專利名稱：固定在固體載體上的洛伐他汀酯酶、酶固定化的方法、固定化酶的應(yīng)用、生物催化流動反 ...的制作方法
固定在固體載體上的洛伐他汀酯酶、酶固定化的方法、固定 化酶的應(yīng)用、生物催化流動反應(yīng)器以及制備和/或純化辛
伐他汀的方法本發(fā)明涉及固定在不溶于水的固體載體上的洛伐他汀酯酶、酶固定化的方法、固 定化酶的應(yīng)用、生物催化流動反應(yīng)器以及制備和/或純化辛伐他汀的方法。辛伐他汀和洛伐他汀屬于命名為他汀類的羥基-3-甲基-戊二酰輔酶A(HMG-CoA) 還原酶抑制劑類化合物。他汀類顯著地降低了冠狀動脈疾病、腦中風(fēng)和外周動脈粥樣硬化 的風(fēng)險。它們通過減少膽固醇沉積，穩(wěn)定動脈粥樣硬化斑塊，改善血管內(nèi)皮功能，抑制平滑 肌細(xì)胞的生長和遷移，同時對凝血、纖溶以及血小板活性也具有有益效果，并且還顯示抗 炎作用[Tobert J. A.等人，Journal of Clinicallnvestigations, 1982, April, 69 (4), 913-919 ；Pedersen Τ.等人，Lancet(1994)344，1383-89 ;Czynniki Ryzyka. Kwartalnik PolskiegoTowarzystwa Badan nad Miazdzycqi (Risk Factors. Polish Society ofAtherosclerosis Research Quarterly)2003,40,5-13]。使用土曲霉(Aspergillus terreus)菌株經(jīng)發(fā)酵制備了洛伐他汀——式I的化合 物。由洛伐他汀半合成制備了辛伐他汀——式II的化合物，其具有較洛伐他汀更高的藥理 學(xué)活性以及更低的毒性。 美國專利第4，582，915號公開了一種制備辛伐他汀的方法，該方法根據(jù)下列方案
修飾洛伐他汀側(cè)鏈。 對洛伐他汀進(jìn)行加堿水解，并在仲胺存在下用強(qiáng)堿例如正丁基鋰、繼之以甲基化 劑(如甲基碘)處理所形成的鉀鹽。所得到的轉(zhuǎn)化不超過95%。辛伐他汀以其純形式的分 離是困難的，原因在于殘留的洛伐他汀污染物原則上僅能借助于HPLC進(jìn)行分離。在辛伐他汀鹽存在下，洛伐他汀酯酶有可能選擇性地水解洛伐他汀鹽。該酶是通 過成菌絲真菌(Clonostachys compactiuscula) (ATCC 38009，ATCC 74178)產(chǎn)生的。在轉(zhuǎn) 化成銨鹽后，對辛伐他汀和洛伐他汀的混合物進(jìn)行洛伐他汀酯酶催化的酶水解反應(yīng)，引起 選擇性地水解洛伐他汀鹽成“三醇”，而不觸動辛伐他汀鹽。在酸性環(huán)境下酸混合物的內(nèi)酰 化導(dǎo)致形成可通過結(jié)晶化分離的內(nèi)酯混合物。使用天然洛伐他汀酯酶進(jìn)行酶水解反應(yīng)導(dǎo)致酶損失，增加了將洛伐他汀轉(zhuǎn)化為辛 伐他汀的成本。盡管有可能使用來自Clonostachyscompactiuscula培養(yǎng)物的全細(xì)胞物質(zhì)， 但是其使產(chǎn)物的分離變得復(fù)雜。在固體載體上固定化酶使其避免這些不便成為可能。Ostaszewski R.等人， Biotechnology(2006,888-892)披露了在不溶于水的固體載體上嘗試固定洛伐他汀酯酶。 盡管如此，所獲得的催化劑仍呈現(xiàn)低活性，并且該固定化酶的特征在于缺乏或顯著降低的 與辛伐他汀相比對洛伐他汀水解的選擇性，即酶處理導(dǎo)致洛伐他汀和辛伐他汀兩者均被水解。本發(fā)明的目的在于提供固定在不溶于水的固體載體上的洛伐他汀酯酶、酶固定化 的方法、固定化酶的應(yīng)用、生物催化流動反應(yīng)器以及制備和/或純化辛伐他汀的方法。根據(jù)本發(fā)明，固定在不溶于水的固體載體上的洛伐他汀酯酶，其特征在于該酶共 價連接于用至少雙官能偶合試劑活化的固體載體，在辛伐他汀和/或其鹽存在下，固定化 的洛伐他汀酯酶展示其對洛伐他汀及其鹽的水解活性較對辛伐他汀及其鹽的水解活性至少高5倍。優(yōu)選地，固體載體是多糖或改性多糖。多糖尤其是聚半乳糖苷。特別地，改性多糖 是二 -(Ch6烷基)氨基-Cu烷基纖維素，尤其是二乙氨乙基纖維素。優(yōu)選地，固體載體是硅膠或改性硅膠。特別地，改性硅膠是用氨基-CV6烷基-三 ((V6烷氧基)硅烷改性的硅膠，尤其是氨丙基硅烷化硅膠。優(yōu)選地，活化固體載體的至少的雙官能試劑是式,Y、的化合物，其中Y表 示-SO2-或-SO2-(CHR)n-SO2-,其中η表示1_18的整數(shù)，R表示氫原子或CV6烷基，或
表 示-SO2-Ar-SO2-,其中Ar表示通過取代直接結(jié)合芳環(huán)碳原子的兩個氫原子所形成的二價芳 基，該二價芳基任選地帶有Cp6烷基取代基。特別地活化固體載體的至少的雙官能試劑是 式,
、的化合物，其中Y表示-S02-。優(yōu)選地，活化固體載體的至少的雙官能試劑是氰尿酰鹵和/或鄰磺酸氰尿酸酯。 特別地，活化固體載體的至少的雙官能試劑是氰尿酰鹵，尤其是氰尿酰氯。優(yōu)選地，固體載體是聚半乳糖苷，以及活化固體載體的至少的雙官能試劑是式 ,
、的化合物，其中γ表示-so2-。優(yōu)選地，固體載體是二乙氨乙基纖維素，以及活化固體載體的至少的雙官能試劑
是氰尿酰氯。優(yōu)選地，固體載體是氨丙基硅烷化硅膠，以及活化固體載體的至少的雙官能試劑
是氰尿酰氯。特別地，所述酶是Clonostachys compactiuscula ATTC 38009, ATCC 741川產(chǎn)生 的酶。根據(jù)本發(fā)明，一種在不溶于水的固體載體上固定化洛伐他汀酯酶的方法，其特征 在于使用機(jī)械攪拌，將氰尿酰商與處于溶劑中的固體載體接觸，通過過濾分離活化的固體 載體，干燥活化的固體載體并將其懸浮于含洛伐他汀酯酶的水混合物中，直至該酶固定化， 通過過濾分離懸浮物質(zhì)，用緩沖液洗滌并干燥。優(yōu)選地，多糖或改性多糖被用作固體載體。特別地，改性多糖是二 -(Cp6烷基)氨 基-Cp6烷基纖維素，尤其是二乙氨乙基纖維素。優(yōu)選地，硅膠或改性硅膠被用作固體載體。特別地，用氨基-Cp6烷基-三(Cp6烷 氧基)硅烷改性的硅膠，尤其是氨丙基硅烷化硅膠被用作改性硅膠。優(yōu)選地，所使用的氰尿酰鹵是氰尿酰氯。具體地，使用高壓釜處理的固體載體。任選地，所使用的機(jī)械攪拌是振蕩。優(yōu)選地，在用緩沖液洗滌前用水洗滌濾過物質(zhì)。特別地，在堿和/或緩沖液存在下將氰尿酰鹵與固體載體接觸。所使用的含酶水溶液尤其是從Clonostachys compactiusculaATTC 38009，ATCC 74178中提取的物質(zhì)的蛋白級分。根據(jù)本發(fā)明，一種在不溶于水的固體載體上固定化洛伐他汀酯酶的方法，其特征 在于使用機(jī)械攪拌，將式
、的化合物與處于溶劑中的固體聚半乳糖載體接觸，其中 Y表示-SO2-或-SO2-(CHR)n-SO2-,其中η表示1_18的整數(shù)，R表示氫原子或C^6烷基，或Y 表示-SO2-Ar-SO2-,其中Ar表示通過取代直接結(jié)合芳環(huán)碳原子的兩個氫原子所形成的二價芳基，該二價芳基任選地帶有(V6烷基取代基，通過過濾分離活化的固體載體，干燥活化的 固體載體并將其懸浮于含洛伐他汀酯酶的水混合物中，通過過濾分離懸浮物質(zhì)，用緩沖液 洗滌并干燥。優(yōu)選地，式,
