專利名稱：β-甘露聚糖酶及基因和制備方法以及載體和宿主細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于一種(3-甘露聚糖酶及其編碼基因和制備方法，以及含有該 基因的重組載體和重組宿主細(xì)胞。
背景技術(shù)：
甘露聚糖酶是一類(lèi)能夠水解半纖維素中第二大組分——異甘露聚糖的 內(nèi)切酶，在醫(yī)藥、食品、飼料、造紙、紡織、印染、洗滌、石油開(kāi)采及生物 技術(shù)等諸多領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。例如甘露聚糖酶可作為飼料酶添加劑， 飼料中添加甘露聚糖酶可補(bǔ)充內(nèi)源消化酶不足，消除和降解飼料原料中的抗 營(yíng)養(yǎng)因子，促進(jìn)畜禽生長(zhǎng)，減少養(yǎng)殖污染(Lee， et al., Poultry Science, 82: 1925-1931,2003);可水解甘露聚糖型植物膠(如角豆膠、瓜兒豆膠、魔芋等)， 生成具有增殖雙岐桿菌生理功效的低聚甘露糖，具有較大的市場(chǎng)前景。
卩-甘露聚糖酶的來(lái)源非常廣泛，細(xì)菌中的芽孢桿菌屬、氣單胞菌屬、腸 桿菌屬、假單孢菌屬和鏈霉菌屬，絲狀真菌和酵母，以及高等植物和某些低 等動(dòng)物中都發(fā)現(xiàn)了甘露聚糖酶。各種不同來(lái)源的P-甘露聚糖酶，在活性大小 及對(duì)環(huán)境條件的要求等方面，大多存在或多或少的差別。工業(yè)生產(chǎn)一般需要 經(jīng)過(guò)高溫過(guò)程，所以能夠進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn)的甘露聚糖酶需要具有一定的耐熱性 (最好具有60-7(TC的耐熱性)。如果要用于飼料或食物添加劑，還需要具備 一定的耐酸性，這是因?yàn)楸M管消化碳水化合物的主要過(guò)程發(fā)生在中性微酸的 小腸和其它消化道中，但是食物或飼料還是要經(jīng)過(guò)胃部的酸性環(huán)境。目前分 離到的黑曲霉(ApeW//w "扭。AS2710菌株產(chǎn)生的甘露聚糖酶能夠較好 地滿足以上兩點(diǎn)，該酶耐熱性能好，工作溫度范圍是30-85°C，最適反應(yīng)溫 度70。C;反應(yīng)pH 2-9.2，最適pH 3.0-3.8( 丁宏標(biāo)等，中國(guó)專利CN 01144782.6，
2001年)。然而，黑曲霉AS2710菌株的甘露聚糖酶基因還沒(méi)有克隆得到， 其表達(dá)主要是通過(guò)黑曲霉AS2710菌株發(fā)酵，該菌發(fā)酵周期長(zhǎng)(5天以上)， 另外因?yàn)闆](méi)有有效的啟動(dòng)子控制，也不容易實(shí)現(xiàn)甘露聚糖酶基因的高效表 達(dá)，且該酶沒(méi)有有效的親和標(biāo)簽，不利于快速方便地純化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是克服目前沒(méi)有適于原核表達(dá)且易于純化分離的耐 酸耐熱的P-甘露聚糖酶的缺陷，提供一種適于原核表達(dá)且易于純化分離的耐 酸耐熱的(3-甘露聚糖酶。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供編碼該(3-甘露聚糖酶的基因。 本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供含有該基因的重組載體。 本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供含有該重組載體的宿主細(xì)胞。 本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供所述p-甘露聚糖酶的制備方法。 本發(fā)明提供了一種卩-甘露聚糖酶，該卩-甘露聚糖酶具有SEQID: NO. 2 所示的氨基酸序列，SEQID: NO. 4所示的氨基酸序列，SEQID: NO. 6所 示的氨基酸序列，SEQID: N0.8所示的氨基酸序列，或者對(duì)SEQID: NO. 2、 SEQID: NO. 4、 SEQID: NO. 6或SEQID: NO. 8所示的氨基酸序列進(jìn) 行一個(gè)或幾個(gè)氨基酸取代、缺失或添加而得到的p-甘露聚糖酶活性不變的氨 基酸序列。
本發(fā)明提供了一種編碼本發(fā)明提供的P-甘露聚糖酶的基因。 本發(fā)明提供了一種重組載體，該重組載體含有本發(fā)明提供的基因。 本發(fā)明提供了一種重組宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞含有本發(fā)明提供的重組載體。
本發(fā)明提供了一種P-甘露聚糖酶的制備方法，該方法包括培養(yǎng)本發(fā)明提 供的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明提供的(3-甘露聚糖酶能夠水解各種含有卩-1,4甘露糖苷鍵的甘露 聚糖，生成寡糖，其最適作用條件是pH 5-5.5， 60-65°C，能夠作為食物或飼 料添加劑，適應(yīng)胃部的酸性環(huán)境，而且能夠滿足工業(yè)生產(chǎn)對(duì)耐熱性的需要。 雖然，之前已經(jīng)分離到的黑曲霉(Jwwg///w "/ge。 AS2710菌株產(chǎn)生的甘 露聚糖酶，具有耐熱耐酸性，但是其生產(chǎn)方法是真菌發(fā)酵的方法，存在周期 長(zhǎng)、產(chǎn)量低的缺點(diǎn)，而本發(fā)明提供的(3-甘露聚糖酶可以利用本發(fā)明構(gòu)建原核 表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行生產(chǎn)，克服了上述真菌發(fā)酵的缺點(diǎn)。另外，本發(fā)明中的重組甘 露聚糖酶，表達(dá)后具有六個(gè)組氨酸標(biāo)簽，純化十分方便。
本發(fā)明涉及的重組宿主細(xì)胞為含有SEQID: NO.l的重組克隆載體轉(zhuǎn)化 菌株DH5a(pUCU7)，分類(lèi)命名為大腸埃希氏菌，拉丁文學(xué)名為^c/^/c/^a 于2007年5月17日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生 物中心，保藏編號(hào)為CGMCCNo.2051。


圖1: SEQID:N0.6所示的(3-甘露聚糖酶和E159A突變體的SDS-PAGE 電泳圖2: SEQ ID: N0.6所示的(3-甘露聚糖酶活性隨溫度和pH變化的曲 線圖。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明提供的(3-甘露聚糖酶具有SEQ ID:NO. 2所示的氨基酸序列，SEQ ID: N0.4所示的氨基酸序列，SEQID: NO. 6所示的氨基酸序列，SEQ ID: NO. 8所示的氨基酸序列，或者對(duì)SEQ ID: NO. 2、 SEQ ID: NO. 4、 SEQ ID:
NO. 6或SEQ ID: N0.8所示的氨基酸序列進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)氨基酸取代、缺 失或添加而得到的P-甘露聚糖酶活性不變的氨基酸序列。
