專(zhuān)利名稱(chēng)：一種水溶性β-1,3/1,6-葡聚糖的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種水溶性P -1， 3/1， 6-葡聚糖的制備方法。
技術(shù)背景酵母是一種單細(xì)胞真菌，是迄今為止人類(lèi)使用最廣泛、經(jīng)濟(jì)價(jià)值最高的微生物。 國(guó)際FDA認(rèn)可啤酒酵母為安全的微生物，已經(jīng)在飲料和食品的生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用。目前， 我國(guó)年消耗酵母約2000噸，產(chǎn)生約3噸的廢酵母泥。由于酵母細(xì)胞壁是啤酒制造產(chǎn) 業(yè)的主要副產(chǎn)物，而且現(xiàn)今對(duì)其的主要處理方法就是作為粗飼料廉價(jià)售出或者直接排 放，給環(huán)境造成很大的資源浪費(fèi)和污染。已經(jīng)有多個(gè)研究結(jié)果表明，純凈的酵母細(xì)胞壁對(duì)動(dòng)物具有明顯的免疫促進(jìn)作用， 而且還表現(xiàn)出促進(jìn)生長(zhǎng)作用。進(jìn)一步的證據(jù)表明，其主要機(jī)理是其中含有的e -1， 3/1， 6-葡聚糖和甘露聚糖具有相應(yīng)的免疫和生長(zhǎng)促進(jìn)作用，已有大量試驗(yàn)研究結(jié) 果表明，0-1，3/1，6-葡聚糖和甘露聚糖是效果顯著的動(dòng)物機(jī)體功能調(diào)節(jié)劑。而且， 隨著飼用抗生素的逐漸禁用，安全、可替代的生物詞料添加劑正逐漸成為行業(yè)主流。e-l，3/1，6-葡聚糖是酵母P-葡聚糖的正式學(xué)名。其結(jié)構(gòu)為葡萄糖分子以 0-1,3-糖苷鍵連接形成主鏈，以e-l，6-糖苷鍵連接形成支鏈。葡萄糖分子從主鏈上以e-i,6連接發(fā)出分枝。-r-(3-D-Glcp-(l，3)- P-D-Glcp-(1，3)- |3-D-GlcP-(l,3)- (3-D-GlcpNAc-l-I 1,6p-D-Glcp-(l ，6)-|3-D-Quip-( 1,6)國(guó)際國(guó)內(nèi)制備飼料用免疫調(diào)節(jié)劑0 -1, 3/1， 6-葡聚糖的主要方法為化學(xué)提取法。 但采用化學(xué)方法提取的P-1，3/1，6-葡聚糖的得率偏低(<17%) 、 P-l，3/l，6-葡聚 糖產(chǎn)品純度不高(<85%)以及成本較高。在美國(guó)，飼料用P-1，3/1，6-葡聚糖的價(jià)格 大概為2000 5000美元/千克(視產(chǎn)品純度而定，有些甚至可達(dá)到10000美元/千克)。 甘露聚糖的主要生產(chǎn)方式則多為微生物發(fā)酵方法，費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、結(jié)果不穩(wěn)定(純度<75 %，得率〈15%)且成本較高。酵母細(xì)胞壁中直接提取的0 -1， 3/1, 6-葡聚糖為水不溶性P -1， 3/1， 6-葡聚糖，其 提取方法主要包括堿提取一步法、酸提取一步法和酸堿復(fù)合提取法等三類(lèi)方法。堿一步提取法以s叩hantharika等(2003)方法為代表，其旨在優(yōu)化提取工藝，
提高提取效率，綜合考慮堿濃度、提取時(shí)間、提取溫度以及堿溶液與底物酵母細(xì)胞壁 的混合比例。該方法采用逐步確定參數(shù)法，分別考慮各個(gè)影響因素。得出各參數(shù)分別 為混合比例為l: 5 (酵母細(xì)胞壁堿液)、提取時(shí)間lh、溫度為90。C、堿濃度為4% (NaOH)，得到產(chǎn)品的得率為19 22%。此方法工藝簡(jiǎn)單、提取物得率較高、產(chǎn) 物中蛋白含量也較低，但提取物中0-l，3/l，6-葡聚糖的含量也較低。酸一步提取法的方法范圍較廣，主要是所采用的酸的種類(lèi)和濃度都變化很大。但 酸提取的主要缺點(diǎn)就是提取產(chǎn)物中P -葡聚糖的含量也較低，原因是在提取過(guò)程中為 酸所水解(降解)的P-葡聚糖較多。 一般情況下不采用酸提取法。近些年來(lái)各國(guó)主要采用的方法主要集中于酸堿復(fù)合方法的建立、改進(jìn)和參數(shù)優(yōu)化 上。e-葡聚糖得率、純度等隨工藝流程變化有很大不同。比較有代表性的主要是 Stefan等(2003)研究的結(jié)果，其工藝溫和、pH無(wú)嚴(yán)格限制，旨在盡可能保持細(xì)胞 壁中e-葡聚糖的結(jié)構(gòu)，同時(shí)提高提取物得率。其提取物經(jīng)檢測(cè)可得，P-葡聚糖的含 量為85%，甘露糖為6%，蛋白質(zhì)含量為5%，含微量的脂類(lèi)，該工藝得率可達(dá)細(xì)胞 壁干重的26%。由于其在中試條件下的結(jié)果表明，葡聚糖含量還可進(jìn)一步提高，甘 露聚糖和蛋白含量進(jìn)一步下降。水溶性的0-葡聚糖的制備有部分實(shí)驗(yàn)室研究結(jié)果報(bào)道。