的化合物是其中Y表示-SO2-的化合物。具體地，振蕩被用作機(jī)械攪拌。在用緩沖液洗滌前，任選地用水洗滌過濾的物質(zhì)。所使用的含酶水溶液尤其是從Clonostachys compactiusculaATTC 38009，ATCC 74178中提取的物質(zhì)的蛋白級分。根據(jù)本發(fā)明，固定在不溶于水的固體載體上的洛伐他汀酯酶用于制備和/或分離 和/或純化辛伐他汀。優(yōu)選地，該酶用于從具有洛伐他汀的混合物中純化和/或分離辛伐他汀。特別地，在辛伐他汀銨鹽存在下，酶用于選擇性地水解洛伐他汀銨鹽成三醇鹽。以 分批處理的方式，在辛伐他汀銨鹽存在下，該酶被任選地用于選擇性地水解洛伐他汀銨鹽 成三醇鹽。以連續(xù)處理的方式，在辛伐他汀銨鹽存在下，該酶被尤其用于選擇性地水解洛伐 他汀銨鹽成三醇鹽。根據(jù)本發(fā)明，帶有床的生物催化流動反應(yīng)器，其特征在于其包含反應(yīng)器本體，該本 體具有連接液體進(jìn)口和液體出口的內(nèi)部空間，在該內(nèi)部空間中存在含固定化的洛伐他汀酯 酶的床。優(yōu)選地，該床包含固定在不溶于水的固體載體上的酶，該酶共價連接于用至少雙 官能偶合試劑活化的固體載體。特別地，固體載體是多糖或改性多糖。多糖尤其是聚半乳糖苷。特別地，改性多糖 是二 -(Ch6烷基)氨基-Cu烷基纖維素，尤其是二乙氨乙基纖維素。優(yōu)選地，活化固體載體的至少的雙官能試劑是式,
、的化合物，其中Y表 示-SO2-或-SO2-(CHR)n-SO2-,其中η表示1_18的整數(shù)，R表示氫原子或CV6烷基，或Y表 示-SO2-Ar-SO2-,其中Ar表示通過取代直接結(jié)合芳環(huán)碳原子的兩個氫原子所形成的二價芳 基，該二價芳基任選地帶有Cp6烷基取代基。特別地活化固體載體的至少的雙官能試劑是 式,
、的化合物，其中Y表示-S02-。優(yōu)選地，活化固體載體的至少的雙官能試劑是氰尿酰鹵和/或鄰磺酸氰尿酸酯。 特別地，活化固體載體的至少的雙官能試劑是氰尿酰鹵，尤其是氰尿酰氯。優(yōu)選地，固體載體是聚半乳糖苷，以及活化固體載體的至少的雙官能試劑是式
、的化合物，其中Y表示-S02-。優(yōu)選地，固體載體是二乙氨乙基纖維素，以及活化固體載體的至少的雙官能試劑
是氰尿酰氯。所述酶尤其是由Clonostachys compactiuscula ATTC 38009, ATCC 741川產(chǎn)生的酶。根據(jù)本發(fā)明，一種制備和/或純化辛伐他汀的方法，包括用洛伐他汀酯酶處理含 殘留量的洛伐他汀鹽的辛伐他汀鹽溶液，直至水解洛伐他汀形成三醇，分離該三醇，并分離 基本上不含洛伐他汀的辛伐他汀，其特征在于使含殘留量的洛伐他汀鹽的辛伐他汀鹽溶液 與固定在不溶于水的固體載體上的洛伐他汀酯酶接觸。
優(yōu)選地，酶共價地連接于用至少的雙官能偶合試劑活化的固體載體。優(yōu)選地，固體載體是多糖或改性多糖。多糖尤其是聚半乳糖苷。特別地，改性多糖 是二 -(Ch6烷基)氨基-Cu烷基纖維素，尤其是二乙氨乙基纖維素。優(yōu)選地，固體載體是硅膠或改性硅膠。特別地，改性硅膠是用氨基-CV6烷基-三 ((V6烷氧基)硅烷改性的硅膠，尤其是氨丙基硅烷化硅膠。優(yōu)選地，活化固體載體的至少的雙官能試劑是式
的化合物，其中Y表 示-SO2-或-SO2-(CHR)n-SO2-,其中η表示1_18的整數(shù)，R表示氫原子或CV6烷基，或Y表 示SO2-Ar-SO2-，其中Ar表示通過取代直接結(jié)合于芳環(huán)碳原子的兩個氫原子所形成的二價 芳基，該二價芳基任選地帶有CV6烷基取代基。特別地活化固體載體的至少的雙官能試劑 是式
的化合物，其中Y表示-so2-。優(yōu)選地，活化固體載體的至少的雙官能試劑是氰尿酰鹵和/或鄰磺酸氰尿酸酯。 特別地，活化固體載體的至少的雙官能試劑是氰尿酰鹵，尤其是氰尿酰氯。優(yōu)選地，固體載體是聚半乳糖苷，以及活化固體載體的至少的雙官能試劑是式
的化合物，其中Y表示-so2-。優(yōu)選地，固體載體是二乙氨乙基纖維素，以及活化固體載體的至少的雙官能試劑
是氰尿酰氯。優(yōu)選地，固體載體是氨丙基硅烷化硅膠，以及活化固體載體的至少的雙官能試劑
是氰尿酰氯。特別地，在26°C _50°C的溫度下進(jìn)行含殘留量的洛伐他汀鹽的辛伐他汀鹽溶液與 固定在不溶于水的固體載體上的酶的接觸。尤其是，在流動反應(yīng)器中連續(xù)進(jìn)行含殘留量的洛伐他汀鹽的辛伐他汀鹽溶液與固 定在不溶于水的固體載體上的酶的接觸。特別地，所述酶是由Clonostachys compactiuscula ATTC38009, ATCC 74178產(chǎn)生 的酶。酶的固定化使之有可能在適當(dāng)調(diào)節(jié)的處理參數(shù)下重復(fù)再利用相同的酶，而不損失 其活性。非常重要的是因為增強(qiáng)了對蛋白水解降解的抗性，因此容許進(jìn)行該處理而不使用 防腐條件，從而顯著降低了成本。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，固定化酶包含在流動反應(yīng)器中。該反應(yīng)器供給有含 15%洛伐他汀和85%辛伐他汀的他汀混合物。這是一種在化學(xué)合成過程中所獲得的典型的 混合物。辛伐他汀鹽濃度的改變不超過1%，而洛伐他汀銨鹽則以約87%被水解。在長時 間的水解過程中轉(zhuǎn)化水平并不改變，并且工藝穩(wěn)定性保持至少6個月。因此，洛伐他汀酯酶 的固定化提供了一種穩(wěn)定的生物催化劑，其展示了足以用于辛伐他汀合成的工藝應(yīng)用的穩(wěn) 定性。附圖中示出了了根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案，其中

圖1表示根據(jù)本發(fā)明的生物催化流 動反應(yīng)器的橫截面圖，以及圖2表示關(guān)于溫度的洛伐他汀轉(zhuǎn)化水平的改變。在本發(fā)明說明書及專利權(quán)利要求書通篇 中，術(shù)語“三醇”指式III的化合物， 其中M表示氫原子，以及其中M也表示金屬陽離子或銨陽離子，即該化合物分別以 游離酸形式或以鹽形式存在，如果不另有說明的話。由于以游離酸形式(M = H)存在的化 合物III容易被內(nèi)酯化，因此術(shù)語“三醇”還可包括式IV的內(nèi)酯-二醇形式，如果不另有說 明的話。 術(shù)語“洛伐他汀”和“辛伐他汀”分別指式I和II的化合物。 在本發(fā)明說明書及專利權(quán)利要求書通篇中，術(shù)語“洛伐他汀”和“辛伐他汀”還包 含這些化合物的羧酸形式，分別具有式IV和V(M = H)， 以及式IV和V的化合物的鹽形式，如果不另有說明的話。“洛伐他汀鹽”表示式IV 的化合物，其中M表示金屬陽離子或銨陽離子，以及“辛伐他汀鹽”表示式V的化合物，其中 M表示金屬陽離子或銨陽離子。在本發(fā)明說明書及專利權(quán)利要求書通篇中，“洛伐他汀酯酶”指具有酶活性的天然 的或重組來源的細(xì)胞或非細(xì)胞物質(zhì)，該酶活性為催化洛伐他汀及其鹽的水解形成上述定義的三醇或其鹽，而在類似的條件下，辛伐他汀鹽不經(jīng)受酶水解或以低至少一個數(shù)量級的速 度經(jīng)受酶水解。在本發(fā)明說明書及專利權(quán)利要求書通篇中，不溶于水的固體載體指粒狀或纖維狀 的固體載體，其在水中大體上不溶解，即其不形成液體溶液或包含多于0. Ig載體/IOOg水 的假水溶液(pseudo-solution)。在本發(fā)明說明書及專利權(quán)利要求書通篇中，酶活性表示用1毫克酶在1分鐘內(nèi)水解的底物(洛伐他汀或辛伐他汀)的微摩爾量。在本發(fā)明說明書及專利權(quán)利要求書通篇中，蛋白級分表示通過純化生物學(xué)制備所 獲得的混合物的一部分，在該部分中所測定的蛋白的總濃度大于0。