專利名稱：細(xì)胞可透性p18重組蛋白、編碼其的多核苷酸、以及含有其的抗癌組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及其中腫瘤抑制因子pl8 (tumor suppressor pl8)融合至大分子轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié) 構(gòu)域(MTD)的細(xì)胞可透性pl8重組蛋白、編碼其的多核苷酸、用于生產(chǎn)其的表達(dá)載體、以及 包含其作為治療P18缺乏或失效(failure)的有效成分的抗癌藥物組合物。
背景技術(shù)：
真核細(xì)胞經(jīng) 歷細(xì)胞周期中的一系列事件而導(dǎo)致復(fù)制和增殖。細(xì)胞周期由四個(gè)不同 階段組成G1期，其為前一個(gè)M階段結(jié)束到DNA合成開始的靜止階段；S期，當(dāng)進(jìn)行DNA復(fù) 制時(shí)；G2期，當(dāng)在準(zhǔn)備細(xì)胞有絲分裂中進(jìn)行大量蛋白質(zhì)合成時(shí)(G1、S和G2期統(tǒng)稱為分裂間 期(interphase))；以及M期，當(dāng)進(jìn)行核分裂(即，染色體分開)和細(xì)胞質(zhì)分裂(胞質(zhì)分裂) 時(shí)。隨著這些事件重復(fù)進(jìn)行，就完成了細(xì)胞復(fù)制和增殖。細(xì)胞周期檢查點(diǎn)是確保真核細(xì)胞中細(xì)胞分裂保真度的控制機(jī)制。這些檢查點(diǎn)確證 在細(xì)胞周期的每個(gè)階段的進(jìn)程是否在進(jìn)入下一階段之前已正確完成。例如,如果細(xì)胞被損 壞或暴露于輻射，那么細(xì)胞周期可能會在腫瘤形成過程中的三個(gè)檢查點(diǎn)處被中斷G1檢查 點(diǎn)，用于阻斷從G1期進(jìn)入S期；S檢查點(diǎn)，用于延遲S期的進(jìn)程；以及G2檢查點(diǎn)，用于阻斷 從 G2 期進(jìn)入 M 期的進(jìn)程(Kastan, M. B. Nature 410 :766-7，2001)。細(xì)胞周期的這種微妙調(diào)節(jié)受各種調(diào)節(jié)分子的控制,其中最重要的是細(xì)胞周期(調(diào) 節(jié))蛋白依賴性激酶(CDK)。CDK與稱為細(xì)胞周期蛋白的調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合,該調(diào)節(jié)蛋白在細(xì)胞 周期的各個(gè)階段特異性地表達(dá)以形成功能單元，導(dǎo)致產(chǎn)生在細(xì)胞周期的各個(gè)階段特異性地 被活化的細(xì)胞周期蛋白-CDK復(fù)合物的各種組合。在接收有絲分裂前(pro-mitotic)的胞 外信號后，細(xì)胞進(jìn)入S期。具體地,細(xì)胞周期蛋白D-CDK2或細(xì)胞周期蛋白D-CDK6復(fù)合物首 先被活化,在進(jìn)入S期后細(xì)胞周期蛋白E-CDK2復(fù)合物接著被活化,然后細(xì)胞周期蛋白A與 CDK2相互作用以在G1后期及S早期進(jìn)行細(xì)胞周期進(jìn)程。如上所指出的，細(xì)胞周期進(jìn)程通過各種細(xì)胞周期蛋白和與其相互作用的激酶調(diào) 節(jié)，并且與CDK抑制因子，如CDK4抑制劑(IKK4)和CDK相互作用蛋白/激酶抑制蛋白 (CIP/KIP)家族的連接，在細(xì)胞周期調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用(Balomenos, D. and Martinez, A. C. Immunol. Today 21 :551_5，2000)。而且，已發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)失調(diào)性毛細(xì)血管擴(kuò)張癥突變蛋白 (ataxia telangiectasia mutated, ATM)，其是磷脂酰肌醇3-激酶相關(guān)激酶(PIKK)家族的 絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，響應(yīng)于DNA損壞或致癌信號來控制細(xì)胞-周期檢查點(diǎn),從而確保 基因組完整性和穩(wěn)定性。ATM對于下游因子如p53、鼠雙微體2(MDM2)和BRCA1的磷酸化和 活化是必需的(Lu, S. et. al.，Carcinogenesis 27 :848_55，2006)。例如，如果細(xì)胞收到一 個(gè)致癌信號，如對雙鏈DNA的損壞，那么ATM激活(活化，activate)誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯和細(xì) 胞凋亡的靶蛋白，導(dǎo)致對基因轉(zhuǎn)錄和DNA修復(fù)進(jìn)行調(diào)節(jié)(Abraham, R. T. Nat. Med. 11 :257 8， 2005)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，與ATM相關(guān)的pl8用作小鼠和人類中的腫瘤抑制因子。pl8缺乏或失效,通過抑制具有DNA損壞或突變的細(xì)胞凋亡而提高對于癌癥的易感性,從而導(dǎo)致細(xì)胞的 惡性轉(zhuǎn)化(Abraham,R. T. Nat. Med. 11 :257_8，2005)。在先前的研究中，使用pl8敲除小鼠， P18純合(或同型)敲除小鼠引起胚胎致死，而pl8雜合(或異型)敲除小鼠表現(xiàn)出對于 各種腫瘤，包括肝癌、乳腺癌、肺癌等的高易感性(Park, B. j. et al. , Cell 120 :209-21, 2005)。P18被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核中并響應(yīng)于DNA損壞而被活化,在那里pl8表達(dá)的提高導(dǎo)致p53 的磷酸化和活化(French, J. E. et al. ’ Carcinogenesis 22 :99_106，2001 ；Ide, F. et al. ’ Am. J. Pathol. 163 :1729-33, 2003)，p53是控制細(xì)胞增 殖和死亡的另一種腫瘤抑制因子。相 反，pl8 缺失(缺乏，depletion)抑制 p53 的表達(dá)(Park, B. J. et al. , Cel l 120 :209-21， 2005)。腫瘤抑制因子pl8位于染色體區(qū)域6p24_25上，其中發(fā)現(xiàn)雜合性丟失(loss-of heterozygosity, L0H)區(qū)域在淋巴瘤中(Baumgartner, A. K. et al.，Lab. Invest. 83 1509-16, 2003)。已經(jīng)提出,在該染色體中的L0H負(fù)責(zé)p!8的較低表達(dá)。根據(jù)近期研究，內(nèi) 源P18的水平減少一般且經(jīng)常在各種人類癌細(xì)胞系以及初生組織中檢測到,表明pl8是在 用于ATM-介導(dǎo)的p53活化的機(jī)制中的限速因子，以及單倍缺陷(haploinsufficient)腫瘤 抑制因子(Park, B. J. et al.，Cell 120 :209-21, 2005)。基于pl.8是一種響應(yīng)于致癌信號如DNA損壞而直接與ATM相互作用以活化p53的 潛在腫瘤抑制因子(Savitsky, K. et. al. , Hum. Mol. Genet. 4 =2025-32,1995)，并且是一種 作為細(xì)胞周期檢查點(diǎn)包括ATM和p53的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中涉及的單倍缺陷腫瘤抑制因子的 有吸弓I力的革巴蛋白(Kastan, M. B. Nature 410 :766—7, 2001 ;Balomenos，D. and Martinez,
A.C. Immunol. Today 21 :551-5,2000 ；Abraham, R. T. Nat. Med. 11 :257-8，2005 ；Park,
B.J. et al. ,Cell 120 =209-21,2005)的事實(shí),本發(fā)明人努力開發(fā)新型抗癌藥劑。同時(shí)，來源于合成化合物或天然化合物的小分子能夠被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞中，而大分子， 如蛋白質(zhì)、肽和核酸則不能。已廣泛理解的，大于500kDa的大分子不能穿透質(zhì)膜，即，活細(xì) 胞的脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)。為了克服這一問題,開發(fā)了大分子細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)(MITT) (Jo etal., Nat. Biotech. 19 :929_33, 2001),該技術(shù)允許將治療有效的大分子遞送至細(xì)胞中，使得利用 肽、蛋白和遺傳物質(zhì)幵發(fā)新型藥物成為可能。按照該方法，如果靶標(biāo)大分子融合至疏水性大 分子轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(MTD)并且以重組蛋白形式合成、表達(dá)和純化的其它細(xì)胞遞送調(diào)節(jié)劑，那 么它能夠穿透細(xì)胞的質(zhì)膜脂質(zhì)雙層,被準(zhǔn)確地遞送至靶位點(diǎn)，并隨后有效地展現(xiàn)其治療作 用。這樣的MTD有助于許多融合至肽、蛋白、DNA、RNA、合成化合物等的不可穿透物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)至 細(xì)胞中。因此，本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)開發(fā)一種介導(dǎo)腫瘤抑制因子P18轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞中的方 法,其中通過將MTD融合至腫瘤抑制因子pl8而遺傳改造細(xì)胞可透性pl8重組蛋白。已發(fā) 現(xiàn)這樣的細(xì)胞可透性P18重組蛋白在體內(nèi)及體外有效地介導(dǎo)腫瘤抑制因子pl8轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞 中，并且能夠用作抗癌藥劑，用于治療各種人類癌癥中出現(xiàn)的P18缺乏或失效。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題因此，本發(fā)明的目的是提供細(xì)胞可透性pl8重組蛋白，該重組蛋白可作為有效治 療各種人類癌癥中出現(xiàn)的P18缺乏或失效的抗癌藥劑。
技術(shù)方案本發(fā)明的一方面涉及細(xì)胞可透性pl8重組蛋白，其通過將具有細(xì)胞可透性(或穿 透性)的大分子轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(MTD)融合至腫瘤抑制蛋白而能夠介導(dǎo)腫瘤抑制因子pl8轉(zhuǎn)運(yùn) 至細(xì)胞中。本發(fā)明的另一方面涉及編碼上述細(xì)胞可透性pl8重組蛋白的多核苷酸。本發(fā)明還涉及含有上述多核苷酸的表達(dá)載體、以及用....丨二述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化體 (轉(zhuǎn)化子，transformant) □本發(fā)明的另一方面涉及一種生產(chǎn)細(xì)胞可透性pl8重組蛋白的方法,該方法包括培 養(yǎng)上述轉(zhuǎn)化體。本發(fā)明的另一方面涉及一種藥物組合物，其包括作為用于治療pl8缺乏或失效的 有效成分的上述細(xì)胞可透性P18重組蛋白。


圖la是示出了根據(jù)本發(fā)明融合至kFGF4來源MTD (kFGF4衍生的MTD， kFGF4-derived MTD)并以全長和截短形式進(jìn)行構(gòu)建的細(xì)胞可透性pl8重組蛋白的結(jié)構(gòu)的 示意圖。圖lb是示出了根據(jù)本發(fā)明分別融合至J0-101和J0-103MTD并以全長形式進(jìn)行構(gòu) 建的細(xì)胞可透性P18重組蛋白的結(jié)構(gòu)的示意圖。 圖2a是瓊脂糖凝膠電泳分析的照片，其示出了編碼根據(jù)本發(fā)明的融合至kFGF4來 源MTD并以全長和截短形式進(jìn)行構(gòu)建的細(xì)胞可透性pl_8重組蛋白的PGR擴(kuò)增的DNA片段。圖2b是瓊脂糖凝膠電泳分析的照片，其示出了編碼根據(jù)本發(fā)明的分別融合至 J0-101和J0-103MTD并以全長和截短形式進(jìn)行構(gòu)建的細(xì)胞可透性pl8重組蛋白的PCR擴(kuò)增 的DNA片段。圖3a是示出了將編碼根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞可透性pl8重組蛋白的PCR產(chǎn)物亞克隆 入pGEM-T簡易載體(pGEM-T Easy vector)中的示意圖。圖3b和3c是瓊脂糖凝膠電泳分析的照片，分別示出了根據(jù)本發(fā)明亞克隆入 pGEM-T簡易載體中的來自于圖2a和2b的編碼細(xì)胞可透性pl8重組蛋白的PCR產(chǎn)物。圖4a是示出了將編碼根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞可透性pl8重組蛋白的重組DNA片段克 隆入pET28(+)載體中的示意圖。圖4b和4c是瓊脂糖凝膠電泳分析的照片，示出了根據(jù)本發(fā)明亞克隆入PET28 (+) 載體中的編碼細(xì)胞可透性P18重組蛋白的重組DNA片段。圖5a是SDS-PAGE分析的照片，示出了在各種宿主細(xì)胞中根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞可透 性pl8重組蛋白的誘導(dǎo)性表達(dá)。圖5b是SDS-PAGE分析的照片，示出了在具有或沒有IPTG作為誘導(dǎo)劑的情況F根 據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞可透性P18重組蛋白的誘導(dǎo)性表達(dá)。圖6a至6c是SDS-PAGE分析的照片，示出了根據(jù)本發(fā)明以全長形式分別融合至 kFGF4來源MTD、J0-101MTD和J0-103MTD的細(xì)胞可透性pl8重組蛋白的純化結(jié)果。圖7a至7c是示出了根據(jù)本發(fā)明以全長形式分別融合至kFGF4來源MTD、 J0-101MTD和JO-103MTD的細(xì)胞可透性pl8重組蛋白的細(xì)胞可透性的流式細(xì)胞儀分析結(jié)果的曲線圖。圖8a至8c是共焦激光掃描顯微照片，其可視化了在小鼠成纖維細(xì)胞中根據(jù)本發(fā) 明以全長形式分別融合至kFGF4來源MTD、JO-101MTD和J0-103MTD的細(xì)胞可透性pl8重組 蛋白的細(xì)胞可透性。圖9是共焦激光掃描顯微照片，其可視化(使顯影，visualize) 了在各種小鼠組 織中根據(jù)本發(fā)明以全長形式融合至kFGF4來源MTD、J0-101MTD和J0-103MTD的細(xì)胞可透性 P18重組蛋白的細(xì)胞可透性。圖10是蛋白質(zhì)印跡分析的照片，其示出了根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞可透性pl8重組蛋白 HMlP 18和Hp 18MX的體內(nèi)功能。圖11是蛋白質(zhì)印跡分析的照片，其示出了根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞可透性pl8重組蛋白 IM2p 18、Hp 18M2、HM2p 18M2、IM3p 18、Hp 18M3 和 HM3p 18M3 的體內(nèi)功能。圖12是細(xì)胞DNA含量分析的照片,其示出了根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞可透性pl8重組蛋 白HMiPlSAHplSM^H^plS]^和HM3pl8的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用。圖13是體內(nèi)膜聯(lián)蛋白-V染色的照片，其示出了根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞可透性pl8重 組蛋白HM3pl8的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用。圖14a和14b是示出在具有腫瘤的小鼠中腫瘤大小和體重的分別變化的曲線圖， 其中經(jīng)腹膜內(nèi)注射21天給予根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞可透性pl8重組蛋白HMlP18和HplSMi中的