Hunter (2002)將堿、 酸復(fù)合提取得到的不溶性提取物采用超聲波和噴霧干燥技術(shù)可制備出直徑均一為 1 2uM的顆粒，可水溶。該方法可制得較純凈且生物活性較好的水溶性e-葡聚糖， 但得率較低(總糖含量85%)，幾丁質(zhì)、蛋白、脂肪及核酸等去除不夠(幾丁質(zhì)4.5%、 其余均處于1 5%之間)。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種水溶性0 -1， 3/1， 6-葡聚糖的制備方法。 本發(fā)明所提供的一種水溶性e -1， 3/1， 6-葡聚糖的制備方法，包括下述步驟1) 氧化劑降解處理:將水不溶性e -1， 3/1， 6-葡聚糖懸浮于氧化劑溶液中，在2 8°C，靜置降解16 24h，離心收集沉淀；所述氧化劑溶液為含有體積百分濃度為5 15%的NaClO、質(zhì)量百分濃度為0. 05 0. 2mol/L NaOH和體積百分濃度為0. 05 0. 2% 的DMS0的溶液；2) 洗滌將步驟l)中所得的沉淀用乙醇和丙酮分別重懸攪拌洗滌30分鐘 1 小時(shí)，離心收集沉淀；3) 超聲處理將步驟2)所得沉淀重懸于體積百分濃度為0.05 0.2%的DMSO 溶液中，將重懸液進(jìn)行超聲處理20 30分鐘；離心收集上清液得到水溶性e -1，3/1，6-葡聚糖溶液。
所述方法中，所述步驟1)中，所述水不溶性0-1， 3/1,6-葡聚糖懸浮于所述氧 化劑溶液中的濃度為30 50g/L，優(yōu)選為30g/L;所述氧化劑溶液優(yōu)選為含有體積百分 濃度為10%的NaClO、質(zhì)量百分濃度0. lmol/L NaOH和體積百分濃度為0. 1%的DMSO 的溶液。所述方法中，所述步驟l)中，所述氧化反應(yīng)的溫度為4"C，時(shí)間為24小時(shí)。所述方法中，所述步驟2)中，所述乙醇或丙酮的用量為4-5ml/g沉淀干重；所 述乙醇或丙酮洗滌時(shí)間分別優(yōu)選為1小時(shí)。所述方法中，所述步驟3)中，所述DMSO溶液的體積百分濃度優(yōu)選為0. 1%;所 述超聲處理的超聲頻率為20KHz，超聲功率為50 150W，間隔時(shí)間為0. 2 0. 8 s; 超聲功率優(yōu)選為IOOW，間隔時(shí)間優(yōu)選為0. 5s。所述方法中還包括將所述水溶性0 -1， 3/1， 6-葡聚糖溶液濃縮，冷凍干燥或減壓 蒸干得到水溶性0 -1， 3/1， 6-葡聚糖粉。所述方法中，所述水不溶性e-1,3/1，6-葡聚糖的制備方法，包括下述步驟① 酶解破壁處理將酵母細(xì)胞壁的懸浮液中加入溶菌酶，在35 4(TC下，酶解， 離心收集沉淀；② 堿處理將步驟①得到的酶解后的產(chǎn)物，在0.5 1.5mol/L的Na0H溶液中， 在75 9(TC下，進(jìn)行攪拌處理2 3小時(shí)，然后離心收集沉淀；③ 酸處理將步驟②得到的沉淀在體積百分濃度為2 8%的乙酸溶液中，室溫 條件下，攪拌處理2 3小時(shí)，離心收集沉淀； 脫脂、去除蛋白將步驟③酸處理后離心得到的沉淀依次用無(wú)水乙醇、丙酮和 乙醚依次重懸攪拌洗滌30 60分鐘，乙醚處理后再靜置12 24小時(shí)，離心收集沉淀 干燥得到水不溶性e -1， 3/1， 6-葡聚糖。所述步驟①中，所述酶解溫度為37X:;所述酶解溫度優(yōu)選為37X:。所述溶菌酶 的添加量為0. 5 3mg/g ( 10000 60000U/g)酵母細(xì)胞壁干重，優(yōu)選為lmg/g (20000U/g)酵母細(xì)胞壁干重；所述溶菌酶在所述酵母細(xì)胞壁的懸浮液中的濃度為 2000 12000U/ml，優(yōu)選為4000U/ml。所述酶解時(shí)間為30 60分鐘，優(yōu)選為30分鐘。所述步驟②中，所述Na0H溶液的濃度為lmol/L;所述堿處理的溫度為85°C ， 堿處理時(shí)間為3小時(shí)；所述酶解后的產(chǎn)物干重與所述NaOH溶液的質(zhì)量/體積比為lg: 5 12ral，優(yōu)選為lg: 5-6ml。所述步驟③中，所述乙酸溶液的體積百分濃度為4%;所述酸處理溫度為室溫，酸處理時(shí)間為2小時(shí)；所述步驟②得到的沉淀干重與所述乙酸溶液的質(zhì)量/體積比為 lg: 5-12ml，優(yōu)選為lg: 10-llml;所述方法中，還包括將所述步驟②、②和③中收
集的沉淀用水洗滌。本發(fā)明將化學(xué)處理和超聲波破碎結(jié)合起來(lái)，首先采用化學(xué)氧化的方法初步將大 分子量葡聚糖破碎成較小分子量片段，在此基礎(chǔ)上緊接著以超聲波破碎成合適分子量 大小的葡聚糖，并且以有機(jī)溶劑去除產(chǎn)物中的大多數(shù)非葡聚糖成分。其優(yōu)點(diǎn)在于降低 單純化學(xué)處理的副產(chǎn)品的環(huán)境污染和單純超聲波處理的產(chǎn)品不均一性，以有機(jī)溶劑處 理可以提高產(chǎn)品中水溶性葡聚糖的純度和得率，并在一定程度上降低了提取的成本， 總結(jié)出一套完整的提取、純化工藝。本發(fā)明的方法制備的水溶性P-1,3/1， 6-葡聚糖經(jīng)檢測(cè)，得率可達(dá)到95%以上， 蛋白含量和脂肪含量很小。本發(fā)明的方法制備的水溶性P -1， 3/1， 6-葡聚糖平均分子 量為190KD,為水溶性多聚糖，經(jīng)動(dòng)物試驗(yàn)驗(yàn)證均為適合動(dòng)物生產(chǎn)實(shí)踐中應(yīng)用的免疫 調(diào)節(jié)劑。