洛伐他汀酯酶對洛伐他汀及其鹽的水解活性表示其水解洛伐他汀及其鹽形成上 述定義的三醇的能力。洛伐他汀酯酶對辛伐他汀及其鹽的水解活性表示其水解辛伐他汀及其鹽形成上 述定義的三醇的能力。與洛伐他汀酯酶對辛伐他汀及其鹽的水解活性相比，洛伐他汀酯酶對洛伐他汀及 其鹽的水解活性至少高一個數(shù)量級。在固體載體上，特別地在不溶于水的固體載體上固定 化洛伐他汀酯酶后，該活性可被改變。在理論上考慮到不限制本發(fā)明的范圍，可設(shè)想由于將 上述定義的酶化學(xué)結(jié)合在固相表面，因此可能發(fā)生酶空間構(gòu)型的固定化，從而改變酶活性 中心的相對定位。因此洛伐他汀酯酶的水解活性以及在固體載體上固定化后的酶活性可能 不同于該酶在水混合物中的活性。這樣的差異以其自身在固體載體上固定化后水解活性的 選擇性損失和/或降低活性而得以表現(xiàn)。出乎意料地發(fā)現(xiàn)不溶于水的固體載體和至少雙官能偶合試劑的特定組合容許獲 得在不溶于水的固體載體上固定化的酶，在辛伐他汀和/或其鹽存在下，該酶展示其對洛 伐他汀及其鹽的水解活性較對辛伐他汀及其鹽的水解活性至少高5倍，在這里酶具有足夠 的活性以應(yīng)用于從具有洛伐他汀的混合物中純化和/或分離辛伐他汀。通過根據(jù)本發(fā)明的方法，使用式
的至少的雙官能試劑，其中Y表 示-SO2-或-SO2-(CHR)n-SO2-,其中η表示1_18的整數(shù)，R表示氫原子或CV6烷基，或Y表 示-SO2-Ar-SO2-,其中Ar表示通過取代直接結(jié)合于芳環(huán)碳原子的兩個氫原子所形成的二價 芳基，該二價芳基任選地帶有Cp6烷基取代基，將洛伐他汀酯酶固定在聚半乳糖例如瓊脂糖 (優(yōu)選地Siipharose Β4)床上。優(yōu)選地，活化固體載體的試劑是式
的化合物，其中 Y表示-so2-，即二乙烯基砜。根據(jù)本發(fā)明，該聚半乳糖固體載體活化的方法在于將載體與式
的化合 物，優(yōu)選二乙烯基砜接觸，導(dǎo)致形成活化的固體載體。然后，利用機(jī)械攪拌，使用緩沖液將根 據(jù)已知方法制備的含洛伐他汀酯酶的混合物與該活化的固體載體接觸，超過足以將酶固定 在固體載體上的一段時間。在固定化后，通過過濾分離所獲得的生物催化劑，優(yōu)選用水和/或緩沖液洗滌。接著，將根據(jù)本發(fā)明的固定化酶用于純化和/或分離辛伐他汀的過程中。將使用二乙烯基砜作為偶合試劑固定在固體載體上的酶用于含15%洛伐他汀和 85%辛伐他汀的他汀混合物的水解反應(yīng)中。這是一種在通過化學(xué)合成由洛伐他汀制備辛伐 他汀的過程中所獲得的典型的混合物。已設(shè)計并制造了在圖1中以橫截面圖呈現(xiàn)的流動反 應(yīng)器用于進(jìn)行該反應(yīng)。根據(jù)本發(fā)明的流動反應(yīng)器包含反應(yīng)器本體1，該本體1具有連接液體進(jìn)口 3和液體出口 4的內(nèi)部空間2。內(nèi)部空間2充滿含固定化酶的床5。通過經(jīng)液體進(jìn) 口 3進(jìn)料洛伐他汀和辛伐他汀銨鹽混合物溶液并從液體出口 4接收流出物，連續(xù)進(jìn)行水解 處理。通過HPLC分析連續(xù)的流出物部分，證實了相對于初始濃度在處理過程中辛伐他汀鹽 的濃度的改變沒有超過1%。洛伐他汀銨鹽的水解度為至少87%。在連續(xù)進(jìn)行120小時的 處理過程中轉(zhuǎn)化水平?jīng)]有改變，證實了根據(jù)本發(fā)明的帶有含固定化洛伐他汀酯酶的床5的 流動反應(yīng)器能有效地用于從含辛伐他汀和洛伐他汀的他汀混合物中制造、分離和/或純化 辛伐他汀的方法。反應(yīng)器在+4 °C貯藏6個月后，通過重復(fù)涉及水解含15%洛伐他汀和85%辛伐他汀 的他汀混合物的實驗，檢查根據(jù)本發(fā)明的反應(yīng)器的工藝穩(wěn)定性。通過經(jīng)液體進(jìn)口 3進(jìn)料洛 伐他汀和辛伐他汀銨鹽混合物溶液并從液體出口 4接收流出物，連續(xù)進(jìn)行水解處理。通過 HPLC分析連續(xù)的流出物部分，證實了相對于初始濃度在處理過程中辛伐他汀鹽的濃度的改 變沒有超過1%。洛伐他汀銨鹽的水解度為至少96%。列于表3中的數(shù)據(jù)表明流動反應(yīng)器 的貯藏時間對其性能無顯著影響。在25小時內(nèi)，洛伐他汀的轉(zhuǎn)化實際上沒有改變，證實了 根據(jù)本發(fā)明的固定化酶保留了其在辛伐他汀鹽存在下水解洛伐他汀鹽的活性以及選擇性。 因此，在固體載體上固定化酶提供了一種具有足以用于制造、分離和/或純化辛伐他汀的 方法中的穩(wěn)定性的穩(wěn)定的生物催化劑。在根據(jù)本發(fā)明的在固體載體上固定化酶的方法的另一個實施方案中，活化不溶于 水的固體載體，例如用氨基-Ch6烷基-三(Ch6烷氧基)硅烷改性的硅膠，優(yōu)選用氨丙基甲 硅烷基改性的硅膠。將至少雙官能活化試劑，優(yōu)選氰尿酸衍生物(1，3，5_三嗪-2，4，6-三 醇衍生物)，例如氰尿酰鹵，或其中至少兩個羥基被鹵素取代基或鄰磺酸酯基團(tuán)例如氰尿酰 鹵和/或鄰磺酸氰尿酸酯所取代的氰尿酸衍生物，用于該活化。通過用氰尿酸衍生物溶液處理，活化用氨基-Cp6烷基-三(Cp6烷氧基)硅烷改 性的硅膠，然后懸浮于緩沖液中并添加含洛伐他汀酯酶的混合物，伴隨機(jī)械攪拌，超過足以 將酶固定在固體載體上的一段時間。使用未純化的酶以及通過色譜法純化的酶進(jìn)行該固定 化。通過使用氨丙基硅烷化硅膠作為優(yōu)選的固體載體以及氰尿酰氯作為優(yōu)選的偶合試劑， 發(fā)現(xiàn)使用純化的酶給予了更高的酶固定化效率。此外，使用未經(jīng)純化的酶獲得的根據(jù)本發(fā) 明的固定化酶展示了較使用純化的酶獲得的根據(jù)本發(fā)明的固定化酶低的活性。
在根據(jù)本發(fā)明的固定化酶的方法的另一個實施方案中，活化不溶于水的固體載 體，例如用二-(Ch6烷基)氨基-Cp6烷基改性的纖維素。此類固體載體的實例是二乙氨乙 基纖維素。至少雙官能活化試劑被用于活化，其優(yōu)選是氰尿酸的衍生物(1，3，5_三嗪_2，4， 6-三醇衍生物)，其中至少兩個羥基被鹵素取代基或鄰磺酸酯基團(tuán)例如氰尿酰鹵和/或鄰 磺酸氰尿酸酯所取代。任選地在堿存在下，使用氰尿酸衍生物溶液活化用二 _ ((V6烷基)氨基-Cp6烷基 改性的纖維素以產(chǎn)生活化的固體載體。將該固體載體懸浮于緩沖液中并添加含洛伐他汀酯 酶的混合物，伴隨機(jī)械攪拌，超過足以將酶固定在固體載體上的一段時間。然后，將根據(jù)本 發(fā)明的該固定化酶用于辛伐他汀的制備、分離和/或純化的過程中。使用氰尿酰氯作為偶合試劑，將在用二乙氨乙基改性的纖維素上固定化酶，并將 該酶用于洛伐他汀和辛伐他汀的他汀混合物、他汀銨鹽混合物的水解中，以便在幾小時內(nèi) 給出非常高的洛伐他汀鹽至三醇的轉(zhuǎn)化(> 99% )。通過使用活化的固體載體二乙氨乙基纖維素獲得具有非常高的活性的固定在固體載體二乙氨乙基纖維素上的酶，該二乙氨乙基纖維素之前在高壓釜中進(jìn)行了退火熱處理。如圖1中所呈現(xiàn)的，將根據(jù)本發(fā)明獲得的固定化酶用作用于根據(jù)本發(fā)明的反應(yīng)器 的床。該反應(yīng)器被置于具有穩(wěn)定在28°C溫度的恒溫夾套中。水解過程連續(xù)進(jìn)行，經(jīng)液體進(jìn) 口 3供給有洛伐他汀和辛伐他汀銨鹽混合物的溶液并從液體出口 4收集流出物。每隔4小 時通過HPLC分析連續(xù)的流出物部分。在反應(yīng)器運(yùn)轉(zhuǎn)過程中，改變流速并記錄洛伐他汀轉(zhuǎn)化 改變。發(fā)現(xiàn)洛伐他汀轉(zhuǎn)化減少發(fā)生在流速超過極限流速(即洛伐他汀轉(zhuǎn)化為100%時的最 大流速)的時候。對于流速高于極限流速(當(dāng)轉(zhuǎn)化明顯低于極限流速時)，測定相對于反應(yīng) 器溫度的洛伐他汀轉(zhuǎn)化改變。在一系列溫度下進(jìn)行測量。結(jié)果以圖表示(圖2)。發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明固定在不溶于水的固體載體上的洛伐他汀酯酶在37°C顯示最高 的活性(圖2)。通過下列實施例更詳細(xì)地呈現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案。在下列實施例通篇中，術(shù) 語“LE酶”表示洛伐他汀酯酶。