組成蛋白質(zhì)的20種氨基酸殘基，按照側(cè)鏈極性可以分成四類(lèi)1、非極 性的氨基酸丙氨酸(Ala)、纈氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、異亮氨酸(Ile)、 甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)和脯氨酸(Pro); 2、極 性不帶電荷的氨基酸甘氨酸(Gly)、絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)、半胱 氨酸(Cys)、天冬氨酸(Asn)、谷氨酰胺(Gln)和酪氨酸(Tyr); 3、帶正 電荷的氨基酸精氨酸(Arg)、賴氨酸(Lys)和組氨酸(His); 4、帶負(fù)電 荷的氨基酸天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)(參見(jiàn)"生物化學(xué)"(第二版) 上冊(cè)，沈同、王鏡巖，第82-83頁(yè)，高等教育出版社，1990年12月)。蛋白 質(zhì)中如果發(fā)生同屬一個(gè)類(lèi)別的氨基酸殘基取代，例如由Arg取代Lys或由 Leu取代Ile，所述殘基在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域中所起的作用(比如提供正電荷或形 成疏水囊袋結(jié)構(gòu)的作用)沒(méi)有改變，因此對(duì)蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)并不會(huì)產(chǎn)生影 響，因此仍然可以實(shí)現(xiàn)蛋白的功能。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，Ala和Ser、 Val和Ile、 Asp和Glu、 Ser和Thr、 Ala和Gly、 Ala和Thr、 Ser和Asn、 Ala 禾口 Val、 Ser禾口 Gly、 Tyr禾卩Phe、 Ala禾口 pro、 Lys禾口 Arg、 Asp禾口 Asn、 Leu 禾口Ile、 Leu禾BVal、 Ala和Glu以及Asp和Gly，兩兩之間相互取代，不會(huì)影 響蛋白的立體結(jié)構(gòu)和功能。所述同屬一個(gè)類(lèi)別的氨基酸殘基取代可以發(fā)生在 上述(3-甘露聚糖酶的任意一個(gè)氨基酸殘基位置上。
本發(fā)明提供的P-甘露聚糖酶還可以進(jìn)行修飾或突變，得到衍生的蛋白 質(zhì)。本發(fā)明所述"衍生的蛋白質(zhì)"指與具有上述氨基酸序列的P-甘露聚糖酶具 有氨基酸序列上的差異，也可以有不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼 而有之。這些蛋白包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。所述誘導(dǎo)變異體可以通過(guò) 各種技術(shù)得到，如輻射或誘變劑等產(chǎn)生的隨機(jī)突變，也可以通過(guò)如定點(diǎn)突變 法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。所述"衍生的蛋白質(zhì)"還包括具有天然L型 氨基酸的殘基的類(lèi)似物(如D型氨基酸)，以及具有非天然存在的或合成的 氨基酸(如P-氨基酸、，氨基酸等)的類(lèi)似物。
修飾(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的蛋白的化學(xué)衍生 形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些在蛋白的合成和加工中 或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的蛋白。這種修飾可以通過(guò)將蛋 白暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動(dòng)物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。 修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸 蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解 性能的蛋白。
所述(3-甘露聚糖酶優(yōu)選具有SEQ ID: NO. 2所示的氨基酸序列，SEQ ID: N0.4所示的氨基酸序列，SEQ ID: NO,6所示的氨基酸序列，或者SEQID: NO. 8所示的氨基酸序列，更優(yōu)選具有SEQID: NO. 2或SEQ ID: NO. 6所
示的氨基酸序列。
本發(fā)明提供了一種編碼本發(fā)明提供的P-甘露聚糖酶的基因。 本領(lǐng)域公知，組成蛋白質(zhì)的20種不同的氨基酸中，除Met (ATG)或 Trp (TGG)分別為單一密碼子編碼外，其他18種氨基酸分別由2-6個(gè)密碼 子編碼(Sambrook等，分子克隆，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，紐約，美國(guó)，第 二版，1989，見(jiàn)950頁(yè)附錄D)。即由于遺傳密碼子的簡(jiǎn)并性，決定一個(gè)氨 基酸的密碼子大多不止一個(gè)，三聯(lián)體密碼子中第三個(gè)核苷酸的置換，往往不 會(huì)改變氨基酸的組成，因此編碼相同蛋白的基因的核苷酸序列可以不同。本 領(lǐng)域人員根據(jù)公知的密碼子表，從本發(fā)明公開(kāi)的氨基酸序列，以及由所述氨 基酸序列得到的(3-甘露聚糖酶活性不變的氨基酸序列，完全可以推導(dǎo)出能夠 編碼它們的基因的核苷酸序列，通過(guò)生物學(xué)方法(如PCR方法、突變方法) 或化學(xué)合成方法得到所述核苷酸序列，因此該部分核苷酸序列都應(yīng)該包括在 本發(fā)明范圍內(nèi)。相反，利用本文公開(kāi)的DNA序列，也可以通過(guò)本領(lǐng)域公知 的方法，例如Sambrook等的方法(分子克隆，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，紐約， 美國(guó)，第二版，1989)進(jìn)行，通過(guò)修改本發(fā)明提供的核酸序列，得到與本發(fā)
明所述P-甘露聚糖酶活性一致的氨基酸序列。
優(yōu)選情況下，編碼本發(fā)明提供的P-甘露聚糖酶的基因具有SEQID: NO. l所示的核苷酸序列，SEQID: N0.3所示的核苷酸序列，SEQID: NO. 5 所示的核苷酸序列，SEQID: N0.7所示的核苷酸序列，或者對(duì)SEQID: NO. 1、 SEQID: NO. 3、 SEQID: NO. 5或SEQID: NO. 7所示的核苷酸序 列進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)核苷酸取代、缺失或添加而得到的編碼活性不變的P-甘露 聚糖酶的核苷酸序列。更優(yōu)選的情況下，編碼本發(fā)明提供的(3-甘露聚糖酶的 基因具有SEQ ID: NO. 1所示的核苷酸序列，SEQ ID: NO. 3所示的核苷酸 序列，SEQID: N0.5所示的核苷酸序列，或者SEQID: N0.7所示的核苷 酸序列。進(jìn)一步優(yōu)選的情況下，具有SEQID: NO. 1或SEQID: NO. 5所示 的核苷酸序列
本發(fā)明提供的核苷酸序列通常可以用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增法、 重組法、或人工合成的方法獲得。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明所提供 的核苷酸序列，可以很容易得到模板和引物，利用PCR進(jìn)行擴(kuò)增獲得有關(guān) 序列。
一旦獲得了有關(guān)核苷酸序列，就可以用重組法大批量的獲得有關(guān)氨基酸 序列。通常將所得核苷酸序列克隆入載體，再轉(zhuǎn)入基因工程菌中，然后通過(guò) 常規(guī)的方法從增殖后的宿主細(xì)胞分離得到有關(guān)核苷酸序列。
此外，還可用公知的人工化學(xué)合成的方法來(lái)合成有關(guān)核苷酸序列。
本發(fā)明提供的重組載體含有本發(fā)明提供的基因。
優(yōu)選所述重組載體為重組質(zhì)粒pUCl.17或重組質(zhì)粒pETMAN-HA963。 在本發(fā)明中，所述"載體"可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的各種質(zhì)粒、 粘粒、噬菌體及反轉(zhuǎn)錄病毒等，本發(fā)明優(yōu)選pUC18或pET28a質(zhì)粒。重組載 體構(gòu)建可采用能夠在載體多克隆位點(diǎn)具有切割位點(diǎn)的各種核酸內(nèi)切酶(如對(duì) 于pUC18，可用Sal I 、 BamH I 、 EcoR I等；對(duì)于pET28a，可用Nde I 、Nhe I 、 EcoRl 、 BamH、 HindIII等)進(jìn)行酶切獲得線性質(zhì)粒，與采用相同 核酸內(nèi)切酶切割的基因片段連接，獲得重組質(zhì)粒。本發(fā)明優(yōu)選采用Sall切 割pUC18及與其連接的基因片段。Nhe I和HindIII雙酶切pET28a及與其連 接的PCR產(chǎn)物片段，經(jīng)連接酶連接，分別構(gòu)建重組載體pUC1.17和 pETMan-HA963。