圖1為水不溶性P-l，3/l，6-葡聚糖的制備方法流程圖。 圖2為水溶性e -1， 3/1， 6-葡聚糖的制備方法流程圖。
具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中的方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法。 下述實(shí)施例中所述的百分含量，如無(wú)特別說(shuō)明，均為質(zhì)量百分含量。 實(shí)施例1、水溶性e -1， 3/1， 6-葡聚糖的制備 一、水不溶性P-1,3/1， 6-葡聚糖的制備水不溶性P -1， 3/1， 6-葡聚糖的制備操作流程如圖1所示，具體步驟如下所述1、 酵母細(xì)胞壁的酶解將100g酵母細(xì)胞壁(產(chǎn)品購(gòu)自湖北宜昌安琪酵母股份公 司，"福邦"牌)、100mg (20000U/mg)溶菌酶(源自卵清蛋白，Cayman)和500ral 水混合(質(zhì)量比為1000: 1: 5000) ， 37。C條件下用勻速攪拌器中速(上海標(biāo)本模型 廠，驃馬牌可調(diào)速攪拌器，200 300轉(zhuǎn)/分鐘)攪拌，攪拌時(shí)間為30分鐘，之后以 3000轉(zhuǎn)/分鐘(上海安亭科學(xué)儀器廠，DL6000B型冷凍離心機(jī)，下同)離心20分鐘去 上清得到95.3 g沉淀，即為酵母細(xì)胞壁酶解后的產(chǎn)物。2、 堿處理將步驟l中所得母細(xì)胞壁酶解后的產(chǎn)物95.3g加入500ml 1M NaOH 溶液中(即按照破壁后的產(chǎn)物干重與1M NaOH溶液的質(zhì)量/體積比約為lg: 5ml的比 例添加)，在85'C條件下用勻速攪拌器中速(上海標(biāo)本模型廠，驃馬牌可調(diào)速攪拌 器，200 300轉(zhuǎn)/分鐘)攪拌，攪拌時(shí)間為3小時(shí)，然后以3600轉(zhuǎn)/分鐘離心20分 鐘，得到上清液(可繼續(xù)用于提取甘露聚糖)，和29.5 g沉淀。將沉淀用水洗滌三 遍，得到28.7 g沉淀。3、 酸處理將步驟2中所得堿處理后的產(chǎn)物28. 7 g加入300 ml體積百分濃度 為4%乙酸溶液中(即按照堿處理后的產(chǎn)物干重與4%乙酸溶液的質(zhì)量/體積比約為 lg- 10ml的比例添加)，在室溫條件下用勻速攪拌器中速(上海標(biāo)本模型廠，驃馬 牌可調(diào)速攪拌器，200 300轉(zhuǎn)/分鐘)攪拌，攪拌時(shí)間為2小時(shí)，之后以3000轉(zhuǎn)/ 分鐘離心20分鐘去上清。得到22.2g沉淀，將沉淀用水洗滌三遍。將沉淀用水洗滌 三遍，得到21.5g沉淀。4、 乙醇洗滌將步驟3中所得酸處理后的產(chǎn)物(21. 5g)按照0. 2-0. 25g產(chǎn)物(干 重)/ml的量加入到無(wú)水乙醇中，室溫(18 25°C，下同)條件下用勻速攪拌器中速(上海標(biāo)本模型廠，驃馬牌可調(diào)速攪拌器，200 300轉(zhuǎn)/分鐘)攪拌，攪拌時(shí)間為1 小時(shí)，之后以3000轉(zhuǎn)/分鐘速度離心20分鐘去上清，收集沉淀。5、 丙酮洗滌將步驟4中所得乙醇洗滌后的沉淀產(chǎn)物按照0.2-0.25g產(chǎn)物(干 重)/ml的量加入到無(wú)水丙酮中，室溫條件下用勻速攪拌器慢速攪拌(上海標(biāo)本模型 廠，驃馬牌可調(diào)速攪拌器，100 150轉(zhuǎn)/分鐘)，攪拌時(shí)間為l小時(shí)，之后以2400 轉(zhuǎn)/分鐘速度離心20分鐘去上清，收集沉淀。6、 乙醚洗滌將步驟5中所得丙酮處理后的沉淀產(chǎn)物按照0.2-0.25g產(chǎn)物(干 重)/ml的量于通風(fēng)櫥中加入到無(wú)水乙醚中，室溫條件下用勻速攪拌器慢速(上海標(biāo) 本模型廠，驃馬牌可調(diào)速攪拌器，100 150轉(zhuǎn)/分鐘)攪拌，攪拌時(shí)間為l小時(shí)，之 后將容器蓋蓋后室溫靜置12 24小時(shí)。然后，2400轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘去上清，干 燥(氣流吹干或減壓蒸干或冷凍干燥)，得到20. 1 g水不溶性P-1,3/1, 6-葡聚糖。7、 所得產(chǎn)物純度采用總糖測(cè)定法和薄層層析測(cè)定法確定，結(jié)果表明上述得到的 水不溶性0 -1, 3/1， 6-葡聚糖的純度為91. 5%;得率采用產(chǎn)物量/所用細(xì)胞壁量相比， 結(jié)果為20. 1%;分子量按照熒光法(Rinsten， L. ， T. Stenberg and R. Andersson. 