實施例實施例1.酶的分離和純化LE 酶是以編號 ATCC 38009 保藏的真菌 Clonostachyscompactiuscula 產(chǎn)生的。根 據(jù)文獻(xiàn)(美國專利第5，223，415號)中所描述的方法收獲該真菌。la.從菌絲體中提取LE酶在液氮中用玻璃珠(0. 4g)研磨 Clonostachys compactiuscula 的菌絲體(59g)8 小時，然后用磷酸鹽緩沖液(60mL，pH = 6. 5)提取，并通過離心除去固體(12000rpm ； IOmin ;4°C)。分離上清液并重復(fù)用緩沖液(40mL)進(jìn)行提取的步驟。匯合上清液并經(jīng)定性 濾紙過濾產(chǎn)生IlOmL濾液，在下文中稱為上清液Xl (Cse= 4180yg/mL)。lb.通過鹽析活性蛋白級分純化洛伐他汀酯酶向上清液Xl (20mL)添加硫酸銨以達(dá)到40%的濃度(4. 62g，1小時，0°C )。然后將 溶液靜置1小時(0°C)，并離心(12000rpm;20min;4°C)。分離上清液并添加硫酸銨以達(dá) 到85%的濃度(6g ；1小時；O0C )，并離心(12000rpm ；20min ；4°C )。收集所產(chǎn)生的沉淀物 并溶解在磷酸鹽緩沖液(pH 7. 8 ；20mM ；0. 5mol NaCl)中得到0. 72mL的LE溶液，在下文中 稱為溶液 X2 (Cise= 2980 μ g/mL)，具有 6· 62 μ mol/min · mg 的比活。Ic.通過色譜法純化洛伐他汀酯酶用磷酸鹽緩沖液(pH = 6.5; lmL/min ；5小時)平衡裝有苯基瓊脂糖凝膠 6FF(Sepharose 6-fast flow) (26mL)的疏水相互作用柱。然后，將溶液X2 (15mL)上柱，用 磷酸鹽緩沖液(pH = 6.5 ；1. 4mL/min)、雙蒸水(1. 4mL/min)洗脫，收集含LE酶的級分。在 分離后，用磷酸鹽緩沖液(PH = 6.5；1. 4mL/min ；30min)再次沖洗柱子。合并含LE酶的活 性級分并添加碳酸鹽緩沖液(lmL，pH = 9. 4 ；50mmol)以產(chǎn)生12. 5mL溶液(Cge= 21 μ g/ mL)，進(jìn)一步稱為溶液X3，具有290 μ mol/mg. min的比活(通過HPLC測定的)。實施例2.在S印harose B4 (瓊脂糖凝膠)上固定化LE酶2a.固體載體的活化用水(20X 5mL)、磷酸鹽緩沖液(1/15M，pH = 5. 6，20 X 5mL)、水(20X5mL)、碳酸鹽緩沖液(50mmol,pH = 9. 6，20X5mL)洗滌 Sepharose B4(5mL)。干燥并分析 IOOmg 所獲
得的床樣品。IR(KBr) 3436(35 % )，2901 (60 % ), 1650(55 % ), 1474(55 % ), 1415(55 % )， 1376(50% )，1307(55% )，1250(55% )，1190(35% )，1157(35% )，1071(30% )，1042 (% )， 988 (55 % ), 966 (50 % ),931(40 % ),891(45 % ), 870 (60 % ), 788 (60 % ), 772 (55 % ), 741(50% ) ,716(50% ) ,693(50% ) ,538(50% ) ,483(50% ^cnT10元素分析確定C41. 61% ；H 6. 47% ；N 0. 0%。 將所獲得的固體載體懸浮于碳酸鹽緩沖液(10mL，50mmOlpH = 9. 6)中，添加二 乙烯基砜(lmL，IOmmol)并振蕩混合物70min。用水(20X5mL)、磷酸鹽緩沖液(20X5mL， 1/15Μ，ρΗ = 5. 6)、水(20X5mL)和碳酸鹽緩沖液(20 X 5mL，50mmol，pH = 9. 6)洗滌固體載 體。干燥并分析IOOmg所獲得的固體載體樣品。IR(KBr) 3436 (40 % ),2902(65 % ),1651 (55 % ),1475 (60 % ),1413 (55 % ), 1377(50 % ), 1302(60 % )，1251 (60 % )，1183(40 % )，1157(40 % ), 1076(30 % )， 1044(30 % ),988(60 % ),966 (60 % ),931(50 % ),891(60 % ),772(70 % ),741(70 % ), 715(70% ) cm_1o元素分析確定C43. 50% ；H 6. 76% ；N 0% ；S 0.88%。2b.在固體載體上固定化LE酶用水(20X5mL)、碳酸鹽緩沖液(5mL，50mM pH = 9.6)洗滌活化的固體載體， 并添加處于碳酸鹽緩沖液(0. 5mL,50mmol, pH = 9. 6)中的提取自微生物Clonostachys compactiuscula 的上清液 Xl (C 蛋白=21178 μ g/mL，活性=13. 2 μ mol/mg. mL)，然后振蕩 混合物18小時。通過過濾分離固體載體，懸浮于甘氨酸緩沖液(10mL，50mmOl，pH = 9. 6) 中，振蕩2小時，用水(20X5mL)、磷酸鹽緩沖液(20X5mL, l/15mol, pH = 5. 6)、再次用水 (20X5mL)和甘氨酸緩沖液(20X5mL，50mmol，pH = 9. 6)洗滌。固定了 910yg的蛋白。實施例3.以分批方式用固定在固體載體上的LE酶水解他汀銨鹽混合物將固定在固體載體S印harose B4(實施例2b中獲得的；干重9. 2mg)上的LE酶 懸浮于溶解于甘氨酸緩沖液(10mL，50mmOl，pH = 9.6)中的他汀銨鹽混合物(lmL，C_T|S| = 0. 8mg/mL)中。在30°C振蕩懸浮液90分鐘。通過過濾分離固定化的LE酶，并通過HPLC分 析測定對洛伐他汀銨鹽的水解活性(水解活性L)和對辛伐他汀銨鹽的水解活性(水解活性S)以及相應(yīng)的轉(zhuǎn)化。用水(5X5mL)洗滌固定化的LE酶，并重復(fù)水解分批處理。在4次 重復(fù)后，回收5. 7mg固定化的LE酶(在干燥至恒重后)。該生物催化劑的分析結(jié)果列于表 1中。表1 實施例4使用流動反應(yīng)器水解他汀銨鹽混合物使用IOmL的S印harose B4和來自實施例Ic的純化的LE酶的溶液X3 (C蛋白= 46. 1 μ g/mL，活性=56. lnmol/mg · min)，根據(jù)實施例3中所描述的方法進(jìn)行固定化。固定 了 123. Iyg的總蛋白。將所產(chǎn)生的生物催化劑用于制備流動反應(yīng)器。反應(yīng)器的本體是耐酸鋼管(例如用于制備高壓色譜柱的耐酸鋼管)，包含在液 體出口上游的橫截柱軸的多孔板，其支撐該本體。在該實施例中，使用具有3. 7mm直徑和 149mm長度的色譜柱(內(nèi)部空間體積1. 