本發(fā)明提供的重組宿主細(xì)胞含有本發(fā)明提供的重組載體。
可以通過(guò)本領(lǐng)域常規(guī)的方法將所述重組載體轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)或者轉(zhuǎn)染到宿主 細(xì)胞中，如氯化鈣法化學(xué)轉(zhuǎn)化、高壓電擊轉(zhuǎn)化，優(yōu)選電擊轉(zhuǎn)化。所述宿主細(xì) 胞可以為原核細(xì)胞或真核細(xì)胞，優(yōu)選為大腸桿菌、枯草桿菌、酵母或各種動(dòng) 植物細(xì)胞，更優(yōu)選所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌。
本發(fā)明還提供的制備P-甘露聚糖酶的方法包括培養(yǎng)本發(fā)明提供的重組 宿主細(xì)胞。所述培養(yǎng)條件為常規(guī)的培養(yǎng)條件，如使用LB培養(yǎng)基(酵母粉5 克/升，蛋白胨10克/升，NaCl 10克/升)，在37'C下培養(yǎng)。由于本發(fā)明提供 的重組宿主細(xì)胞中含有編碼(3-甘露聚糖酶的基因，可以高效地表達(dá)P-甘露聚 糖酶。培養(yǎng)后經(jīng)過(guò)分離提純，即可得到高純度的p-甘露聚糖酶。
下面的實(shí)施例將對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。
實(shí)施例1.含有SEQ ID: NO.l所示的P-甘露聚糖酶基因的重組質(zhì)粒 pUC1.17和轉(zhuǎn)化菌株DH5a (pUC1.17)的構(gòu)建
從云南騰沖熱泉(pH 2， 90°C)采集水樣2L，經(jīng)0.22pm微孔濾膜 (Milipore公司)過(guò)濾收集水樣中的菌體，用STE緩沖液(0.1MNaCl; 10 mM Tris-HCl， pH 8.0; 1 mM EDTA， pH 8.0)洗下濾膜上的菌體，離心4000 rpm， 10 min，得菌體新鮮濕重約0.5g。菌體沉淀物用UltraClean Soil DNA Kit 提取總DNA(10(Hd, 4|ig/Vl)，測(cè)定吸光度比值為A260/A280= 1.947， A260/A230 = 2.15。取上述總DNA溶液50 |il (約含200 |ag DNA)，用限制
酶Sa/1酶切，酶切體系中含有5 pi 1酶(20 U/pl), 5 |il Buffer 1 (10 mM KC1， 10 mM Tris畫(huà)HCl， 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 200 ng/ml BSA, 50%甘油， NEB公司)，35pl去離子水，37'C溫育4h充分反應(yīng)。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝 膠電泳回收2-4kbDNA片段，溶于50julTE (10 mM Tris-Cl， pH 8.0; 1 mM EDTA， pH8.0)溶液中，即得環(huán)境基因組DNA。采用與酶切基因組相同的 反應(yīng)體系和條件用1酶切pUC18質(zhì)粒，瓊脂糖凝膠電泳回收后溶于3(^1 去離子水中(濃度約10ng4U)，加入1 jul熱敏磷酸酶(5U4d, NEB公司生產(chǎn))， 5.6^1 10倍熱敏磷酸酶反應(yīng)緩沖液(NEB公司生產(chǎn))，37t:反應(yīng)30min，再 于65。C水浴5min使磷酸酶失去活性，12000 rpm離心10 min后，上清即為 去磷酸化的pUC18質(zhì)粒DNA溶液。取2 |il此質(zhì)粒DNA溶液與14 pl上述 環(huán)境基因組DNA溶液混合，另外加入2 |il 10X連接酶緩沖液和2 nl的連接 酶(10U 1，NEB公司生產(chǎn))，4r條件下過(guò)夜連接，得連接混合物。取4支含 50 pl電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的1.5ml離心管，于冰浴中融化10 min后，每管加 入上述連接混合物2 pl，混勻，冰浴2min，然后將其轉(zhuǎn)入已預(yù)冷的電轉(zhuǎn)槽 中，電擊(1.8kV，電容25vF，電擊時(shí)間5ms，如無(wú)特別說(shuō)明，本說(shuō)明書(shū) 均采用此條件進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化)后迅速加入液體LB培養(yǎng)基1 ml，混勻后于37°C 搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速220 rpm， 50 min后按100 pl/平板涂布于含有安芐青霉素(100 lng/mL)、 5-溴-4-氯-3』引哚半乳糖苷(X-gal， 20 ng/mL)和異丙基-卩-D-硫代半 乳糖苷(IPTG， 20|ig/mL)的LB (LB培養(yǎng)基的基本成分為酵母粉5克/ 升,蛋白胨10克/升，NaC110克/升)平板上，37。C培養(yǎng)15h。獲得了近10000 個(gè)克隆子?？寺∽咏?jīng)過(guò)substrate overlay method (參看Teather， R. M., and P. J. Wood, Applied and Environmental Microbiology 43:777-80, 1982)活性測(cè)定， 篩選得到一個(gè)具有甘露聚糖酶的陽(yáng)性克隆子，經(jīng)測(cè)序公司(均堯公司，北京， 下同)對(duì)其插入片段進(jìn)行測(cè)序，該插入片段的序列如SEQID: N0.9所示， 該序列中自核苷酸175位至1137位為一個(gè)編碼基因，該基因的序列如SEQ
ID: NO.l所示，可以得知SEQID: NO.l所示的基因即為甘露聚糖酶m"W 基因，編碼的氨基酸序列如SEQ ID: NO.2所示。該陽(yáng)性克隆子即為含有SEQ ID: NO.l所示序列的重組克隆載體轉(zhuǎn)化菌株DH5a (pUCl.17)(此菌種已 保存在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC No.2051)。轉(zhuǎn)化菌株DH5a(pUC1.17)中的重組質(zhì)粒pUC1.17(含有SEQ ID: NO.l所示的序列)可用于進(jìn)一步構(gòu)建表達(dá)載體。
實(shí)施例2.卩-甘露聚糖酶表達(dá)載體和轉(zhuǎn)化菌株的構(gòu)建
根據(jù)SEQ ID: NO.l所示的核苷酸序列(ma"」序列)，合成正反向引 物，IF.向引物為5，-GTGCGCTAGCATGGGACG-3，，下劃線部分為Nhe I的 酶切位點(diǎn)，反向引物為5，- GCGAAGCTTTCATCGATTTG-3，，下劃線部分 為Hindin的酶切位點(diǎn)。采用這兩個(gè)引物，以質(zhì)粒pUCl.17為模板，禾U用下 面PCR反應(yīng)體系(Taq DNA聚合酶及其緩沖液、dNTP采用天根公司成品)
IOX緩沖液 5|il
dNTP 4 nl
Taq DNA聚合酶 0.5 pi
正向引物(25 pM) 1 pi 反向引物(25 pM)
pUC1.17模板(lpgAil) 1 ^
反應(yīng)條件94。C預(yù)變性4min，然后94。C變性30秒-5(TC退火30秒-72。C延 伸1 min30個(gè)循環(huán)，最后72"C延伸10min。 PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳 檢測(cè)產(chǎn)量和特異性，并用DNA純化試劑盒(超薄離心柱型，天根公司生產(chǎn)) 純化。純化后用Nhe I和HindIII雙酶切該P(yáng)CR產(chǎn)物，反應(yīng)體系為50 pl PCR 產(chǎn)物、Nhe I (10U/nl， NEB公司)和HindlII(10U/ul， NEB)各5pl、 10jal Buffer 2 (50 mM NaCl， 10 mM Tris畫(huà)Cl, 10 mM MgC12, lmM DTT， NEB公司)，30^1