2003. Determination of P -glucan molecular weight using SEC with calcofluor detection in cereal extracts. Ceres7 CZ e歷i6^ry， 80(4) :485-490)測(cè)定，約為 800 850KD。結(jié)構(gòu)檢測(cè)經(jīng)紅外光譜和核磁共振分析如下所示-『-|3-D-Glci>(l,3)- 0-D-Glcp-(l,3V 0-D-Glcp-(U). (3-D-GlcpNAc-l-I L6卩-D-Glcp-(l ,6)-p陽(yáng)D-Quip-( 1,6)產(chǎn)品中蛋白質(zhì)、脂肪和粗灰分含量的測(cè)定采用國(guó)標(biāo)方法，分別為蛋白含量為1. 15%、脂肪含量為0. 43%。二、水溶性e-l，3/l，6-葡聚糖的制備(操作流程如圖2所示)1、氧化處理將步驟一制備的水不溶性e-1,3/1, 6-葡聚糖干粉20. OOg，按照
水不溶性P-1， 3/1,6-葡聚糖NaClO (體積百分濃度為10%) : NaOH (0. lmol/L): DMS0 (體積百分濃度為0. 1%) =1: 10: 10: 10 (g: mL: niL: mL)配成懸濁液，在4 °C，于暗處?kù)o置氧化反應(yīng)24h，反應(yīng)完全后，將反應(yīng)混合物離心(離心速度3000轉(zhuǎn)/ 分鐘，上海安亭科學(xué)儀器廠，DL6000B型冷凍離心機(jī)，下同)收集得到19.87 g沉淀。2、 洗滌將步驟l中所得氧化處理后的離心沉淀按照0.20-0.25g/ml (干物質(zhì) 基礎(chǔ))加入無(wú)水乙醇中重懸，室溫條件下用均速攪拌器中速(上海標(biāo)本模型廠，驃馬 牌可調(diào)速攪拌器，200 300轉(zhuǎn)/分鐘)混合，混合時(shí)間為l小時(shí)，之后以3000轉(zhuǎn)/分 鐘速度離心20分鐘去上清。將獲得的沉淀按照0. 20-0. 25g/ml (干物質(zhì)基礎(chǔ))加入 無(wú)水丙酮中，室溫條件下用均速攪拌器慢速(上海標(biāo)本模型廠，驃馬牌可調(diào)速攪拌器， 100 150轉(zhuǎn)/分鐘)攪拌混合，攪拌混合時(shí)間l小時(shí)，之后以2400轉(zhuǎn)/分鐘速度離心 20分鐘去上清，收集沉淀。3、 超聲處理步驟2所得沉淀重懸于體積百分濃度為0. 1。/。的DMS0溶液中，將 重懸液進(jìn)行超聲波處理(超聲時(shí)間20min，超聲頻率20KHz，超聲功率IOOW，間隔時(shí) 間O. 5s)。4、 超聲完畢后將混合物在3000 rpm下離心去掉沉淀，濃縮上清液，冷凍干燥或 減壓蒸干得到19. 19g水溶性0 -1， 3/1， 6-葡聚糖。5、 所得產(chǎn)物分子量按照熒光法(Rinsten， L. ， T. Stenberg and R. Andersson. 2003. Determination of P -glucan molecular weight using SEC with calcofluor detection in cereal extracts. Ceres7 C力柳15^r7， 80(4) :485-490)測(cè)定，平均 分子量為190KD。結(jié)構(gòu)檢測(cè)經(jīng)紅外光譜和核磁共振分析如下所示-r-P-D-G-(U)- e-D-G-(l、3)陽(yáng)(3-D-G-(l，3)陽(yáng)B-D-G-l-I L6p國(guó)D-G-(l,6)-P-D-Quip-(1，6)得率可達(dá)到95.95%。產(chǎn)品的蛋白質(zhì)和脂肪含量采用國(guó)標(biāo)方法進(jìn)行，分別為蛋 白含量為1. 15%、脂肪含量為0. 43%。實(shí)施例2、水溶性e-1，3/1，6-葡聚糖的制備 一、水不溶性P-1，3/1,6-葡聚糖的制備水不溶性P -1, 3/1， 6-葡聚糖的制備操作流程如圖1所示，具體步驟如下所述 1、酵母細(xì)胞壁的酶解將200g酵母細(xì)胞壁、400mg (20000U/mg)溶菌酶(源自 卵清蛋白，Cayman)和500ml水混合，35。C條件下用勻速攪拌器中速(上海標(biāo)本模型 廠，驃馬牌可調(diào)速攪拌器，200 300轉(zhuǎn)/分鐘)攪拌，攪拌時(shí)間為60分鐘，之后以 3000轉(zhuǎn)/分鐘(上海安亭科學(xué)儀器廠，DL6000B型冷凍離心機(jī))離心25分鐘去上清得 到191.20g沉淀，即為酵母細(xì)胞壁酶解后的產(chǎn)物。2、 堿處理將步驟1中所得酵母細(xì)胞壁酶解后的產(chǎn)物191. 20 g加入2000ml 0. 5 MNaOH溶液中(即按照破壁后的產(chǎn)物干重與NaOH溶液的質(zhì)量/體積比約為lg: 10ml 的比例添加)，在75r條件下用勻速攪拌器中速攪拌(上海標(biāo)本模型廠，驃馬牌可 調(diào)速攪拌器，200 300轉(zhuǎn)/分鐘)，攪拌時(shí)間為3小時(shí)，然后以3600轉(zhuǎn)/分鐘離心 20分鐘，得到上清液2040ml繼續(xù)用于提取甘露聚糖，和50. 