每一種。圖15是示出與對照小鼠相比在具有腫瘤的小鼠中腫瘤大小和體重的變化的照 片，其中分別經(jīng)腹膜內(nèi)注射21天給予根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞可透性pl8重組蛋白HM:lP18和 Hpl8Mi中的每一種。圖16a和16b是示出在具有腫瘤的小鼠中腫瘤大小和體重的變化的曲線圖，其中 分別經(jīng)腹膜內(nèi)注射21天給予根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞可透性pl8重組蛋白HMlP18和HplSMi中的 每一種,然后終止給予7天。圖17a和17b是示出在具有腫瘤的小鼠中腫瘤大小和體重的變化的曲線圖,其中 經(jīng)靜脈內(nèi)注射14天給予根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞可透性pl8重組蛋白HM3pl8，然后終止給予14圖18是示出與對照小鼠相比在具有腫瘤的小鼠中腫瘤大小和體重的變化的照 片,其中經(jīng)靜脈內(nèi)注射14天給予根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞可透性pl8重組蛋白HM3pl8。圖19是示出與對照小鼠相比在具有腫瘤的小鼠中腫瘤大小和體重的變化的照 片，其中經(jīng)靜脈內(nèi)注射14天給予根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞可透性pl8重組蛋白IM3pl8，然后終止 給予1.4天。圖20a和20b是示出在具有腫瘤的小鼠中腫瘤大小和體重的分別變化的曲線圖， 其中經(jīng)腫瘤內(nèi)注射給予根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞可透性P18重組蛋白Hpl8M:l、HM2pl8M2和HM3pl8 中的每一種，然后終止給予14天。圖21是示出與對照小鼠相比在具有腫瘤的小鼠中腫瘤大小和體重的變化的照 片，其中經(jīng)腫瘤內(nèi)注射14天給予根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞可透性pl8重組蛋白HplSMp HM2pl8M2 和HM3pl8中的每一種。圖22是示出與對照小鼠相比在具有腫瘤的小鼠中腫瘤大小和體重的變化的照片,其中經(jīng)腫瘤內(nèi)注射14天給予根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞可透性pl8重組蛋白HplSM1, HM2pl8M2 和HM3P18中的每一種，然后終止給予14天。圖23是蘇木精(haematoxylin)和曙紅(eosin)染色的照片，其示出了在從經(jīng)靜 脈內(nèi)注射給予細(xì)胞可透性P18重組蛋白HM3PlS的小鼠中提取的小鼠腫瘤組織中的組織學(xué)變化。圖24是蘇木精和曙紅染色的照片，其示出了在從經(jīng)腫瘤內(nèi)注射給予細(xì)胞可透性P18重組蛋白HplSMp HM2P18M2和IM3pl8中的每一種的小鼠中提取的小鼠腫瘤組織中的組 織學(xué)變化。圖25是末端脫氧核苷酸基轉(zhuǎn)移酶-介導(dǎo)的dUTP缺口 -末端標(biāo)記(TUNEL)分析的 照片，其示出了在從經(jīng)靜脈內(nèi)注射給予細(xì)胞可透性PlS重組蛋白HM3PlS的小鼠中獲取的小 鼠腫瘤組織中的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用。圖26是ApopTag(細(xì)胞凋亡標(biāo)簽)分析的照片，其示出了在從經(jīng)靜脈內(nèi)注射給予 細(xì)胞可透性P18重組蛋白HM3PlS的小鼠中提取的小鼠腫瘤組織中的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用。圖27是TUNEL分析的照片，其示出了經(jīng)腫瘤內(nèi)注射給予細(xì)胞可透性pl8重組蛋 白，HPISM1JM2PISM2和HM3pl8的小鼠中獲取的小鼠腫瘤組織的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)。圖28是ApopTag分析的照片，其示出了在從經(jīng)腫瘤內(nèi)注射給予細(xì)胞可透性pl8重 組蛋白Hpism1^HM2PISM2和HM3P18中的每一種的小鼠中提取的小鼠腫瘤組織中的細(xì)胞凋亡 誘導(dǎo)作用。圖29是微陣列分析的照片，其示出了在從經(jīng)靜脈內(nèi)注射給予細(xì)胞可透性P18重組 蛋白HM2PlSM2的小鼠中提取的小鼠腫瘤中的差異基因表達(dá)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供能夠介導(dǎo)腫瘤抑制因子pl8轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞中的細(xì)胞可透性pl8重組蛋白 (CP-pl8)，其中腫瘤抑制因子pl_8融合至大分子轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域,并由此賦予細(xì)胞可透性；以及 編碼每-一種細(xì)胞可透性PlS重組蛋白的多核苷酸。本發(fā)明的特征在于腫瘤抑制因子pl8，其是不能夠被引入細(xì)胞中的大分子，被融合 至特定的大分子轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(下文稱為“MTD”)肽,從而提供細(xì)胞可透性，并因此能夠被有 效地轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞中。MTD肽可以融合至腫瘤抑制因子pl8的N 末端、O末端、或其兩個(gè)末端。本發(fā)明涉及通過將腫瘤抑制因子pl8融合至能夠介導(dǎo)大分子轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞中的三 個(gè)MTD結(jié)構(gòu)域而被遺傳改造的細(xì)胞可透性pl8重組蛋白。如本文中使用的,術(shù)語“細(xì)胞可透性pl8重組蛋白”是指帶有MTD和腫瘤抑制蛋白 P18的共價(jià)鍵復(fù)合物,其中它們通過遺傳融合或化學(xué)結(jié)合而功能性地連接。此處,術(shù)語“遺 傳融合”是指兩個(gè)或多個(gè)蛋白或其片段經(jīng)由它們各自的肽骨架，通過編碼這些蛋白的多核 苷酸分子的遺傳表達(dá)，進(jìn)行共線性、共價(jià)連接。pi8是這樣一種腫瘤抑制蛋白，其響應(yīng)于致癌信號如DNA損壞而直接與ATM相互作 用，用于對誘導(dǎo)細(xì)胞周期停止和凋亡的P53進(jìn)行活化。pl8具有SEQ ID NO :2所示的氨基 酸序列，而編碼其的多核苷酸具有SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列。pl8用作信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通 路包括ATM p53中的重要靶蛋白。
腫瘤抑制因子pl8的氨基酸序列，即，SEQ ID NO 2,由對應(yīng)于氨基酸殘基1-60的N-末端結(jié)構(gòu)域、對應(yīng)于氨基酸殘基61-120的S-末端結(jié)構(gòu)域、以及對應(yīng)于氨基酸殘基 121-168的C-末端結(jié)構(gòu)域構(gòu)成(參見圖la)。對于能夠融合至腫瘤抑制因子pl8的MTD,可以使用具有選自由SEQ ID NO :4、6、 8和53至243構(gòu)成的組中的氨基酸序列的細(xì)胞可透性肽。具有SEQ ID NO :4、6、8和53至 243所示的氨基酸序列之一的MTD是能夠介導(dǎo)生物學(xué)活性分子，如多肽、蛋白結(jié)構(gòu)域、或全 長蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)跨過細(xì)胞膜的細(xì)胞可透性多肽。對于本發(fā)明適合的MTD包括疏水性區(qū)域，其通 過在信號肽處形成螺旋結(jié)構(gòu)而表現(xiàn)出細(xì)胞膜靶向活性，該信號肽由含有分泌蛋白質(zhì)切割位 點(diǎn)的N-末端結(jié)構(gòu)域、疏水性結(jié)構(gòu)域和C-末端結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。這些MTD能夠直接穿透細(xì)胞膜 而不引起任何細(xì)胞損壞，將靶蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞中，并因而允許靶蛋白展現(xiàn)其所期望的功能。具有SEQ ID NO :4、6、8和53至243所示的氨基酸序列并且能夠被融合至根據(jù)本 發(fā)明的腫瘤抑制因子P18的MTD總結(jié)在下表Ia至11中。[表 la] [表Ic] [表 Ie] [表If] [表Ig] [表lh] [表Ij] [表 lk] [表11] 在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明可采用具有SEQ ID NO 3的核苷酸序列和SEQ ID NO 4的氨基酸序列的卡波西氏(kaposi)成纖維細(xì)胞生長因子4(kFGF4) -來源MTD (下文中稱 為“MTD1")、具有SEQ ID NO :5的核苷酸序列和SEQ ID NO :6的氨基酸序列且為來源于環(huán) 形泰勒蟲(Theileria annulata)的假定蛋白(hypotheticalprotein)的 J0-101MTD(下文 中稱為"MTD2”)、以及具有SEQ IDNO 7的核苷酸序列和SEQ ID NO 8的氨基酸序列且屬于 人類TMEM9結(jié)構(gòu)域家族中的成員B的JO-1.03MTD (下文中稱為“MTD/’)，作為能夠?qū)⒛[瘤抑 制因子P18轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞中的MTD。根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞可透性pl8重組蛋白具有這樣的結(jié)構(gòu)，其中三種MTD (kFGF4_來 源MTD =MTD1, J0-101 =MTD2, J0-103 =MTD3)中的一種融合至腫瘤抑制蛋白pl8的一端或兩 端，而SV40大T抗原-來源的核定位序列(NLS) (SEQ ID NO 9的核苷酸序列，SEQ ID NO 10的氨基酸序列)及用于方便純化的組氨酸-標(biāo)簽(His-Tag)親合性結(jié)構(gòu)域融合至所得構(gòu)
建體的一端。在另一種實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及通過利用kFGF4-來源MTD，進(jìn)行細(xì)胞可透性pl8 重組蛋白的三種全長形式和五種截短形式的構(gòu)建。如本文中所使用的,術(shù)語“全長形式”是指包括腫瘤抑制蛋白pl8的整個(gè)N-、S_及 C-末端結(jié)構(gòu)域的構(gòu)建體(或結(jié)構(gòu))，而術(shù)語“截短形式”是指缺少其N-、S-及C-末端結(jié)構(gòu) 域中的任意一個(gè)或多個(gè)的構(gòu)建體。參照圖la,細(xì)胞可透性PlS重組蛋白的全長形式如下1)麗1 18,其中kFGF4-來源MTD融合至全長ρ 18的N-末端，2) HplSM1，其中kFGF4-來源MTD融合至全長ρ 18的C-末端，3) HM1PlSM1,其中kFGF4 來源MTD融合至全長ρ 18的兩個(gè)末端，其中，His-標(biāo)簽和來源于SV40大T抗原的NLS共價(jià)地連接至上述構(gòu)建體的N 末 端。對于如上所述的全長形式的細(xì)胞可透性pl8重組蛋白，HMlP18具有SEQ ID NO 26 所示的氨基酸序列，而編碼其的多核苷酸具有SEQ ID NO :25所示的核苷酸序列；HplSM1具有SEQ ID NO :28所示的氨基酸序列，而編碼其的多核苷酸具有SEQ ID NO :27所示的核苷酸序列；HM1PlSM1具有SEQ ID NO 30所示的氨基酸序列，而編碼其的多核苷酸具有SEQ ID NO :29所示的核苷酸序列。而且,細(xì)胞可透性pl8重組蛋白的截短形式為如下DHpISNM1,其中kFGF4_來源MTD融合至缺少S-和C-末端結(jié)構(gòu)域的pl8N_末端 結(jié)構(gòu)域片段的C-末端，2)HplSSM1，其中kFGF4 來源MTD融合至缺少N-和C 末端結(jié)構(gòu)域的pl8S-末端 結(jié)構(gòu)域片段的O末端，3)HplSCM1,其中kFGF4_來源MTD融合至缺少N-和S-末端結(jié)構(gòu)域的pl8C_末端 結(jié)構(gòu)域片段的C-末端，4) HpISNSM1,其中kFGF4 來源MTD融合至缺少C 末端結(jié)構(gòu)域的pl8N-和S-末端 結(jié)構(gòu)域片段的O末端，5) HpISSCM1,其中kFGF4_來源MTD融合至缺少N-末端結(jié)構(gòu)域的pl8S_和C-末端 結(jié)構(gòu)域片段的C-末端，其中，His 標(biāo)簽和來源于SV40大T抗原的NLS共價(jià)地連接至上述構(gòu)建體的N-末端。對于如上所述的截短形式的細(xì)胞可透性pl8重組蛋白，HplSNM1具有SEQ ID NO: 32所示的氨基酸序列，而編碼其的多核苷酸具有SEQ ID NO :31所示的核苷酸序列；HplSSM1 具有SEQ IDNO :34所示的氨基酸序列，而編碼其的多核苷酸具有SEQ ID NO :33所示的核苷 酸序列；Hp ISCM1具有SEQ ID NO 36所示的氨基酸序列，而編碼其的多核苷酸具有SEQ ID NO :35所示的核苷酸序列；HpISNSM1具有SEQ ID NO :38所示的氨基酸序列，而編碼其的多 核苷酸具有SEQ ID NO 37所示的核苷酸序列；HpISSCM1具有SEQ ID NO 40所示的氨基酸 序列，而編碼其的多核苷酸具有SEQ ID NO :39所示的核苷酸序列。在另一種實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及通過使用JO-1.01MTD和JO-1.03MTD,分別進(jìn)行細(xì) 胞可透性P18重組蛋白的三種全長形式的構(gòu)建。參照圖lb，細(xì)胞可透性P18重組蛋白的全長形式為如下1)ΙΜ2ρ18，其中JO-101MTD融合至全長ρ 18的N-末端，2) HplSM2,其中 JO-1.01MTD 融合至全長 ρ18 的 C-末端，3) HM2PISM2,其中J0-101MTD融合至全長ρ 18的兩個(gè)末端，4)ΗΜ3ρ18，其中J0-103MTD融合至全長ρ 18的N-末端，5) HplSM3,其中JO-103MTD融合至全長ρ18的C-末端，
