中測量cAMP。所述FRTL-5細胞成為對為格雷夫斯病特異性癥狀的 自身抗體進行的首次成功測定的基礎(chǔ)。美國專利號No. 4，609，622 (通過引文并入本文)B. FRTL-5細胞測定和饑餓培養(yǎng)基如Vitti等所述的使用FRTL-5細胞進行的典型測定(Vitti et al.，J. Clin. Endocrinol. Metabol. ,76 =499(1993))涉及在96孔板上用除細胞培養(yǎng)基中使用的正常生 長成分外還含有6種激素的特殊的完全培養(yǎng)基(即，例如，6H培養(yǎng)基)接種FRTL-5細胞 (30，000細胞/孔)。在5% CO2、濕潤、37°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 3天后(即當(dāng)細胞匯合 時)，將培養(yǎng)基更換成缺乏TSH的“饑餓培養(yǎng)基”(從而得到了 5H培養(yǎng)基)，其中在6H培養(yǎng) 基中TSH為6種激素之一。將所述細胞在培養(yǎng)箱中持續(xù)培養(yǎng)4 5天，每2 3天更換培 養(yǎng)基。在此期間所述細胞不生長或增殖。隨后，可在診斷測定中使用所述細胞。C.放射件標記物測定和刺激培養(yǎng)基早期的診斷格雷夫斯病的方法通過移出饑餓培養(yǎng)基并添加包含含有磷酸二酯 酶抑制劑(如0.5mM甲基異丁基黃嘌呤，IBMX)的特殊的低氯化鈉、高蔗糖緩沖液(HBSS NaCl+222mM 蔗糖；緩沖液的配方為0. 0608g/L ΚΗ2Ρ04、0· 144g/L CaCl2、0. 373g/L KC1、 0. 048g/LMgS04、0. 097g/L Na2PHO4U. Og/L D-葡萄糖、76g/L(即 222mM)蔗糖、4. 77g/L HEPES和10g/L BSA, ρΗ為7. 2 7. 4)的刺激培養(yǎng)基來進行，以阻止所述酶分解cAMP。將 特別制備的患者免疫球蛋白(IgG)樣品、對照和標準品添加到適當(dāng)?shù)目字校ǔＲ皇饺荩?并將所述平板在5% CO2、濕潤、37°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2小時。經(jīng)所述培養(yǎng)后，從各孔中移出 5 10 μ 1的培養(yǎng)基并在放射性免疫測定系統(tǒng)中使用以檢測cAMP的存在。通常用約6個標 準品進行兩個重復(fù)的所述測定，患者和對照也進行兩個重復(fù)的測定。所述測定通常需要過 夜培養(yǎng)，及第二天所需約1小時用于從結(jié)合抗體的經(jīng)放射性標記的cAMP分離游離的經(jīng)放射 性標記的cAMP。由于放射性物質(zhì)的使用和很長的準備時間為FRTL-5測定的消極方面，已開發(fā)出
16改良的系統(tǒng)。一研究涉及低鹽條件的使用以提高測定系統(tǒng)的靈敏性(見Kosugi et al., Endocrinol.，125 :410_417 (1989))。生物測定中更多的改良涉及用人TSH受體轉(zhuǎn)染的中 國倉鼠卵巢(“CH0”)細胞系(“CH0-R”;見Vitti et al.，supra)。所述的細胞系提供針 對FRTL測定的兩個主要改良。第一，所述方法涉及使用人TSH受體替代大鼠TSH受體，其 可提供更好的特異性和可能的靈敏性以檢測TSAbs ；第二，無所述的特別的6H培養(yǎng)基及經(jīng) 過6 8天變?yōu)?H培養(yǎng)基的需求，因為所述CHO-R細胞在標準的補給性培養(yǎng)基上生長良好 且依據(jù)使用的接種到所述孔的細胞懸液密度在接種1 3天后可使用所述細胞。另外，與 FRTL-5細胞的比較研究顯示，CHO-R細胞在檢測格雷夫斯病TSAbs中更準確(見Vitti et al) ο P. #用CHO-Rluc細朐系講行熒光素_某因測丨定 通過CHO-R細胞的使用而提供了進一步的改良，所述CHO-R細胞被設(shè)計為通過報 告基因(S卩，例如熒光素酶)的使用輕易評估由TSI所致的增加的cAMP量(Evans et al.， J. Clin. Endocrinol. Metabol. ,84 :374 (1999))。因此，由于經(jīng)改造細胞系(即 CHO-Rluc)的 導(dǎo)入，消除了在先前開發(fā)的用于cAMP檢測和定量的放射性免疫測定中使用的放射性化合 物的使用中固有的復(fù)雜性和危險性。用這些細胞，通過移出細胞培養(yǎng)基、添加裂解緩沖液、 允許20 30分鐘以發(fā)生裂解、移出裂解物樣品、添加熒光素酶底物，和使用光度計以15秒 的間隔測量光輸出，從而簡單測量熒光素酶。但是，如下的實施例部分所述，所述方法提供 可疑的結(jié)果，并需要進一步的改良。在一實施方式中，本發(fā)明涉及并入CHO-Rluc方案的優(yōu)勢，同時提供在可信性和可 重復(fù)性方面的額外優(yōu)勢的方法。相當(dāng)大的研究努力致力于本發(fā)明方法的開發(fā)，其包括允許 在光度測定中使用CHO-Rluc細胞，所述光度測定使用從未治療的格雷夫斯病患者獲得的 TSH和免疫球蛋白。最初使用的標準方案涉及種植來自凍存液的CHO-Rluc細胞，以在培養(yǎng)18 24小 時后產(chǎn)生匯合的單層細胞的濃度接種。開始，移出生長培養(yǎng)基，并將饑餓培養(yǎng)基添加到單層 細胞中、向其中加入一系列的TSH標準品(例如0、10、100、1000μ IU TSH/ml)和患者IgG 樣品。因為所述方法產(chǎn)生了差的結(jié)果，測試了過夜饑餓期或調(diào)節(jié)期。饑餓期導(dǎo)致了具有低背景值的改良的結(jié)果且產(chǎn)生了對應(yīng)TSH標準品和測試的患 者樣品的良好值(good value) 0也測試了另外的實驗選項，其中使用了聚乙二醇(PEG)以 提高抗原抗體結(jié)合。在這些實驗中，添加PEG到刺激培養(yǎng)基。在各種實驗中，測試了如下文實施例部分所述的不同培養(yǎng)基配方和組合。例如， 用刺激培養(yǎng)基饑餓產(chǎn)生了 對應(yīng)0 μ IU/ml TSH標準品的(32，103)的RLU/sec值，對應(yīng) 10 μ IU TSH/ml 樣品的-1，148，對應(yīng) 1000 μ IU TSH/ml 樣品的 47，478，和對應(yīng) IgG 樣品 #13 的19，350。如此和如下所述，括號中的數(shù)字代表0μ IU TSH/ml值，其被從對應(yīng)標準品或樣 品的值中減掉以得到凈值。用標準HBSS饑餓得到了 對應(yīng)0 μ IU/ml TSH對照的(21，671)的RLU/sec值，對 應(yīng)10 μ IU TSH/ml樣品的1，336，對應(yīng)1000 μ IUTSH/ml樣品的82，466和對應(yīng)IgG樣品#13 的39，082。用標準HBSS和6 % PEG饑餓得到了 對應(yīng)0 μ IU/ml TSH對照的(32，562)的 RLU/sec 值，對應(yīng) 10 μ IU TSH/ml 樣品的 5，980，對應(yīng) 1000 μ IU 5 TSH/ml 樣品的 207，831 和對應(yīng)IgG樣品#13的174，461。因此，用標準HBSS饑餓產(chǎn)生了對應(yīng)TSH和格雷夫斯病樣品的更高值，而添加PEG到刺激培養(yǎng)基產(chǎn)生了甚至更高值。與上文所述的方法相比，這些更 高值在本發(fā)明方法中給予了更高靈敏性水平。然而，涉及饑餓期的這些測定的較長持續(xù)時 間是不利的。假設(shè)了測定的改良，即縮短的3 4天的測定期也克提高測定的靈敏性和準 確性。E.嵌合TSH警體細胞系在一實施方式中，本發(fā)明設(shè)計重組細胞系(即，例如CHO和RD)，其組合表達TSH/ LH/TSH嵌合受體(即例如RMc4)與螢火蟲熒光素酶基因。在一實施方式中，所述表達由人 糖蛋白α亞基啟動子驅(qū)動。雖然不需了解本發(fā)明的機理，認為通過使用嵌合受體可消除和 /或減少阻斷性抗體(即，例如TBAb)的結(jié)合。在一實施方式中，嵌合受體包含至少一個只 表達TSAb結(jié)合區(qū)的遺傳修飾。認為當(dāng)與CHO-Luc細胞或KRONUS 測定相比，重組細胞系具 有提高的特異性。III.免疫應(yīng)答發(fā)展的監(jiān)測如上所述，本發(fā)明也提供監(jiān)測免疫應(yīng)答發(fā)展的方法和組合物。尤其，本發(fā)明也提供 適于監(jiān)測個體對疫苗接種的應(yīng)答的方法和組合物。在一實施方式中，可使用免疫前的血清(即，施用疫苗前收集的血清)作為用于對 照目的的基準?？稍谝呙缃臃N后的短時間內(nèi)(例如疫苗接種后1 2周)和疫苗接種后的 幾個月定期收集所述血清。然后測試所述血清樣品中中和抗體的存在和量。在一些實施方式中，進行診斷測定以監(jiān)測對病毒抗原的應(yīng)答。在所述測定中，聯(lián)用 ELVIS (Diagnostic Hybrids, Athens, OH)之類的細胞與本發(fā)明的聚乙二醇(PEG)溶液。 在一實施方式中，PEG提高了抗原-抗體反應(yīng)，從而導(dǎo)致了更高的反應(yīng)性。IV.在 CH0_Mc41uc 和 RD_Mc41uc 細胞系中的 TSI 檢測在一實施方式中，本發(fā)明涉及使用經(jīng)基因工程改造的中國倉鼠卵巢細胞(CHO)和 /或人橫紋肌肉瘤細胞(RD)以診斷格雷夫斯病和/或監(jiān)測格雷夫斯病的治療。臨床實驗室目前利用各種細胞和反應(yīng)緩沖液以檢測和測量在患者血清中特異于 格雷夫斯病的刺激性自身抗體從而確認患者是否患上所述疾病且監(jiān)測其治療。大量實驗室 利用例如，包括含有野生型人促甲狀腺激素受體(TSHR)和CRE-Luc報告系統(tǒng)的經(jīng)基因修飾 的CHO細胞的細胞。然而，所述細胞需要一天用于生長和一天用于饑餓，從而在獲得測試結(jié) 果上遭到了時間的限制。在第三天，用所述細胞和反應(yīng)緩沖液與患者的血清樣本溫育以檢 測格雷夫斯病自身抗體的存在。在一些實施方式中，本發(fā)明涉及不需要多天測定過程的方 法。在一實施方式中，所述時間更短的方法無饑餓培養(yǎng)期。下文更全面的解釋針對格雷夫 斯病診斷測定的快速、準確和靈敏優(yōu)勢。在一實施方式中，本發(fā)明涉及提高甲狀腺刺激性免疫球蛋白(TSI)的檢測細胞系 (CHO-RLuc)的方法。在一實施方式中，所述細胞系還包含嵌合受體。在一實施方式中，所 述嵌合受體包含促甲狀腺激素受體(TSHR)和大鼠促黃體激素(LH)(即，例如RMc4受體)。 雖然不需了解本發(fā)明的機理，但認為嵌合TSH受體提供了改良的TSI結(jié)合特異性以便在診 斷測定中不需要饑餓期。在一實施方式中，本發(fā)明涉及在CHO細胞和/或RD細胞(或其他哺乳動物細胞) 中表達Mc4嵌合受體的方法。在一實施方式中，所述方法還包含使用CRE-Luc作為報告基 因以檢測TSI。在一實施方式中，由于優(yōu)先結(jié)合刺激性自身抗體(即與阻斷性自身抗體相