去離子水，37'C溫育4h，瓊脂糖電泳回收。質(zhì)粒pET28a經(jīng)同樣條件雙酶切， 電泳回收。所回收雙酶切PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒進(jìn)行連接(連接酶用量、反應(yīng)條 件同實(shí)施例1)，構(gòu)建成pETMan-HA963重組表達(dá)載體。此重組載體電擊轉(zhuǎn) 化大腸桿菌BL21 (DE3)后涂布于含有50|ng/mL卡那霉素的LB平板，37°C 培養(yǎng)15 h，即得含有SEQ ID: NO. l所示序列的重組表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化菌株 Man-HA963。由于連接到pET28a的SEQ ID: NO. 1所示序列與pET28a中 編碼組氨酸標(biāo)簽的序列處于同一閱讀框，實(shí)際獲得的蛋白質(zhì)序列如SEQ ID: NO. 6所示，與SEQ ID: N0.2相比，該序列在前端多了 23個(gè)由pET28a上 游序列編碼的氨基酸，其中包括用于分離純化的六個(gè)組氨酸標(biāo)簽。編碼SEQ ID: NO. 6的核苷酸序列如SEQ ID: NO. 5所示。
實(shí)施例3.甘露聚糖酶基因突變體的制備
以實(shí)施例2的表達(dá)載體pETMan-HA963為模板，采用Stratagene公司的 定點(diǎn)突變?cè)噭┖?QuikChange site-directed mutagenesis kit),參照說(shuō)明書(shū)，通 過(guò)在引物中引入突變堿基并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將SEQ ID: NO. l所示的核苷 酸序列在476位A突變?yōu)镃，獲得含有該突變體的載體pETMan-E159A。該 突變體的核苷酸序列經(jīng)北京諾賽基因組研究中心有限公司測(cè)序，結(jié)果如SEQ ID: N0.3所示，實(shí)現(xiàn)了預(yù)設(shè)的點(diǎn)突變，艮卩，與SEQ ID: NO. 1相比，該突 變體基因的核苷酸序列在476位A突變?yōu)镃，三聯(lián)體密碼子GAA變?yōu)镚CA， 相應(yīng)的氨基酸序列(如SEQ ID: N0.4所示)159位氨基酸Glu變?yōu)锳la。 按照與實(shí)施例2相同的方法，將此重組質(zhì)粒pETMan-E159A電擊轉(zhuǎn)入大腸桿 菌BL21 (DE3)，含有此重組質(zhì)粒的大腸桿菌稱為Man-HA963-E159A。由 于連接到pET28a的SEQ ID: NO. 3所示序列與pET28a中編碼組氨酸標(biāo)簽 的序列處于同一閱讀框，實(shí)際獲得的蛋白質(zhì)序列如SEQID: N0.8所示，與 SEQ ID: N0.4相比，該序列在前端多了23個(gè)由pET28a上游序列編碼的氨
基酸，其中包括用于分離純化的六個(gè)組氨酸標(biāo)簽。編碼SEQID: N0.8的核 苷酸序列如SEQID: N0.7所示。
實(shí)施例4.重組卩-甘露聚糖酶的表達(dá)和純化
將上述含有重組表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化菌株Man-HA963培養(yǎng)于含有50 )ig/ml 卡那霉素的LB培養(yǎng)基(基本成分為酵母粉5克/升，蛋白胨10克/升， NaCl 10克/升)中，37。C培養(yǎng)3 h， OD6oo=0.7，加入IPTG至終濃度為0.8 pM， 轉(zhuǎn)至3(TC繼續(xù)培養(yǎng)4h。 5000rpm， 10min離心收集菌體，懸浮于溶液A (20 mM Tris-Cl， pH 7.9, 0.5 MNaCl， 10 mM咪唑)中，于冰浴中超聲破碎(60W， 10min內(nèi)循環(huán)超聲，超聲2s，停止2s，防止溶液過(guò)熱導(dǎo)致蛋白失活)，之后 15000 rpm離心10 min除去細(xì)胞碎片，上清過(guò)Ni-IDA His'Bind Superflow純 化柱，用5 ml溶液A沖洗，再用10 ml溶液B (20 mM Tris-Cl， pH 7.9， 0.5 M NaCl, 60 mM咪唑)漂洗，最后用5 ml溶液C (20 mM Tris-Cl, pH 7.9, 0.5 M NaCl, 500 mM咪唑)洗脫，收集洗脫液。然后將洗脫液用FPLC (快速 蛋白液相層析)的脫鹽、凝膠過(guò)濾和離子交換層析柱分別進(jìn)行純化，獲得純 化蛋白。Man-HA963-E159A的培養(yǎng)和甘露聚糖酶突變體的純化同上，獲得 甘露聚糖酶突變體E159A。 10% SDS-PAGE電泳(120V, 2 h， 25°C)顯示 所得重組蛋白均顯示為一條純的單一蛋白帶(如圖1所示，圖1中泳道1表 示低分子量蛋白Marker,泳道2表示SEQ ID: NO. 6所示的蛋白，泳道3 為SEQ ID: NO. 8所示的突變重組蛋白)。SDS-PAGE電泳顯示SEQ ID: NO. 6所示的蛋白和突變蛋白的分子量均為約36 kD左右，基本符合理論推斷的 38 kD。
實(shí)施例5.甘露聚糖酶活性測(cè)定
標(biāo)準(zhǔn)活性測(cè)定體系為1 ml，其中含有0.9 ml 0.5%槐豆膠溶液(pH 5.5
的50mM磷酸檸檬酸緩沖液配制)，O.lml如SEQID: N0.6所示的P-甘露 聚糖酶的酶液(0.05 ^M)。底物在測(cè)定溫度先溫育5min后加入酶液，反應(yīng) 10 min后加入二硝基水楊酸溶液(DNS)終止反應(yīng)(張龍翔等主編.《生化 實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)》，高等教育出版社，1996.)，然后沸水浴IO min后測(cè)定在 540 nm處的吸光值。酶活單位定義為1 min內(nèi)催化產(chǎn)生1 )iimol還原糖所需 的酶量。測(cè)定最適反應(yīng)溫度時(shí)采用pH 5.5的50 mM磷酸檸檬酸緩沖液，在 測(cè)定溫度溫育5 min，加入0.1 ml酶液，繼續(xù)在該溫度反應(yīng)10 min后加入1 ml DNS終止反應(yīng)，其余同標(biāo)準(zhǔn)活性測(cè)定。最適反應(yīng)pH測(cè)定在4(TC進(jìn)行，分別 采用pH為4.5、 5、 5.5、 6、 6.5、 7、 7.5和8的磷酸檸檬酸緩沖液配制底物 溶液，其余反應(yīng)同標(biāo)準(zhǔn)活性測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)圖2。該重組蛋白最適作用pH5.5， 最適溫度65'C。測(cè)定還顯示突變體活性與SEQ ID: N0.6所示的p-甘露聚 糖酶完全相同。本發(fā)明重組表達(dá)菌株產(chǎn)酶活力為78 U，mr1，約為黑曲霉 AS2710菌株150 Unnl"的一半，但考慮到發(fā)酵周期，黑曲霉發(fā)酵周期需要 至少5天，而本發(fā)明中菌株活化需要10h左右，加上誘導(dǎo)表達(dá)的8h，共18 h，所以日平均產(chǎn)酶活力本發(fā)明中的甘露聚糖酶為104 U，ml、day'1，黑曲霉 AS2710菌株的甘露聚糖酶小于30U，ml、da/1，另外，本發(fā)明中的重組甘露 聚糖酶，表達(dá)后在蛋白的第5到第10個(gè)氨基酸的位置有六個(gè)組氨酸，使得 目的蛋白一次純化即達(dá)到90%以上，十分方便有效。因此本發(fā)明在發(fā)酵生產(chǎn) 上比黑曲霉AS2710菌株具有更大的優(yōu)勢(shì)。
SEQUENCE LISTING
〈110〉中國(guó)科學(xué)院微生物研究所
〈120〉 (3-甘露聚糖酶及基因和制備方法以及載體和宿主細(xì)胞 〈130〉 I7947ZKW 〈160〉 9
〈170〉 Patentln version 3. 1 <210〉 1 <211〉 1173 〈212〉 DNA 〈213〉人工合成 〈400〉 1