6) HM3PlSM3,其中JO-103MTD融合至全長pl_8的兩個(gè)末端，其中,His-標(biāo)簽和來源于SV40大T抗原的NLS共價(jià)地連接至上述構(gòu)建體的N-末 端。對于如上所述的全長形式的細(xì)胞可透性pl8重組蛋白，HM2pl8具有SEQ ID NO 42 所示的氨基酸序列，而編碼其的多核苷酸具有SEQ ID NO 41所示的核苷酸序列；HplSM2具 有SEQ ID NO :44所示的氨基酸序列，而編碼其的多核苷酸具有SEQ ID NO :43所示的核苷 酸序列；HM2PISM2具有SEQ ID NO :46所示的氨基酸序列，而編碼其的多核苷酸具有SEQ ID NO 45所示的核苷酸序列；HM3PlS具有SEQ ID NO 48所示的氨基酸序列，而編碼其的多核苷酸具有SEQ ID NO 47所示的核苷酸序列；HplSM3具有SEQ IDNO 50所示的氨基酸序列， 而編碼其的多核苷酸具有SEQ ID N0:49所示的核苷酸序列；HM3pl8M3具有SEQ ID NO 52 所示的氨基酸序列，而編碼其的多核苷酸具有SEQ ID NO :51所示的核苷酸序列。作為用于細(xì)胞可透性pl.8重組蛋白的對照，構(gòu)建了 Hpl.8,其中全長pl.8僅融合至來 源于SV40大T抗原的核定位序列(NLS)和組氨酸-標(biāo)簽(His-Tag)而沒有任何MTD。該對 照蛋白具有SEQID NO :24所示的氨基酸序列，而編碼其的多核苷酸具有SEQ IDNO :23所示 的核苷酸序列。而且，本發(fā)明提供包含編碼上述細(xì)胞可透性pl8重組蛋白每一種的多核苷酸的表 達(dá)載體、以及能夠以高水平生產(chǎn)細(xì)胞可透性PlS重組蛋白每一種的轉(zhuǎn)化體,其可通過使用 該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞而獲得。如本文中使用的，術(shù)語“表達(dá)載體”是能夠在合適的宿主細(xì)胞中表達(dá)靶蛋白或靶 RNA的載體。本發(fā)明的核苷酸序列可存在于載體中，其中該核苷酸序列可操作地連接至能夠 提供用于通過適合的宿主細(xì)胞表達(dá)該核苷酸序列的調(diào)節(jié)序列。在表達(dá)載體范疇中，術(shù)語“可操作地連接”意指感興趣的核苷酸序列以允許核苷酸表 達(dá)的方式連接至(一個(gè)或多個(gè))調(diào)節(jié)序列。術(shù)語“調(diào)節(jié)序列(或調(diào)控序列)”意在包括啟動(dòng)子、 增強(qiáng)子以及其它表達(dá)控制元件。與表達(dá)載體的這種可操作連接能夠通過本領(lǐng)域中已知的常規(guī) 基因重組技術(shù)實(shí)現(xiàn),而位點(diǎn)_定向DNA切割和連接通過使用本領(lǐng)域中已知的常用酶進(jìn)行。適用于本發(fā)明的表達(dá)載體可包括質(zhì)粒載體、粘粒載體、噬菌體載體、病毒載體等， 但并不局限于此。用于本發(fā)明中的表達(dá)載體可包含用于膜靶向或分泌的信號序列或前導(dǎo)序 列、以及調(diào)節(jié)序列如啟動(dòng)子、操縱子、起始密碼子、終止密碼子、多聚腺苷化信號、增強(qiáng)子等。 啟動(dòng)子可以是組成性或誘導(dǎo)性啟動(dòng)子。而且,表達(dá)載體可包括一個(gè)或多個(gè)用于選擇包含該 表達(dá)載體的宿主細(xì)胞的可選擇標(biāo)記基因，并且可進(jìn)一步包括使得該載體能夠在所討論的宿 主細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制的核苷酸序列。根據(jù)本發(fā)明構(gòu)建的表達(dá)載體可以通過PHplSM1舉例說明，其中編碼重組蛋白 HplSMl (其中kFGF4-來源MTD融合至全長pl8的N-末端)的多核苷酸在pET_28a (+)載體 的多克隆位點(diǎn)(MCS)內(nèi)被插入NdeI限制酶的切割位點(diǎn)中。在另一種實(shí)施方式中，本發(fā)明的多核苷酸被克隆入帶有His 標(biāo)簽序列的 pET-28a(+)載體(Novagen/USA)中，以將六個(gè)組氨酸殘基融合至細(xì)胞可透性pl8重組蛋白 的N-末端從而使純化方便。因此，在上述表達(dá)載體中表達(dá)的細(xì)胞可透性pl8重組蛋白具有這樣的結(jié)構(gòu)，其中 kFGF4-來源MTD、J0-101MTD和JO-103MTD之一融合至全長或截短的pl8,并且His-標(biāo)簽和 NLS連接至其N 末端。本發(fā)明進(jìn)一步提供一種能夠以高水平生產(chǎn)細(xì)胞可透性pl8重組蛋白的每一種的 轉(zhuǎn)化體，其可通過使用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞而獲得。適用于本發(fā)明的宿主細(xì)胞可以是真 核細(xì)胞，如大腸桿菌(E.coli)。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，用作宿主細(xì)胞的大腸桿菌用 表達(dá)載體轉(zhuǎn)化，例如PHPlSM1,其含有編碼細(xì)胞可透性重組蛋白HplSM1 (其中kFGF4-來源 MTD融合至根據(jù)本發(fā)明的全長pl8的C-末端)的多核苷酸,從而以高水平生產(chǎn)細(xì)胞可透性 PlS重組蛋白。用于轉(zhuǎn)化細(xì)菌細(xì)胞的方法在本領(lǐng)域中已熟知，包括但不限于，生物化學(xué)方 法，如轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、軛合、原生質(zhì)體融合、磷酸鈣沉淀、以及施加多聚陽離子如二乙基氨基乙基(DEAE)葡聚糖；和機(jī)械方法,如電穿孔、直接微注射、微粒轟擊、磷酸鈣(CaPO4)沉淀、氯 化鈣(CaCl2)沉淀、PEG-介導(dǎo)的融合和脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法。在一些實(shí)施方式中，通過分別用含有細(xì)胞可透性pl8重組蛋白IIpl-SM1 (其中 kFGF4 來源MTD融合至全長pl8的O末端)的表達(dá)載體、含有細(xì)胞可透性pl8重組蛋白 HM2PlSM2 (其中J0-101MTD融合至其兩個(gè)末端)的表達(dá)載體、含有細(xì)胞可透性pl8重組蛋 白HM3PlS (其中J0-103MTD融合至其N-末端)的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α獲得的轉(zhuǎn) 化體,在韓國大田廣域市儒城區(qū)魚隱洞52號(305-333)的韓國生物科學(xué)和生物技術(shù)研究 所(KRIBB)典型培養(yǎng)物保藏中心(KCTC)分別以登錄號KCTC-11310BP、KCTC-11.31 IBP禾口 KCTC-11312BP保藏。這里涉及的所有保藏均根據(jù)布達(dá)佩斯條約在2008年4月12日完成， 并且保藏人對關(guān)于保藏的生物材料對公眾的可獲得性施加的所有限制將在授予專利權(quán)后 不可取消地去除。
本發(fā)明提供一種以高水平生產(chǎn)細(xì)胞可透性ρ18重組蛋白的方法,包括培養(yǎng)上述轉(zhuǎn) 化體的步驟。本發(fā)明的方法可以通過在適合的條件下在適合的介質(zhì)中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，用于在引入 到該轉(zhuǎn)化體中的表達(dá)載體中表達(dá)細(xì)胞可透性PlS重組蛋白而實(shí)施。通過培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體而表達(dá) 重組蛋白的方法在本領(lǐng)域中已熟知，例如可以通過在適于轉(zhuǎn)化體生長的介質(zhì)(或培養(yǎng)基) 中接種轉(zhuǎn)化體(或轉(zhuǎn)化株)、進(jìn)行傳代培養(yǎng)(subculture)、將其轉(zhuǎn)移至主要培養(yǎng)基中、在適 合的條件下培養(yǎng)，例如補(bǔ)充有基因表達(dá)誘導(dǎo)劑異丙基_ β -D-硫代半乳糖苷(IPTG)，從而誘 導(dǎo)重組蛋白表達(dá)而得以實(shí)施。在培養(yǎng)完成后，可以從培養(yǎng)液中獲得“基本上純的”重組蛋白。 術(shù)語“基本上純的”是指本發(fā)明的重組蛋白和編碼其的多核苷酸在實(shí)施和使用它們的計(jì)劃 用途的程度上基本上沒有在天然或體內(nèi)系統(tǒng)中可以發(fā)現(xiàn)的其它物質(zhì)。如上獲得的本發(fā)明的重組蛋白可以從宿主細(xì)胞內(nèi)部或外部(例如，介質(zhì))分離， 并純化為基本上純的同源性多肽。用于多肽分離和純化的方法不局限于任何特定的方 法。實(shí)際上，可以使用任何標(biāo)準(zhǔn)方法。例如，色譜(或?qū)游?法、過濾器、超濾、鹽析、溶 劑沉淀、溶劑萃取、蒸餾、免疫沉淀、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電點(diǎn)電泳、透析和重結(jié) 晶可以適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行選擇和組合以分離和純化多肽。關(guān)于色譜法，例如可以使用親和性色 譜、離子交換色譜、疏水性色譜、凝膠過濾色譜、反相色譜、吸附色譜等(Maniatis et al., Molecular Cloning :A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor, N. Y.，1982 ；Sambrook et al.，Molecular Cloning :A Laboratory Manual，2d Ed·，Cold Spring HarborLaboratory Press,1989 ；Deutscher, Μ·，Guide to Protein PurificationMethods Enzymology vol· 182· Academic Press. Inc. San Diego，CA，1990)。同時(shí)，根據(jù)本發(fā)明在轉(zhuǎn)化體內(nèi)表達(dá)的重組蛋白可以在蛋白純化過程中根據(jù)蛋白特 性而分為可溶部分(soluble fraction)與不可溶部分(insoluble fraction)。如果大 多數(shù)表達(dá)的重組蛋白以可溶部分存在，那么重組蛋白能夠根據(jù)如____匕所述的方法進(jìn)行分離和 純化。然而，當(dāng)大多數(shù)表達(dá)的重組蛋白以不可溶部分存在時(shí)，即，作為包含體(inclusion body),重組蛋白首先通過采用多肽變性劑如脲、鹽酸胍和去垢劑進(jìn)行溶解，然后通過一系 列的離心、透析、電泳和柱色譜進(jìn)行純化。由于多肽變性劑導(dǎo)致結(jié)構(gòu)改變而存在喪失重組蛋 白活性的風(fēng)險(xiǎn)，因而從不可溶部分純化重組蛋白的方法要求脫鹽和重折疊步驟。就是說，脫 鹽和再折疊步驟通過使用不包含多肽變性劑的溶液進(jìn)行透析和稀釋、或者通過用過濾器進(jìn)行離心過濾能夠?qū)嵤?。而?如果用于從可溶部分純化重組蛋白的溶液中鹽含量相對較高，可以實(shí)施這樣的脫鹽和再折疊步驟。在一些實(shí)施方式中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的細(xì)胞可透性pl8重組蛋白大多以包含體存 在于不可溶部分中。為了從不可溶部分純化重組蛋白，可以將不可溶部分溶解在含有非離 子表面活性劑如TritonX-IOO溶胞緩沖液中、進(jìn)行超聲處理、然后離心以分離沉淀物?？蓪?分離的沉淀物溶解在補(bǔ)充有強(qiáng)變性劑如脲的緩沖液中并離心以分離—丨二清。上述分離的—I 清借助于組氨酸-標(biāo)記的蛋白純化試劑盒進(jìn)行純化并進(jìn)行超濾，例如通過使用無菌過濾器 (amicon filter)以進(jìn)行脫鹽和蛋白再折疊，由此獲得本發(fā)明的純化重組蛋白。而且,本發(fā)明提供了一種包含細(xì)胞可透性pl8重組蛋白作為治療pl8缺乏和失效 的有效成分的抗癌藥物組合物。通過向細(xì)胞中有效地引入腫瘤抑制蛋白pl8,本發(fā)明的細(xì)胞可透性pl8重組蛋白 能夠激活A(yù)TM和p53的活化(其響應(yīng)于DNA損壞和致癌信號)中所涉及的細(xì)胞信號傳導(dǎo)機(jī) 制。因此,本發(fā)明的細(xì)胞可透性P18重組蛋白能夠有效地用作治療各種人類癌癥的抗癌藥劑。包含本發(fā)明的重組蛋白作為有效成分的藥物組合物可進(jìn)一步包括適于口服 給藥和腸胃外給藥的藥用載體。如本文中所用的,“藥用載體”包括任何及所有的溶 劑、分散介質(zhì)、涂層、表面活性劑、抗氧化劑、防腐劑(例如，抗細(xì)菌劑、抗真菌劑)、等滲 齊 、吸收延遲劑、鹽、防腐劑、藥物、藥物穩(wěn)定劑、凝膠、粘結(jié)劑、賦形劑、崩解劑、潤滑劑、 甜味劑、調(diào)味劑、染料、類似物質(zhì)及它們的組合，正如本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所知曉的 (Remington^sPharmaceutical Sciences,19th ed.，Mack Publishing Company，Easton,PA， 1995)。用于口服給藥的載體可包括乳糖、淀粉、纖維素衍生物、硬脂酸鎂、硬脂酸等。在口 服給藥的情況下,本發(fā)明的重組蛋白能夠以咀嚼片、含片、錠齊IJ、膠囊、酏齊 、懸浮劑、糖漿、 薄晶片(wafer)形式和通過與載體混合的其組合形式而配制。此外，用于腸胃外給藥的載 體可包括水、適合的油、生理鹽水、含水葡萄糖、乙二醇等，并且可進(jìn)一步包括穩(wěn)定劑和防腐 劑。適用于本發(fā)明的穩(wěn)定劑可包括抗氧化劑如亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉和抗壞血酸。適合的 防腐劑可包括苯扎氯銨、尼泊金甲酯、尼泊金丙酯及氯丁醇。本發(fā)明的藥物組合物可配制為各種腸胃外和口服給藥形式。腸胃外制劑的代表性 實(shí)例包括設(shè)計(jì)用于注射給藥的那些。對于注射,本發(fā)明的重組蛋白可配制在水溶液，特別是 生理兼容性緩沖液或生理鹽水緩沖液中。這些注射制劑可以通過常規(guī)方法利用一種或多種 分散劑、潤濕劑和懸浮劑進(jìn)行配制。對于口服給藥,蛋白可通過將蛋白與本領(lǐng)域熟知的藥用 載體結(jié)合而方便地配制。這樣的載體使得能夠?qū)⒈景l(fā)明的蛋白配制成片劑、丸劑、膠囊、液 體、凝膠、糖漿、漿液、懸浮液等，用于待治療患者進(jìn)行口服消化。這樣的口服固體制劑可包 括適合的賦形劑如稀釋劑(例如,乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇、山梨糖醇纖維素和/或甘氨 酸)和潤滑劑(如膠態(tài)硅、滑石、硬脂酸、硬脂酸鎂、硬脂酸鈣、和/或聚乙二醇)。片劑可包 括粘結(jié)劑，如硅酸鋁、淀粉、明膠、黃蓍膠、甲基纖維素、羥丙基甲基_纖維素、羧甲基纖維素 鈉、和/或聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)，以及崩解劑，如交聯(lián)聚乙烯基吡咯烷酮、瓊脂或褐藻酸 或其鹽如褐藻酸鈉。如果需要，可以加入吸收劑、著色劑、調(diào)味劑和/和甜味劑?？梢园凑?本領(lǐng)域中熟知的常規(guī)方法通過混合、制粒和涂覆制備制劑。如有必要，本發(fā)明的藥物組合物可進(jìn)一步包括藥物添加劑，如防腐劑、抗氧化劑、 乳化劑、緩沖劑和/或用于調(diào)節(jié)滲透壓的鹽以及其它治療有效的物質(zhì)，且可按照本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法進(jìn)行配制。