18反)，嵌合受體提供了比野生型受體更高的特異性。在一實施方式中，由于優(yōu)先結(jié)合刺激性 自身抗體(即與阻斷性自身抗體相反)，嵌合受體提供了比野生型受體更高的特異性。在一 實施方式中，所述細胞培養(yǎng)物還包含PEG。雖然不需了解本發(fā)明的機理，但認為因為格雷夫 斯病患者血清可兼有刺激性自身抗體和阻斷性自身抗體，野生型TSH-R受體將與兩種抗體 均等的結(jié)合。另外，認為阻斷性自身抗體可調(diào)節(jié)和抑制刺激性自身抗體的活性。在公開的細胞系中表達的嵌合TSH-R受體提供了超越目前所用細胞系的優(yōu)勢1.導(dǎo)致了較低的熒光素酶活性背景，從而導(dǎo)致了較高的信噪比(S N)或信號背 景比(S B)。2.細胞系不需要目前使用的細胞系所需的過夜“饑餓”(以使由TSI結(jié)合所致的 信號最大化)。所述改變減少了周轉(zhuǎn)時間使其從目前的3天測定到2天測定，其對實驗室、 醫(yī)生和患者非常有利。3.所述測定以測量刺激性抗體，鑒于野生型TSH-R對刺激性和阻斷性抗體都有反 應(yīng)，鑒于Mc4嵌合受體只對刺激性抗體有反應(yīng)，從而提供針對所測量物的更高特異性。V.嵌合TSH警體在一實施方式中，本發(fā)明涉及以高檢測靈敏性和特異性檢測促甲狀腺激素受體 (TSH-R)自身抗體(即，例如甲狀腺刺激性免疫球蛋白；TSI)的新診斷細胞系。在一實施方 式中，所述細胞系包括重組的中國倉鼠卵巢細胞(即，例如CHO-Kl細胞)。在一實施方式 中，所述細胞系包括人橫紋肌肉瘤(RD)細胞。在一實施方式中，本發(fā)明涉及包含編碼連接到螢火蟲熒光素酶報告基因和操控性 結(jié)合糖蛋白激素α亞基啟動子的hTSH/rLH-R融合蛋白(即，例如RMc4)核苷酸序列的載 體。在一實施方式中，用所述載體轉(zhuǎn)染所述細胞系。在一實施方式中，在可檢測到熒光素 酶報告信號的條件下，所述經(jīng)轉(zhuǎn)染細胞系表達了人TSH-R/大鼠促黃體激素(LH)嵌合受體 (hTSH/rLH-R)。Α.嵌合體構(gòu)建最初通過構(gòu)建人/大鼠嵌合TSH-R構(gòu)建體來檢查與格雷夫斯病相關(guān)的TSH和甲狀 腺刺激性自身抗體的結(jié)合位點特性。用相應(yīng)的大鼠序列部分取代人TSH-R產(chǎn)生下列嵌合體 受體i)取代氨基酸殘基8 165的Mcl+2 ；ii)取代氨基酸殘基90 165的Mc2 ；和iii)取 代氨基酸殘基261 370的Mc4。所述數(shù)據(jù)提示，氨基酸殘基8 165含有特異于甲狀腺刺激 性自身抗體的表位，而其與TSH所需的表位不同?？稍谔匕l(fā)性粘液性水腫甲狀腺刺激性抗 體、格雷夫斯病甲狀腺刺激性抗體和TSH間的結(jié)合位點中觀察到顯著的異質(zhì)性。(見Tahara et al. ，" Immunoglobulins From Graves' Disease Patients Interact WithDifferent Sites On TSH Receptor/LH/CG Receptor Chimeras ThanEither TSH Or Immunoglobulins From Idiopathic MyxedemaPatients“ Biochem Biophys Res Comm 179:70-77(1991))早期研究說明了包括大鼠TSH受體和大鼠促黃體激素絨毛膜促性腺激素受體區(qū) 段的嵌合TSH受體的轉(zhuǎn)染和表達。用相應(yīng)的大鼠LH/GC序列取代各種大鼠TSH氨基酸序列。 其數(shù)據(jù)表明氨基酸殘基268 304對生成cAMP的反應(yīng)是不重要的，但其消除了 TSH高親和 力結(jié)合位點。(見 Akamizu et al.，"Chimeric Studies Of TheExtracellular Domain Of The Rat Thyrotropin (TSH) Receptor :Amino Acids (268-304)In The TSH Receptor Are Involved InLigand High Affinity Binding，But Not In TSH Receptor-SpecificSignal
19Transduction" Endocr J 40:363-372(1993))。通過比較使用的嵌合人 TSH 受體對 i) TSH 結(jié)合抑制性免疫球蛋白；ii)甲狀腺刺激性抗體；和iii)甲狀腺阻斷性抗體的結(jié)合來確定 抗TSH受體抗體的異質(zhì)性，其中人TSH受體的90 165個氨基酸殘基被等量的促黃體激素 絨毛膜促性腺激素受體的氨基酸殘基取代。結(jié)合數(shù)據(jù)提示可能有兩種類型的甲狀腺刺激性 抗體、三種類型的TSH結(jié)合抑制性免疫球蛋白和一種非功能性抗體。已報道嵌合TSH受體檢測和表征了各種類型的疑似與格雷夫斯病有關(guān)的循環(huán) 抗體。認為所述抗體包括但不限于激活TSH-R的刺激性自身抗體和可阻斷TSH-R結(jié) 合TSH或刺激性自身抗體的阻斷性自身抗體。例如，人TSH-R(hTSH-R)和促黃體激素人 絨毛膜促性腺激素受體(LH-hCG-R)的嵌合體包括用等量的人LH/CG-R殘基取代所述 hTSH-R的261 370的氨基酸的RMc4嵌合體。通過放射性免疫測定測量從格雷夫斯 病血清樣品純化的IgG樣品刺激cAMP產(chǎn)生的能力(見Kung et al.，Epitope Mapping of TSH Receptor-BlockingAntibodies In Graves ' Disease That Appear During Pregnancy" JClin Endocrinol Metab 86:3647—3653(2001))。通過使用兩種類型的TSH-R嵌合構(gòu)建體確定TSH刺激性和阻斷性自身抗體間的 互作。第一個嵌合體被命名為Mc2，其用等量的大鼠促黃體激素絨毛膜促性腺激素受體殘 基取代人TSH-R氨基酸殘基90 165。第二個受體被命名為Mcl+2，其用等量的大鼠促 黃體激素絨毛膜促性腺激素受體殘基取代人TSH-R氨基酸殘基8 165。對格雷夫斯病 患者中的循環(huán)自身抗體的評估顯示，阻斷性自身抗體不強烈拮抗刺激性自身抗體的作用， 但可對通過目前CH0-hTSH-R診斷測定方法測量的低估刺激性自身抗體活性負責(zé)(Kim et al. , “ ThePrevalance And Clinical Significance Of Blocking ThyrotropinReceptor Antibodies In Untreated Hyperthyroid Graves ' Disease " Thyroid 10 579-586(2000))ο嵌合hTSH/rLH-R受體(RMc4)的DNA序列總共包含2，324個堿基對，并編碼730 個氨基酸。圖8。在所述嵌合受體中，用相應(yīng)的大鼠促黃體激素(LH)受體的73個氨基酸取 代人TSH-R的第262氨基酸 第335氨基酸的區(qū)域。驅(qū)動熒光素酶報告子表達的序列為236個核苷酸的糖蛋白α亞基啟動子，其包含 環(huán)AMP(cAMP)調(diào)控元件(CRE)，并通過PCR克隆。克隆的啟動子的核苷酸序列通過DNA測序 確定，并通過與Genebank序列AF401991的序列比對確認。將克隆的啟動子與從HEK細胞 通過PCR擴增的GPH啟動子比對表明所述兩種序列是相同的。圖9C.嵌合體診斷測定然后比較CH0_RMc41uc、RD-RMc41uc和CHO-Rluc細胞系對陰性和陽性TSI血清 的反應(yīng)。用TSI陰性和陽性血清與所述細胞溫育3小時。然后裂解細胞，并用Veritas Microplat光度計測量熒光素酶活性。其結(jié)果表明與CHO-Rluc細胞相比，CH0-RMc41uc和 RD-RMc41uc細胞系具有更高的檢測靈敏性。圖10A、10B、IOC、IOD和10E。從TSI陽性血 清和陰性血清所得的熒光素酶RLU比(S/N比)的比較顯示CH0-RMc41uc和RD-RMc41uc 細胞比CHO-Rluc細胞系敏感6 8倍和2. 1 4倍。分別見圖IOB和IOD0 CH0-RMc41uc 細胞比RD-RMc41uc細胞敏感約1.3 3. 5倍。圖10E。另外，當(dāng)用TSI陰性血清測試時， CH0-RMc41uc有比CHO-Rluc更低的誘導(dǎo)的熒光素酶活性水平，從而導(dǎo)致了更低的背景和提 高的信號/陰性(S/N)比。圖10A。此外，CH0-RMc41uc和RD-RMc41uc細胞系都顯示了非