4 g沉淀(用于提取水 不溶性e-1,3/1, 6-葡聚糖)。3、 酸處理將步驟2中所得堿處理后的產(chǎn)物50.4 g加入260 ml體積百分含量 為2%乙酸溶液中(即按照堿處理后的產(chǎn)物干重與乙酸溶液的質(zhì)量/體積比約為lg: 5ml的比例添加)，在室溫條件下用勻速攪拌器中速(上海標(biāo)本模型廠，驃馬牌可調(diào) 速攪拌器，200 300轉(zhuǎn)/分鐘)攪拌，攪拌時(shí)間為2小時(shí)，之后以3000轉(zhuǎn)/分鐘離 心20分鐘去上清。得到36. 12g沉淀，將沉淀用水洗滌三遍。將沉淀用水洗滌三遍， 得到35.80g沉淀。4、 乙醇洗滌將步驟3中所得酸處理后的產(chǎn)物(35.80g)按照0.2-0.25g產(chǎn)物 (干重)/ml的量加入到無(wú)水乙醇中，室溫(18 25°C)條件下用勻速攪拌器中速攪拌，攪拌時(shí)間為30分鐘，之后以3000轉(zhuǎn)/分鐘速度離心20分鐘去上清，收集沉淀。5、 丙酮洗滌將步驟4中所得乙醇洗滌后的沉淀產(chǎn)物按照0.2-0.25g產(chǎn)物(干 重)/ml的量加入到無(wú)水丙酮中，室溫(1S 25。C)條件下用勻速攪拌器慢速攪拌(上 海標(biāo)本模型廠，驃馬牌可調(diào)速攪拌器，100 150轉(zhuǎn)/分鐘)，攪拌時(shí)間為30分鐘， 之后以2400轉(zhuǎn)/分鐘速度離心20分鐘去上清，收集沉淀。6、 乙醚洗滌將步驟5中所得丙酮處理后的沉淀產(chǎn)物按照0.2-0.25g產(chǎn)物(干 重)/ml的量于通風(fēng)櫥中加入到無(wú)水乙醚中，室溫(18 25°C)條件下用勻速攪拌器 慢速(上海標(biāo)本模型廠，驃馬牌可調(diào)速攪拌器，100 150轉(zhuǎn)/分鐘)攪拌，攪拌時(shí)間 為30分鐘，之后將容器蓋蓋后室溫靜置12 24小時(shí)。然后，2400轉(zhuǎn)/分鐘離心20 分鐘去上清，干燥(氣流吹干或減壓蒸干或冷凍干燥)，得到34.63 g水不溶性曰 -l，3/l，6-葡聚糖。7、 所得產(chǎn)物純度釆用總糖測(cè)定法和薄層層析測(cè)定法確定，為89.51%;得率采用 產(chǎn)物量/所用細(xì)胞壁量相比，結(jié)果為17.31%;分子量按照改進(jìn)熒光法(Rinsten， L.， T. Stenberg and R. Andersson. 2003. Determination of P -glucan molecular weight using SEC with calcofluor detection in cereal extracts. CeresJ 67/謹(jǐn).s^y， 80(4):485-490)測(cè)定，結(jié)果表明上述得到的水不溶性P-1， 3/1， 6-葡聚 糖的分子量為800 850KD。結(jié)構(gòu)檢測(cè)經(jīng)紅外光譜和核磁共振分析如下所示
-『-|3-D-Glcp-(U)- |3-D-Glcp-(1，3)- (3-D-Glcp-(U)陽(yáng)p-D-GlcpNAc-1-Ip-D-Glcp-(l ,6)陽(yáng)p-D-Quip-( 1,6)產(chǎn)品的蛋白質(zhì)和脂肪含量采用國(guó)標(biāo)方法進(jìn)行，分別為蛋白含量為l. 14%、脂肪含量為0. 52%。二、水溶性P-1，3/1，6-葡聚糖的制備(操作流程如圖2所示)1、 氧化處理將步驟一制備的水不溶性P-l，3/l，6-葡聚糖干粉20.00g，按照 水不溶性P-1，3/1，6-葡聚糖NaCIO (體積百分濃度為5%) : NaOH (0.05mol/L): DMSO (體積百分濃度為0.05%) =1: 10: 10: 10 (g: mL: mL: mL)配成懸濁液，在 4°C，于暗處?kù)o置氧化反應(yīng)24h，反應(yīng)完全后，將反應(yīng)混合物離心(離心速度3000轉(zhuǎn) /分鐘，上海安亭科學(xué)儀器廠，DL6000B型冷凍離心機(jī)，下同)收集得到19.88 g沉 淀。2、 洗滌將步驟l中所得氧化處理后的離心沉淀按照0.20-0.25g/ml (干物質(zhì) 基礎(chǔ))加入無(wú)水乙醇中重懸，室溫條件下用均速攪拌器中速(上海標(biāo)本模型廠，驃馬 牌可調(diào)速攪拌器，200 300轉(zhuǎn)/分鐘)混合，混合時(shí)間為30小時(shí)，之后以3000轉(zhuǎn)/ 分鐘速度離心20分鐘去上清。將獲得的沉淀按照0. 20-0. 25g/ml (干物質(zhì)基礎(chǔ))加 入無(wú)水丙酮中，室溫條件下用均速攪拌器慢速(上海標(biāo)本模型廠，驃馬牌可調(diào)速攪拌 器，100 150轉(zhuǎn)/分鐘)攪拌混合，攪拌混合時(shí)間l小時(shí)，之后以2400轉(zhuǎn)/分鐘速度 離心20分鐘去上清，收集沉淀。