另外，本發(fā)明的藥物組合物可以經(jīng)由口腔途徑或腸胃外途徑如靜脈內(nèi)、皮下、鼻內(nèi) 或腹膜內(nèi)進(jìn)行給藥?？诜o藥可包括舌下施用。腸胃外給藥可包括點(diǎn)滴注射和注射如皮下 注射、肌內(nèi)注射、靜脈內(nèi)注射以及腫瘤內(nèi)注射。本發(fā)明重組蛋白的總有效量能夠以單一劑量給予患者或者通過分開的治療方案 進(jìn)行給藥，其中多個(gè)劑量在更長的一段時(shí)間內(nèi)進(jìn)行給藥。盡管在本發(fā)明的藥物組合物中重 組蛋白或編碼其的核苷酸的量可依賴于疾病的嚴(yán)重程度可變化，蛋白或核苷酸可一般情況 下以5至20mg的有效劑量一天給予幾次。然而,本發(fā)明的藥物組合物中重組蛋白的適合劑 量可取決于多種因素，如患者的年齡、體重、健康狀態(tài)、性別、疾病嚴(yán)重程度、飲食和排泄，以 及給藥途徑和待給藥的治療數(shù)目。鑒于____Ll述因素，本領(lǐng)域中的任何技術(shù)人員可確定作為抗 癌劑用于治療和預(yù)防P18缺乏和失效的組合蛋白的有效劑量。含重組蛋白的本發(fā)明的藥物 組合物對其劑型、給藥途徑和/或給藥模式?jīng)]有特別限制,只要其表現(xiàn)出本發(fā)明的效果。[實(shí)施例]提供以F實(shí)施例以更加詳細(xì)地舉例說明本發(fā)明的實(shí)施方式，但絕非意在限制本發(fā) 明的范圍。實(shí)施例1-細(xì)胞可透性pl_8重組蛋白(CP-pl8)的構(gòu)建<1-1>通過采用kFGF4-來源MTD構(gòu)建pl8重組蛋白通過采用kFGF4-來源MTD (MTD1)構(gòu)建三種全長形式和五種截短形式的細(xì)胞可透 性ρ 18 (CP-ρ 18)重組蛋白。參照圖la,全長形式的CP-pl.8重組構(gòu)建體為如下1):圓1 18,其中kFGF4-來源 MTD融合至全長pl8的N-末端；2) HplSM1,其中kFGF4_來源MTD融合至全長pl8的C-末 端；3) HMlPlSM1，其中kFGF4-來源MTD融合至全長ρ 18的兩個(gè)末端，其中，His-標(biāo)簽和來源 于SV40大T抗原的NLS共價(jià)地連接至上述構(gòu)建體的N-末端。為了制備全長CP pl8重組 構(gòu)建體,通過使用下表1中描述的寡核苷酸作為特異于每個(gè)重組構(gòu)建體的引物對以及使用 人類pl8cDNA(SEQ ID NO 1)作為模板進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)(圖2a)。用于擴(kuò)增HMlP18 的正向和反向引物分別具有SEQ ID NO: 13和12表示的核苷酸序列；用于擴(kuò)增HplSM1的正 向和反向引物分別具有SEQ ID NO 11和14表示的核苷酸序列；用于擴(kuò)增HM1PlSM1的正向 和反向引物分別具有SEQ ID NO :13和14表示的核苷酸序列。而且,截短形式的CP-pl8重組蛋白為如下=DHpISNM1,其中kFGF4_來源MTD融合 至缺少S-和C-末端結(jié)構(gòu)域的P18N-末端結(jié)構(gòu)域片段的C-末端；2) HplSSM1，其中kFGF4_來 源MTD融合至缺少N 和O末端結(jié)構(gòu)域的pl8S 末端結(jié)構(gòu)域片段的C 末端；3) HplSCM1，其 中kFGF4 來源MTD融合至缺少N 和S 末端結(jié)構(gòu)域的pl8C 末端結(jié)構(gòu)域片段的C 末端；4) HpISNSM1,其中kFGF4-來源MTD融合至缺少C-末端結(jié)構(gòu)域的pl8N_和S-末端結(jié)構(gòu)域片段 的C-末端；以及5) HP18SCM,，其中kFGF4-來源MTD融合至缺少N-末端結(jié)構(gòu)域的pl8S_和 C-末端結(jié)構(gòu)域片段的C-末端，其中，His 標(biāo)簽和來源于SV40大T抗原的NLS共價(jià)地連接 至所有構(gòu)建體的N 末端。為了制備截短CP-P18重組蛋白，通過使用表1中的寡核苷酸作為 特異于每種重組蛋白的引物組以及使用人類plScDNA(SEQ ID NO :1)作為模板進(jìn)行PCR(圖 2a)。用于擴(kuò)增HplSNM1的正向和反向引物分別具有SEQ ID NO 11和15表示的核苷酸序 列；而用于擴(kuò)增HplSSM1的正向和反向引物分別具有SEQ ID NO 16和17表示的核苷酸序列；用于擴(kuò)增HplSCM1的正向和反向引物分別具有SEQ ID NO 14和18表示的核苷酸序列； 用于擴(kuò)增HpISNSM1的正向和反向引物分別具有SEQ ID NO=Il和17表示的核苷酸序列；用 于擴(kuò)增HpISSCM1的正向和反向引物分別具有SEQID NO 14和16表示的核苷酸序列。PCR在50 μ 1含有IOOng人類plScDNA作為模板的反應(yīng)混合物中進(jìn)行、0. 2mMdNTP 混合物(dGTP、dATP、dTTP、以及dCTP,分別為2mM)、0. 6 μ M的各種引物、5 μ 1的IOXTaq緩 沖液、1 μ 1的Taq聚合酶(Takara,日本)。PCR在94°C起始變性3分鐘后進(jìn)行30次循環(huán) (940C 45秒、57°C 45秒及72°C 45秒),然后在72°C最后延展4分鐘。PCR完成后,用限制 性酶NdeI消化擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物并加載到1. 0%的瓊脂糖凝膠上以分餾分離。如圖2a所示， 證實(shí)了融合至kFGF4-來源MTD的每個(gè)重組構(gòu)建體的預(yù)期片段被成功擴(kuò)增。將預(yù)期大小的DNA帶從凝膠切割F來、洗脫、并通過利用QIA快速凝膠提取試劑盒 (QiagemUSA)進(jìn)行純化。將洗脫的DNA用乙醇沉淀并在6 μ 1蒸餾水中再懸浮用于進(jìn)行連 接。如圖3a所示,按照TA克隆方法,用T4連接酶將含有編碼區(qū)的PCR擴(kuò)增DNA片段亞克 隆入pGEM-T簡易載體(Promega,Madison WI, USA)中，隨后用該pGEM-T簡易載體轉(zhuǎn)化大腸 桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞。將細(xì)胞鋪放在LB平板培養(yǎng)基....匕其中補(bǔ)充有100 μ g/ml的氨芐霉 素，并于37°C培養(yǎng)過夜。通過用限制性酶NdeI在37°C處理1小時(shí)而分離重組片段插入的 pGEM-T簡易載體后，使其進(jìn)行0. 8%瓊脂糖凝膠電泳。如圖3b所示，檢測到全長形式的約0. 6kb的DNA片段以及截短形式的約 0. 2-0. 4kb的DNA片段和約3kb的載體片段，證實(shí)CP_pl8重組構(gòu)建體的插入DNA被合適地 亞克隆入pGEM T簡易載體中。將帶有組氨酸-標(biāo)簽和T7啟動(dòng)子的pET-28⑴a載體(Novagen, Madison, WI)用 限制性酶NdeKEnzynomics,韓國)消化。通過利用QIA快速凝膠提取試劑盒來純化含有 CP-p 18重組片段的pGEM-T簡易載體片段和pET_28 (+) a載體片段。采用T4連接酶在16°C 下經(jīng)12小時(shí)將每種pGEM-T簡易載體片段克隆入預(yù)處理的pET 28a(+)中，隨后用獲得的 pET 28a(+)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞(圖4a)。在用限制性酶NdeI (Enzynomics,韓國)處理這些克隆體并進(jìn)行0.8%的瓊脂糖凝 膠電泳后，確證檢測到全長形式的約0. 6kb的DNA片段以及截短形式的約0. 2-0. 4kb的DNA 片段和約5kb的載體片段，證實(shí)CP-pl8重組構(gòu)建體的插入DNA已克隆入pET-28a(+)載體 中，如圖4b所示。得到成功克隆的用于表達(dá)細(xì)胞可透性pl8重組蛋白的表達(dá)載體分別指定為pHplS、 PHM1P18、pHpl8M,、pHM:lpISM1、pHpl8NM,、pHp 18SM:I、pHpISCM1、pHpl8NSM,和 pHp 18SCM〖。其中，通 過用表達(dá)載體PliPlSM1轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α獲得的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體DII5 α /HplSM1在2008年 4月12日按照布達(dá)佩斯條約以登錄號KCTC-11310ΒΡ保藏于韓國大田廣域市305-333儒城區(qū) 魚隱洞52號的韓國韓國生物科學(xué)和生物技術(shù)研究所(KRIBB)典型培養(yǎng)物保藏中心(KCTC)。<1-2>通過利用J0-10IMTD和J0-103MTD構(gòu)建ρ 18重組蛋白為了通過利用JO-101MTD(MTD2)和J0-103MTD (MTD3)構(gòu)建細(xì)胞可透性ρ 18重組蛋 白，對每種MTD構(gòu)建了全長形式的CP-p 1.8重組構(gòu)建體。參照圖2b,融合至JO-10IMTD的全長形式的CP_p 18重組構(gòu)建體為如下1) HM2P18, 其中J0-10IMTD融合至全長pl8的N-末端，2)Hpl8M2，其中J0-10IMTD融合至全長pl8的 C-末端，3)HM2PISM2，其中JO-101MTD融合至全長pl8的兩個(gè)末端,其中，Iiis-標(biāo)簽和來源于SV40大T抗原的NLS共價(jià)地連接至上述構(gòu)建體的N-末端。為了制備全長CP-pl8重組 蛋白，按照以上述實(shí)施例1的<1_1>部分所描述的相同方法進(jìn)行PCR0用于擴(kuò)增HM2PlS的 正向和反向引物分別具有SEQ ID NO: 19和12表示的核苷酸序列；而用于擴(kuò)增IIplSM2的正 向和反向引物分別具有SEQ ID NO 11和20表示的核苷酸序列，以及用于擴(kuò)增HM2pl8M2的 正向和反向引物分別具有SEQ ID NO: 19和20表示的核苷酸序列。而且，融合至.J0-103MTD的全長形式的CP_pl8重組構(gòu)建體為如下1)ΗΜ3ρ18，其中 J0-103MTD融合至全長pl8的N-末端,2) Hpl8M3，其中JO-103MTD融合至全長pl8的C-末 端，3) HM:3pl8M3，其中JO-103MTD融合至全長pl8的兩個(gè)末端，其中，His-標(biāo)簽和來源于SV40 大T抗原的NLS共價(jià)地連接至上述構(gòu)建體的N-末端。為了制備全長CP-pl8重組蛋白，按 照以—匕述實(shí)施例的<1_1>部分所描述的相同方法進(jìn)行PCR。用于擴(kuò)增M3PlS的正向和反向 引物分別具有SEQ ID NO 21和12表示的核苷酸序列；而用于擴(kuò)增HplSM3的正向和反向引 物分別具有SEQ ID NO 11和22表示的核苷酸序列，以及用于擴(kuò)增HM3PISM3的正向和反向 引物分別具有SEQ ID NO 21和22表示的核苷酸序列。將每種PCR擴(kuò)增的DNA片段亞克隆入pGEM_T簡易載體中，隨后按照上述實(shí)施例1 的<14>部分中描述的相同方法克隆入pET 28 (+) a載體中，從而獲得用于表達(dá)細(xì)胞可透性 PlS重組蛋白的表達(dá)載體。重組片段成功插入到pGEM-T簡易載體和pET-28⑴a載體中，已 在圖3c和4c中得到證實(shí)。由此獲得的用于表達(dá)細(xì)胞可透性pl8重組蛋白的表達(dá)載體分別指定為 PlM2P 18、plip 18M2、pIM2p 1SM2、pHM3p 18、pHp 1SM3、以及 pHM3p 18M3。其中，通過用每種表達(dá) 載體pHM2pl8M2, pHM3pl8轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α獲得的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體DH5 α /HM2pISM2, DH5 α /HM2PlSM2在2008年4月12日按照布達(dá)佩斯條約分別以登錄號KCTC-1131IBP和 KCTC-11312BP保藏于韓國大田廣域市儒城區(qū)魚隱洞52號(305-333)的韓國生物科學(xué)和生 物技術(shù)研究所(KRIBB)典型培養(yǎng)物保藏中心(KCTC)。作為特異于每種重組蛋白的正向和反向引物組的寡核苷酸總結(jié)于下表2中。[表2] [表2續(xù)] 實(shí)施例2-重組蛋白的表達(dá)<2-D最佳菌株的選擇為了選擇用于表達(dá)上述實(shí)施例1中制備的細(xì)胞可透性P18重組蛋白的表達(dá)的最 佳菌株，在大腸桿菌 BL21 (DE3)、BL21-金(BL21_Gold) (DE3)、BL21_CodonPlus (密碼子 +) (DE3)和BL21-金(DE3)pLysS菌株(Stratagene，USA)中進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)，以上所有菌株均包 含LacI啟動(dòng)子。首先,將每種表達(dá)載體PHM1PlS JHplSM1、和pHpl8 (對照)按照熱休克方法分別轉(zhuǎn)化至大 腸桿菌 BL21 (DE3)、BL21-金(DE3)、BL21-CodonPlus (DE3)和 BL21-金(DE3)pLysS 中，隨后在含有 50 μ g/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)。之后，將用重組蛋白編碼基因轉(zhuǎn)化的細(xì)胞在Iml的LB培 養(yǎng)基中在37°C生長過夜,然后在37°C下在IOQml的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng),同時(shí)強(qiáng)烈搖晃,直到光密度 BOO(OD600)達(dá)到0.5。然后以終濃度為0.65mM將IPTG(異丙基-β-D硫代半乳糖苷)加入其中，以 誘導(dǎo)CP-pl8重組蛋白的表達(dá)。使蛋白誘導(dǎo)在37°CTF延長3小時(shí)。通過在4。C F，以7000Xg離心 20分鐘收獲大腸桿菌培養(yǎng)溶液,再懸浮于溶胞緩沖液(IOOmMNaH2PO4, IOmM Tris-HC1，8M脲，pll 8. 0) 中,并在冰上使用配備有探針的近距離聲波定位器進(jìn)行超聲處理。將細(xì)胞溶解產(chǎn)物以14000 X g離 心15分鐘,從而將不可溶部分與可溶部分分離。將由此獲得的在具有IPTG的大腸桿菌菌株中表 達(dá)的CPilS重組蛋白的可蔣和不可溶部分加載到SDS-PAGE凝膠....丨二。如圖5a所示,在BL21-CodonPlus (DE3)中觀察到最高表達(dá)水平的CP-pl8重組蛋 白。根據(jù)這些結(jié)果,選擇BL21 C0d0nPlUS(DE3)作為用于表達(dá)根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞可透性pl8 重組蛋白的最佳菌株。