20常低的標準偏差值。分別見圖IOA和IOC0標號為#19的TSI陽性血清在CH0-RMc41uc、 RD-RMc41uc和CHO-Rluc細胞系上顯示了高熒光素酶誘導(dǎo)水平。稀釋所述血清，并在所述細 胞系上進行測試以比較靈敏性。圖IOE另夕卜，比較用一系列稀釋的TSI陽性血清誘導(dǎo)CHO-Rluc、CH0-RMc41uc和 RD-RMC41UC細胞系的檢測靈敏性。例如，連續(xù)稀釋TSI陽性血清，且在不同的細胞系上溫 育3小時。所述RD-RMc41uc和CHO-Rluc細胞系在1 2至1 8之間的血清稀釋液范圍 顯示了 S/N比的線性響應(yīng)，但是RD-RMc41uc的劑量響應(yīng)(值)的斜率和由此所得的檢測靈 敏性比CHO-Rluc細胞系更高。圖11A。在無或低血清稀釋液中CH0-RMc41uc未顯示出S/N 比的線性響應(yīng)。圖11B。但是CH0-RMc41uc細胞在從1 32至1 128范圍的血清稀釋液 中顯示了 S/N比的線性劑量響應(yīng)。圖11。注意，劑量響應(yīng)(值)的斜率甚至比RD-RMc41uc 細胞系的更高。圖IlA和圖11C。也比較了 CH0_RMc41uc細胞系和CHO-Rluc細胞系的TSH靈敏性。所述S/N比源 自使用由重組人TSH誘導(dǎo)的CHO-Rluc、CH0-RMc41uc和RD_RMc41uc細胞系進行的熒光素酶 測定。將各種濃度的重組人TSH與CH0-RMc41uc和CHO-Rluc細胞系溫育3小時。在溫育 后，進行熒光素酶測定。其結(jié)果表明，它們都能在低達5 μ IU/ml的濃度下檢測到TSH，但是 CH0-RMc41uc的檢測靈敏性比CHO-Rluc細胞系甚更高。圖12。也使用包括人促黃體激素(hLH)、人卵泡刺激激素(hFSH)和人絨毛膜促性腺激素 (hCG)的都有一共同α亞基的其他垂體前葉激素測試CH0-RMc41uc和CHO-Rluc細胞系的 特異性。兩種細胞系都未顯示與所測試激素的任何交叉反應(yīng)。表1。表1 :CH0-Rluc和CH0_RMc41uc對人TSH和其他激素的特異性。A. TSI血清對促性腺激素的熒光素酶S/N比的比較 使用CH0-RMc41uc和CHO-Rluc細胞系來篩選正常人血清，以確定源自熒光素酶測 定的S/N比分布。對源自由108個正常人血清誘導(dǎo)的CHO-Rluc和CH0_RMc41uc細胞系的 熒光素酶測定的S/N比分布進行比較。在CH0-RMc41uc和CHO-Rluc細胞系中測試全部血 清樣品。使用已知的正常血清作為計算S/N比的參照。CH0-RMc41uc細胞系的分布顯示出 與CHO-Rluc細胞系非常相似的樣式。CHO-Rluc的平均值為1且CH0-RMc41uc的平均值為 0. 88。CHO-Rluc的標準偏差為0. 23且CHO-Luc的標準偏差為0. 21。圖13。比較了 CH0-RMc41uc、RD-RMc41uc和CHO-Rluc細胞系對臨床患者血清樣品的反 應(yīng)。所述S/N比源自對由12個臨床血清樣品誘導(dǎo)的CHO-Rluc、CH0-RMc41uc和RD_RMc41uc 細胞系進行的熒光素酶測定。在CH0-RMc41uc、RD-RMc41uc和CHO-Rluc細胞系中測試12 個血清樣品的每一個。將所述樣品的熒光素酶活性與已知的陰性血清樣品(陰性參照)相 比較。研究所得結(jié)果表明與CHO-Rluc細胞相比，CH0-RMc41uc和RD-RMc41uc細胞系都有 更高的檢測靈敏性，且CH0-RMc41uc細胞系為最靈敏的細胞系。圖14。VI.嵌合警體測定和饑餓預(yù)處理期
如上所述，所述CH0-RMc41Uc細胞系在靈敏性和特異性上提供了超越目前所用 CHO-Rluc細胞系的明確優(yōu)勢。例如，通過格雷夫斯病抗體刺激的CH0-RMc41uc細胞提供了 通過相對光單位(RLU)輸出測量的增強的熒光素酶反應(yīng)。所述改進允許從方案中除去一天 的饑餓過程。用于CHO-Rluc細胞系的標準方案包括饑餓期。饑餓形式的所述方案為接種細胞 以在第一天生長、第二天饑餓及第三天刺激和測量RLU。當(dāng)去除了饑餓期時，可去除所述的 “第二天饑餓”的步驟，并可在第二天而非第三天將最終結(jié)果報告給醫(yī)生，這更被期望。因為 用戶的勞動量顯著下降，且醫(yī)生可在次日獲得結(jié)果，而與具有一天饑餓期的CHO-Rluc方案 相比其起提供了更高準確性的測定，所以所述的非饑餓方案提供了針對用戶和醫(yī)生的顯著 優(yōu)勢。使用饑餓期以提高正常血清和格雷夫斯病陽性血清的RLU或％分離。所述RLU分 離直接與測定的準確性相關(guān)。使用格雷夫斯病陽性和正常血清樣本，使用兩種不同的細胞 系CHO-Rluc和CH0-RMc41uc測試了饑餓期的影響。見表8。表8 饑餓期對CHO-Rluc和CH0_RMc41uc細胞的相對影響
23 分別使用饑餓的CHO-Rluc和饑餓的CH0_RMc41uc細胞及非饑餓的CH0_RMc41uc 細胞的方案獲得格雷夫斯病陽性和陰性血清的RLU值。饑餓對CH0-RMc41uC細胞的預(yù) 計影響為降低細胞中熒光素酶活性的背景水平，從而升高格雷夫斯病陽性和格雷夫斯病 陰性血清的RLU比。對所述血清組來說，饑餓的CHO-RIuc的平均比為3. 25X、非饑餓的 CH0-RMc41uc 為 7. 29X、且饑餓的 CH0-RMc41uc 細胞為 11. 5X。因此，與饑餓CHO-RIuc細胞相比，非饑餓CH0-RMc41uc細胞提供了高于2倍的亮 度(即，和因此的靈敏性)提高。這提供了縮短了一天及提供了更準確和更靈敏結(jié)果的方案 的明顯優(yōu)勢。血清參照比(SRRs)用百分比比較了 RLU值，并進一步確認CH0-RMc41uc細 胞(無論饑餓或非饑餓的)提供了正常和格雷夫斯病血清之間的RLU的提高的分離。提交 的臨界值是近似的，且當(dāng)測定值>特定方案/細胞系的臨界值時，其為格雷夫斯病的指標。 _5] VII.俥用糖皮質(zhì)激素的嵌合等體測丨定改良因為上述數(shù)據(jù)表明饑餓期也提供了 CH0-RMC41UC細胞準確性和靈敏性的提高。然 后進行了進一步的研究以開發(fā)無饑餓期的更優(yōu)的CH0-RMC41UC細胞測定。根據(jù)實施例15收集了一組數(shù)據(jù)，其中CH0-RMC41UC細胞經(jīng)歷饑餓期，然后與不同 濃度的地塞米松(DEX)溫育。數(shù)據(jù)清楚表明了地塞米松顯著提高了 RLU強度并顯著超過由 僅有饑餓期提供的RLU強度。表9。表9 地塞米松對饑餓的CH0-R_Mc4細胞的影響
25 陽性對照所述數(shù)據(jù)顯示地塞米松降低了參照血清的RLU讀數(shù)而同時大大提高了患者#18的 RLU讀數(shù)?？傊?，就患者#18血清樣品而言，地塞米松的存在導(dǎo)致了 S/B比提高了約80%。這些觀察數(shù)據(jù)提示，如果使用地塞米松代替饑餓期可改良測定。結(jié)果，對經(jīng)歷饑餓 期的細胞和僅與生長培養(yǎng)基中的地塞米松(40 μ M)接觸的細胞進行比較。見實施例16。為 比較不同的方案，對格雷夫斯病陽性和格雷夫斯病陰性血清的RLU結(jié)果一起平均，并分別 計算它們參照標準上的百分比。表10。表10 饑餓處理與地塞米松處理的CH0_rMc4細胞的比較
26 所述數(shù)據(jù)證明，與無地塞米松的非饑餓CH0-RMc41uc細胞相比，具有地塞米松的 非饑餓CH0-RMC41UC細胞提供了檢測循環(huán)TSI ’ s的更高靈敏性(和因此的更高準確性)。 例如，在未經(jīng)歷饑餓期的格雷夫斯病陽性患者血清中，具有地塞米松的CH0-RMC41UC細胞 在發(fā)光上顯示出365% (相對于參照)的升高，而不具有地塞米松的CH0-RMc4細胞在發(fā)光 上顯示出189%的升高。當(dāng)比較格雷夫斯病陽性患者血清和格雷夫斯病陰性患者血清時，由地塞米松所 致的靈敏性和準確性上的提高甚至更引人注目。例如，在存在地塞米松下，格雷夫斯病陽 性血清和格雷夫斯病陰性血清之間的差異為309% (即，例如365% 56% )，但在不存在 地塞米松下，格雷夫斯病陽性血清和格雷夫斯病陰性血清之間的差異為157% (即，例如 189% 32% )。所述結(jié)果清楚地顯示由于更強的發(fā)光信號強度，就靈敏性而言，地塞米松提供了 更好的測定系統(tǒng)。所述改良導(dǎo)致提高了測試靈敏性，且當(dāng)其與RMc41uC測試系統(tǒng)組合時，本 發(fā)明提供了比先前公開的需要饑餓培養(yǎng)期的TSI抗體測定更快速和準確的診斷測定。進一步的研究證明，所述作用不限于地塞米松，并可從大多數(shù)但不是全部糖皮質(zhì) 激素預(yù)見到。例如，本文所提交的數(shù)據(jù)顯示，與替代饑餓培養(yǎng)期相比，其他糖皮質(zhì)激素也提 高了 CH0-RMC41UC測定的靈敏性以提供等量的靈敏性。盡管如此，糖皮質(zhì)激素的存在提供 了可在兩天內(nèi)而非三天內(nèi)進行測定的優(yōu)勢?；谙鄬鈫挝?RLUs)和以百分比表達的血清參照比(SRRs% )，將替代性糖皮 質(zhì)激素(GC)與地塞米松(40μΜ)進行比較。鑒于此目的，在不存在饑餓期下，全部5個測 試的糖皮質(zhì)激素在提高RMc41uc測定的靈敏性上顯示出共通效果。根據(jù)實施例17的方案收集數(shù)據(jù)。通過分別從所述濃度的陽性對照的RLU值或 中減去該濃度的正常對照的RLU值或SRR%值，以各糖皮質(zhì)激素(GC)濃度的RLU值