6mL)，其在底部用螺帽和玻璃料進(jìn)行保護(hù)，并在頂部 通過套圈延伸。將上述制備的固定化酶作為處于甘氨酸緩沖液(PH = 9.4，20mM，5mL)中 的懸浮液引入該裝置中。經(jīng)通過洗脫液(流速0. 4mL/min,甘氨酸緩沖液pH = 9. 4，20mM, 5mL)形成床。在達(dá)到穩(wěn)定的壓力以及穩(wěn)定的吸光度(如在λ = 254nm下通過UV檢測器 所測定的)后視為完成了床的形成。接著，移除延伸的套圈并用螺帽和玻璃料固定暴露的 床。經(jīng)通過甘氨酸緩沖液(pH = 9. 4，20mM, 5mL)對反應(yīng)器中的床中進(jìn)行老化(流速0. 4mL/ min) 。然后，以0. 4mL/min的流速將含15%洛伐他汀和85%辛伐他汀的他汀銨鹽混合物 引入反應(yīng)器中。每隔6小時取樣一次流出物并通過HPLC分析。重新計算為水解度的分析 結(jié)果匯總于表2中。在整個過程中，辛伐他汀鹽的濃度變化不超過1%。洛伐他汀銨鹽以約 87%被水解。該轉(zhuǎn)化在超過120小時后仍未改變。表2.在帶有含固定在固體載體上的LE酶的床的流動反應(yīng)器中他汀混合物的水解 實施例5.帶有含固定在固體載體上的LE酶的床的反應(yīng)器的技術(shù)穩(wěn)定性評價用緊固罩固定在實施例4中使用的流動反應(yīng)器的入口和出口，然后在4°C貯藏反應(yīng)器6個月。在穩(wěn)定化后，按照實施例4的步驟，反應(yīng)器再次用于水解他汀銨鹽混合物。洛 伐他汀鹽或辛伐他汀鹽的轉(zhuǎn)化結(jié)果匯總于表3中。表3.在帶有含固定在固體載體上的LE酶的床的流動反應(yīng)器中他汀混合物的水解 (該反應(yīng)器在4°C貯藏6個月后再次使用) 實施例6.使用氰尿酰氯在固體載體(硅膠)上固定化LE酶 6a.改性硅膠將硅膠(50g ；200-300目)置于燒結(jié)玻璃漏斗上并用硝酸(5%，15mL)和水(15mL) 沖洗。然后，用甲苯(210mL)沒過一部分的凝膠(30g)并通過蒸餾出共沸混合物(水-甲苯， 110°C;4小時)干燥。在冷卻至80°C后，添加(3-氨丙基)三甲氧基硅烷(6mL，34. 3mmol)， 并在80°C加熱混合物2小時。濾出所獲得的固體載體并用甲苯(20mL)、己烷(20mL)、四氫 呋喃(20mL)和甲苯再次(20mL)漂洗。在80°C干燥該物質(zhì)直至恒重以產(chǎn)生24g的固體載 體。元素分析確定C4. 99% ;H 1. 12% ；N 1.69%。6b.固體載體的活化和LE酶的固定化在12°C，將實施例6a中獲得的氨丙基硅烷化的硅膠(250mg，200-300目，每Ig 固體載體含Immol氨基)添加到處于二噁烷(5mL)和甲苯(ImL)混合物中的氰尿酰氯 (62. 8mg,0. 34mmol)的溶液中，并在振蕩器上振蕩3小時。濾出固體載體，用甲苯(15mL)和 丙酮(15mL)沖洗，并減壓干燥。將實施例Ia中獲得的上清液Xl (11. 5mL,C5e= 4180 μ g/ mL)添加到如此制備的固體載體中并在振蕩器上振蕩2. 5小時。濾出所獲得的生物催化劑 (在固體載體上的LE酶)并用碳酸鹽緩沖液(50mmol，pH = 9.4;5X5mL)洗滌以產(chǎn)生固定 化酶和濾液。固定化率為16%。將所獲得的生物催化劑用于水解他汀銨鹽混合物，超過90分鐘后得到7. 的洛 伐他汀轉(zhuǎn)化。所獲得的生物催化劑的選擇性> 100。使用非固定化酶(殘留于濾液中)進(jìn) 行水解反應(yīng)具有11. 5%的產(chǎn)率。實施例7.使用氰尿酰氯在固體載體(改性硅膠)上固定化LE酶在9°C下，將實施例6a中獲得的氨丙基硅烷化的硅膠(500mg，200-300目，每Ig 床含Immol氨基)添加到處于二噁烷(5mL)和甲苯(ImL)混合物中的氰尿酰氯(125. 9mg， 0. 68mmol)的溶液中，并在振蕩器上振蕩3小時。然后，濾出活化的固體載體，用甲苯(25mL) 和丙酮(25mL)漂洗，并減壓干燥。將活化的固體載體的一部分(250mg)懸浮于實施例Ic 中獲得的溶液X2 (11. 5mL, Cge= 21 μ g/mL)中，并在振蕩器上振蕩2. 5小時。濾出所獲得 的生物催化劑(在固體載體上的LE酶)并用碳酸鹽緩沖液(50mmol，pH = 9. 4，5X5mL)洗 滌以產(chǎn)生固定化酶和濾液。固定化率為52%。將所獲得的生物催化劑用于水解他汀銨鹽混合物，超過90分鐘后得到34. 1 %的洛伐他汀轉(zhuǎn)化。該生物催化劑的選擇性> 100。使用濾液所進(jìn)行的相同的反應(yīng)則根本沒有 發(fā)生，證實了 LE完全固定化在固體載體上。實施例8.使用氰尿酰氯在固體載體(改性硅膠)上固定化LE酶在9°C，將實施例6a中獲得的氨丙基硅烷化的硅膠(500mg，200-300目，每Ig 床含Immol氨基)添加到處于二噁烷(5mL)和甲苯(ImL)混合物中的氰尿酰氯(9. 3mg, 0. 05mmol)的溶液中，并在振蕩器上振蕩3小時。濾出活化的固體載體，用甲苯(25mL)和丙 酮(25mL)漂洗，并減壓干燥。然后，將該固體載體(250mg)懸浮于實施例Ic中獲得的LE 酶的溶液X3(11.5mL，Cse= 21yg/mL)中，并在振蕩器上振蕩2. 5小時。濾出所獲得的生 物催化劑并用碳酸鹽緩沖液(50mmol，pH = 9. 4，5X5mL)洗滌以產(chǎn)生固定化酶和濾液。固 定化率為52%。將所獲得的生物催化劑用于水解他汀銨鹽混合物，超過90分鐘后得到16. 3%的 洛伐他汀轉(zhuǎn)化。該生物催化劑的選擇性> 100。使用濾液所進(jìn)行的相同的反應(yīng)則根本沒有 發(fā)生，證實了 LE完全固定化在固體載體上。在上述他汀銨鹽混合物水解后，用碳酸鹽緩沖液(50mmol，pH = 9. 4，5X5mL)漂洗 生物催化劑并在4°C下貯藏7天。然后，將該生物催化劑再次用于水解他汀銨鹽混合物，超 過90分鐘后得到26. 的洛伐他汀轉(zhuǎn)化。該生物催化劑的選擇性> 100。實施例9.使用氰尿酰氯在固體載體(二乙氨乙基纖維素)上固定化LE酶 用水(IOmL)洗滌二乙氨乙基纖維素(0. 5g)，懸浮于氫氧化鈉溶液(lmol，IOmL) 中，振蕩(15min，250rpm)，過濾，用水(IOmL)洗并懸浮于二噁烷(IOmL)中。將氰尿酰氯 (lg,5. 4mmol)甲苯(IOmL)溶液添加到所獲得的懸浮液中。振蕩懸浮液(30min，250rpm)， 過濾，并用二噁烷(2 X IOmL)、乙酸/水/ 二噁烷(2/2/4mL)混合物、水(IOmL)、丙酮 (2X IOmL)漂洗沉淀物，并減壓干燥(0. 2tor)。將實施例Ic中獲得的溶液X3(13mL，比活 313 μ mol-mirT1 -mg"1)添加到活化的固體載體。在振蕩器上振蕩懸浮液18小時(250rpm)， 然后濾出生物催化劑，用水(2X IOmL)和碳酸鹽緩沖液(2X 10mL，50mmol，pH = 9. 4)洗滌。 固定化率為37. 2%。通過水解SmL他汀銨鹽混合物校核所獲得的固定化酶的活性，以獲得 Sllymol-min^-mg-1的比活值。該生物催化劑的選擇性> 100。在30°C下，將上述獲得的固定化的LE酶添加到處于碳酸鹽緩沖液(150mL， 50mmol,pH = 9. 4)中的辛伐他汀(294mg，0. 67mmol)和洛伐他汀(21. 7mg,0. 05mmol)的銨 鹽溶液，伴隨磁力攪拌(250rpm)。通過HPLC分析反應(yīng)進(jìn)程和水解選擇性。