<2_2>重組蛋白的表達(dá)將每種表達(dá)載體P^lP18、ρΗρΙδΜ,和ρΗρ18 (對照)按照熱休克方法轉(zhuǎn)化至以一I 實(shí)施例2的部分<2-D中選擇作為最佳菌株的大腸桿菌BL21-CodonPlUS(DE3)中，隨后在 含有5()yg/m:[卡那霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)。之后,將用重組蛋白編碼基因轉(zhuǎn)化的細(xì)胞在 25ml的LB培養(yǎng)基中在37 培養(yǎng)過夜,然后在37°C下在IL的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，同時(shí)強(qiáng)烈 搖晃，直到光密度600 (OD600)達(dá)到0. 5。然后以終濃度為0. 65mM將IPTG加入其中，以誘導(dǎo) CP-pl8重組蛋白的表達(dá)。使蛋白誘導(dǎo)在37°C下延長3小時(shí)。通過在4°C下，以7000Xg離 心20分鐘收獲大腸桿菌培養(yǎng)溶液,再懸浮于溶胞緩沖液(IOOmM NaH2PO4JOmM Tri s-HCl， 8M脲，pH8. 0)中，并在冰上使用配備有探針的近距離聲波定位器進(jìn)行超聲處理。將細(xì)胞溶 解產(chǎn)物以HOOOXg離心15分鐘，從而將不可溶部分與可溶部分分離。將由此獲得的在具 有IPTG的大腸桿菌菌株中表達(dá)的CP-pl8重組蛋白的可溶和不可溶部分加載至SDS-PAGE如圖5b所示，證實(shí)了在宿主細(xì)胞中表達(dá)的細(xì)胞可透性pl8重組蛋白( 21kDa) 大部分作為包含體包含在不可溶部分中，且它們的表達(dá)在IPTG存在下得到顯著提高。實(shí)施例3-重組蛋白的純化細(xì)胞可透性pl.8重組蛋白在大腸桿菌系統(tǒng)中的可誘導(dǎo)表達(dá)導(dǎo)致不可溶聚集體的 形成,該不可溶聚集體被稱為包含體。為了完全溶解這些包含體,上述所有表達(dá)蛋白通過將首先，將用每種表達(dá)載體 pHpl8、PlM1P 18, ρΙΙρΙδΜ^ ρΗΜ2ρ18、ρΙΙρ18Μ2、ρΗΜ2ρ18Μ2、 ρΗΜ3ρ 1.8、pHplSM3、以及 ρΗΜ3ρ18Μ3 轉(zhuǎn)化的 BL21-CodonPlus (DE3)菌株,按照實(shí)施例 2 中所述， 在IL的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)。每種培養(yǎng)溶液通過離心而收獲,輕輕地再懸浮于20ml的溶胞緩 沖液(IOOmM NaH2PO4, IOmMTris-HCl，8M脲，pH8.0)中，同時(shí)沒有形成氣泡，并在冰....匕使用配 備有探針的近距離聲波定位器進(jìn)行超聲處理。使細(xì)胞間歇地進(jìn)行聲波處理30秒，然后冷卻 10秒，同時(shí)將功率設(shè)定為最大功率的25%?？偟穆暡ㄌ幚頃r(shí)間為5分鐘。以3000Xg離心 細(xì)胞溶解產(chǎn)物25分鐘,從而分離上清和細(xì)胞碎片沉淀物。將上清加載到Ni-NTA瓊脂糖樹 脂上，其中次氮基三乙酸瓊脂糖(nitrilotriacetic acidagarose)加載有鎳(Ni)。Ni-NTA 瓊脂糖樹脂用溶解緩沖液平衡。通過在4°C下輕輕振蕩(使用旋轉(zhuǎn)振蕩器)8小時(shí)以上而使 上清吸附在樹脂上。吸附有含重組蛋白的包含體的樹脂在4°C下以IOOOXg離心5分鐘， 以去除反應(yīng)溶液,并用清洗緩沖液(IOOmM NaH2PO4, IOmM Tris-HCl,8M脲，pH6. 3)清洗五次 以去除非特異性吸附的物質(zhì)。在清洗后，用洗脫緩沖液(IOOmM NaH2PO4, IOmM Tris-HCl,8M 脲，PH4. 0)洗脫吸附至樹脂的蛋白2小時(shí)或8小時(shí)。洗脫的蛋白用12%的SDS-PAGE凝膠 電泳進(jìn)行分析，通過輕輕震蕩用考馬斯亮藍(lán)^Coomassie Bri l liant Blue R)染色,并用脫根據(jù)圖6a-6c中示出的結(jié)果，分別融合至kFGF4-來源MTD、.J0-10IMTD和 J0-103MTD的所有細(xì)胞可透性pl8重組蛋白，作為對應(yīng)于大約21kDa的單一條帶得到檢測， 這證實(shí)了本發(fā)明的細(xì)胞可透性PlS重組蛋白已從不可溶部分得到純化。實(shí)施例4-重組蛋白的再折疊由于如在以上實(shí)施例3中所描述的從不可溶部分中純化的本發(fā)明的細(xì)胞可透性 PlS重組蛋白通過強(qiáng)變性劑，如8M脲進(jìn)行變性，因而必須將變性的蛋白通過如下的再折疊步驟轉(zhuǎn)化為活性形式。 首先，通過使它們在4 0C經(jīng)再折疊緩沖液(0. 55M胍HC1，0. 44ML-精氨酸，SOmM Tris^HCl, 150mM NaCl, ImM EDTA’ IOOmMNDSB, 2mM 氧化型谷胱甘肽，以及 0. 2mM 還原型谷胱 甘肽)透析24小時(shí)，由此去除變性劑,使純化的重組蛋白進(jìn)行再折疊過程。通過使用透析 袋(褶皺蛇皮,PIERCE)在4°C下使所有再折疊的重組蛋白對細(xì)胞培養(yǎng)基DMEMiDulbecco改 進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基)透析8小時(shí)。每3小時(shí)將培養(yǎng)基用新鮮的DMEM替代。為了定量地確定上述再折疊為其活性形式的CP-pl8重組蛋白的細(xì)胞可透性,將 它們用FITC(熒光素-5-異硫氰酸鹽，MolecularProbe)進(jìn)行標(biāo)記。將重組蛋白(2-20mg) 與1 μ 1的333mg/ml的濃度的FITC混合并在室溫下在暗室中通過輕輕攪拌反應(yīng)1小時(shí)。在 4°CTF將反應(yīng)溶液對DMEM透析1天，直到未反應(yīng)的FITC被完全去除，從而獲得FITC-結(jié)合 的重組蛋白。將由此獲得的FITC-結(jié)合的重組蛋白進(jìn)行Bradford蛋白分析以測定蛋白濃 度。結(jié)果,每種FITC-結(jié)合的重組蛋白被測定具有約1 μ g/ μ 1的濃度。實(shí)施例5-細(xì)胞可透性的測定<5_1>流式細(xì)胞術(shù)為了定量地測定根據(jù)本發(fā)明的CP-ρ18重組蛋白的細(xì)胞可透性,將來源于小鼠巨 噬細(xì)胞的RAW264. 7細(xì)胞用10 μ M上述制備的每種FITC 結(jié)合的重組蛋白在37°C下培養(yǎng)1 小時(shí)。將RAW264. 7細(xì)胞維持在補(bǔ)充有10%胎牛血清和5%青霉素/鏈霉素(500mg/ml) 的DMEM中并在含5% CO2的空氣中的潮濕環(huán)境下在37°σ下進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)后，用胰蛋白 酶/EDTA(T/E, Invitrogen, Carlsbad, CA)處理細(xì)胞以去除細(xì)胞表面結(jié)合的蛋白，用冷的 PBS清洗三次,然后采用FACS (熒光激活細(xì)胞分選)Caliber系統(tǒng)(Beckton-Dickinson)的 CellQuest Pro軟件程序進(jìn)行流式細(xì)胞分析。圖7a至7c示出了流式細(xì)胞分析的結(jié)果，其中灰色覆蓋的曲線代表僅有細(xì)胞，黑色 曲線代表僅FITC，藍(lán)色曲線代表未融合至MTD的HplS (對照)的細(xì)胞可透性,綠色曲線代 表其中MTD (MTI)1、MTD2或MTD3)融合至其N-末端的HMplS的細(xì)胞可透性，紅色曲線代表其 中MTD (MTDp MTD2或附03)融合至其C-末端的HMplS的細(xì)胞可透性,且橙色曲線代表其中 MTD(MTD1、MTD2或MTD3)融合至其兩個(gè)末端的HMp 18的細(xì)胞可透性。參照圖7a至7c中示出的 結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在融合有kFGF4 來源MTD (MTD1)的細(xì)胞可透性ρ 18重組蛋白的情況下，含有融合 至其C-末端的MTD的HplSM1比含有融合至其N-末端的MTD的HM:lP18表現(xiàn)更高的細(xì)胞可透 性。在融合有J0-10IMTD (MTD2)的CP_pl8的情況下,含有融合至其N-末端的MTD的HM2P18、 含有融合至其C-末端的MTD的HplSM2以及含有融合至其兩個(gè)末端的MTD的HM2pl8M2表現(xiàn)相 似的細(xì)胞可透性，并高于未融合至MTD的對照。此外，在融合有J0-103MTD (MTD3)的CP-ρ 18 的情況下，含有融合至其N 末端的MTD的HM3PlS和含有融合至其C-末端的MTD的HplSM3 比含有融合至其兩個(gè)末端的MTD的HM3PlSM3表現(xiàn)出更高的細(xì)胞可透性。<5-2>共焦激光掃描顯微鏡分析I為了可視化遞送至細(xì)胞中的人PlS蛋白的細(xì)胞內(nèi)定位,沒有用FITC(僅細(xì)胞)或 用FITC(僅FITC)、或10 μ M缺少kFGF4-來源MTD(HplS)的FITC-結(jié)合的重組蛋白、或 10 μ M融合至kFGF4-來源MTD (HM1P18, HplSM1)的FITC-結(jié)合的重組蛋白處理NIH3T3細(xì) 胞1小時(shí)，并通過共焦激光掃描顯微鏡可視化。在5% CO2中在37°σ下將ΝΙΗ3Τ3細(xì)胞維 持在補(bǔ)充有10%胎牛血清和5%青霉素/鏈霉素(500mg/ml)的DMEM中。為了保持重組蛋白的FITC熒光,在觀察前將載玻片在10ul的封固劑中固定15分鐘。為了直接檢測被 內(nèi)在化的FITC-結(jié)合的重組蛋白，用PBS清洗細(xì)胞三次并用核熒光染色溶液碘化丙啶(PI， Sigma~Aldrich,St. Louis,M0)進(jìn)行復(fù)染色。用諾馬斯基(normaski)過濾器通過共焦激光 掃描顯微鏡分析，確定在單個(gè)細(xì)胞的中部的熒光胞內(nèi)分布。如圖8a至8c所示,觀察到用FITC(綠色)和PI (紅色)染色的細(xì)胞可透性pl8 重組蛋白大面積地分布在核中，這與通過流式細(xì)胞術(shù)確定的CP-pl8重組蛋白的細(xì)胞可透 性一致。從這些結(jié)果可證實(shí),本發(fā)明的細(xì)胞可透性P18重組蛋白表現(xiàn)出高的細(xì)胞可透性。<5-3>共焦激光掃描顯微分析11:為了考察根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞可透性pl8重組蛋白相對于組織是否表現(xiàn)出細(xì)胞可 透性，進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn)。在該實(shí)驗(yàn)中，使用1-周齡的MIIC (主要組織相容性復(fù)合體)-缺陷型Balb/c nu/ mi小鼠(Central Lab. Animal Inc.,首爾)。對小鼠在其右腿使用注射器(omincan,德 國，B.BRAUN)皮下注射人結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT-116細(xì)胞(1 X 107)(韓國細(xì)胞系庫)，從而誘 導(dǎo)腫瘤形成。同時(shí)，用FITC標(biāo)記HP18M,(其中kFEF4-來源MTD (MTD丨)融合至其C-末端)、 IM2pl8M2 (其中 JO-101MTD (MTD2)融合至其兩個(gè)末端)、HM3pl8 (其中 JO-103MTD (MTD3)融合 至其N 末端)、以及未融合MTD的Hpl.8。對具有腫瘤的小鼠經(jīng)腹膜內(nèi)注射給予300 u g的 每種FITC-結(jié)合的重組蛋白。兩小時(shí)后,處死小鼠，并從肝、腎、脾、肺、心、腦、以及腫瘤中提 取各種組織樣本。將提取的組織樣本包埋在OCT化合物中，冷凍，然后用超薄切片機(jī)切割成 14um的厚度。將組織樣品固定在載玻片上并用共焦激光掃描顯微鏡觀察。為了保持重組 蛋白的FITC熒光,在觀察前將載玻片在10u 1的封固劑中固定15分鐘。如圖9中所示,發(fā)現(xiàn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至用FITC(綠色)清楚染色的核中，并且在所有的組 織樣品中觀察到PI (紅色)，這與通過流式細(xì)胞術(shù)測定的CP-pl8重組蛋白的細(xì)胞可透性一 致。這些結(jié)果表明，根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞可透性P18重組蛋白能夠有效地用于將腫瘤抑制因 子P18轉(zhuǎn)運(yùn)到靶組織中。實(shí)施例6-細(xì)胞可透性pl8重組蛋白的體內(nèi)功能<6_1>蛋白質(zhì)印跡分析為了評估根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞可透性pl8重組蛋白的體內(nèi)功能，如下進(jìn)行蛋白質(zhì)印 跡分析。從韓國細(xì)胞系庫(韓國首爾)購得本實(shí)驗(yàn)中使用的HC1M16細(xì)胞，一種人結(jié)腸癌細(xì) 胞系。在5% C02培養(yǎng)器(恒溫箱，incubator)中在37°C下將HCT-116細(xì)胞維持在RPMI1640 培養(yǎng)基(L-谷氨酸300mg/L，25mM HEPES, 25mM NaHC0389 . 3 %，熱失活的胎牛血清9. 8 %，鏈 霉素/青霉素0. 9% )中。向6-孔板的每個(gè)孔中加入2ml的RPMI 1640培養(yǎng)基，然后向其 中接種HCT-116細(xì)胞,在37°C下培養(yǎng)1天，然后在沒有血清存在下再培養(yǎng)1天。去除培養(yǎng) 基后,用冷的PBS (磷酸鹽緩沖鹽水)清洗HCT-116細(xì)胞并分別以10 y M、10 u M禾D 20 y M的 濃度用腿；^18 (其中kFGF4-來源MTD融合至其N-末端)、Hpl8M:l (其中kFGF4_來源MTD 融合至其O末端)、和Hpl8(未融合至MTD)中的每一種處理。用重組蛋白處理的細(xì)胞在 5% C()2培養(yǎng)器中于37°C下反應(yīng)4小時(shí)以便誘導(dǎo)p21的表達(dá),或培養(yǎng)1小時(shí)以便誘導(dǎo)p53、 ATM、MEK、ERK和Rb的磷酸化。