或的差異(Δ)計算數(shù)據(jù)。所述數(shù)據(jù)證明，全部四種GC提高了至少6000RLUS的信號強度，其中氫化可的松和
27可的松具有等于地塞米松的信號強度。見圖17。然而，當(dāng)以SRR%計算數(shù)據(jù)時，可看到與全 部替代性糖皮質(zhì)激素相比，地塞米松提高了信噪比約2倍。見圖18。盡管如此，所述數(shù)據(jù)證 明，任何糖皮質(zhì)激素可提供在RMc41uc測定的靈敏性和準確性上的提高，由此不需要饑餓
培養(yǎng)期。VII.試劑盒在其他的實施方式中，本發(fā)明提供了使用嵌合TSH受體進行格雷夫斯病診斷測定 的試劑盒。優(yōu)選所述試劑盒包括一個或更多容器，其包含本發(fā)明的基于細胞系的診斷方法。 在一些實施方式中，所述容器包含糖皮質(zhì)激素，其包括但不限于地塞米松、可的松、氫化可 的松、潑尼松或氟替卡松。在一些實施方式中，所述試劑盒包含進行格雷夫斯病診斷測定以 檢測患者血清中循環(huán)的TSH自身抗體的所有必需或充足組分，其包括全部對照、進行測定 的使用說明和用于分析和顯示結(jié)果的任何軟件。在一些實施方式中，所述試劑盒包含編碼 具有轉(zhuǎn)染細胞系能力的嵌合TSH受體的載體。在一些實施方式中，所述試劑盒包含在一步 反應(yīng)中進行診斷測定的全部必需或充足材料，且提供了診斷、預(yù)后或預(yù)測信息(例如給研 究人員或臨床醫(yī)師)。例如，所述的試劑盒可能含有包含嵌合TSH受體和熒光素酶系統(tǒng)的細 胞系。在一些實施方式中，所述試劑盒包含含有Mc4嵌合TSH受體的第一核酸序列、熒光素 /熒光素酶報告系統(tǒng)的第二核酸序列和啟動子的第三核酸序列的載體。其他的實施方式也 包括緩沖液、對照劑、檢測裝置、軟件、使用說明和TSH自身抗體標準制劑。所述試劑盒也任選包括適當(dāng)?shù)南到y(tǒng)(如不透明容器)或穩(wěn)定劑(如抗氧化劑)，以 防止由光或其他不利條件所致的試劑降解。把各溶液或組合物裝在小瓶或瓶中，且全部小 瓶在盒中密閉保存以用于商業(yè)銷售。所述試劑盒任選包括含有為格雷夫斯病診斷、檢測和/或治療中試劑的使用所提 供的指導(dǎo)(即方案)的說明性材料。雖然所述說明性材料通常包括手寫或印刷的材料，但 其不僅限于這些材料。本發(fā)明涉及任何能貯存所述說明并將其傳達給終端用戶的媒介。所 述媒介包括但不限于電子儲存媒介(例如，磁盤、磁帶、膠卷、芯片)、光學(xué)媒介(如CD ROM) 等。所述媒體可包括提供所述說明性材料的網(wǎng)址。麵提供了下面的例子以證明和進一步顯示本發(fā)明的某些實施方式和方面，其不能被 解釋以限制本發(fā)明的范圍。在下面的實驗公開中，下列縮寫適用eq(當(dāng)量)、M(摩爾/升)、μ M(微摩爾/ 升)、N(正常)、！Iiol (摩爾)、mmol (毫摩爾)、μ mol (微摩爾)、nmol (納摩爾)、g (克)、mg (毫 克)、yg(微克)、ng(納克)、或L(升)、ml (毫升)、μ1(微升)、μ υ(微國際單位)、cm(厘 米)、mm(毫米)、μπι(微米)、nm(納米)、°C (攝氏度)、sec·或s(秒)、min.和m(分)、麗(分 子量)、促甲狀腺激素(TSH)、bTSH(牛TSH)、TSI (甲狀腺刺激性免疫球蛋白)、TSAb(甲狀腺 刺激性抗體)、EDTA (乙二胺四乙酸)、RLU/sec (相對光單位/秒)、GM或PM(生長培養(yǎng)基或接 種培養(yǎng)基)、SM(饑餓培養(yǎng)基)、HBSS (漢克平衡鹽溶液)、EMEM(Eagle' s最小必需培養(yǎng)基)、 FBS或FCS (胎牛血清)、DMSO(二甲基亞砜)、CHO(中國倉鼠卵巢細胞)、CHO-R(用人TSH 受體轉(zhuǎn)染的CHO細胞)XHO-Rluc (用ere-熒光素酶報告基因復(fù)合物轉(zhuǎn)染的CHO-R細胞)、 Oxoid(Oxoid, Basingstoke，England)、BBL(Becton DickinsonMicrobiology Systems, Cockeysville, ME)、DIFCO(DifcoLaboratories，Detroit，Nil)、U. S. Biochemical(U.
28S. Biochemical Corp.，Cleveland, OH)、Fisher(Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)、 Sigma(Sigma Chemical Co. , St. Louis，MO. )、ATCC(American TypeCulture Collection， Rockville, Maryland)、LTI (Life Technologies, Rockville, MD)、禾口 Promega (Promega Corp.，Madison，WI)。在下面的方法中，在全部方法中使用的全部溶液為滅菌(除了 TSH、對照、患者樣 本)和無菌處理的。在無菌條件下和生物安全柜中進行全部操作。從LTI獲得的細胞培養(yǎng) 基(例如Ham' s F-12、EMEM等)，而非必需氨基酸之類的添加試劑從Sigma獲得。因為溫度的循環(huán)變化可導(dǎo)致生存能力喪失，在本發(fā)明的方法中直到解凍和使用前 的即刻，細胞冷凍瓶不允許從它們-80°C (或更低)的保存溫度中升溫。因為其含有在室溫 中不穩(wěn)定的二硫蘇糖醇，從-20°C的保存溫度移出所述5X細胞裂解溶液足夠長的時間，以 移出制備IX溶液所需體積。因為復(fù)原的熒光素酶底物溶液也含有二硫蘇糖醇，直到剛使 用前其應(yīng)在-20°C冷凍保存，在所述時間可移出所述溶液，并置于25 37°C水浴以解凍和 達到室溫。一般而言，當(dāng)從孔(例如，微孔板等)中移出液體，可將孔中的液體傾倒至生物安 全櫥中的容器?？赏ㄟ^將平板倒放在無菌的吸水擦上排干或去除殘余液體，或通過使用移 液器的精細尖端吸出以移出所述液體。如果使用了吸出液體的方法，要以所述液體不溢出 孔的傾角把持所述平板，并將移液器尖端幾乎徑直插至所述孔的底部以移出液體，而只留 下最少量的殘余。但是因為所述細胞易于被移液器移出，操作必需小心以防止擾動細胞單 層細胞。如下文方法所述，建議樣本、標準物和對照物各做三份。因為溶液3的粘性和難 于在所述孔中達到充分混合，將+10%所述試劑的三份總體積(33μ1)移至+10%溶液 3 (330 μ 1)所需的三份體積中，徹底混合，并分別將110μ 1移至三份孔中。在單層細胞的制備中(例如，在微孔板的所述孔內(nèi))，優(yōu)選在孔內(nèi)平均分布所述細 胞。因此，為了避免細胞分布不均勻，應(yīng)在無振動生物安全櫥中將細胞懸液移至所述孔中。 在平板中的全部孔中接受了細胞后，蓋上所述平板并將其小心的置于穩(wěn)固、無震動的表面 上30分鐘，以允許所述細胞不受干擾的附著至孔底。這有助于確保在各孔中存在均勻分布 的細胞。實施例實施例1 用于測試的CHO-RIuc細胞的制備在所述實驗中，由在測試方法中使用的W-25 CHO-R細胞制備CHO-Rluc細胞，以檢 測在格雷夫斯病患者中的TSI。獲得耐嘌呤霉素的細胞池，并測試應(yīng)答牛TSH的光輸出。在 下文所述實驗中選擇具有最高光輸出的克隆使用。CHO-Rluc細胞在細胞培養(yǎng)瓶(例如Τ-225瓶)中，在含有Ham' sF-12培養(yǎng)基、 10% FBS(56°C加熱30分鐘以滅活補體)、2mM谷氨酰胺和IX非必需氨基酸的生長培養(yǎng)基 中生長。將所述培養(yǎng)瓶在35 37°C、含有5% 二氧化碳的濕潤氣氛中培養(yǎng)。在所述細胞培養(yǎng)物匯合時，從各培養(yǎng)瓶中吸走培養(yǎng)基，并用無Ca和Mg++的HBSS洗 滌所述單層細胞。然后，將7ml 0.25%胰蛋白酶/ImM EDTA溶液添加到各培養(yǎng)瓶中，并允 許其與單層細胞在室溫下反應(yīng)約5 10分鐘，以分離和分散所述細胞成為幾乎單細胞的懸 液。然后將所述細胞懸液在300 400 X g下離心約5分鐘，隨后移出上清，并用由4ml含有
291 XHBSS和20% FBS的EMEM與4ml 7令凍保護培養(yǎng)基(含有1 XHBSS和15% DMSO的EMEM) 混合所制備的8ml培養(yǎng)基重懸沉淀的細胞。然后使用等分的各細胞懸液確定懸液中存在的細胞數(shù)?？墒褂矛F(xiàn)有技術(shù)已知的任 何方法(包括但不限于使用血球計數(shù)器確定細胞數(shù)量的方法)完成所述確定。因此，希望 可使用任何方法確定懸液中的細胞數(shù)?；趹乙褐械募毎麛?shù)，等分所述細胞至2 X IO6細胞 而裝進標準冷凍瓶中。然后將所述細胞在-90°C冷凍保存以用于短期的保存。對于長期保 存而言，應(yīng)在液氮(約-200°C )中保存所述細胞。實施例2 =CHO-Rluc泖I定平板的制備和測試在所述實驗中，在用于診斷格雷夫斯病的診斷中使用如實施例1所制備的 CHO-Rluc細胞。為制備用于測試的24群單層細胞，首先通過添加50 100 μ 1 0.1%明膠 溶液(Sigma)處理在96孔微孔板中的24個孔，以增強細胞附著至測試所選擇的24個孔底 部。經(jīng)室溫培養(yǎng)約1分鐘后，從各孔中通過吸走移出所述明膠溶液。注意可在所述孔中保 留明膠長于1分鐘。所述明膠用于用膠原包被所述孔，以便所述細胞更快速的附著至所述 孔，且更快速的達到匯合。然而，細胞可在無明膠下接種和生長，且仍表現(xiàn)良好。將如實施例1制備的CHO-Rluc細胞冷凍瓶在37°C水浴中迅速解凍，以提供用移 液器良好混合的約0.4ml細胞懸液。然后將細胞添加到2. 5ml GM(也稱為“接種培養(yǎng)基”) 中，通過振蕩1 2秒以充分混合，并將100 μ 1等分的細胞懸液添加到每一個孔中，然后蓋 上平板。