atgggacgga tcgaaagcgc attcgatctc gtcggccagc acgggacgtg gggaaccgac gaacagccct tcaactgggt gacgctcgcc cccgccatcg cgtatgggcc tccggtcacc gagcttgccc acgcactcgg gctcaaggtg gggacgtggc gaggcgagat ccggttcgag gaagcgtggt ttgggtctta ttccgacatg acgggttgcg卿tgttctg cgtgggctgc atgtggcgcg ,ccatcgc gcgcgtgcga tgcaaccacg ggcgcgagga gcacgtgcgc agcgcctact atcccatcga ccggtggcga gaggcgcatg aaaagccgct cttcttcatg ggcgcctgcc cgtgggacta ccggcaccca
ggcttcatcc gaggcatgac gaggcgcgcg catcgatgcg ttcgcgggcc tcatggagca gtgagcgacg acg卿ttgc tgcctgaagc cgaccgtgaa 33ggaac3cg gcccggatct atggcccact acgcgcatgt gagatgacga ctgccgagcc accgagtacg acggcctcgt ttctgggacg cggtcgatct gatcgcgtgc ctgtgctccg gaagtggggt gcccgagccg ggcgccgtct gtcttgacga
ctttggcttc 60
tgcgcttgcc 120
ccccggcgat 180
gtcgatggcg 240
ctgccgagac 300
cgagtcctgg 360
ggcg犯gcgc 420
acacgaagcc 480
gacgtacaac 540
catctcgtcg 600
cgaggtggca 660
ctccggctcc 720
gcaggcgcgg 780200710121923.2
ttctacgaag ccatgttcgc cgccatgccc gacgagccgt tgggaatggc cgtggaagct gtacccgcgc gaagcggcgt atctacggca aaccggccga ggacgtcgtg gcgcgggcgt tga
說(shuō)明書(shū)第14/22頁(yè) ggttcaaggg ttacatgctg 840 ccgaggacgg aagctactgc 900 tctcggccat cgcaaatcga 960
963
〈210> 2 〈211〉 320 〈212〉 PRT 〈213〉 重組表達(dá) 〈400〉 2
Met Gly Arg lie Glu Ser Ala Phe Asp Leu Gly Phe lie Arg Gly Met
1 5 10 15
Thr Phe Gly Phe Val Gly Gin His Gly Thr Trp Gly Thr Asp Glu Ala
20 25 30
Arg Ala Ser Met Arg Ala Leu Ala Glu Gin Pro Phe Asn Trp Val Thr
35 40 45
Leu Ala Phe Ala Gly Leu Met Glu His Pro Gly Asp Pro Ala lie Ala
50 55 60
Tyr Gly Pro Pro Val Thr Val Ser Asp Asp Glu lie Ala Ser Met Ala 65 70 75 80
Glu Leu Ala His Ala Leu Gly Leu Lys Val Cys Leu Lys Pro Thr Val
85 90 95
Asn Cys Arg Asp Gly Thr Trp Arg Gly Glu lie Arg Phe Glu Lys Glu
100 105 110
His Gly Pro Asp Leu Glu Ser Trp Glu Ala Trp Phe Gly Ser Tyr Ser
115 120 125
Asp Met Met Ala His Tyr Ala His Val Ala Lys Arg Thr Gly Cys Glu
130 135 140
Met Phe Cys Val Gly Cys Glu Met Thr Thr Ala Glu Pro His Glu Ala 145 150 155 160
Met Trp Arg Glu Thr lie Ala Arg Val Arg Thr Glu Tyr Asp Gly Leu
165 170 175
Val Thr Tyr Asn Cys Asn His Gly Arg Glu Glu His Val Arg Phe Trp
180 185 190
Asp Ala Val Asp Leu lie Ser Ser Ser Ala Tyr Tyr Pro lie Asp Arg
195 200 205
Trp Arg Asp Arg Val Pro Val Leu Arg Glu Val Ala Glu Ala His Glu
210 215 220
Lys Pro Leu Phe Phe Met Glu Val Gly Cys Pro Ser Arg Ser Gly Ser 225 230 235 240Gly Ala Cys Pro Trp Asp Tyr Arg His Pro Gly
245 250 Glu Gin Ala Arg Phe Tyr Glu Ala Met Phe Ala
260 265 Pro Trp Phe Lys Gly Tyr Met Leu Trp Glu Trp
275 280 Pro Arg Glu Ala Ala Ser Glu Asp Gly Ser Tyr
290 295 Pro Ala Glu Asp Val Val Ala Arg Ala Phe Ser 305 310 315
<210〉 3 〈211> 963 〈212〉 腿 〈213〉人工合成 <400〉 3 atgggacgga
Ala Val Cys Leu Asp 255
Ala Met Pro Asp Glu 270
Pro Trp Lys Leu Tyr 285
Cys lie Tyr Gly Lys 300
Ala lie Ala Asn Arg 320
60
tcgaaagcgc attcgatctc ggcttcatcc gaggcatgac ctttggcttc
gtcggccagc acgggacgtg gggaaccgac gaggcgcgcg catcgatgcg tgcgcttgcc 120
gaacagccct tcaactgggt gacgctcgcc ttcgcgggcc tcatggagca ccccggcgat 180
cccgccatcg cgtatgggcc tccggtcacc gtgagcgacg acgagattgc gtcgatggcg 240
gagcttgccc acgcactcgg gctcaaggtg tgcctgaagc cgaccgtgaa ctgccgagac 300
gggacgtggc gaggcgagat ccggttcgag aaggaacacg gcccggatct cgagtcctgg 360
gaagcgtggt ttgggtctta ttccgacatg atggcccact acgcgcatgt ggcgaagcgc 420
acgggttgcg agatgttctg cgtgggctgc gagatgacga ctgccgagcc acacgcagcc 480
atgtggcgcg agaccatcgc gcgcgtgcga accgagtacg acggcctcgt gacgtacaac 540
tgcaaccacg ggcgcgagga gcacgtgcgc ttctgggacg cggtcgatct catctcgtcg 600
agcgcctact atcccatcga ccggtggcga gatcgcgtgc ctgtgctccg cgaggtggca 660
gaggcgcatg aaaagccgct cttcttcatg gaagtggggt gcccgagccg ctccggctcc 720
ggcgcctgcc cgtgggacta ccggcaccca ggcgccgtct gtcttgacga gcaggcgcgg 780
ttctacgaag ccatgttcgc cgccatgccc gacgagccgt ggttcaaggg ttacatgctg 840
tgggaatggc cgtggaagct gtacccgcgc gaagcggcgt ccgaggacgg aagctactgc 900