表4.在用固定在用氰尿酰氯活化的二乙氨乙基纖維素上的LE酶催化的反應(yīng)中洛 伐他汀鹽的轉(zhuǎn)化 實施例10.使用氰尿酰氯在固體載體(二乙氨乙基纖維素)上固定化LE酶按照實施例9中所描述的方法，使用之前未經(jīng)初步純化的高壓釜處理的二乙氨乙 基纖維素以及具有61. 2 μ mol-min—1 · mg—1比活(L)的LE酶。根據(jù)實施例9中所描述的方法，將所獲得的固定化的LE酶用于制備性水解他汀銨 鹽混合物。表5.在用固定在用氰尿酰氯活化的二乙氨乙基纖維素上的LE酶催化的反應(yīng)中洛 伐他汀鹽的轉(zhuǎn)化 發(fā)現(xiàn)與固定在未經(jīng)高壓釜處理的纖維素上的酶LE相比，在固定化LE酶之前高壓 釜處理固體載體增加了 35%的生物催化劑活性。該生物催化劑的選擇性> 100。實施例11.使用流動反應(yīng)器水解他汀銨鹽混合物在一末端用玻璃料固定色譜柱本體(0.58cm直徑，9. 6cm長，2. 5mL內(nèi)部空間體 積)。將延伸套圈裝在另一末端上。將實施例9中獲得的固定化的LE酶作為處于碳酸鹽緩沖液(101^，50讓01，？!1 = 9.4，0.211^/1^ NaN3,0. 3mg/mL EDTA)中的懸浮液引入所獲得的裝 置中。在從玻璃料滴下緩沖液后，移除延伸套圈并用第二玻璃料固定暴露的床(床的量相 當(dāng)于由0. Sg 二乙氨乙基纖維素所獲得的產(chǎn)物的重量并含有0. 62mg的固定化的蛋白)。用 1 小時流量的碳酸鹽緩沖液(0. 4mL/min，50mmol，pH = 9. 4,0. 2mg/mL NaN3,0. 3mg/mL EDTA) 形成反應(yīng)器中的床。然后，將辛伐他汀(0. 74mg/mL)和洛伐他汀(0. 06mg/mL)的銨鹽溶液 泵送通過在28°C恒溫的反應(yīng)器。每隔4小時，通過HPLC測定一次流出物中他汀銨鹽的含 量。在變化范圍在0. 175mL/min-0. 2mL/min的流速下進(jìn)行該實驗。表6.在用固定在用氰尿酰氯活化的二乙氨乙基纖維素上的LE酶催化的反應(yīng)中， 流速對洛伐他汀鹽轉(zhuǎn)化的影響 通過控制恒溫柱的溫度，確定了洛伐他汀轉(zhuǎn)化的熱依賴性。表7.在用固定在用氰尿酰氯活化的二乙氨乙基纖維素上的LE酶催化的反應(yīng)中， 溫度對洛伐他汀鹽轉(zhuǎn)化的影響 表7中的結(jié)果顯示固定化的LE酶在37°C下具有最高的活性。參照實施例
參照實施例1.在改性硅膠上固定化LE酶將IOg硅膠添加到Y(jié) -氨丙基三乙氧基硅烷和甲苯(按體積計2%，IOOmL)的混合物中，并回流該混合物10小時。然后濾出凝膠，用丙酮(2X5mL)、水(5mL)、再次用丙酮 (2X5mL)漂洗，并用干燥空氣干燥10小時。在20°C，將如此制備的凝膠(IOOmg)懸浮于碳 酸鹽緩沖液(2mL,50mM,pH 9.4)中，并添加二乙烯基砜(0. 25mL，2. 50mmol)。30分鐘后，分 離固體載體并在真空中干燥2小時。接著用蒸餾水(4X20mL)漂洗，懸浮于碳酸鹽緩沖液 (lmL,50mM, pH 9.4)中并用LE酶(lmL，0. 225mg/mL)溶液浸泡。在20°C靜置該混合物20 小時。濾出具有LE酶沉積在其中的固體載體并用蒸餾水(2X10mL)漂洗。參照實施例2.在羊毛上固定化LE酶在20°C，將羊毛小碎片(50mg)懸浮于碳酸鹽緩沖液(2mL，50mM，pH 9.4)中，然后 添加二乙烯基砜(0.25mL，2.5mmol)。30分鐘后，分離羊毛，在真空中干燥(2小時)并用蒸 餾水(4X20mL)漂洗。將該固體載體再次懸浮于碳酸鹽緩沖液(lmL，50mM，pH 9.4)中，用 LE酶溶液(lmL，0. 225mg/mL)浸泡，并在室溫下靜置10小時。濾出具有LE酶沉積在其中的 固體載體并用蒸餾水(2X10mL)漂洗。參照實施例3.通過溶膠-凝膠法固定化LE酶將LE 酶溶液(0. 5mL，0. 225mg/mL)與 Tris 緩沖液(0. 5mL，0. ΙΜ,ρΗ = 7. 5)混合， 并置于振蕩器上(10分鐘)。接著，添加聚乙烯醇(100 μ L，按體積計4%)、氟化鈉(50yL， 1M)和異丙醇(IOOyL)的水溶液。在5分鐘后，添加異丁基三甲氧基硅烷(2. 5mmol)和 TMOS (0. 5mmol,74 μ L ；76mg)，并將混合物置于振蕩器上。于開口容器中容許該混合物在室 溫下干燥過夜，然后添加異丙醇(IOmL)。分離凝膠并用水(IOmL)、異丙醇(IOmL)和正戊烷 (IOmL)洗滌。壓碎所獲得的凝膠并在室溫下靜置干燥過夜。參照實施例4.通過溶膠-凝膠法固定化LE酶使用根據(jù)參照實施例3的方法，改變之處在于將Tween 80 (0. ImL)添加到酶溶液中。參照實施例5.通過溶膠-凝膠法固定化LE酶使用根據(jù)參照實施例3的方法，改變之處在于將洛伐他汀銨鹽(50mg)添加到酶溶 液中。參照實施例6.在Eupergit C上固定化LE酶將凍干的LE酶(17mg，蛋白含量2. 6% )溶解于碳酸鹽緩沖液(lmL，50mM，pH 9. 4)
中，向溶液中添加Eupergit C(50mg，甲基丙烯酰胺和用N，N’ -亞甲基雙丙烯酰胺交聯(lián)的
甲基丙烯酸縮水甘油酯的共聚物)，并在室溫下靜置1天。然后，濾出固定化酶并用蒸餾水 (2 X IOmL)漂洗。參照實施例7.通過封裝在藻酸鈣中固定化LE酶將純化的LE酶溶液(0. 8mL, 0. 225mg/mL)與藻酸鈣水溶液(8mL，2 % wt. /v.)充分 混合。接著，將如此獲得的溶液逐滴添加到氯化鈣水溶液(10mL，280mM)中，混合20分鐘， 濾出沉淀物，并用蒸餾水(2X10mL)洗滌。于4°C在蒸餾水下貯藏所獲得的固定化物。參照實施例8.通過封裝在藻酸鈣中固定化LE酶將純化的酶溶液(0. 8mL, 0. 225mg/mL)與藻酸鈣水溶液(8mL，2 % wt. /v.)充分混合。接著，將如此獲得的溶液逐滴添加到氯化鈣水溶液(10mL，280mM)中，混合20分鐘，濾 出沉淀物，用蒸餾水(2X10mL)洗滌。將所獲得的物質(zhì)懸浮于四甲氧基硅烷(l.OmL)中并 在4°C攪拌15分鐘。容許整個混合物聚合12小時。濾出固定化酶，用蒸餾水(2X10mL)洗 滌并在室溫下干燥。參照實施例9在30°C，將參照實施例1-8中獲得的固定化的LE酶添加到溶解于碳酸鹽緩沖 液(150mL,50mmol, pH = 9.4)中的辛伐他汀(294mg,0. 67mmol)和洛伐他汀(21. 7mg, 0. 05mmol)銨鹽的溶液中，伴隨磁力攪拌(250rpm)。通過HPLC分析水解反應(yīng)進(jìn)程和選擇性。 用參照實施例1-8中制備的物質(zhì)所獲得的結(jié)果列于表8。表8 N.D.-未測定a)固定化率測定如下固定化的蛋白量/蛋白總量· 100% ；b)每毫克蛋白在1分鐘內(nèi)用酶水解各自底物的量(μ M/min · mg)；c)對洛伐他汀的LE比活/對辛伐他汀的LE比活。
權(quán)利要求
固定在不溶于水的固體載體上的洛伐他汀酯酶，其特征在于，所述酶共價地連接于用至少雙官能偶合試劑活化的固體載體，在辛伐他汀和/或其鹽存在下，固定化的洛伐他汀酯酶顯示其對洛伐他汀及其鹽的水解活性較對辛伐他汀及其鹽的水解活性至少高5倍。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的洛伐他汀酯酶，其特征在于，所述固體載體是多糖或改性多 糖。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的洛伐他汀酯酶，其特征在于，所述多糖是聚半乳糖苷。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的洛伐他汀酯酶，其特征在于，所述改性多糖是二_ (Cm烷基) 氨基-Cm烷基纖維素，尤其是二乙氨乙基纖維素。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的洛伐他汀酯酶，其特征在于，所述固體載體是硅膠或改性硅膠。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的洛伐他汀酯酶，其特征在于，所述改性硅膠是用氨基-Cm烷 基-三烷氧基)硅烷改性的硅膠，尤其是氨丙基硅烷化硅膠。