優(yōu)選在各孔中產(chǎn)生均勻分布的細胞。因此，為了避免不均勻的細胞分布，應(yīng)將微孔 板放在無震動櫥中以用于細胞接種和細胞附著至微孔板的壁上。然后在35 37°C、含有 5% CO2的濕潤氣氛中培養(yǎng)接種細胞約20 24小時以允許所述細胞形成幾乎或完全匯合 的單層細胞。然后盡可能完全地從各孔中吸出所述GM，要小心而不擾動單層細胞(即，匯合的 單層細胞保留在孔中)。用約100 μ 1/孔的饑餓培養(yǎng)基(含有Ca++(0. 14g/L)和Mg++(0. 048g/ L)的HBSS)漂洗所述單層細胞。吸出所述饑餓培養(yǎng)基，然后將100 μ 1新鮮的饑餓培養(yǎng)基添 加到各孔中。重要的是進行所述過程要足夠快，從而細胞單層細胞不變干。然后將所述平 板在35 37°C、5% CO2、濕潤的培養(yǎng)箱中過夜溫育。經(jīng)溫育后，從孔中吸出饑餓培養(yǎng)基，要 小心操作以避免擾動單層細胞。然后，將約100μ 1刺激培養(yǎng)基添加到各單層細胞中，同樣 迅速操作以便單層細胞不變干。然后，在上述替代性方法中，將10μ 1患者的、對照的和TSH標準溶液添加至適當(dāng) 的孔中。用稀釋液(即HBSS-NaCl+222mM蔗糖)稀釋TSH標準物和IgG樣品。在0、10、 100、1000和5000 μ IU的濃度下測試所述TSH標準物。稀釋患者樣品至IOmg蛋白/ml的濃 度以用于測定。因為所述刺激培養(yǎng)基是粘性的，懸液的充分混合是重要的。通過顯微鏡檢 單層細胞確定混合的充分性。將所述平板在35 37°C、5% CO2、濕潤的培養(yǎng)箱中過夜溫育 4小時。小心的從各孔中吸出培養(yǎng)基，并將150 μ 1裂解溶液(Promega)添加到各孔中。所 述裂解溶液含有25mM撲化-磷酸鹽？!17.8、21111二氨基環(huán)己四乙酸(⑶TA)、2mM 二硫蘇糖醇 (DTT)、10%甘油和Triton X-100。然后將所述平板在室溫溫育30分鐘以允許單層細 胞裂解。裂解后，使用移液器吸頭刮和攪拌各孔。然后，從各孔中移出25 μ 1裂解產(chǎn)物，并 放在光度計管中(12 X 75mm，聚丙烯)，然后添加50 μ 1的熒光素酶底物(Promega)。將管振 蕩1 2秒，并使用5秒延遲和10秒讀取的設(shè)置確定RLU/sec值。從全部測試平均值中減去“0 TSH"(即陰性對照)樣品的平均值，以獲得平均凈值。實施例3 IgG樣品的制備在所述實驗中，制備患者IgG用于在本發(fā)明方法中的測試。38個熟知和表征 的未治療的格雷夫斯病患者的凍干IgG樣品由Dr.B.Y. Cho(D印artment of Internal Medicine, Seoul National University, College of Medicine, Seoul, Korea)友情提供。 因為大多數(shù)樣品已通過使用CHO-R和FRTL-5細胞的標準方法進行了測試，這些測試結(jié)果對 于所述35個樣品是已知的。在用于凍干的制劑中，使用現(xiàn)有技術(shù)已知的蛋白A-瓊脂糖CL-4B柱親和純化所述 IgG，然后在4°C下，在100倍體積的蒸餾水中透析。在兩天的時間內(nèi)每8小時更換所述透析 水。通過在4°C、1500Xg離心15分鐘來去除變性蛋白后，凍干所述IgG，并保存在-20°C直 到在本文所述的實驗中使用。在一些實驗中，用正常的血清(在下文的實施例7中所述的甲狀腺機能正常的血 清)稀釋純化的未治療的格雷夫斯病IgG，并使用下文所述的CHORluc測定對其進行測定。實施例4 =CHO-Rluc 測定在所述實驗中，評估CHO-Rluc細胞的表現(xiàn)使用Evans等(Evanset al.，J. Clin. Endocrinol. Metabol. ,84 =374(1999))所述方法。吸出如實施例2所述的在96孔微孔 板中使用的24孔的單層細胞的培養(yǎng)基，并用100 μ 1含有10%經(jīng)活性炭解吸的小牛血清 (charcoal-strippedcalf serum) (Sigma)的 Ham' s F-12 培養(yǎng)基代替，然后在 35 37°C、 含有5% CO2的濕潤氣氛中過夜培養(yǎng)。然后，將10 μ 1稀釋至一定濃度(例如0、10、100和1000 μ IU)范圍的牛TSH標準 物和格雷夫斯病IgG(在經(jīng)活性炭解吸的小牛血清中溶解至IOmg蛋白/ml的濃度)添加到 各四重復(fù)孔中?；旌细骺字械膽乙?，并將所述平板在35 37°C、含有5% CO2的濕潤氣氛 中溫育4小時。然后從各孔中吸出培養(yǎng)基，并將150 μ 1裂解緩沖液(Promega，如上所述) 添加到各孔中。然后將所述平板在室溫溫育30分鐘以允許孔中細胞裂解。隨后，將25μ1 裂解產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到12X75聚乙烯光度計管中，而就在混合及以5秒延遲和10秒讀取的設(shè)置 在光度計中讀取前添加50 μ 1的熒光素酶底物(Promega)。光度計讀取以相對光單位/秒 (RLU/sec)提供的結(jié)果。從各讀取結(jié)果中減去陰性或“0”TSH標準值。在一輪實驗中，OyU/ ml TSI標準物的平均凈值為68，011RLU/sec，而含有10 μ IU/ μ 1的樣品的結(jié)果為4031RLU/ sec，含有1000 μ IU的樣品的結(jié)果為222，801RLU/sec, 一個格雷夫斯病IgG測試樣品結(jié)果為 384RLUTsec (樣品#1)，且另一格雷夫斯病IgG測試樣品結(jié)果為-3012RLU/sec (樣品#9)。使用標準FRTL-5細胞和cAMP RIA測定對格雷夫斯病IgG樣品#1和樣品#9先 進行了測定。在cAMP測定中，認為用FRTL-5細胞所得的值高于153為TSI存在陽性。用 FRTL-5細胞所得的樣品#1的cAMP值為212，和樣品#9的cAMP值為803。所述相同樣品 (#1和#9)的CHO-R值分別為116和1733，在測定系統(tǒng)中，認為當(dāng)CHO-R值高于173為格雷 夫斯病陽性。因此，所述結(jié)果清楚的表明對格雷夫斯病的檢測而言，使用不同的細胞系獲得 的結(jié)果之間有差異。實際上，對兩個IgG樣品而言，Evans等人的方法的使用產(chǎn)生了陰性結(jié) 果，這表明盡管對牛TSH的反應(yīng)非常好，使用CHO-Rluc的所述系統(tǒng)在檢測人TSI是無用的。此外，在開發(fā)本發(fā)明期間(如上所述)，確定如果在含有經(jīng)活性炭解吸的小牛血清 的培養(yǎng)基中接種培養(yǎng)CHO-Rluc細胞24小時(即，以達到匯合)，所述細胞只附著到孔的底
31部，但不在培養(yǎng)期間增殖且匯合，這與使用正常FBS的情況不同。因此，所述出人意料的結(jié) 果表明在培養(yǎng)基中經(jīng)活性炭解吸的血清的使用導(dǎo)致了細胞的饑餓過程，這與在5H培養(yǎng)基 中FRTL-5細胞的培養(yǎng)有些類似。在純化的一些實驗中，在CHO-RIuc測定(使用peg)中測試用正常血清稀釋的未 治療格雷夫斯病的 IgG。IgG #10(2mg/ml)的 RLU/sec 值為 131，461、IgG#15 (2mg/ml)的 RLU/sec 值為 180，327、IgG#27 (5mg/ml)的 RLU/sec 值為 179，777、和 IgG#32 (5mg/ml)的 RLU/sec指為112，627。所述結(jié)果清楚地表明在血清存在下CHO-Rluc測定可測量TSI。實施例5 培養(yǎng)基配方的研制鑒于上述實驗，研究不同培養(yǎng)基配方的效果以在用CHO-Rluc細胞測量牛TSH和人 TSI中使用。在所述實驗中，使用bTSH標準物和從格雷夫斯病患者的血清中提取的IgG，以 所述CHO-Rluc測定中的“饑餓”和“刺激”過程測試各種培養(yǎng)基配方。在所述實驗中，一旦在96孔微孔板的孔中含有的單層細胞(如上所述)達到匯 合，通過吸走移出生長培養(yǎng)基，并將100 μ 1饑餓培養(yǎng)基添加到各單側(cè)細胞。然后將所述平 板在35 37°C、含有5% CO2的濕潤氣氛中培養(yǎng)16 24小時，以饑餓或調(diào)節(jié)細胞。然后 從孔中吸出饑餓培養(yǎng)基。為了進行測定，將10 μ 1的患者樣本IgG、bTSH標準物和IgG對照物(正常和格雷 夫斯病血清)以三個平行的方式添加到單層細胞中。在各孔中混合懸液，并在上述條件下 培養(yǎng)4小時。通過吸走從各單層細胞移出所述液體，并將150 μ 1裂解緩沖液(Promega，如 上所述)添加到各孔中。允許在室溫溫育所述平板30分鐘，以裂解單層中的細胞。為了測量由針對TSH受體的TSH標準物或抗體導(dǎo)致的細胞刺激量，通過添加25μ 1 裂解產(chǎn)物到已添加了 50 μ 1底物溶液(Promega)的光度計管中來測量在細胞裂解產(chǎn)物中的 熒光素酶。混合所述懸液，然后以5秒延遲和10秒讀取的設(shè)置在光度計中讀取，以確定各 樣品的RLU。為了使用TSI或TSH刺激的細胞，通過吸走移出饑餓培養(yǎng)基，并將100 μ 1刺 激培養(yǎng)基添加到各孔中。刺激培養(yǎng)基為HBSS--NaCl+222mM蔗糖。下述的表2提供了 HBSS-NaCl+222mM蔗糖配方和標準HBSS配方的比較。表2 =HBSS培養(yǎng)基配方比較 所述刺激培養(yǎng)基配方為在FRTL-5和CHO-R細胞中TSI的測量中常用的配方。在下述的表3中指明了測試各種饑餓培養(yǎng)基配方的實驗結(jié)果。在所述實驗中，使 用了 HBSS-NaCl+222mM蔗糖刺激培養(yǎng)基。如表3所述，含有20mM蔗糖的標準HBSS產(chǎn)生了 最好的信噪比(即最低的背景值和最高的格雷夫斯病IgG值)。表3 各種培養(yǎng)基(生長對饑餓)的RLU/Sec a. CHO GM為含有10% FBS的CHO生長培養(yǎng)基。b. CHO Char為含有10%經(jīng)活性炭解吸的小牛血清的CHO生長培養(yǎng)基。c.饑餓培養(yǎng)基。實施例6 =PEG的使用因為PEG可用于體外抗原/抗體反應(yīng)以促進或提高反應(yīng)速率，進行了在刺激培養(yǎng) 基中加入PEG的實驗。因為所述化合物可降低抗原/抗體復(fù)合物的解離速率或解離，研究 了本發(fā)明方法中PEG的使用。用含12% PEG-8000 (即平均MW 8000)的HBSS—NaCl蔗糖得到的初步結(jié)果導(dǎo)致了 具有提高的細胞間空間的單層細胞。測試了在HBSS-NaCl+lllmM蔗糖中的6%PEG-8000以 降低明顯的滲透壓。在所述實驗中，使用了產(chǎn)生最好結(jié)果的饑餓培養(yǎng)基(即HBSS+20mM蔗 糖)。在下述的表4中顯示了結(jié)果。表4 含和不含PEG的刺激培養(yǎng)基的RLU/Sec結(jié)果