atctacggca aaccggccga ggacgtcgtg gcgcgggcgt tctcggccat cgcaaatcga %0
tga 963
〈210〉 4 〈211〉 320 〈212〉 PRT 〈213>重組表達(dá) 〈400〉 4
Met Gly Arg lie Glu Ser Ala Phe A印Leu Gly 1 5 10
Thr Phe Gly Phe Val Gly Gin His Gly Thr Trp
20 25 Arg Ala Ser Met Arg Ala Leu Ala Glu Gin Pro
35 40 Leu Ala Phe Ala Gly Leu Met Glu His Pro Gly
50 55 Tyr Gly Pro Pro Val Thr Val Ser Asp Asp Glu 65 70 75
Glu Leu Ala His Ala Leu Gly Leu Lys Val Cys
85 90 Asn Cys Arg Asp Gly Thr Trp Arg Gly Glu lie
100 105 His Gly Pro Asp Leu Glu Ser Trp Glu Ala Trp
115 120 Asp Met Met Ala His Tyr Ala His Val Ala Lys
130 135 Met Phe Cys Val Gly Cys Glu Met Thr Thr Ala 145 150 155
Met Trp Arg Glu Thr lie Ala Arg Val Arg Thr
165 170 Val Thr Tyr Asn Cys Asn His Gly Arg Glu Glu
180 185 Asp Ala Val Asp Leu lie Ser Ser Ser Ala Tyr
195 200 Trp Arg Asp Arg Val Pro Val Leu Arg Glu Val
210 215 Lys Pro Leu Phe Phe Met Glu Val Gly Cys Pro 225 230 235
Gly Ala Cys Pro Trp Asp Tyr Arg His Pro Gly
245 250 Glu Gin Ala Arg Phe Tyr Glu Ala Met Phe Ala
Phe lie Arg Gly Met 15
Gly Thr Asp Glu Ala 30
Phe Asn Trp Val Thr 45
Asp Pro Ala lie Ala 60
lie Ala Ser Met Ala 80
Leu Lys Pro Thr Val 95
Arg Phe Glu Lys Glu 110
Phe Gly Ser Tyr Ser 125
Arg Thr Gly Cys Glu 140
Glu Pro His Ala Ala 160
Glu Tyr Asp Gly Leu 175
His Val Arg Phe Trp 190
Tyr Pro lie Asp Arg 205
Ala Glu Ala His Glu 220
Ser Arg Ser Gly Ser 240
Ala Val Cys Leu Asp 255
Ala Met Pro Asp Glu
260 265 Pro Trp Phe Lys Gly Tyr Met Leu Trp Glu Trp
275 280 Pro Arg Glu Ala Ala Ser Glu Asp Gly Ser Tyr
290 295 Pro Ala Glu Asp Val Val Ala Arg Ala Phe Ser
305
<210> 5
〈211〉 1032
〈212〉 腿 <213〉人工合成
<400> 5 atgggcagcfi
310 315
270
Pro Trp Lys Leu Tyr 285
Cys lie Tyr Gly Lys 300
Ala lie Ala Asn Arg 320
60
gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat
atggctagca tgggacggat cgaaagcgca ttcgatctcg gcttcatccg aggcatgacc 120
tttggcttcg tcggccagca cgggacgtgg ggaaccgacg aggcgcgcgc atcgatgcgt 副
gcgcttgccg aacagccctt caactgggtg acgctcgcct tcgcgggcct catggagcac 240
cccggcgatc ccgccatcgc gtatgggcct ccggtcaccg tgagcgacga cgagattgcg 300
tcgatggcgg agcttgccca cgcactcggg ctcaaggtgt gcctgaagcc gaccgtgaac 360
tgccgagacg ggacgtggcg aggcgagatc cggttcgaga aggaacacgg cccggatctc 420
gagtcctggg aagcgtggtt tgggtcttat tccgacatga tggcccacta cgcgcatgtg 480
gcgaagcgca cgggttgcga gatgttctgc gtgggctgcg agatgacgac tgccgagcca 540
cacgaagcca tgtggcgcga gaccatcgcg cgcgtgcgaa ccgagtacga cggcctcgtg 600
acgtacaact gcaaccacgg gcgcgaggag cacgtgcgct tctgggacgc ggtcgatctc 660
atctcgtcga gcgcctacta tcccatcgac cggtggcgag atcgcgtgcc tgtgctccgc 720
gaggtggcag aggcgcatga aaagccgctc ttcttcatgg aagtggggtg cccgagccgc 780
tccggctccg gcgcctgccc gtgggactac cggcacccag gcgccgtctg tcttgacgag 840caggcgcggt tctacgaagc catgttcgcc gccatgcccg acgagccgtg gttcaagggt 900
tacatgctgt gggaatggcc gtggaagctg tacccgcgcg aagcggcgtc cgaggacgga 960
agctactgca tctacggcaa accggccgag gacgtcgtgg cgcgggcgtt ctcggccatc 1020
gcaaatcgat ga 1032
〈210〉 6
<211〉 343
〈212〉 PRT
<213〉 重組表達(dá)
<400> 6
Met Gly Ser Ser 1
Arg Gly Ser His 20
Leu Gly Phe lie 35
Thr Trp Gly Thr 50
Gin Pro Phe Asn 65
Pro Gly Asp Pro
Asp Glu lie Ala 100
Val Cys Leu Lys 115
Glu lie Arg Phe 130
Ala Trp Phe Gly 145
Ala Lys Arg Thr
Thr Ala Glu Pro 180
Arg Thr Glu Tyr 195
Glu Glu His Val
His His His His His His Ser 5 10 Met Ala Ser Met Gly Arg lie 25
Arg Gly Met Thr Phe Gly Phe 40
Asp Glu Ala Arg Ala Ser Met 55
Trp Val Thr Leu Ala Phe Ala
70 75 Ala lie Ala Tyr Gly Pro Pro 85 90 Ser Met Ala Glu Leu Ala His 105
Pro Thr Val Asn Cys Arg Asp 120
Glu Lys Glu His Gly Pro Asp 135
Ser Tyr Ser Asp Met Met Ala 150 155 Gly Cys Glu Met Phe Cys Val 165 170 His Glu Ala Met Trp Arg Glu 185
Asp Gly Leu Val Thr Tyr Asn 200
Arg Phe Trp Asp Ala Val Asp
Ser Gly Leu Val Pro 15
Glu Ser Ala Phe Asp 30