3、 超聲處理步驟2所得沉淀重懸于體積百分濃度為0.05y。的DMSO溶液中，將 重懸液進(jìn)行超聲波處理(超聲時(shí)間20min，超聲頻率20KHz，超聲功率50W，間隔時(shí) 間0.2s)。4、 超聲完畢后將混合物在3000 rpm下離心去掉沉淀，濃縮上清液，冷凍干燥或 減壓蒸干得到18. 13 g水溶性P -1， 3/1, 6-葡聚糖。5、 所得產(chǎn)物分子量按照熒光法(Rinsten, L. ， T. Stenberg and R. Andersson. 2003. Determination of 0 -glucan molecular weight using SEC with calcof luor detection in cereal extracts. Cerea7 C/ e肌.5"fr7， 80(4) :485-490)測(cè)定，平均 分子量為190KD。結(jié)構(gòu)檢測(cè)經(jīng)紅外光譜和核磁共振分析如下所示-「-l3-D-G-(l,3)- P-D-G陽(yáng)(l，3)- B-D-G-(l，3)陽(yáng)B-D-G-l-I 1,6(3-D-G-( 1 ，6)-p-D-Quip-( 1,6)
得率可達(dá)到90.2%。產(chǎn)品的蛋白質(zhì)和脂肪含量采用國(guó)標(biāo)方法進(jìn)行，分別為蛋白含量為1. 17%、脂肪含量為0. 42%。
實(shí)施例3、水溶性P-1，3/1，6-葡聚糖的制備 一、水不溶性P-1,3/1， 6-葡聚糖的制備
水不溶性P -1， 3/1， 6-葡聚糖的制備操作流程如圖1所示，具體步驟如下所述
1、 酵母細(xì)胞壁的酶解將200g酵母細(xì)胞壁、600 mg (20000U/mg)溶菌酶(源 自卵清蛋白，Cayman)和1000ml水混合，4(TC條件下用勻速攪拌器中速(上海標(biāo)本 模型廠，驃馬牌可調(diào)速攪拌器，200 300轉(zhuǎn)/分鐘)攪拌，攪拌時(shí)間為30分鐘，之 后以3000轉(zhuǎn)/分鐘(上海安亭科學(xué)儀器廠，DL6000B型冷凍離心機(jī))離心20分鐘去 上清得到190.8 g沉淀，即為酵母細(xì)胞壁酶解后的產(chǎn)物。
2、 堿處理將步驟l中所得酵母細(xì)胞壁酶解后的產(chǎn)物190.8g加入2000m11.0 MNaOH溶液中(即按照破壁后的產(chǎn)物干重與NaOH溶液的質(zhì)量/體積比約為lg: 10 ml 的比例添加)，在9(TC條件下用勻速攪拌器中速攪拌(上海標(biāo)本模型廠，驃馬牌可 調(diào)速攪拌器，200 300轉(zhuǎn)/分鐘)，攪拌時(shí)間為2.5小時(shí)，然后以3600轉(zhuǎn)/分鐘離 心20分鐘，得到上清液2040ml繼續(xù)用于提取甘露聚糖，和57. 4 g沉淀(用于提取 水不溶性1，3/1,6-葡聚糖)。
3、 酸處理將步驟2中所得堿處理后的產(chǎn)物57. 4 g加入600 ml體積百分含量 為8%乙酸溶液中(即按照堿處理后的產(chǎn)物干重與乙酸溶液的質(zhì)量/體積比約為lg: 10ml的比例添加)，在室溫條件下用勻速攪拌器中速(上海標(biāo)本模型廠，驃馬牌可 調(diào)速攪拌器，200 300轉(zhuǎn)/分鐘)攪拌，攪拌時(shí)間為2.5小時(shí)，之后以3000轉(zhuǎn)/分 鐘離心20分鐘去上清。得到40.2g沉淀，將沉淀用水洗滌三遍。將沉淀用水洗滌三 遍，得到38.0g沉淀。
4、 乙醇洗滌將步驟3中所得酸處理后的產(chǎn)物(38. Og)按照0. 2-0. 25g產(chǎn)物(干 重)/ml的量加入到無(wú)水乙醇中，室溫(18 25°C)條件下用勻速攪拌器中速攪拌， 攪拌時(shí)間為50分鐘，之后以3000轉(zhuǎn)/分鐘速度離心20分鐘去上清，收集沉淀。
5、 丙酮洗漆將步驟4中所得乙醇洗滌后的沉淀產(chǎn)物按照0.2-0.25g產(chǎn)物(干 重)/ml的量加入到無(wú)水丙酮中，室溫(18 25。C)條件下用勻速攪拌器慢速攪拌(上 海標(biāo)本模型廠，驃馬牌可調(diào)速攪拌器，100 150轉(zhuǎn)/分鐘)，攪拌時(shí)間為40分鐘， 之后以2400轉(zhuǎn)/分鐘速度離心20分鐘去上清，收集沉淀。
6、 乙醚洗滌將步驟5中所得丙酮處理后的沉淀產(chǎn)物按照0.2-0.25g產(chǎn)物(干 重)/ml的量于通風(fēng)櫥中加入到無(wú)水乙醚中，室溫(18 25°C)條件下用勻速攪拌器