7.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的洛伐他汀酯酶，其特征在于，活化固體載體的至少的雙 官能試劑是式#丫、的化合物，其中Y表示-S02-或-S02- (CHR)n-S02-，其中n表示1_18 的整數(shù)，R表示氫原子或(V6烷基，或Y表示-S02-Ar-S02-，其中Ar表示通過取代直接結(jié)合 芳環(huán)碳原子的兩個氫原子所形成的二價芳基，所述二價芳基任選地帶有Cm烷基取代基。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的洛伐他汀酯酶，其特征在于，活化固體載體的至少的雙官能 試劑是式,Y、的化合物，其中Y表示-S02-。
9.根據(jù)權(quán)利要求1、2、4、5或6所述的洛伐他汀酯酶，其特征在于，活化固體載體的至少 的雙官能試劑是氰尿酰鹵和/或鄰磺酸氰尿酸酯。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的洛伐他汀酯酶，其特征在于，活化固體載體的至少的雙官能 試劑是氰尿酰商，尤其是氰尿酰氯。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的洛伐他汀酯酶，其特征在于，所述固體載體是聚半乳糖苷， 以及活化固體載體的至少的雙官能試劑是式的化合物，其中Y表示-S02-。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的洛伐他汀酯酶，其特征在于，所述固體載體是二乙氨乙基纖 維素，以及活化固體載體的至少的雙官能試劑是氰尿酰氯。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的洛伐他汀酯酶，其特征在于，所述固體載體是氨丙基硅烷化 硅膠，以及活化固體載體的至少的雙官能試劑是氰尿酰氯。
14.根據(jù)權(quán)利要求1、11、12或13所述的洛伐他汀酯酶，其特征在于，所述酶是由 Clonostachys compactiuscula ATTC 38009，ATCC 74178 產(chǎn)生的酶。
15.一種在不溶于水的固體載體上固定化洛伐他汀酯酶的方法，其特征在于，使用機(jī)械 攪拌，將氰尿酰鹵與處于溶劑中的固體載體接觸，通過過濾分離活化的固體載體，干燥活化 的固體載體并懸浮于含洛伐他汀酯酶的含水混合物中，直至所述酶固定化，通過過濾分離 懸浮物質(zhì)，用緩沖液洗滌并干燥。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其特征在于，多糖或改性多糖被用作固體載體。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其特征在于，所述改性多糖是二-((V6烷基)氨基-CV6 烷基纖維素，尤其是二乙氨乙基纖維素。
18.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其特征在于，硅膠或改性硅膠被用作固體載體。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其特征在于，用氨基-CV6烷基-三(CV6烷氧基)硅烷改性硅膠，尤其是氨丙基硅烷化硅膠被用作改性硅膠。
20.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其特征在于，所使用的氰尿酰鹵是氰尿酰氯。
21.根據(jù)權(quán)利要求15、16或17的方法，其特征在于，使用高壓釜處理的固體載體。
22.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其特征在于，所使用的機(jī)械攪拌是振蕩。
23.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其特征在于，在用緩沖液洗滌前用水洗滌，濾過物質(zhì)。
24.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其特征在于，在堿和/或緩沖液存在下將氰尿酰鹵與固體 載體接觸。
25.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其特征在于，所使用的含酶水溶液是從Clonostachys compactiuscula ATTC 38009，ATCC 74178 中提取的物質(zhì)的蛋白級分。
26.—種在不溶于水的固體載體上固定化洛伐他汀酯酶的方法，其特征在于，使用 機(jī)械攪拌，將式 的化合物與處于溶劑中的固體聚半乳糖載體接觸，其中Y表 示-S02-或-S02-(CHR)n-S02-，其中n表示1-18的整數(shù)，R表示氫原子或(V6烷基，或Y表 示-S02-Ar-S02-，其中Ar表示通過取代直接結(jié)合于芳環(huán)碳原子的兩個氫原子所形成的二價 芳基，所述二價芳基任選地帶有Cm烷基取代基，通過過濾分離活化的固體載體，干燥活化 的固體載體并懸浮于含洛伐他汀酯酶的水混合物中，通過過濾分離懸浮物質(zhì)，用緩沖液洗 滌并干燥。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其特征在于，式 的化合物是其中Y表示-302-的 化合物。
28.根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其特征在于，振蕩被用作機(jī)械攪拌。
29.根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其特征在于，在用緩沖液洗滌前，用水洗滌濾過物質(zhì)。
30.根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其特征在于，所使用的含酶水溶液是從Clonostachys compactiuscula ATTC 38009，ATCC 74178 中提取的物質(zhì)的蛋白級分。
31.一種固定在不溶于水的固體載體上的洛伐他汀酯酶在制備和/或分離和/或純化 辛伐他汀中的應(yīng)用。
32.根據(jù)權(quán)利要求31的應(yīng)用，其特征在于，所述酶用于從具有洛伐他汀的混合物中純 化和/或分離辛伐他汀。
33.根據(jù)權(quán)利要求32的應(yīng)用，其特征在于，在辛伐他汀銨鹽存在下，所述酶用于選擇性 地水解洛伐他汀銨鹽成三醇鹽。
34.根據(jù)權(quán)利要求33的應(yīng)用，其特征在于，以分批處理的方式，在辛伐他汀銨鹽存在 下，所述酶被用于選擇性地水解洛伐他汀銨鹽成三醇鹽。
35.根據(jù)權(quán)利要求33的應(yīng)用，其特征在于，以連續(xù)處理的方式，在辛伐他汀銨鹽存在 下，所述酶被用于選擇性地水解洛伐他汀銨鹽成三醇鹽。
36.一種帶有床的生物催化流動反應(yīng)器，其特征在于，其包括反應(yīng)器本體(1)，該本體 (1)具有連接液體進(jìn)口(3)和液體出口(4)的內(nèi)部空間(2)，在該內(nèi)部空間(2)中存在含固 定化的洛伐他汀酯酶的床(5)。