Val Gly Gin His Gly 45
Arg Ala Leu Ala Glu 60
Gly Leu Met Glu His 80
Val Thr Val Ser Asp 95
Ala Leu Gly Leu Lys 110
Gly Thr Trp Arg Gly 125
Leu Glu Ser Trp Glu 140
His Tyr Ala His Val 160
Gly Cys Glu Met Thr 175
Thr lie Ala Arg Val 190
Cys Asn His Gly Arg 205
Leu lie Ser Ser Ser
210 215 Ala Tyr Tyr Pro lie Asp Arg Trp Arg Asp Arg 225 230 235
Glu Val Ala Glu Ala His Glu Lys Pro Leu Phe
245 250 Cys Pro Ser Arg Ser Gly Ser Gly Ala Cys Pro
260 265 Pro Gly Ala Val Cys Leu Asp Glu Gin Ala Arg
275 280 Phe Ala Ala Met Pro Asp Glu Pro Trp Phe Lys
290 295 Glu Trp Pro Trp Lys Leu Tyr Pro Arg Glu Ala 305 310 315
Ser Tyr Cys lie Tyr Gly Lys Pro Ala Glu Asp
325 330 Phe Ser Ala lie Ala Asn Arg 340
〈210〉 7 〈211〉 1032 〈212〉 DNA 〈213〉人工合成 〈400〉 7
atgggcagca gccatcatca tcatcatcac
220
Val Pro Val Leu Arg 240
Phe Met Glu Val Gly 255
Trp Asp Tyr Arg His 270
Phe Tyr Glu Ala Met 285
Gly Tyr Met Leu Trp 300
Ala Ser Glu Asp Gly 320
Val Val Ala Arg Ala 335
60
agcagcggcc tggtgccgcg cggcagcca/t
atggctagca tgggacggat cgaaagcgca ttcgatctcg gcttcatccg aggcatgacc 120
tttggcUcg tcggccagca cgggacgtgg ggaaccgacg aggcgcgcgc atcgatgcgt 訓(xùn)
gcgcttgccg aacagccctt caactgggtg acgctcgcct tcgcgggcct catggagcac 240
cccggcgatc ccgccatcgc gtatgggcct ccggtcaccg tgagcgacga cgagattgcg 300
tcgatggcgg agcttgccca cgcactcggg ctcaaggtgt gcctgaagcc gaccgtgaac 360
tgccgagacg ggacgtggcg aggcgagatc cggttcgaga aggaacacgg cccggatctc 420
gagtcctggg aagcgtggtt tgggtcttat tccgacatga tggcccacta cgcgcatgtg 480
gcgaagcgca cgggttgcga gatgttctgc gtgggctgcg卿tgacgac tgccgagcca 540
cacgcagcca tgtggcgcga gaccatcgcg cgcgtgcgaa acgtacaact gcaaccacgg gcgcgaggag cacgtgcgct atctcgtcga gcgcctacta tcccatcgac cggtggcgag gaggtggcag aggcgcatga aaagccgctc ttcttcatgg tccggctccg gcgcctgccc gtgggactac cggcacccag caggcgcggt tctacgaagc catgttcgcc gccatgcccg t織tgctgt gggaatggcc gtggaagctg tacccgcgcg agctactgca tctacggcaa accggccgag gacgtcgtgg gcaaatcgat ga
〈210〉 8
〈211〉 343
〈212〉 PRT
<213〉 重組表達(dá)
<400〉 8
Met Gly Ser Ser 1
Arg Gly Ser His 20
Leu Gly Phe lie 35
Thr Trp Gly Thr 50
Gin Pro Phe Asn 65
Pro Gly Asp Pro
Asp Glu lie Ala 100
Val Cys Leu Lys 115
Glu lie Arg Phe
His His 5
Met Ala
Arg Gly
Asp Glu
Trp Val 70 Ala lie 85
Ser Met Pro Thr Glu Lys
His His His
Ser Met Gly 25
Met Thr Phe 40
Ala Arg Ala 55
Thr Leu Ala
Ala Tyr Gly
Ala Glu Leu 105
Val Asn Cys
120 Glu His Gly
His Ser 10
Arg lie
Gly Phe
Ser Met
Phe Ala
75 Pro Pro 90
Ala His Arg Asp Pro Asp
ccgagtacga cggcctcgtg 600
tctgggacgc ggtcgatctc 660
atcgcgtgcc tgtgctccgc 720
aagtggggtg cccgagccgc 780
gcgccgtctg tcttgacgag 840
acgagccgtg gttcaagggt 900
aagcggcgtc cgaggacgga 960
cgcgggcgtt ctcggccatc 1020
1032
Ser Gly Leu Vsl Pro 15
Glu Ser Ala Phe Asp 30
Val Gly Gin His Gly 45
Arg Ala Leu Ala Glu 60
Gly Leu Met Glu His 80
Val Thr Val Ser Asp 95
Ala Leu Gly Leu Lys 110
Gly Thr Trp Arg Gly 125
Leu Glu Ser Trp Glu130 135 140
Ala Trp Phe Gly Ser Tyr Ser Asp Met Met Ala His Tyr Ala His Val 145 150 155 160
Ala Lys Arg Thr Gly Cys Glu Met Phe Cys Val Gly Cys Glu Met Thr
165 170 175
Thr Ala Glu Pro His Ala Ala Met Trp Arg Glu Thr lie Ala Arg Val
180 185 190
Arg Thr Glu Tyr Asp Gly Leu Val Thr Tyr Asn Cys Asn His Gly Arg
195 200 205
Glu Glu His Val Arg Phe Trp Asp Ala Val Asp Leu lie Ser Ser Ser
210 215 220
Ala Tyr Tyr Pro lie Asp Arg Trp Arg Asp Arg Val Pro Val Leu Arg 225 230 235 240
Glu Val Ala Glu Ala His Glu Lys Pro Leu Phe Phe Met Glu Val Gly
245 250 255
Cys Pro Ser Arg Ser Gly Ser Gly Ala Cys Pro Trp Asp Tyr Arg His
260 265 270
Pro Gly Ala Val Cys Leu Asp Glu Gin Ala Arg Phe Tyr Glu Ala Met
275 280 285
Phe Ala Ala Met Pro Asp Glu Pro Trp Phe Lys Gly Tyr Met Leu Trp
290 295 300
Glu Trp Pro Trp Lys Leu Tyr Pro Arg Glu Ala Ala Ser Glu Asp Gly 305 310 315 320
Ser Tyr Cys lie Tyr Gly Lys Pro Ala Glu Asp Val Val Ala Arg Ala