慢速(上海標(biāo)本模型廠，驃馬牌可調(diào)速攪拌器，100 150轉(zhuǎn)/分鐘)攪拌，攪拌時(shí)間 為30分鐘，之后將容器蓋蓋后室溫靜置12 24小時(shí)。然后，2400轉(zhuǎn)/分鐘離心20 分鐘去上清，干燥(氣流吹干或減壓蒸干或冷凍干燥)，得到37.0 g水不溶性e -1, 3/1， 6-葡聚糖。7、所得產(chǎn)物純度采用總糖測(cè)定法和薄層層析測(cè)定法確定，為90.37 %;得率采 用產(chǎn)物量/所用細(xì)胞壁量相比，結(jié)果表明上述得到的水不溶性P -1, 3/1， 6-葡聚糖的得 率為18. 54 %;分子量按照熒光法(Rinsten, L. ， T. Stenberg and R. Andersson. 2003. Determination of P -glucan molecular weight using SEC with calcofluor detection in cereal extracts. C力,'MiT， 80(4) :485-490)測(cè)定，結(jié)果表明上述得到的水不溶性0 -1， 3/1， 6-葡聚糖的分子量為S00 850KD。結(jié)構(gòu)檢測(cè)經(jīng)紅 外光譜和核磁共振分析如下所示-r-P-D-Glcp-(l，3)- 0-D-Glcp-(l，3)- B-D-Glcp陽(yáng)(1,3)- B-D-GlcpNAc-1-I(3-D-Glcp-( 1,6)-卩-D-Quip-(1,6)產(chǎn)品的蛋白質(zhì)和脂肪含量采用國(guó)標(biāo)方法進(jìn)行，分別為蛋白含量為1.04%、脂肪 含量為0. 40%。二、水溶性e-l，3/1，6-葡聚糖的制備(操作流程如圖2所示)1、 氧化處理將步驟一制備的水不溶性e-1，3/1，6-葡聚糖干粉20.00g，按照 水不溶性P-1,3/1， 6-葡聚糖NaC10 (體積百分濃度為15%) : Na0H (0.2raol/L): DMS0 (體積百分濃度為0.2%) =1: 10: 10: 10 (g: mL: mL: mL)配成懸濁液，在4 °C，于暗處?kù)o置氧化反應(yīng)24h，反應(yīng)完全后，將反應(yīng)混合物離心(離心速度3000轉(zhuǎn)/ 分鐘，上海安亭科學(xué)儀器廠，DL6000B型冷凍離心機(jī)，下同)收集得到19.87 g沉淀。2、 洗滌將步驟1中所得氧化處理后的離心沉淀按照0.20-0.25g/ml (干物質(zhì) 基礎(chǔ))加入無(wú)水乙醇中重懸，室溫條件下用均速攪拌器中速(上海標(biāo)本模型廠，驃馬 牌可調(diào)速攪拌器，200 300轉(zhuǎn)/分鐘)混合，混合時(shí)間為30小時(shí)，之后以3000轉(zhuǎn)/ 分鐘速度離心20分鐘去上清。將獲得的沉淀按照0. 20-0. 25g/ml (干物質(zhì)基礎(chǔ))加 入無(wú)水丙酮中，室溫條件下用均速攪拌器慢速(上海標(biāo)本模型廠，驃馬牌可調(diào)速攪拌 器，100 150轉(zhuǎn)/分鐘)攪拌混合，攪拌混合時(shí)間l小時(shí)，之后以2400轉(zhuǎn)/分鐘速度 離心20分鐘去上清，收集沉淀。3、 超聲處理步驟2所得沉淀重懸于體積百分濃度為0.2。/。的DMS0溶液中，將 重懸液進(jìn)行超聲波處理(超聲時(shí)間20min，超聲頻率20KHz，超聲功率150W，間隔時(shí) 間O. 8s)。 4、 超聲完畢后將混合物在3000 rpm下離心去掉沉淀，濃縮上清液，冷凍干燥或 減壓蒸干得到18. 45 g水溶性0 -1， 3/1, 6-葡聚糖。5、 所得產(chǎn)物分子量按照熒光法(Rinsten， L. , T. Stenberg and R. Andersson. 2003. Determination of P-glucan molecular weight using SEC with calcofluor detection in cereal extracts. CareW C/ ,\sfir， 80(4) :485-490)測(cè)定，平均 分子量為190KD。結(jié)構(gòu)檢測(cè)經(jīng)紅外光譜和核磁共振分析如下所示-r-e-D-G-(l,3)- 0-D-G-(l,3)- 0-D-G-(l,3)陽(yáng)P-D-G-V I 1,6P-D-G-( 1,6)-p-D-Quip-( 1 ，6)得率可達(dá)到92. 25 。/。。產(chǎn)品的蛋白質(zhì)和脂肪含量采用國(guó)標(biāo)方法進(jìn)行，分別為蛋 白含量為1. 19%、脂肪含量為0. 47%。
權(quán)利要求
1、一種水溶性β-1，3/1，6-葡聚糖的制備方法，包括下述步驟1)氧化處理將水不溶性β-1，3/1，6-葡聚糖懸浮于氧化劑溶液中，在2～8℃，靜置氧化反應(yīng)16～24h，離心收集沉淀；所述氧化劑溶液為含有體積百分濃度為5～15％的NaClO、質(zhì)量百分濃度為0.05～0.2mol/L NaOH和體積百分濃度為0.05～0.2％的DMSO的溶液；2)洗滌將步驟1)中所得的沉淀用乙醇和丙酮分別重懸攪拌洗滌30分鐘～1小時(shí)，離心收集沉淀；3)超聲處理將步驟2)所得沉淀重懸于體積百分濃度為0.05～0.2％的DMSO溶液中，將重懸液進(jìn)行超聲處理20～30分鐘；離心收集上清液得到水溶性β-1，3/1，6-葡聚糖溶液。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟l)中，所述水不溶性 P -1， 3/1, 6-葡聚糖懸浮于所述氧化劑溶液中的濃度為30 50g/L，優(yōu)選為30g/L;所 述氧化劑溶液為含有體積百分濃度為10%的NaC10、質(zhì)量百分濃度0. lmol/L Na0H 和體積百分濃度為0. 