反應(yīng)完成后，將細(xì)胞再懸浮于200 u 1的溶胞緩沖液(20mM HEPES，Ph7. 2，1 % Triton-X, 10%甘油)中并在冰上進(jìn)行超聲處理30分鐘，從而獲得細(xì)胞 溶解產(chǎn)物。在4°C以12000rpm離心細(xì)胞溶解產(chǎn)物20分鐘以分離上清。使由此獲得的上清進(jìn)行Bradford蛋白測定以定量地檢測蛋白濃度,并保存于-80°C直到使用時(shí)。對于蛋白質(zhì)印跡分析，使用p21Wafl/Cipl(21kDa，CellSignaling Technology)、 磷(phospho)-p’53(Serl5，53kDa, CellSignaling)、磷-ATM(Serl981，’350kDa, Santa Cruze Biotechnology)、磷-MEK1/2(Ser217/221,45kDa, Cell Signaling)、磷-Erk(Thr202/ Tyr204、42/'44kDa, Cell Signaling)、以及磷-Rb (Ser807/811, IlOkDa, Santa Cruz Biotechnology)作為第一抗體，并使用羊抗-小鼠 IgG-HRP (Santa Cruz Biotechnology) 和羊抗-兔IgG-HRP(Santa Cruz Biotechnology)作為第二抗體。將上清施加至處于 100V的12%卜二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)上并轉(zhuǎn)移到在70V的PDVF膜 上達(dá)2小時(shí)。為了避免在印跡蛋白和不相關(guān)抗體之間發(fā)現(xiàn)非特異性相互作用，用在TBS/ TdOmMTris-Cl, 150mM NaCl,0. 05% Tween 20,pH 8.0)中的 5% 的脫脂奶粉封閉該P(yáng)VDF膜 1小時(shí)，然后用每種第一抗體在4°C下孵育1小時(shí)。用TBS/T清洗膜五次并在室溫下用第二 抗體孵育ι小時(shí)。在用TBS/T清洗五次后,用ECL(增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光)檢測系統(tǒng)(GEHealthcare Amersham UK)對膜染色以可視化抗原/抗體相互作用。如圖10中所示，在用細(xì)胞可透性pl8重組蛋白(其融合有kFGF4_來源MTD)處理 的細(xì)胞中，p21的表達(dá)和ATM(P-ATM)和p53 (P-p53)的磷酸化(誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯)增加， 而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期活化的MEK (P-MEK)、ERK(P-ERK)和Rb (P-Rb)的磷酸化減少。尤其是， HplSM1重組蛋白(其中kFGF4-來源MTD融合至其C-末端)強(qiáng)有力地抑制所培養(yǎng)癌細(xì)胞的 細(xì)胞周期，表明其能夠有效地用作能夠防止腫瘤形成的細(xì)胞周期抑制劑。同時(shí)，按照與上述相同的方法，對JO- 101MTD (MTD2)融合的重組蛋白(HM2P18、 HplSM2 和 HM2PlSM2)、J0-103MTD (MTD3)融合的重組蛋白(HM3pl8、HplSM3 和 HM3PlSM3)、以及 未融合至MTD的對照重組蛋白(HplS)進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。參照圖11中示出的結(jié)果，在用細(xì)胞可透性pl8重組蛋白處理的細(xì)胞中，p21的表 達(dá)和ATM (P-ATM)和p53(P p53)的磷酸化(誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯)增加，而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周 期活化的MEK (P-MEK)、ERK (P-ERK)和Rb (P-Rb)的磷酸化減少。尤其是,HM2pl.8M2重組蛋白 (其中kFGF4-來源MTD融合至其兩個(gè)末端)和HM3P18重組蛋白(其中kFGF4_來源MTD融 合至其C-末端)強(qiáng)有力地抑制所培養(yǎng)的癌細(xì)胞的細(xì)胞周期，表明它們能夠有效地用作能夠 防止腫瘤形成的細(xì)胞周期抑制劑。<6-2>細(xì)胞DNA含量分析為了考察根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞可透性pl8重組蛋白的體內(nèi)功能,通過如下的細(xì)胞 DNA含量分析來考察重組蛋白的細(xì)胞凋亡-誘導(dǎo)效應(yīng)。在5% CO2培養(yǎng)器中在37°C下將HCT-116細(xì)胞(韓國細(xì)胞系庫)，一種人結(jié)腸癌 細(xì)胞系，在 RPMI1640 培養(yǎng)基(L-谷氨酸 300mg/L, 25mM HEPES, 25raM KaHC0389. 3 % ,熱失 活的胎牛血清9. 8%,鏈霉素/青霉素0.9%)中培養(yǎng)。向6-孔板的每個(gè)孔中加入2ml的 RPMI1640培養(yǎng)基，然后向其中接種以上培養(yǎng)的HCT-116細(xì)胞，在37°CTF培養(yǎng)1天。以20 μ M 的濃度將HM1PlS和HplSM1 (均含有kFGF4-來源MTD (MTD1)融合其中)、IM2pl8M2 (融合有 」()-101MTD (MTD2))、HM3pl8 (融合有」()-103MTD (MTD3))、和 HplS (未融合至 MTD)中的每一種 加入各個(gè)孔中,然后在無血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)1小時(shí)。用冷的PBS清洗孔板兩次，向各個(gè)孔 中加入2ml的RPIM1640培養(yǎng)基，對孔板分別再培養(yǎng)0、2、4和8小時(shí)。然后，用冷的PBS清洗 細(xì)胞兩次，懸浮于200 μ 1的PBS中,并輕輕地浸泡在4ml的70%乙醇中。由此獲得的細(xì)胞懸浮液在冰上保持45分鐘并儲存在-20°C下1天。用PI (40 μ g/ml)和RNase A (100 μ g/ ml)處理細(xì)胞懸浮液并進(jìn)行流式細(xì)胞分析以定量誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡程度。根據(jù)圖12中示出的結(jié)果，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞系中的細(xì)胞周期進(jìn)程以較高速率得到 顯著抑制,并且由此在用細(xì)胞可透性P18重組蛋白(HM1PisdplSMr HM2PlSM2JM3PlS)處理 的細(xì)胞中強(qiáng)有力地誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡，而不是在未處理的和用對照蛋白(HplS)處理的細(xì)胞 中。
<6_3>利用膜聯(lián)蛋白-V分析細(xì)胞凋亡-誘導(dǎo)作用為了考察根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞可透性pl8重組蛋白的體內(nèi)功能,通過如下的膜聯(lián)蛋 白-ν測定考察重組蛋白的細(xì)胞凋亡_誘導(dǎo)作用。在5% CO2培養(yǎng)器中在37°CTF將HCT-116細(xì)胞(韓國細(xì)胞系庫)，一種人結(jié)腸癌細(xì) 胞系，在RPMI1640培養(yǎng)基(L-谷氨酸300mg/L，25mM HEPES, 25mM NaIIC0389. 3%，熱失活的胎 牛血清9.8%,鏈霉素/青霉素0. 9% )中培養(yǎng)。向6-孔板的每個(gè)孔中加入2m:[的RPMI1640 培養(yǎng)基，然后向其中接種以上培養(yǎng)的HCT-116細(xì)胞,在37°C下培養(yǎng)1天。以20 μ M的濃度將 HM3PlS (融合有J0-103MTD (MTD3))和Ηρ18 (未融合至MTD)中的每一種加入各個(gè)孔中，然后 在無血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)1小時(shí)。此后，用冷的PBS清洗細(xì)胞兩次，并以IXlO6細(xì)胞/ml的 濃度懸浮于Iml的結(jié)合緩沖液(IX)中。隨后,將l()()m:[的細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移至EP-管，并將 5ml的膜聯(lián)蛋白-V和5ml的PI加入其中，然后將EP-管在室溫下反應(yīng)15分鐘。反應(yīng)完成 后，向EP-管中加入400ml的結(jié)合緩沖液(IX)，并使細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞分析以定量誘導(dǎo)的 細(xì)胞凋亡程度。參照在圖13中示出的結(jié)果,發(fā)現(xiàn)與未處理的以及對照蛋白(HplS)處理的細(xì)胞相 比，在用細(xì)胞可透性PlS重組蛋白(HM3PlS)處理的細(xì)胞中以顯著更高的程度誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡。實(shí)施例7-細(xì)胞可透性pl8重組蛋白的體內(nèi)功能-腹膜注射<7 1>給藥期間的抗癌作用為了考察根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞可透性pl8重組蛋白的體內(nèi)功能,通過如下利用動(dòng)物 模型來研究重組蛋白的抗癌作用。在該實(shí)驗(yàn)中，采用7-周齡的MHC-缺陷Balb/c nu/nu小鼠(Central Lab. Animal Inc.,首爾)。通過使用注射器(oranican,德國，B. BRAUN)在其右腿上對小鼠皮下注射人結(jié) 腸癌細(xì)胞系HCT-116細(xì)胞(IX IO7)(韓國細(xì)胞系庫)，從而誘導(dǎo)腫瘤形成。將24只小鼠細(xì) 分成4組，每組6只小鼠。從通過使用游標(biāo)卡尺測量的腫瘤大小(寬度2X長度/2)達(dá)到 IOOmm3的那天起,在21天內(nèi)每天經(jīng)腹膜內(nèi)注射給予小鼠300 μ g的每種細(xì)胞可透性pl8重 組蛋白HM1PlS (第3組，1 μ g/ μ 1)和HplSM1 (第4組，1 μ g/ μ ！)，它們均含有kFGF4-來源 MTD融合其中。作為對照,將300 μ 1的賦形劑(RPMI1640培養(yǎng)基,第1組)和未融合至MTD 的Ηρ18(第2組)中的每一種經(jīng)腹膜內(nèi)注射給予小鼠21天。在注射完成后，測量每組小鼠 的腫瘤大小和體重，其中結(jié)果示于圖14a和14b中。參照在圖14a和14b中示出的結(jié)果，盡管與對照(第1組和第2組)相比，用細(xì)胞 可透性P18重組蛋白^1PlS和HplSM1處理的小鼠中腫瘤大小顯著減小,但在對照小鼠與細(xì) 胞可透性pl8重組蛋白處理小鼠之間卻沒有體重上的顯著差異。用細(xì)胞可透性pl8重組蛋 白處理的小鼠的腫瘤大小和體重的平均值P小于0.05，表明該結(jié)果有意義。圖15示出了可視化了在21天中給予根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞可透性pl8重組蛋白的小鼠中腫瘤大小和體重變 化的照片。視覺觀察到用細(xì)胞可透性P18重組蛋白處理的小鼠比對照小鼠表現(xiàn)出顯著減小 的腫瘤大小。<7_2>給藥后的抗癌作用 為了考察給藥后細(xì)胞可透性pl8重組蛋白(麗lP18、HplSM1)的體內(nèi)抗癌作用的持 續(xù)性，根據(jù)以—Ll實(shí)施例7的部分<7-1>中描述的相同方法在21天中給予小鼠每種重組蛋 白。在給藥終止后，從每組中選擇2只小鼠,并觀察它們的腫瘤大小7天。根據(jù)圖16a和1.6b中示出的結(jié)果,在所有的試驗(yàn)組中腫瘤大小都增大。具體地,雖 然HM1PlS處理小鼠(第3組)，與對照相似，腫瘤大小明顯增大(在給藥期間表現(xiàn)出顯著減 小的腫瘤大小)，但是HplSM1處理小鼠(第4組)腫瘤大小的增大顯著較小。這些結(jié)果表 明，細(xì)胞可透性PlS重組蛋白IIplSM1能夠在延長的時(shí)間期內(nèi)穩(wěn)定地維持其抗癌作用，因而 能夠有效地用作癌細(xì)胞的細(xì)胞周期抑制劑。實(shí)施例8-細(xì)胞可透性pl8重組蛋白的體內(nèi)功能_靜脈內(nèi)注射<8-1>給藥期間的抗癌作用為了考察根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞可透性pl8重組蛋白的體內(nèi)功能，按照以上實(shí)施例7 中描述的相同方法使用注射器在5-周齡的MHC 缺陷Balb/c nu/nu小鼠的右腿皮下注射 HCT-116細(xì)胞(IXlO7)0將15只小鼠細(xì)分為3組,每組5只小鼠。利用游標(biāo)卡尺選擇具有 腫瘤大小為70-80mm3 (寬度2X長度/2)的小鼠。將融合有J0-103MTD的細(xì)胞可透性pl8重 組蛋白(ΗΜ3ρ18,300μ g)、作為對照的賦形劑(RPIM 1640培養(yǎng)基,300 μ 1)和未融合至MTD 的重組蛋白Ηρ18(300μ g)中的每一種經(jīng)靜脈內(nèi)注射每日給予具有腫瘤的小鼠共14天。根據(jù)圖17a和17b中所示的結(jié)果,與對照小鼠相比,在用細(xì)胞可透性pl8重組蛋白 (HM3PlS)處理的小鼠中腫瘤生長得到顯著抑制。而且，盡管對照小鼠表現(xiàn)逐漸減小的體重， 但用細(xì)胞可透性PlS重組蛋白(HM3PlS)處理的小鼠與對照小鼠相比并不表現(xiàn)出體重的減 小,且由于腫瘤生長得到抑制因而體重增大。圖18示出了可視化與對照小鼠相比經(jīng)靜脈內(nèi) 注射給藥根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞可透性P18重組蛋白的小鼠中腫瘤大小變化的照片。<8-2>給藥后的抗癌作用為了考察給藥后細(xì)胞可透性pl8重組蛋白(HM3PlS)的體內(nèi)抗癌作用的持續(xù)性，根 據(jù)以實(shí)施例8的部分<8 1>中描述的相同方法在14天中給予小鼠每種重組蛋白。在給藥 終止后,從每組中選擇2只小鼠，并觀察它們的腫瘤大小達(dá)14天。參照圖19中示出的結(jié)果，盡管在對照小鼠(賦形劑)中腫瘤大小顯著增大，但終 止給予細(xì)胞可透性P18重組蛋白(IM3pl8)的小鼠維持與給藥期間相似的腫瘤大小，而沒有 引起任何腫瘤大小的突然變化。這些結(jié)果表明，細(xì)胞可透性P18重組蛋白能夠通過細(xì)胞周 期進(jìn)程和細(xì)胞分裂,將癌細(xì)胞完全重編程為正常細(xì)胞，因此能夠有效地用作癌細(xì)胞的細(xì)胞 周期抑制劑。實(shí)施例9-細(xì)胞可透性pl8重組蛋白的體內(nèi)功能-腫瘤內(nèi)注射<9-D給藥期間的抗癌作用為了考察根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞可透性pl8重組蛋白的體內(nèi)功能,按照以上實(shí)施例7 中描述的相同方法使用注射器在5-周齡的MHC-缺陷型Balb/c nu/nu小鼠的右腿皮下注 射IICT-116細(xì)胞(1X107)。將25只小鼠細(xì)分為5組,每組5只小鼠。