33 如表4所示，6% PEG-8000的加入顯著并實質(zhì)性地提高了來自CHO-Rluc細胞應(yīng)答 添加的bTSH和格雷夫斯病IgG的發(fā)光信號。進行了另一個實驗以確定PEG-8000的優(yōu)化濃度以在刺激培養(yǎng)基中使用。在表5 中顯示了具有957的FRTL-5 cAMP值的一格雷夫斯病樣品(格雷夫斯病IgG #20)的凈值。 如圖5所示，6% PEG產(chǎn)生了格雷夫斯病TSAb的最大信號。表5 各種PEG濃度的RLU/Sec值 隨后的實驗顯示饑餓培養(yǎng)基不需要含有20mM蔗糖，因為在含或不含20mM蔗糖的 結(jié)果中無數(shù)據(jù)上的顯著差異。另外，可進行實驗證明本發(fā)明的測定以劑量依賴性方式測量了甲狀腺刺激性免疫 球蛋白。在所述實驗中，測試了三種格雷夫斯病IgG樣品(#6、#11和#16)，使用了含有6% PEG-8000的刺激培養(yǎng)基和上文所述的方法制備了連續(xù)3倍稀釋液。在圖1顯示了結(jié)果，其 顯示了稀釋液的線性關(guān)系。由10mg/ml的儲液制備所述IgG樣品，然后用未稀釋的和連續(xù)稀 釋(3 倍稀釋)至 0. 3333,0. 1111,0. 0371,0. 0123 和 0. 0041 的稀釋液(即產(chǎn)生了 3. 333mg/ ml，然后對其進行3倍稀釋產(chǎn)生了 1. lllmg/ml等)對其進行測試。IgG 樣品 #6 的 FRTL-5 值為 2080，而 IgG 樣品 #11 的 FRTL-5 值為 4453，及 IgG 樣 品#16的值為830。下面的表6列出了所述樣品的各結(jié)果。IgG樣品#6的相關(guān)系數(shù)(r)為 0. 857，樣品#11的為0. 858，及樣品#16的為0. 995。表6 格雷夫斯病IgG樣本的劑量依賴(稀釋)曲線* *全部值以RLU/sec報告。實施例7 使用PEG的另一方案在所述實驗中，測試了使用PEG的另一方案。首先，解凍冷凍瓶中的CHO-Rluc細 胞，在生長培養(yǎng)基中稀釋(向各細胞瓶的內(nèi)容物添加至2. 5ml培養(yǎng)基)，并將100 μ 1所述細 胞懸液添加到如上所述制備的96孔微孔板中的24個各明膠包被孔。將所述平板在35 37°C、含有5% CO2的濕潤氣氛中培養(yǎng)20 24小時。這提供了松散匯合的單層細胞。移出生長培養(yǎng)基并用100 μ 1饑餓培養(yǎng)基(含有Ca++和Mg++的正常HBSS)漂洗單 層細胞，并將最終100 μ 1添加到各單層細胞，然后在上文所述的條件下過夜培養(yǎng)。經(jīng)培養(yǎng) 后，移出饑餓培養(yǎng)基，并將100 μ 1含有6% PEG(如上所述)的饑餓培養(yǎng)基添加到各單層細 胞。然后，將10 μ 1的各標準物和樣品放入所述孔中(做三個平行)。雖然測試了其他體 積(如，25μ1、50μ1和75μ1)，所得值與用10 μ 1所獲得的值基本上相等。因此，使用了 更小的體積以節(jié)約樣品和試劑，并使一些血清樣品中存在的潛在干擾物質(zhì)濃度最小?；旌峡字谐煞?，并如上文所述培養(yǎng)單層細胞4小時(即刺激步驟)。從各孔中移 出培養(yǎng)基并添加150 μ 1裂解溶液(如上文所述)到各孔中。允許單層細胞在室溫培養(yǎng)30 分鐘以發(fā)生裂解。然后，添加25μ 1各裂解產(chǎn)物到單獨的光度計管中，在各管中添加50μ 1 的熒光素酶底物(如上文所述)，混合所述內(nèi)容物，并在光度計中用5秒延遲和10秒讀取的 設(shè)置迅速讀取所述管。在一要確定甲狀腺機能正常的血清的正常范圍的實驗中，使用上文所述的 CHO-Rluc測定對從參照實驗室獲得的24個樣本進行實驗。所述血清是甲狀腺機能正常的， 鑒于此，全部樣品都未提交以用于甲狀腺測試。計算了所述24個甲狀腺機能正常的樣品的 平均值(55, 334RLU/sec)和標準偏差(1SD 7，434RLU/sec)。所述結(jié)果如圖7所示。然后將 所述SD值乘以3，從而產(chǎn)生了正常、非格雷夫斯病的77，636RLU/sec的臨界值。所述臨界值 涵蓋> 99%的正常人群；認為高于此臨界值的為TSI陽性。在一單獨組的實驗中，根據(jù)上述方案使用CHO-Rluc細胞測試了 17個患者樣本，其 預(yù)先通過商品化的體內(nèi)測試實驗室使用cAMP RIA和FRTL-5細胞測試了 TSI。FRTL-5測 試結(jié)果顯示16個患者樣本為TSI陰性(即只有一個為陽性)。如圖7所示，通過FRTL-5/ cAMP測定(258%或1.98X臨界值，其中測定的臨界值為130%)鑒定的單個陽性樣本在 基于77，636RLU/sec的2. 45X臨界值的CHO-Rluc測定(190，691RLU/sec)中同樣為陽性。 發(fā)現(xiàn)通過FRTL-5/cAMP測定為陰性(即正常)的16個患者樣本的CHO-Rluc值與用于建立 測定的正常范圍的24個正常血清保持良好的吻合。見圖7。實施例8 =CHO-Rluc方法和標準方法的比較在所述實驗中，將利用含有6% PEG-8000的刺激培養(yǎng)基的本發(fā)明方法與使用標準 的含有HBSS的饑餓培養(yǎng)基和刺激培養(yǎng)基的方法進行比較以獲得從Dr. Cho獲得的35個未 治療的格雷夫斯病IgG樣本的熒光素酶值。與圖2、3和4中CHO-R熒光素酶結(jié)果相比較顯 示了由Dr. Cho用使用本發(fā)明方法所用的相同IgG樣品的FRTL-5和CHO-R細胞獲得的cAMP 值。圖5示熒光素酶應(yīng)答bTSH的線性結(jié)果。圖2提供了 CHO-Rluc熒光素酶結(jié)果與FRTL_5cAMP結(jié)果的比較。此圖表明這些方 法的相關(guān)性相當(dāng)好。圖3提供了 CHO-Rluc熒光素酶結(jié)果與CHO-R cAMP結(jié)果的比較。所 述CHO-R CAMP臨界值為173。低于此臨界值的值(CHOluc RLU/sec)如下110 (219，913)、113 (14，434)、116 (25，373)、152 (84，493)、156 (7576)、和 161 (61，321)。如此圖所示，與 CHO-Rluc的值相比，CHO-R cAMP結(jié)果的范圍相對窄。這在提供了 CHO-R cAMP結(jié)果與FRTL-5 cAMP結(jié)果比較的圖4中也有顯示。所述CHO-R值為173。所述FRTL-5臨界值為153。低 于臨界值的值如下(FRTL-5 值)110 (830)、113 (283)、116 (212)、152 (1100)、156 (388)、和 161 (335)。在圖2所示的測試結(jié)果中的IgG對照(ICN)的平均+/-SD值為472+/_4015(n =8)。圖5示所述CHO-Rluc細胞應(yīng)答bTSH的線性結(jié)果。在所述實驗中，測試了 bTSH的 稀釋液。獲得的RLU/sec值如以下表7所示。表7 :bTSH稀釋液的結(jié)果 認為應(yīng)答bTSH的線性和靈敏性結(jié)果被證明在抗TSH受體的阻斷性抗體的檢測中 有用(例如，在萎縮性甲狀腺炎和橋本甲狀腺炎患者中的自身抗體阻斷TSH受體，從而阻止 甲狀腺激素的產(chǎn)生，且釋放導(dǎo)致了甲狀腺功能減退)。此圖也提供了為什么所述CHO-R細胞 系對來自格雷夫斯病患者血清的TSI不如所述FRTL-5細胞系靈敏的部分解釋。在所述結(jié) 果中，相關(guān)系數(shù)(r)為0.9925。三個S. D.(標準偏差)的靈敏性為1.3 μ IU TSH/ml。實施例9 免疫應(yīng)答的監(jiān)測在所述實驗中，測量和監(jiān)測了疫苗受者的免疫應(yīng)答。盡管不希望如此限制本發(fā)明， 所述例子描述了受試者對單純皰疹病毒(HSV)疫苗的免疫應(yīng)答的監(jiān)測。在施用疫苗前，從受試者收集血清樣品(即預(yù)免疫血清)用作基準或?qū)φ?，并冷?保存直至進行測試。在施用疫苗后也定期(例如接種后1 2周、1個月、2個月等)收集 血清樣品。需要時解凍所述血清并在測定中使用以確定中和抗體的存在和量(即滴度)。 連續(xù)稀釋血清并用已知量的HSV混合。用包含Eagle' s MEM的稀釋劑稀釋所述樣品，所 述Eagle' s MEM含有HBSS，所述HBSS含有2mM谷氨酰胺、2% FBS和PEG(例如6% PEG 8000)。但是，也希望在本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)適用于使用的病毒和測定系統(tǒng)的其他稀釋劑，其包括 含有不同濃度和類型PEG的稀釋劑。添加所述樣品到包含能產(chǎn)生用HSV感染后產(chǎn)生的酶 (如3-半乳糖苷酶)的細胞(如ELVIS 細胞、DiagnosticHybrids)的單層細胞中。在標 準的細胞培養(yǎng)條件下經(jīng)過夜培養(yǎng)后，裂解單層細胞，并使用顯色或發(fā)光方法測量所述酶活 性。通過在樣品中中和HSV的接種后血清的最低稀釋指示對疫苗的陽性反應(yīng)。(即通 過低OD或發(fā)光值指示并與預(yù)免疫對照比較)總之，本發(fā)明提供了超越現(xiàn)有技術(shù)的大量進步和優(yōu)點，包括了放射性的避免并與 易用性、可靠性、靈敏性、特異性、有成本效益和可重復(fù)性的優(yōu)勢組合。實施例10 構(gòu)津嵌合TSH-R質(zhì)粒此實施例呈現(xiàn)了構(gòu)建包含用于檢測格雷夫斯病自身抗體的嵌合TSH-R受體的細 胞系。