1%的DMSO的溶液。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述步驟l)中，所述氧化反應(yīng) 的溫度為4"C，時(shí)間為24小時(shí)。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述步驟2)中，所述乙醇或丙 酮的用量為4-5ml/g沉淀干重；所述乙醇或丙酮洗滌時(shí)間分別為1小時(shí)。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述步驟3)中，所述DMS0溶液 的體積百分濃度為0. 1%;所述超聲處理的條件為超聲頻率為20KHz，超聲功率為50 150W,間隔時(shí)間為0.2 0.8s;所述超聲功率優(yōu)選為100W,間隔時(shí)間優(yōu)選為0. 5s。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述方法中還包括將所述水溶性 P -1， 3/1， 6-葡聚糖溶液濃縮，冷凍干燥或減壓蒸干得到水溶性0 -1， 3/1， 6-葡聚糖 粉。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1-6中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述水不溶性P -1,3/1,6-葡聚糖的制備方法，包括下述步驟① 酶解破壁處理將酵母細(xì)胞壁的懸浮液中加入溶菌酶，在35 40'C下，酶解， 離心收集沉淀；② 堿處理將步驟①得到的酶解后的產(chǎn)物，在0.5 1.5mol/L的NaOH溶液中， 在75 9(TC下，進(jìn)行攪拌處理2 3小時(shí)，然后離心收集沉淀； ③酸處理將步驟②得到的沉淀在體積百分濃度為2 8%的乙酸溶液中，室溫 條件下，攪拌處理2 3小時(shí)，離心收集沉淀； 脫脂、去除蛋白將步驟③酸處理后離心得到的沉淀用無(wú)水乙醇、丙酮和乙醚分別依次重懸攪拌洗滌30分鐘 1小時(shí)，乙醚處理后再靜置12 24小時(shí)，離心收集 沉淀干燥得到水不溶性e -1， 3/1， 6-葡聚糖。
8、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述步驟①中，所述酶解溫度為37°C;所述溶菌酶的添加量為20000 60000U/g酵母細(xì)胞壁干重，優(yōu)選為20000U/g 酵母細(xì)胞壁干重；所述溶菌酶在所述酵母細(xì)胞壁的懸浮液中的濃度為4000 12000U/ml,優(yōu)選為4000U/ml;所述酶解時(shí)間為20 60分鐘，優(yōu)選為30分鐘。
9 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述步驟②中，所述NaOH溶液 的濃度為lmol/L;所述堿處理的溫度為85°C，堿處理時(shí)間為3小時(shí)；所述酶解后的 產(chǎn)物干重與所述NaOH溶液的質(zhì)量/體積比為lg: 5 12ml，優(yōu)選為lg: 5-6ml。
10、 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述步驟③中，所述乙酸溶液 的體積百分濃度為4%;所述酸處理溫度為37X:，酸處理時(shí)間為2小時(shí)；所述步驟② 得到的沉淀干重與所述乙酸溶液的質(zhì)量/體積比為lg: 5 12ml，優(yōu)選為lg: llml;所述方法中，還包括將所述步驟②、②和③中收集的沉淀用水洗滌。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種水溶性β-1，3/1，6-葡聚糖的制備方法。該方法，包括下述步驟1)氧化處理將水不溶性β-1，3/1，6-葡聚糖懸浮于氧化劑溶液中，在2～8℃，于暗處?kù)o置氧化反應(yīng)16～24h，離心收集沉淀； 2)洗滌將步驟1)中所得的沉淀用乙醇和丙酮分別重懸攪拌洗滌30分鐘～1小時(shí)，離心收集沉淀；3)超聲處理將步驟2)所得沉淀重懸于體積百分濃度為0.05～0.2％的DMSO溶液中，將重懸液進(jìn)行超聲處理20分鐘；離心收集上清液得到水溶性β-1，3/1，6-葡聚糖溶液。本發(fā)明的方法制備的水溶性β-1，3/1，6-葡聚糖經(jīng)檢測(cè)，得率可達(dá)到95％以上，蛋白含量和脂肪含量很小。
文檔編號(hào)C12P19/00GK101117357SQ20071012185
公開(kāi)日2008年2月6日 申請(qǐng)日期2007年9月17日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月17日
發(fā)明者咼于明, 博 張 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)