利用游標(biāo)卡尺選擇腫瘤大小為90-100mm3(寬度2X長度/2)的小鼠。將融合至kFGF4_來源MTD的細(xì)胞可透性 pl8 重組蛋白 Hpl8M, (300 11 g)、融合至.J0-101MTD 的 HM2pl8M2 (300 u g)、融合至 J0-103MTD 的HM3pl8 (300 ii g)、作為對照的未融合至MTD的Hpl8 (300 u g)和賦形劑(RPIM1640培養(yǎng)基， 300ii 1)中的每一種經(jīng)腫瘤內(nèi)注射給予具有腫瘤的小鼠。根據(jù)圖20a和20b中所示的結(jié)果,與對照小鼠相比，在用細(xì)胞可透性pl8重組蛋白 (HplSM^HM^lSM^m^plS)處理的小鼠中腫瘤生長得到顯著抑制。而且，盡管對照小鼠表現(xiàn) 出逐漸減小的體重，但用細(xì)胞可透性P18重組蛋白(HplSMp HM2pl8M2、HM3pl8)處理的小鼠 與對照小鼠相比并不表現(xiàn)出體重的減小,且由于腫瘤生長得到抑制而體重增大。圖21示出 了可視化與對照小鼠相比經(jīng)腫瘤內(nèi)注射給予根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞可透性P18重組蛋白14天 的小鼠中腫瘤大小變化的照片。<9-2>給藥后的抗癌作用為了考察給藥后細(xì)胞可透性pl8重組蛋白(HplSM^HM^plSMpH^plS)的體內(nèi)抗癌 作用的持續(xù)性，根據(jù)以實(shí)施例9的部分<9-1>中描述的相同方法在14天中給予小鼠每種重 組蛋白。在給藥終止后，從每組中選擇2只小鼠，并觀察它們的腫瘤大小達(dá)14天。參照圖22中示出的結(jié)果，盡管在對照小鼠(賦形劑)中腫瘤大小顯著增大，但在 給予根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞可透性pl8重組蛋白的小鼠中腫瘤生長得到明顯抑制。實(shí)施例10-給予細(xì)胞可透性pl8重組蛋白I后的組織學(xué)分析為了考察給予細(xì)胞可透性pl8重組蛋白后腫瘤組織中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，利用 蘇木精 曙紅染色，在實(shí)施例8中所用的相同小鼠模型上進(jìn)行組織學(xué)分析。具體地，按照實(shí)施例8中描述的相同方法，對細(xì)分為三組(每組5只小鼠)的小鼠 經(jīng)靜脈內(nèi)注射分別給予細(xì)胞可透性P18重組蛋白(HM3pl8)、賦形劑、和Hpl8(對照)達(dá)14 天。從每組中選擇三只小鼠處死之后，從其提取腫瘤組織樣本。對每組中剩余的另外兩只 小鼠在終止給藥后再觀察14天，然后從其提取腫瘤組織樣本。上述提取的每個(gè)腫瘤組織均 在福爾馬林中固定并包埋于包埋中心在62°C下熔化的石蠟中，從而制備石蠟塊。用超薄切 片機(jī)切割石蠟塊成具有4 u m的厚度,其中將切片固定在載玻片上并用二甲苯處理5分鐘， 三次，以去除石蠟。接下來，通過連續(xù)用100%、95%、90%、80%和70%的乙醇處理，每種處 理達(dá)2分鐘以對載玻片進(jìn)行水合，用水清洗5分鐘,然后用蘇木精和曙紅染色。最后，通過 連續(xù)用70%、80%、90%、95%和100%的乙醇處理,每種處理達(dá)10秒以對載玻片進(jìn)行脫水， 然后通過用二甲苯處理兩次,每次3分鐘進(jìn)行脫蠟。然后,用加拿大香脂(Canada balsam) 作為封固劑封閉載玻片并用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察。參照圖23中示出的結(jié)果，用賦形劑和對照蛋白(IIplS)處理的小鼠中提取的腫瘤 組織并沒有顯著的組織學(xué)變化,而在用根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞可透性P18重組蛋白(HM3pl.8)處 理的小鼠中提取的腫瘤組織中，則觀察到凋亡細(xì)胞死亡的形態(tài)學(xué)變化特征,包括細(xì)胞核收 縮或片段化以及DNA斷裂(碎片)。此外，在用根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞可透性pl8重組蛋白處理 的小鼠中還觀察到，在終止給藥后癌細(xì)胞中仍然誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。實(shí)施例11-給予細(xì)胞可透性pl8重組蛋白II后的組織學(xué)分析為了考察給予細(xì)胞可透性pl8重組蛋白后腫瘤組織中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，利用 蘇木精_曙紅染色，在實(shí)施例9中所用的相同小鼠模型上進(jìn)行組織學(xué)分析。按照實(shí)施例10中描述的相同方法，進(jìn)行蘇木精和曙紅染色,不同之處在于，按照實(shí)施例9中描述的相同方法,對細(xì)分為五組(每組5只小鼠)的小鼠經(jīng)腫瘤內(nèi)注射給予細(xì) 胞可透性pl8重組蛋白(Hp 18M,、HM2Pl8M2、HM3P18)、賦形劑、和Hpl8 (對照)中的每一種達(dá) 14天，并從每組中的一只小鼠提取腫瘤組織樣本。參照圖24中示出的結(jié)果,用賦形劑和對照蛋白(HplS)處理的小鼠中提取的腫瘤 組織中并沒有顯著的組織學(xué)變化，而在用根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞可透性P18重組蛋白(HplSM1, HM2PlSM2, HM3PlS)處理的小鼠中提取的腫瘤組織中，則觀察到凋亡細(xì)胞死亡的形態(tài)學(xué)變化 特征，包括細(xì)胞核收縮或片段化以及DNA斷裂(碎片)。實(shí)施例12-給予細(xì)胞可透性pl8重組蛋白后的細(xì)胞凋亡-誘導(dǎo)作用的分析I為了考察給予細(xì)胞可透性pl8重組蛋白后腫瘤組織中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，使用 在實(shí)施例8描述的相同小鼠模型進(jìn)行TUNEL測定。具體地，按照實(shí)施例8中描述的相同方法，對細(xì)分為三組(每組5只小鼠)的小鼠 經(jīng)靜脈內(nèi)注射給予細(xì)胞可透性P18重組蛋白(HM3PlS)、載體、和Hpl_8(對照)中的每一種達(dá) 14天。從每組中選擇三只小鼠處死之后,從其提取腫瘤組織樣本。對每組中剩余的另外兩 只小鼠在終止給藥后再觀察14天，然后從其提取腫瘤組織樣本。按照實(shí)施例10中描述的 相同方法，通過使用提取的腫瘤組織來制備組織樣品并固定在載玻片上。將載玻片用二甲 苯處理5分鐘,三次,從而去除石蠟。然后連續(xù)用100%、95%、90%、80%和70%的乙醇處 理,每種處理2分鐘以對腫瘤組織脫水，隨后在PBS中孵育5分鐘。用溶解在0. 檸檬酸 鈉溶液中的0. l%Trition X-100處理載玻片8分鐘，并用PBS清洗兩次2分鐘。再向載 玻片滴加TUNEL反應(yīng)緩沖液(50 μ 1,Roche,USA)后，將載玻片培養(yǎng)在37°C下潮濕的培養(yǎng)器 中1小時(shí),用PBS清洗三次,然后用熒光顯微鏡觀察。參照圖25中示出的結(jié)果,用載體和對照蛋白(HplS)處理的小鼠中提取的腫瘤組 織并沒有顯著的組織學(xué)變化，而在用細(xì)胞可透性PlS重組蛋白(HM3PlS)處理的小鼠腫瘤組 織中，則觀察到代表細(xì)胞凋亡特征的染成紅色的區(qū)域,證實(shí)了根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞可透性P18 重組蛋白的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。而且,在用根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞可透性P18重組蛋白處理 的小鼠組中還觀察到,在終止給藥后14天,癌細(xì)胞中仍然誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。實(shí)施例13-給予細(xì)胞可透性pl8重組蛋白后的細(xì)胞凋亡_誘導(dǎo)作用的分析II為了考察給予細(xì)胞可透性pl8重組蛋白后腫瘤組織中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，使用 ApopTag過氧化酶原位細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(Chemicon, S7100)進(jìn)行以下的組織化學(xué)分析。具體地,按照實(shí)施例8中描述的相同方法,對細(xì)分為三組(每組5只小鼠)的小鼠 經(jīng)靜脈內(nèi)注射給予細(xì)胞可透性PlS重組蛋白(HM3PlS)、載體、和HplS (對照)中的每一種達(dá) 14天。從每組中選擇三只小鼠處死之后，從其提取腫瘤組織。對每組中剩余的另外兩只小 鼠在終止給藥后再觀察14天,然后從其提取腫瘤組織樣本。按照實(shí)施例10中描述的相同 方法,通過使用提取的腫瘤組織來制備組織樣品并固定在載玻片上。將載玻片用二甲苯處 理5分鐘，三次，從而去除石蠟。然后連續(xù)用100%、90%和70%的乙醇處理，每種處理3分 鐘以對腫瘤組織進(jìn)行脫水，隨后在PBS中孵育5分鐘。用20 μ g/ml的蛋白酶K(Sigma)處 理載玻片15分鐘,用蒸餾水清洗，然后用3%的H202 (體積/體積，PBS中)處理5 分鐘，由 此抑制內(nèi)源性過氧化酶的活性。用平衡緩沖液處理載玻片10秒,然后用末端脫氧核苷?；?轉(zhuǎn)移酶(TdT)在37tTF處理1小時(shí)。在反應(yīng)完成后，用終止緩沖液處理載玻片并清洗。接 下來，用DAB著色劑處理載玻片5分鐘，并用甲基綠(methyl green)進(jìn)行復(fù)染色。染色后，對載玻片脫水，用蓋玻片密封,并用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察。參照圖26中示出的結(jié)果，用載體和對照蛋白(HplS)處理的小鼠中提取的腫瘤組 織中并沒有顯著的組織學(xué)變化，而在用細(xì)胞可透性PlS重組蛋白(HM3PlS)處理的小鼠腫瘤 組織中，則觀察到代表細(xì)胞凋亡特征的染成棕色的區(qū)域，證實(shí)了根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞可透性 PlS重組蛋白的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。而且,在用根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞可透性pl8重組蛋白處 理的小鼠中還觀察到，在終止給藥后14天，癌細(xì)胞中仍然誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。實(shí)施例14-給予細(xì)胞可透性pl8重組蛋白后的細(xì)胞凋亡-誘導(dǎo)作用的分析III
按照實(shí)施例12中描述的相同方法進(jìn)行TUNEL分析,不同之處在于，按照實(shí)施例9 中描述的相同方法，經(jīng)腫瘤內(nèi)注射將細(xì)胞可透性P18重組蛋白(HplSMi、HM2PlSM2, HM3P18)、 載體、和Hpl8(對照)中的每一種給予細(xì)分為五組(每組5只小鼠)的小鼠14天，并從每 組的一只小鼠中提取腫瘤組織樣本。參照圖27中示出的結(jié)果,用載體和對照蛋白(HplS)處理的小鼠中提取的腫瘤組 織中并沒有顯著的組織學(xué)變化，而在用細(xì)胞可透性PlS重組蛋白(HplSMlAHM2PlSMyHM3PlS) 處理的小鼠腫瘤組織中，則觀察到代表細(xì)胞凋亡特征的染成紅色的區(qū)域，證實(shí)了根據(jù)本發(fā) 明的細(xì)胞可透性PlS重組蛋白的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。實(shí)施例15-給予細(xì)胞可透性pl8重組蛋白后的細(xì)胞凋亡-誘導(dǎo)作用的分析IV按照實(shí)施例13中描述的相同方法進(jìn)行ApopTag分析,不同之處在于,按照實(shí)施例9 中描述的相同方法，經(jīng)腫瘤內(nèi)注射將細(xì)胞可透性P18重組蛋白(ΗρΙδΜρ HM2P18M2, HM3P18)、 載體、和Hpl8(對照)中的每一種給予細(xì)分為五組(每組5只小鼠)的小鼠14天，并從每 組的一只小鼠中提取腫瘤組織樣本。參照圖28中示出的結(jié)果,用載體和對照蛋白(HplS)處理的小鼠中提取的腫瘤組 織并沒有顯著的組織學(xué)變化，而在用細(xì)胞可透性pl8重組蛋白(HplSMpHM2PlSMyHM3PlS)處 理的小鼠腫瘤組織中，則觀察到代表細(xì)胞凋亡特征的染成棕色的區(qū)域,證實(shí)了根據(jù)本發(fā)明 的細(xì)胞可透性PlS重組蛋白的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。實(shí)施例16-給予細(xì)胞可透性pl8重組蛋白后蛋白表達(dá)譜(expressionpattern)的 比較為了考察用根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞可透性pl8重組蛋白處理的腫瘤組織中蛋白表達(dá) 譜的變化,進(jìn)行如下微陣列測定。具體地，按照以上實(shí)施例8中描述的相同方法，將細(xì)胞可透性ρ 18重組蛋白 (HM2PlSM2)、載體和HplS (對照)中的每一種經(jīng)腫瘤內(nèi)注射給予細(xì)分為三組的小鼠14天，然 后在給藥終止后擱置14天。在給藥終止后14天，從每組的小鼠中提取腫瘤組織樣品并用 液氮冷凍。使用TRIZOL試劑(Invitrogen)按照制造商的說明從腫瘤組織中分離總:RNA,并 用無RNase (RNA酶)的DNase (DNA酶)(Life Technology, Inc.)處理,從而徹底去除殘留 的基因組DNA。通過使用低RNA投入線性擴(kuò)增試劑盒(Low RNA Input LinearAmplification kit) (Agi ！ ent Techno!ogy)按照制造商的說明，對由此分離的RNA進(jìn)行靶cRNA探針的 合成和雜交。簡而言之,將Iug總RNA與T7啟動(dòng)子特異性引物混合并在65°C下反應(yīng)10 分鐘。通過混合第一鏈緩沖液(5 X )、0. IM DTTUOmM dNTP混合物、RNase-Out (RNA酶去 除)和MMLV RT(反轉(zhuǎn)錄)而制備cDNA主要混合物(master mix)，然后加入反應(yīng)混合物中。獲得的混合物在40°C下反應(yīng)2小時(shí),然后在65°C下反應(yīng)15分鐘，從而終止反轉(zhuǎn)錄和 dsDNA合成。按照制造商的說明，通過混合轉(zhuǎn)錄緩沖液(4X)、0. IM DTT、NTP混合物、50% PEG、RNase-Out、無機(jī)焦磷酸酶、T7-RNA聚合酶和酞菁(3/5-CTP)來制備轉(zhuǎn)錄主要混合物。 將由此制備的轉(zhuǎn)錄主要混合物加入dsDNA反應(yīng)混合物中并在40°C下反應(yīng)2小時(shí)從而進(jìn) 行dsDNA轉(zhuǎn)錄。