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質(zhì)粒構(gòu)津?qū)幋aTSH-R嵌合受體的第一核酸序列和編碼新霉素抗性基因的第二核酸 序列的質(zhì)粒連接到熒光素酶基因和糖蛋白激素α亞基啟動子。人糖蛋白α亞基啟動子克降使用QIAGEN RNA/DNA試劑盒(QIAGEN Cat#14123)從人胚胎腎細胞分離染色體 DNA。使用分離的染色體DNA作為PCR模板及使用如下2對寡核苷酸引物通過PCR擴增糖 蛋白α亞基啟動子片段5' PCR 引物5' -GAGCTC ATG TGT ATG GCT CAA TAA AAT TACGTA CAA AGT GAC AGC-3‘3' PCR 引物5' -AGATCT TCG TCT TAT GAG TTC TCA GTA ACTGCA GTA TAA TGA AGT-3‘在5' PCR引物的5'端添加Sac I限制性內(nèi)切酶位點，而在3 ‘ PCR引物的 5'端添加Bgl II限制性內(nèi)切酶位點(都是下劃線所示的序列)。使用BD Advantage 2 Polymerase Mix (BD Bioscience Palo Alto CA) fflT PCRifJ!, ^^^ififft (Eppendorf Mastercycler Personal,Germen)中進行PCR反應(yīng)。在熱循環(huán)儀中進行40個循環(huán)，每個循 環(huán)為在94°C 30秒使DNA變性，然后在63°C 30秒使樣品退火至引物，并在68°C 1分30 秒誘導(dǎo)延伸。兩個擴增產(chǎn)物(1. 2kb和0. 6kb)被克隆進質(zhì)粒載體pcDNA2. 1 (Invitrogen, Carlsbad，CA)，并在ABI377 自動測序儀(Davis Sequencing Inc.)上用 BigDye Terminator v3.0循環(huán)測序方法測序。質(zhì)粒pGHP/Luc的構(gòu)建通過用Sac I和Bgl II限制性酶切從載體pcDNA2. 1分離人糖蛋白α亞基啟動 子。然后將所得的316bp片段亞克隆進pGL2增強子質(zhì)粒(Promega，Madison，WI)的Sac I/ Bgl II位點以構(gòu)建名為pGHP/Luc的質(zhì)粒。質(zhì)粒pMc4_neo的構(gòu)建從載體pMCl (Stratagene Cedar Creek，TX)用 Xho I 和 HicII 限制性酶切分離 用于抗生素篩選(陽性克隆篩選)的新霉素抗性基因。然后將所得的片段亞克隆進包含由 SV40啟動子驅(qū)動的TSHR/LH嵌合受體的質(zhì)粒pMc4 (來自Dr. Leonard Kohn)的Xba I位點。 最終的質(zhì)粒命名為pMc4-ne0。質(zhì)粒pMc4_Bsd的構(gòu)建將從載體pCMV/Bsd (Invitrogen，Carlsbad，CA)用 Xho I 和 XbaI 限制性酶切分離 的抗生素篩選基因Blastocidin亞克隆進包含TSHR/LH嵌合受體的質(zhì)粒pMc4的Xba I位 點。(Tahara et al., “ Immunoglobulins From Graves‘ Disease Patients Interact WithDifferent Sites On TSH Receptor/LH/CG Receptor Chimeras ThanEither TSH Or Immunoglobulins From Idiopathic MyxedemaPatients " Biochem Biophys Res Comm 179 :70-77(1991))。最終的質(zhì)粒命名為 pMc4_Bsd。質(zhì)粒pMc4_GHP/Luc 的構(gòu)建經(jīng)SmaI和AccI的限制性酶切從載體pMc4/Luc中分離具有螢火蟲熒光素酶報告 基因的人糖蛋白α亞基啟動子。然后將分離的DNA片段亞克隆進pMc4-ne0質(zhì)粒的PfoI 位點。最終的質(zhì)粒命名為pMV4-GHP/Luc。
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實施例11 哺乳動物細胞篩誅測試了七種不同的哺乳動物細胞系以篩選具有最低的環(huán)AMP基礎(chǔ)水平和最高的 潛在誘導(dǎo)水平的細胞系。所述結(jié)果證明CHO和RD細胞系顯示最低的環(huán)AMP基礎(chǔ)水平和最 高的潛在誘導(dǎo)水平。通過細胞培養(yǎng)類型的合適篩選，所述實驗研究方法可使測定靈敏性最 大化。例如，較低的環(huán)AMP基礎(chǔ)水平提高了熒光素酶測定的靈敏性。環(huán)AMP的最高誘導(dǎo)表 達也提高了熒光素酶測定的準確性。實施例12 用嵌合TSH-R質(zhì)粒轉(zhuǎn)染/篩詵CHO細胞系所述實施例描述了 CHO細胞的永久轉(zhuǎn)染。使用HyFect (Denville Scientific, Metuchen, NJ.)依據(jù)廠家說明用線性化 (Xmnl)的pMc4-GPH/熒光素酶質(zhì)粒轉(zhuǎn)染中國倉鼠卵巢細胞系(CH0-K1 ；ATCC號CCL-61， Manassas VA)。然后在含有10% (ν/ν)胎牛血清和9種必需氨基酸的Ham' s F12培養(yǎng)基 中、在37°C、含有5% CO2的濕潤氣氛中培養(yǎng)所述CHO-Kl細胞。轉(zhuǎn)染后24小時，合并所述 細胞，并將其接種在96孔板中，且用在含有10% FBS的Ham' s F12培養(yǎng)基中的0. 5mg/ml G418篩選。t施例13 用嵌合TSH-R質(zhì)粒轉(zhuǎn)染/ f帝詵RD細胞,系所述實施例描述了用兩種質(zhì)粒pGHP/Luc和pMc4-Bsd接連轉(zhuǎn)染人橫紋肌肉瘤(RD) (ATCC號CCL-136)細胞系以輔助檢測。使用HyFect (Denville Scientific, Metuchen, NJ.)根據(jù)廠家說明用線性化的 pGPH/Luc(Scal)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染RD細胞。用0. 5mg/ml的新霉素篩選所述細胞。然后用線性化的 pMc4-Bsd質(zhì)粒轉(zhuǎn)染從所述轉(zhuǎn)染和篩選而來的優(yōu)化克隆。在轉(zhuǎn)染后，用新霉素(0. 5mg/ml)和 blasticidin(5 μ g/ml)篩選所述細胞，以生產(chǎn)最終RD重組細胞系。用TSI陽性和正常血清測試全部CHO和RD抗生素抗性克隆，以篩選可用于檢測 TSI的克隆。所述TSI誘導(dǎo)性陽性克隆經(jīng)過有限稀釋法克隆化以進一步篩選單克隆。最終的克隆具有以比市場上現(xiàn)有產(chǎn)品更高的靈敏性診斷格雷夫斯病和/或監(jiān)測 患有格雷夫斯病的患者的藥物治療的能力。所述細胞系顯示了良好的穩(wěn)定性，其傳代超過 了 10次，但其繼續(xù)顯非常相似的行為特征。實施例14 用含有TSI的血清誘導(dǎo)細胞系稀釋來自冷凍瓶的細胞，并將其在生長培養(yǎng)基(含有10% (ν/ν)胎牛血清和9種 必需氨基酸的Ham' s F12培養(yǎng)基)中，在37°C和5% CO2的條件下培養(yǎng)16小時。16小時 后移出培養(yǎng)基，并用100 μ 1/孔的“饑餓"HBSS培養(yǎng)基漂洗CHO細胞和給CHO細胞重新喂 液。然后將CHO細胞培養(yǎng)22 24小時。經(jīng)培養(yǎng)后，移出所述培養(yǎng)基，并用ΙΟΟμΙ/孔的反 應(yīng)緩沖液漂洗CHO細胞和給CHO細胞重新喂液。然后在37°C和5% CO2的條件下用在含有 BSA、PEG、蔗糖、葡萄糖和鹽的反應(yīng)緩沖液(Diagnostic Hybrids貨號40_300500)中的患 者血清1 11稀釋液誘導(dǎo)CHO細胞4小時。將RD細胞在含有10% (ν/ν)胎牛血清的Eagle' s最小必需培養(yǎng)基(EMEM)中， 在37°C和5% CO2的條件下培養(yǎng)16 24小時。然后在37°C和5% CO2的條件下用在反應(yīng) 緩沖液(Diagnostic Hybrids貨號40_300500)中的患者血清直接誘導(dǎo)RD細胞4小時。在上文的說明書所提及的全部刊物和專利以引文的形式并入本文。