37.根據(jù)權(quán)利要求36的生物催化流動反應(yīng)器，其特征在于，所述床(5)包含固定在不溶 于水的固體載體上的酶，所述酶共價連接于用至少的雙官能偶合試劑活化的固體載體。
38.根據(jù)權(quán)利要求36的生物催化流動反應(yīng)器，其特征在于，所述固體載體是多糖或改 性多糖。
39.根據(jù)權(quán)利要求36的生物催化流動反應(yīng)器，其特征在于，所述多糖是聚半乳糖苷。
40.根據(jù)權(quán)利要求36的生物催化流動反應(yīng)器，其特征在于，所述改性多糖是二-(Cm烷 基)氨基-Cm烷基纖維素，尤其是二乙氨乙基纖維素。
41.根據(jù)權(quán)利要求36的生物催化流動反應(yīng)器，其特征在于，活化固體載體的至少的雙 官能試劑是式 的化合物，其中Y表示_S02-或-S02-(CHR)n-S02-，其中n表示1_18 的整數(shù)，R表示氫原子或(V6烷基，或Y表示-S02-Ar-S02-，其中Ar表示通過取代直接結(jié)合 芳環(huán)碳原子的兩個氫原子所形成的二價芳基，所述二價芳基任選地帶有Cm烷基取代基。
42.根據(jù)權(quán)利要求41的生物催化流動反應(yīng)器，其特征在于，活化固體載體的至少的雙 官能試劑是式 的化合物，其中Y表示-S02-。
43.根據(jù)權(quán)利要求37的生物催化流動反應(yīng)器，其特征在于，活化固體載體的至少的雙 官能試劑是氰尿酰鹵和/或鄰磺酸氰尿酸酯。
44.根據(jù)權(quán)利要求43的生物催化流動反應(yīng)器，其特征在于，活化固體載體的至少的雙 官能試劑是氰尿酰鹵，尤其是氰尿酰氯。
45.根據(jù)權(quán)利要求37的生物催化流動反應(yīng)器，其特征在于，所述固體載體是聚半乳糖 苷，以及活化固體載體的至少的雙官能試劑是式 的化合物，其中Y表示-S02-。
46.根據(jù)權(quán)利要求37的生物催化流動反應(yīng)器，其特征在于，所述固體載體是二乙氨乙 基纖維素，以及活化固體載體的至少雙官能試劑是氰尿酰氯。
47.根據(jù)權(quán)利要求37的生物催化流動反應(yīng)器，其特征在于，所述酶是由Clonostachys compactiuscula ATTC 38009，ATCC 74178 產(chǎn)生的酶。
48.一種制備和/或純化辛伐他汀的方法，包括用洛伐他汀酯酶處理含殘留量的洛伐 他汀鹽的辛伐他汀鹽溶液，直至水解洛伐他汀形成三醇，分離所述三醇，并分離基本上不含 洛伐他汀的辛伐他汀，其特征在于使含殘留量的洛伐他汀鹽的辛伐他汀鹽溶液與固定在不 溶于水的固體載體上的洛伐他汀酯酶接觸。
49.根據(jù)權(quán)利要求48的制備和/或純化辛伐他汀的方法，其特征在于，所述酶共價連接 于用至少的雙官能偶合試劑活化的固體載體。
50.根據(jù)權(quán)利要求48的制備和/或純化辛伐他汀的方法，其特征在于，所述固體載體是 多糖或改性多糖。
51.根據(jù)權(quán)利要求50的制備和/或純化辛伐他汀的方法，其特征在于，所述多糖是聚半 乳糖苷。
52.根據(jù)權(quán)利要求50的制備和/或純化辛伐他汀的方法，其特征在于，所述改性多糖是 二 - (Cm烷基)氨基-CM烷基纖維素，尤其是二乙氨乙基纖維素。
53.根據(jù)權(quán)利要求48的制備和/或純化辛伐他汀的方法，其特征在于，所述固體載體是 硅膠或改性硅膠。
54.根據(jù)權(quán)利要求53的制備和/或純化辛伐他汀的方法，其特征在于，所述改性硅膠是 用氨基-Cm烷基-三(CM烷氧基)硅烷改性的硅膠，尤其是氨丙基硅烷化硅膠。
55.根據(jù)權(quán)利要求49的制備和/或純化辛伐他汀的方法，其特征在于，活化固體載體的 至少的雙官能試劑是式 的化合物，其中Y表示-S02-或-S02-(CHR)n-S02-，其中n 表示1-18的整數(shù)，R表示氫原子或Cm烷基，或Y表示-S02-Ar-S02-，其中Ar表示通過取代 直接結(jié)合于芳環(huán)碳原子的兩個氫原子所形成的二價芳基，所述二價芳基任選地帶有烷基取代基。
56.根據(jù)權(quán)利要求55的制備和/或純化辛伐他汀的方法，其特征在于，活化固體載體的 至少的雙官能試劑是式 的化合物，其中Y表示-S02-。
57.根據(jù)權(quán)利要求49的制備和/或純化辛伐他汀的方法，其特征在于，活化固體載體的 至少的雙官能試劑是氰尿酰鹵和/或鄰磺酸氰尿酸酯。
58.根據(jù)權(quán)利要求57的制備和/或純化辛伐他汀的方法，其特征在于，活化固體載體的 至少的雙官能試劑是氰尿酰鹵，尤其是氰尿酰氯。
59.根據(jù)權(quán)利要求49的制備和/或純化辛伐他汀的方法，其特征在于，所述固體載體 是聚半乳糖苷，以及活化固體載體的至少的雙官能試劑是式 的化合物，其中Y表 7J\ _S02_o
60.根據(jù)權(quán)利要求49的制備和/或純化辛伐他汀的方法，其特征在于，所述固體載體是 二乙氨乙基纖維素，以及活化固體載體的至少的雙官能試劑是氰尿酰氯。
61.根據(jù)權(quán)利要求49的制備和/或純化辛伐他汀的方法，其特征在于，所述固體載體是 氨丙基硅烷化硅膠，以及活化固體載體的至少的雙官能試劑是氰尿酰氯。
62.根據(jù)權(quán)利要求48的制備和/或純化辛伐他汀的方法，其特征在于，在26°C-50°C的 溫度下進(jìn)行含殘留量的洛伐他汀鹽的辛伐他汀鹽溶液與固定在不溶于水的固體載體上的 酶的接觸。
63.根據(jù)權(quán)利要求48的制備和/或純化辛伐他汀的方法，其特征在于，在流動反應(yīng)器中 連續(xù)進(jìn)行含殘留量的洛伐他汀鹽的辛伐他汀鹽溶液與固定在不溶于水的固體載體上的酶 的接觸。
64.根據(jù)權(quán)利要求48的制備和/或純化辛伐他汀的方法，其特征在于，所述酶是由 Clonostachys compactiuscula ATTC 38009，ATCC 74178 產(chǎn)生的酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及固定在不溶于水的固體載體上的洛伐他汀酯酶，該酶共價連接于用至少的雙官能偶合試劑活化的固體載體，在辛伐他汀和/或其鹽存在下，固定化的洛伐他汀酯酶顯示其對洛伐他汀及其鹽的水解活性較對辛伐他汀及其鹽的水解活性至少高5倍。本發(fā)明還涉及一種在不溶于水的固體載體上固定化洛伐他汀酯酶的方法，以及該固定在固體載體上的酶用于制備和/或分離和/或純化辛伐他汀的應(yīng)用，以及還涉及一種制備和/或純化辛伐他汀的方法，包括用洛伐他汀酯酶處理含殘留量的洛伐他汀鹽的辛伐他汀鹽溶液，直至水解洛伐他汀形成三醇；分離該三醇；并分離基本上不含洛伐他汀的辛伐他汀，其中使含殘留量的洛伐他汀鹽的辛伐他汀鹽溶液與固定在不溶于水的固體載體上的洛伐他汀酯酶接觸。此外，本發(fā)明涉及一種帶有床的生物催化流動反應(yīng)器，包含反應(yīng)器本體(1)，該本體(1)具有連接液體進(jìn)口(3)和液體出口(4)的內(nèi)部空間(2)，在該內(nèi)部空間(2)中存在含固定在不溶于水的固體載體上的洛伐他汀酯酶的床(5)。
文檔編號C12N11/12GK101848988SQ200880114612
公開日2010年9月29日 申請日期2008年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月19日
發(fā)明者多米尼克·科謝夫斯基, 多羅塔·帕特斯卡, 理夏德·奧斯塔謝夫斯基, 瓦爾德馬·庫雷克 申請人:波蘭紐克大學(xué)有機(jī)化學(xué)學(xué)院