325 330 335
Phe Ser Ala lie Ala Asn Arg
340
<210〉9
<211>1173
<212〉DNA
〈213〉人工合成
〈400〉9
tcgacggcat ggtcgcccac accgagagca tgatccaagc ggggcttccg cttctccagc 60 gaggcgaata c已caggcggc cgatacgcgt acttcgacgg cgcgtcgtct gcgcgagccg 120 tgattgaact gctggaa獄gaccgccgtt gaggcgcctt ggaggtgaac tgggatggga 180cggatcgaaa gcgcattcga tctcggcttc atccgaggca tgacctttgg cttcgtcggc 240
cagcacggga cgtggggaac cgacgaggcg cgcgcatcga tgcgtgcgct tgccgaacag 300
cccttcaact gggtgacgct cgccttcgcg ggcctcatgg agcaccccgg cgatcccgcc 360
atcgcgtatg ggcctccggt caccgtgagc gacgacgaga ttgcgtcg已t ggcggagctt 420
gcccacgcac tcgggctcaa ggtgtgcctg aagccgaccg tgaactgccg agacgggacg 480
tggcgaggcg agatccggtt cgag3aggaa cacggcccgg atctcgagtc ctggga3gcg 540
tggtttgggt cttattccga catgatggcc cactacgcgc atgtggcg犯gcgcacgggt 600
tgcgagatgt tctgcgtggg ctgcgagatg acgactgccg agccacacga agccatgtgg 660
cgcgagacca tcgcgcgcgt gcgaaccgag tacgacggcc tcgtgacgta caactgcaac 720
cacgggcgcg aggagcacgt gcgcttctgg gacgcggtcg atctcatctc gtcgagcgcc 780
tactatccca tcgaccggtg gcgagatcgc gtgcctgtgc tccgcgaggt ggcagaggcg 840
catgaaaagc cgctcttctt catggaagtg gggtgcccga gccgctccgg ctccggcgcc 900
tgcccgtggg actaccggca cccaggcgcc gtctgtcttg acgagcaggc gcggttctac 960
gaagccatgt tcgccgccat gcccgacgag ccgtggttca agggttacat gctgtgggaa 1020
tggccgtgga agctgtaccc gcgcgaagcg gcgtccgagg acggaagcta ctgcatctac 1080
ggcaaaccgg ccgaggacgt cgtggcgcgg gcgttctcgg ccatcgcaaa tcgatgacgg 1140
gc已cgcggtt cgtccgcgcc atccggtcga
1170
權(quán)利要求
1、一種β-甘露聚糖酶，該β-甘露聚糖酶具有SEQ IDNO.2所示的氨基酸序列，SEQ IDNO.4所示的氨基酸序列，SEQ IDNO.6所示的氨基酸序列，SEQ IDNO.8所示的氨基酸序列，或者對(duì)SEQ IDNO.2、SEQ IDNO.4、SEQ IDNO.6或SEQ IDNO.8所示的氨基酸序列進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)氨基酸取代、缺失或添加而形成的β-甘露聚糖酶活性不變的氨基酸序列。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的P-甘露聚糖酶，其中，該(3-甘露聚糖酶具有 SEQ ID: N0.2所示的氨基酸序列，SEQ ID: N0.4所示的氨基酸序列，SEQ ID: N0.6所示的氨基酸序列，或者SEQID: NO. 8所示的氨基酸序列。
3、 編碼權(quán)利要求l所述的P-甘露聚糖酶的基因。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因，該基因具有SEQID: NO. l所示核苷 酸序列，SEQ ID: N0.3所示的核苷酸序列，SEQ ID: NO. 5所示的核苷酸 序歹U， SEQ ID: NO. 7所示的核苷酸序列，或者對(duì)SEQ ID: NO. 1、 SEQ ID: NO. 3、 SEQ ID: NO. 5或SEQ ID: NO. 7所示的核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或幾 個(gè)核苷酸取代、缺失或添加而得到的編碼活性不變的P-甘露聚糖酶的核苷酸 序列。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的基因，該基因具有SEQ ID: NO. l所示的核 苷酸序列，SEQ ID: N0.3所示的核苷酸序列，SEQ ID: NO. 5所示的核苷 酸序列，或者SEQID: N0.7所示的核苷酸序列。
6、 一種重組載體，該重組載體含有權(quán)利要求3-5中任意一項(xiàng)所述的基因。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組載體，其中，該重組載體為重組質(zhì)粒。
8、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的重組載體，其中，該重組載體為重組質(zhì)粒 pUC1.17或重組質(zhì)粒pETMAN-HA963。
9、 一種重組宿主細(xì)胞，該重組宿主細(xì)胞含有權(quán)利要求6所述的重組載體。
10、 根據(jù)權(quán)利要求9所述的重組宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌。
11、 根據(jù)權(quán)利要求10所述的重組宿主細(xì)胞，所述大腸桿菌為大腸桿菌 DH5a或大腸桿菌BL21 (DE3)。
12、 根據(jù)權(quán)利要求11所述的重組宿主細(xì)胞，該重組宿主細(xì)胞為保藏編 號(hào)為CGMCCNo.2051的重組大腸桿菌DH5a (pUC1.17)。
13、 一種(3-甘露聚糖酶的制備方法，該方法包括培養(yǎng)權(quán)利要求9-12中 任意一項(xiàng)所述的重組宿主細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種β-甘露聚糖酶，該β-甘露聚糖酶具有SEQ IDNO.2所示的氨基酸序列，SEQ IDNO.4所示的氨基酸序列，SEQ IDNO.6所示的氨基酸序列，SEQ IDNO.8所示的氨基酸序列，或者對(duì)SEQ IDNO.2、SEQ IDNO.4、SEQ IDNO.6或SEQ IDNO.8所示的氨基酸序列進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)氨基酸取代、缺失或添加而得到的β-甘露聚糖酶活性不變的氨基酸序列。本發(fā)明還提供了編碼上述β-甘露聚糖酶的基因、含有所述基因的重組載體和含有所述重組載體的宿主細(xì)胞。本發(fā)明還提供了一種β-甘露聚糖酶的制備方法，該方法包括培養(yǎng)本發(fā)明提供的宿主細(xì)胞。本發(fā)明提供的β-甘露聚糖酶具有耐熱耐酸性，可以利用本發(fā)明構(gòu)建的原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行生產(chǎn)，而且可以利用六個(gè)組氨酸標(biāo)簽進(jìn)行純化。
文檔編號(hào)C12N1/21GK101392241SQ20071012192
公開(kāi)日2009年3月25日 申請(qǐng)日期2007年9月18日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月18日
發(fā)明者張躍靈, 薛燕芬, 馬延和 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院微生物研究所