按照制造商的說明，用cDNA清除模塊(cDNA Cleanup Module) (Agilent Technology)并按照制造商的說明純化由此擴(kuò)增并標(biāo)記的cDNA。使用ND-1000分光光度 計(jì)(DnaoDrop Technologies, Inc.)對標(biāo)記的靶cDNA進(jìn)行定量。在檢查標(biāo)記效率后，將 cRNA與封端劑(IOX)和斷裂緩沖液(fragmentation buffer) (25X)混合，在6()°C反應(yīng) 30分鐘以便進(jìn)行cRNA的片段化。將片段化的cRNA再懸浮于雜交緩沖液(2X)中并直接 滴在全人基因組寡核苷酸微陣列(Whole Human GenomeOligo Microarray, 44K)上。在雜 交爐(Agilent Technology)中于65°C使該微陣列雜交17小時(shí)，然后按照制造商的說明 (Agi IentTechnology)進(jìn)行清洗。 使用DNA微陣列掃描儀(Agilent Technology)讀取雜交圖譜并使用特征提取軟 件(Feature Extraction Software) (AgilentTechnology)進(jìn)行定量。使用 Gene Spring GX 7. 3軟件(AgilentTechnology)進(jìn)行數(shù)據(jù)校準(zhǔn)和倍數(shù)-改變基因(fold-changed genes) 的選擇。平均校準(zhǔn)率計(jì)算為校準(zhǔn)的信號通道強(qiáng)度除以校準(zhǔn)的對照通道強(qiáng)度。基因的功能性 注釋通過使用 Gene Spring GX 7. 3 軟件(Agilent Technology)按照 Gene Ontology 協(xié) 議而實(shí)施。微陣列分析的結(jié)果總結(jié)于圖29和表3-7中，其中表3示出了細(xì)胞凋亡-相關(guān)基因 的表達(dá)譜,表4a和4b示出了細(xì)胞周期調(diào)節(jié)-相關(guān)基因的表達(dá)譜,表5a至5c示出了細(xì)胞生 長_相關(guān)基因的表達(dá)譜,表6示出了細(xì)胞增殖-相關(guān)基因的表達(dá)譜,而表7示出了轉(zhuǎn)移和血 管生成_相關(guān)基因的表達(dá)譜。[表 3] [表4b] [表 5a] [表 5b] [表 5c] [表6] [表7] 如上表3中所描述的，在細(xì)胞凋亡-相關(guān)基因的情況下，與用對照蛋白處理相比， 用細(xì)胞可透性P18重組蛋白處理的小鼠組中，盡管蛋白激酶C(PRKCE)、死亡誘導(dǎo)-清理子 1 (death inducer-obliteratiol,DID01)、和腫瘤壞死因子受體超家族成員 8 (TNFRSF18)的 表達(dá)被上調(diào)1. 5 至2. 0 倍，但磷酸肌醇激酶(PIK3R2)的表達(dá)被下調(diào)3倍。如上表4a和4b中所描述的，在細(xì)胞周期調(diào)節(jié)-相關(guān)基因的情況下，與用對照 蛋白處理相比，用細(xì)胞可透性PlS重組蛋白處理的小鼠組中，視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤結(jié)合蛋白 6 (RBBP6)的表達(dá)被...._丨:二調(diào)1. 8倍。如上表5a至5c中所描述的，在細(xì)胞生長-相關(guān)基因的情況下，與用對照蛋白處理 相比，用細(xì)胞可透性P18重組蛋白處理的小鼠組中，無翼型(wingless-type)翻TV整合位點(diǎn) 家族的成員IOA (WNTlOA)和成員16A(WNT16A)被下調(diào)2-至2. 5_倍。如上表6中所描述的，在細(xì)胞增殖_相關(guān)基因的情況F，與用對照蛋白處理相比， 用細(xì)胞可透性PlS重組蛋白處理的小鼠組中，CD28的表達(dá)被下調(diào)4倍。如上表7中所描述的,在轉(zhuǎn)移和血管生成-相關(guān)基因的情況下，與用對照蛋白處理 相比，用細(xì)胞可透性PlS重組蛋白處理的小鼠組中，轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白1 (MTAl)的表達(dá)被上調(diào)2 倍。盡管本發(fā)明以用于舉例說明的目的進(jìn)行了詳細(xì)描述，但是應(yīng)當(dāng)理解，這樣的詳述 僅用于舉例說明的目的,在不背離由所附權(quán)利要求限定的本發(fā)明的精神和范圍的情況下， 本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠?qū)Ρ九秲?nèi)容作出變形。工業(yè)應(yīng)用本發(fā)明的細(xì)胞可透性pl8重組蛋白，通過將腫瘤抑制因子pl8引入細(xì)胞中，能夠激 活響應(yīng)于DNA損壞和致癌信號誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯和凋亡的ATM和p53活化中涉及的細(xì)胞信 號傳導(dǎo)機(jī)制。因此,本發(fā)明的細(xì)胞可透性P18重組蛋白能夠有效地用作各種人類癌癥的抗 癌藥劑。用于專利程序目的的關(guān)于微生物保藏國際承認(rèn)的布達(dá)佩斯條約國際形式原始保藏情況下的接收根據(jù)第7. 1條公布致韓國光州市西區(qū)楓巖洞1.130錦湖公寓105-303(502-156) 用于專利程序目的的關(guān)于微生物保藏國際承認(rèn)的布達(dá)佩斯條約國際形式原始保藏情況下的接收根據(jù)第7. 1條公布致韓國光州市西區(qū)楓巖洞1130錦湖公寓105-303(502-156) 用于專利程序目的的關(guān)于微生物保藏國際承認(rèn)的布達(dá)佩斯條約國際形式原始保藏情況下的接收根據(jù)第7. 1條公布致韓國光州市西區(qū)楓巖洞1130錦湖公寓105-303(502-156)
權(quán)利要求
一種細(xì)胞可透性p18重組蛋白，包含大分子轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(MTD)和人類腫瘤抑制因子p18，所述MTD融合至所述人類腫瘤抑制因子p18的N-末端、C-末端或兩個(gè)末端。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞可透性pl8重組蛋白，其中，所述人類腫瘤抑制因子pl8 為包括所有N-、S-和C-末端結(jié)構(gòu)域的具有SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列的全長形式，或 者為缺少N、S-和O末端結(jié)構(gòu)域中的一個(gè)或多個(gè)的截短形式。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞可透性pl8重組蛋白，其中，所述MTD具有選自由SEQID NO :4、6、8和53-243構(gòu)成的組中的氨基酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的細(xì)胞可透性pl8重組蛋白，其中，所述MTD選自由具有SEQ ID NO -A所示的氨基酸序列的:k:FGF4 (卡波西氏成纖維細(xì)胞生長因子4)-來源MTD、具有SEQ IDN0:6所示的氨基酸序列的J0-101MTD、具有SEQ ID NO :8所示的氨基酸序列的J0-103MTD 構(gòu)成的組。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞可透性pl8重組蛋白，進(jìn)一步包含核定位序列(NLS)和 組氨酸-標(biāo)簽親合性結(jié)構(gòu)域，所述核定位序列和組氨酸-標(biāo)簽親和性結(jié)構(gòu)域共價(jià)地連接至 所述重組蛋白的一端。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞可透性pl8重組蛋白，其中，所述重組蛋白選 自由以下構(gòu)成的組其中具有SEQ ID NO 4所示的氨基酸序列的kFGF4-來源MTD融合至具有SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列的全長pl8的N-末端的重組蛋白；其中具有SEQ ID NO 4所示的氨基酸序列的kFGF4-來源MTD融合至具有SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列的全長pl8的C 末端的重組蛋白；其中具有SEQ ID NO :4所示的氨基酸序列的kFGF4-來源MTD融合至具有SEQ ID KO 2所示的氨基酸序列的全長pl8的兩個(gè)末端的重組蛋白；其中具有SEQ ID NO :4所示的氨基酸序列的kFGF4-來源MTD融合至缺少SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列中的S-和O末端結(jié)構(gòu)域的pl8N 末端結(jié)構(gòu)域片段的C 末端的重組蛋 白；其中具有SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列的kFGF4-來源MTD融合至缺少SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列中的N-和C-末端結(jié)構(gòu)域的pl8S-末端結(jié)構(gòu)域片段的C-末端的重組蛋 白；其中具有SEQ ID NO 4所示的氨基酸序列的kFGF4-來源MTD融合至缺少SEQ ID NO 2所示氨基酸序列中的N-和S-末端結(jié)構(gòu)域的pl8C-末端結(jié)構(gòu)域片段的C-末端的重組蛋 白；其中具有SEQ ID NO 4所示的氨基酸序列的kFGF4-來源MTD融合至缺少SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列中的O末端結(jié)構(gòu)域的P18N-和S 末端結(jié)構(gòu)域片段的O末端的重組蛋 白；其中具有SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列的kFGF4-來源MTD融合至缺少SEQ ID N0: 2所示氨基酸序列中的N 末端結(jié)構(gòu)域的P18S-和C 末端結(jié)構(gòu)域片段的O末端的重組蛋 白；其中具有SEQ ID NO :6所示的氨基酸序列的J0-101MTD融合至具有SEQ ID N0:2所示 的氨基酸序列的全長PlS的N-末端的重組蛋白；其中具有SEQ ID NO :6所示的氨基酸序列的J0-101MTD融合至具有SEQ ID N0:2所示 的氨基酸序列的全長Pl8的C-末端的重組蛋白；其中具有SEQ ID N0:6所示的氨基酸序列的J0-101MTD融合至具有SEQ ID N0:2所示 的氨基酸序列的全長P18的兩個(gè)末端的重組蛋白；其中具有SEQ ID N0:8所示的氨基酸序列的J0-103MTD融合至具有SEQ ID N0:2所示 的氨基酸序列的全長P18的N-末端的重組蛋白；其中具有SEQ ID N0:8所示的氨基酸序列的JO-103MTD融合至具有SEQ ID N0:2所示 的氨基酸序列的全長Pl8的C 末端的重組蛋白；和其中具有SEQ ID N0:8所示的氨基酸序列的J0-103MTD融合至具有SEQ ID N0:2所示 的氨基酸序列的全長Pl8的兩個(gè)末端的重組蛋白。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞可透性pl8重組蛋白，其中，所述重組蛋白具 有選自由 SEQ ID NO :26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50 和 52 構(gòu)成的組中的氨基 酸序列。
8.一種編碼根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞可透性pl8重組蛋白的多核苷酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的多核苷酸,其中，所述多核苷酸具有選自由SEQID N0:25、 27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49 和 51 構(gòu)成的組中的核苷酸序列。
10.一種包含根據(jù)權(quán)利要求8所述的多核苷酸的表達(dá)載體。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的表達(dá)載體，其中，所述表達(dá)載體選自由P^1P18、pHplSM,, pHMiPlSM” pHplSNM” pHplSSM” pHplSCM” pHplSNSM。pliplSSCM^ pHM2pl8、pIIpl8M2、 pHM2pl_8M2、pHM3pl_8、pH:pl_8M3 和 pHM3pl8M3 構(gòu)成的組。
12.--種包含根據(jù)權(quán)利要求10所述的表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化體。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的轉(zhuǎn)化體，其中，所述轉(zhuǎn)化體為大腸桿菌DH5a /HplSM, (KCTC 11310BP)。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的轉(zhuǎn)化體，其中，所述轉(zhuǎn)化體為大腸桿菌DH5a/ HM2pl8M2(KCTC 1131 IBP)。
15.根據(jù)權(quán)利要求12所述的轉(zhuǎn)化體，其中，所述轉(zhuǎn)化體為大腸桿菌DH5a /HM3pl8 (KCTC 11312BP)。
16.—種生產(chǎn)細(xì)胞可透性pl8重組蛋白的方法，包括培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求12所述的轉(zhuǎn)化
17. 一種用于治療pl8缺乏或失效的藥物組合物，包含作為有效成分的根據(jù)權(quán)利要求1 所述的細(xì)胞可透性P18重組蛋白以及藥用載體。
全文摘要
本發(fā)明披露了細(xì)胞可透性p18重組蛋白，其中大分子轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(MTD)融合至腫瘤抑制因子p18。本發(fā)明還披露了編碼該細(xì)胞可透性p18重組蛋白的多核苷酸、含有該細(xì)胞可透性p18重組蛋白的表達(dá)載體、以及包含該細(xì)胞可透性p18重組蛋白作為有效成分的用于治療p18缺乏或失效的藥物組合物。本發(fā)明的細(xì)胞可透性p18重組蛋白能夠有效地將單倍缺陷腫瘤抑制因子p18引入細(xì)胞中，因而能夠激活在ATM和p53活化中涉及的細(xì)胞信號傳導(dǎo)機(jī)制，其中ATM和p53響應(yīng)于DNA損傷或致癌信號而誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯和凋亡。因此，本發(fā)明的細(xì)胞可透性p18重組蛋白能夠有效地被用作抗癌藥劑。
文檔編號C12N15/62GK101874113SQ200880114533
公開日2010年10月27日 申請日期2008年9月4日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月4日
發(fā)明者姜世銀, 樸基淑, 林貞姬, 趙大雄, 金雪花 申請人:株式會社普羅賽爾制藥