在不背離本發(fā) 明的范圍和精神下本發(fā)明的方法和系統(tǒng)的各種修改和變化對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。盡管本發(fā)明結(jié)合特別優(yōu)選的實施方式進行了描述，應(yīng)了解本發(fā)明的權(quán)利要求不應(yīng) 過分限于所述的特定實施方式。實際上，希望本發(fā)明實行的對在診斷、細胞培養(yǎng)和/或相關(guān) 領(lǐng)域的對技術(shù)人員而言是明顯的所述的各種修改方式在下面權(quán)利要求的范圍內(nèi)。實施例15 地塞米松對饑餓的CH0-RMc41uc細胞的作用在5mlCH0 生長培養(yǎng)基中培養(yǎng) CHO-Rluc (041307A)和 CH0_RMc41uc (062707、P8、 3e6/ml)細胞。從所述細胞儲液中移出足量細胞，并等分成6管，以使用于CHO-Rluc測 定的孔中為66，666細胞/孔，且用于各地塞米松濃度(100、50、40、25、12. 5和ΟμΜ)的 CH0-RMc41uc測定的為50，000細胞/孔。在CHO生長培養(yǎng)基中地塞米松儲液為500 μ M。全 部地塞米松新鮮制備。所述瓶擰緊，并在具有不同濃度地塞米松的CHO生長培養(yǎng)基中培養(yǎng) 所述細胞。然后將細胞培養(yǎng)24小時，用饑餓培養(yǎng)基漂洗，然后將其在含有地塞米松的相同饑 餓培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時。然后用反應(yīng)緩沖液漂洗所述細胞，并添加血清(稀釋比1 11) 到孔中已有的100 μ 1反應(yīng)緩沖液。使用的血清為:i)參照121506R;ii)PC 121506P ；和 iii)患者#18 TSI血清。參照和患者#18血清都經(jīng)過相同的處理并都與6種濃度的地塞米 松溫育。在4小時的培養(yǎng)后，用75 μ 1 Bright Glo 對所述平板進行裂解，裂解5分鐘，然 后在Veritas光度計上讀取。實施例16 饑餓期與地塞米松處理的比較制備9個人血清樣品，其中已知4個樣品為格雷夫斯病陽性且已知5個樣品為格 雷夫斯病陰性。在非饑餓/地塞米松方案和饑餓方案的各條件下測試9個樣品的每一個。1.非饑餓/地塞米松方案使用CH0-RMc4方案分析3個細胞板。板1 :CH0-Mc41uc細胞(4e6細胞/板)+在 CH0-Mc4反應(yīng)緩沖液中含有40 μ M地塞米松的生長培養(yǎng)基。板2 :CH0-RMc41uc細胞(4e6細 胞/板)+在CH0-Mc4反應(yīng)緩沖液中無40 μ M地塞米松的生長培養(yǎng)基。板3 =CHO-Rluc細胞 (4e6細胞/板)+在CHO-Rluc反應(yīng)緩沖液中無40 μ M地塞米松的生長培養(yǎng)基。各平板都經(jīng)歷16小時的生長階段、3小時的誘導(dǎo)階段和10分鐘的裂解階段。2.饑餓方案使用CHO-R方案分析3個平板。板1 :CH0_RMc4細胞(4e6細胞/板)+在CH0_Mc4 反應(yīng)緩沖液中含有40 μ M地塞米松的生長培養(yǎng)基。板2 :CH0-RMC41UC細胞(4e6細胞/板)+ 在CH0-Mc4反應(yīng)緩沖液中無40 μ M地塞米松的生長培養(yǎng)基。板3 =CHO-Rluc細胞(4e6細胞 /板)+在CHO-Rluc反應(yīng)緩沖液中無40 μ M地塞米松的生長培養(yǎng)基。完全相同的設(shè)定各方 案的樣品安排。見圖16。各平板都經(jīng)歷24小時的生長階段、24小時的饑餓階段、4小時的誘導(dǎo)階段和5分 鐘的裂解階段。使用Veritas光度計測量各樣品的發(fā)光度。^mm IT所述實施例提供的數(shù)據(jù)顯示提高CH0-RMc4測定的靈敏性不限于用依據(jù)實施例16 的地塞米松(Dex)代替饑餓培養(yǎng)基階段。所述數(shù)據(jù)證明4種替代性糖皮質(zhì)激素(GC)在提 高信號強度上有等量的效果。在所述研究中檢查了 4種GC :i)潑尼松(Sigma) ；ii)氫化可的松(Sigma) ；iii)
39丙酸氟替卡松(Sigma)和iv)可的松(Sigma)。在DMSO中制備儲液濃度(IOOmM)的各GC。 然后從IOOmM儲液中用DMSO制成1 IO(IOmM)和1 100 (ImM)的稀釋液。全部DMS0/GC 儲液是澄清的且無可見的沉淀。制備含有不同濃度的各GC的生長培養(yǎng)基如下i) 100 μ M GC培養(yǎng)基5 μ LlOOmM GC 儲液+5mL SR097 (w/o Dex) ； )50μΜ GC 培養(yǎng)基2. 5yL IOOmM GC 儲液+5mL SR097 (w/ ο Dex) ；iii)10yMGC 培養(yǎng)基5yL IOmM GC 儲液+5mL SR097 (w/o Dex) ；iii)lyMGC 培養(yǎng) 基5 μ L ImM GC 儲液 +5mL SR097 (w/o Dex)和 iv) 0. 1 μ MGC 培養(yǎng)基0· 5 μ L ImM GC 儲液 +5mL SR097 (w/o Dex)。將40 μ M地塞米松對照與所述的各種濃度的替代性糖皮質(zhì)激素進 行比較。其他的對照包括含有1 μ 1/ml 二甲基亞砜(DMSO)的生長培養(yǎng)基作為溶劑對照和 無任何糖皮質(zhì)激素的生長培養(yǎng)基。通過對各測試的糖皮質(zhì)激素使用2個微孔板進行各測定。各平板的樣品安排如下 所示A.板 1 B.板 2 提交的原始數(shù)據(jù)如下。見表8。表8 替代性糖皮質(zhì)激素_原始數(shù)據(jù)
權(quán)利要求
方法，其包括a)提供i)包含穩(wěn)定轉(zhuǎn)染編碼嵌合TSH受體和熒光素酶基因的載體的細胞系；ii)源自疑似患有格雷夫斯病的患者的血清樣品；和iii)包含糖皮質(zhì)激素的細胞培養(yǎng)基；b)在熒光素酶基因發(fā)出可檢測信號的條件下使所述血清樣品接觸所述細胞系和所述培養(yǎng)基。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述方法還包括步驟c)測量信號強度，其中所述強度與存 在于所述樣品中的促甲狀腺激素受體自身抗體濃度相關(guān)。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述接觸還包含聚乙二醇。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述嵌合TSH受體包含源自大鼠絨毛膜促性腺激素受體的 氨基酸序列。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述氨基酸序列包含對應(yīng)于人TSH受體氨基酸序列的 262 335氨基酸殘基的73個氨基酸。
6.試劑盒，其包含嵌合TSH受體和能檢測血清TSH自身抗體的熒光素-熒光素酶系統(tǒng)， 其中所述系統(tǒng)包含糖皮質(zhì)激素。
7.權(quán)利要求6的試劑盒，其中所述試劑盒還包含能表達所述嵌合TSH受體和所述熒光 素-熒光素酶系統(tǒng)的細胞系。
8.權(quán)利要求6的試劑盒，其中所述試劑盒還包含聚乙二醇。
9.權(quán)利要求6的試劑盒，其中所述嵌合TSH受體和所述熒光素-熒光素酶系統(tǒng)由載體編碼。
10.權(quán)利要求7的試劑盒，其中所述細胞系選自CH0細胞和RD細胞。
11.方法，其包括a)提供i)疑似含有甲狀腺刺激性自身抗體的測試樣品； )包含在測試手段中的含有糖皮質(zhì)激素的培養(yǎng)細胞，其中所述細胞表達嵌合TSH受 體和熒光素_熒光素酶系統(tǒng)，和 iii)聚乙二醇；b)在使用所述熒光素_熒光素酶系統(tǒng)可檢測到所述甲狀腺刺激性抗體的條件下使所 述測試樣品接觸所述培養(yǎng)細胞和所述聚乙二醇；及c)觀察可檢測的甲狀腺刺激性抗體的存在。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述培養(yǎng)細胞選自RDluc和CHORluc細胞。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述觀察使用光度計進行。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述熒光素_熒光素酶系統(tǒng)測定cAMP濃度。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述方法還包含培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基選自生長培養(yǎng)基和 刺激培養(yǎng)基。全文摘要
本發(fā)明提供在自身免疫疾病診斷和管理中有用的方法和組合物。尤其，本發(fā)明提供在格雷夫斯病診斷和管理中使用的方法和組合物。本發(fā)明的方法不僅避免了對放射性物質(zhì)的需要，且比傳統(tǒng)使用的格雷夫斯病診斷方法更簡單、經(jīng)濟和快速，也提高了先前的基于熒光素酶的自身抗體檢測測定的靈敏性和檢測能力。所述改良基于在包括但不限于地塞米松的糖皮質(zhì)激素存在下，包含嵌合TSH受體的測定的優(yōu)良性能。
文檔編號C12Q1/66GK101918585SQ200880115000
公開日2010年12月15日 申請日期2008年9月24日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月1日
發(fā)明者D·斯庫爾, G·納珀里塔諾, J·L·布朗, L·科恩, Y·李 申請人:診斷混合公司