專利名稱：具有表面結(jié)合的分子的固體基片及其制造和使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請涉及在凸起表面如頂端上，包含少量分子，如10個或者更少分子的固體基 片，以及其構(gòu)造和使用方法。
背景技術(shù)：
最初，開發(fā)了原子力顯微鏡(AFM)用于觀察固體表面的形態(tài)?，F(xiàn)今，AFM被應(yīng)用于 廣泛的用途，包括但不限于，測定生物分子間的相互作用，如在藥物篩選中。測定生物分子 間的相互作用的能力是一種有力的分析工具，可以鑒定多種生物分子之間的相關(guān)聯(lián)和不相 關(guān)聯(lián)現(xiàn)象。例如，有時AFM可以用于找出細胞表面上特定配體的位置和分布。盡管熒光顯 微鏡和放射性同位素已經(jīng)被用于鑒定細胞表面配體的分布，但這些方法只能在微米尺度上 顯示數(shù)十個至數(shù)百個聚集的配體的分布。相反，使用AFM測量生物分子間的相互作用力能 提供更為準(zhǔn)確細致的分析，使得追蹤納米尺度配體的個別位置和觀察個別的生命現(xiàn)象成為 了可能。遺憾的是，向AFM針尖上固定化生物分子的傳統(tǒng)方法通常會導(dǎo)致生物分子不僅附 著在針尖頂端上或附近，還附著在AFM針尖的許多位置上，因此導(dǎo)致相對低的AFM分辨率。 為解決這一問題，在向AFM針尖上引入生物分子時，已經(jīng)使用了高倍稀釋或混合單分子層 的方法。盡管這些方法降低了固定化在AFM針尖上的生物分子的相對群體密度，但它們不 能有效地將生物分子特異性地固定化在AFM針尖頂端上，在許多情況下生物分子無法固定 化到AFM針尖頂端上。除之前提及過的使用AFM測量生物分子間相互作用的研究外，還嘗試了 AFM的其 他應(yīng)用，例如，現(xiàn)在已經(jīng)有向AFM針尖頂端引入碳納米管或納米顆粒的嘗試。但目前還沒有 發(fā)展出選擇性修飾AFM針尖頂端的有效方法。因此，需要選擇性修飾AFM針尖頂端或任何其他凸起表面的頂端的方法。發(fā)明概述本發(fā)明一些方面提供了修飾固體基片表面的方法以及其使用方法。特別是，本發(fā) 明的方法包括了向包含凸起表面的固體基片上修飾或附著探針、受體、配體或者任何其他 材料或分子的方法。這里使用的術(shù)語“凸起表面”指的是任何向外突出或凸起或者一般地 高出表面的水平面的表面。凸起表面可以是逐漸的彎曲，尖銳的突出，或者它們的任選組 合。使用本申請的方法修飾的固體基片通常用于分析設(shè)備，例如但不限于，掃描探針顯微鏡 (SPM)、原子力顯微鏡(AFM)、電子力顯微鏡(EFM)、磁力顯微鏡(MFM)以及其他能夠分析少 量分子，即10個或更少，通常5個或更少，經(jīng)常3個或更少，更經(jīng)常是單分子的分析設(shè)備。本發(fā)明的方法向凸起表面附著少量分子的成功概率( 即，成功率)至少約50%，通常至少約60%，經(jīng)常至少約70%，更經(jīng)常至少約75%。本發(fā)明的方法包括將受體附著至第一固體基片表面的凸起表面，以產(chǎn)生包含多個受體的受體結(jié)合的基片；在足以產(chǎn)生受體-配體復(fù)合物結(jié)合的固體基片的條件下，使受體結(jié)合的基片與結(jié) 合至第二固體基片表面的配體相接觸，其中只有所述多個受體中的部分與配體復(fù)合；以及修飾受體_配體復(fù)合物以產(chǎn)生表面經(jīng)修飾的固體基片。如上面所述，本發(fā)明的這些方法提供了僅將少量分子附著至凸起表面的固體基片 表面(如，第一固體基片表面)修飾。受體-配體復(fù)合物的修飾經(jīng)常可以成功地僅附著單 個期望的分子。除文中另有所指之外，術(shù)語“配體”指的是能夠選擇性結(jié)合受體的任何物質(zhì)。配體 可以是抗原、抗體、寡核苷酸、寡肽(包括蛋白質(zhì)，激素等)、酶、底物、藥物、藥物受體、細胞 表面、受體激動劑、半激動劑、混合激動劑、拮抗劑、應(yīng)答誘導(dǎo)或刺激分子，藥物、激素，信息 素、遞質(zhì)、自分泌物、生長因子、細胞因子、輔基、輔酶、輔助因子、基質(zhì)、前體、維生素、毒素、 調(diào)節(jié)因子、抗原、半抗原、碳水化合物、分子模擬物、結(jié)構(gòu)分子、效應(yīng)分子、選擇分子、生物素、 地高辛、交叉反應(yīng)物、類似物、這些分子的競爭物或衍生物和文庫中選出的能夠特異性結(jié)合 所選靶標(biāo)的非寡核苷酸分子，這些分子中的任意成員與第二個分子附著形成的綴合物以及 其他任何可以與相應(yīng)受體選擇性結(jié)合的分子。除文中另有所指之外，術(shù)語“受體”指的能夠選擇性結(jié)合相應(yīng)配體的任何物質(zhì)。應(yīng) 當(dāng)明確，除文中另有所指外，術(shù)語“配體”和“受體”不是指任何特定的物質(zhì)、尺度或結(jié)合關(guān) 系。這些詞語僅是為說明配體與相應(yīng)受體間的選擇性結(jié)合而使用的術(shù)語，在這樣的選擇性 結(jié)合中，被結(jié)合至第一固體基片的化合物被稱為受體而選擇性結(jié)合至受體的物質(zhì)被稱為配 體。因此，如果抗體被結(jié)合至第一固體基片表面，那么該抗體即為受體，與之對應(yīng)的抗原則 為配體。而如果抗原被結(jié)合至第一固體基片表面，那么該抗原即為受體，與之對應(yīng)的抗體則 成為配體。在某些實施方案中，約3個或更少的受體與配體復(fù)合，通常是僅有單個受體與配 體復(fù)合，這就使得受體_配體復(fù)合物的修飾后，僅有單個期望的分子的附著。受體-配體復(fù)合物可以是兩種或多種可以相互結(jié)合以形成相對緊密相互作用的 化合物的任何組合，如通過靜電相互作用、范德華力、離子鍵、頭價鍵、氫鍵以及能夠至少部 分基于某些形式的選擇性使得復(fù)合物形成的其他物理現(xiàn)象或特性。在一些實施方案中，受 體_配體復(fù)合物是雙鏈寡核苷酸、抗原_抗體復(fù)合物、寡肽_小分子復(fù)合物或寡肽_寡肽復(fù) 合物。形成受體_配體復(fù)合物的成功概率(或，成功率)依賴于受體_配體的本質(zhì)或性 質(zhì)。而本發(fā)明方法的成功率一般至少為50%，通常至少60%，經(jīng)常至少70%，更經(jīng)常至少 75%。與之相比，傳統(tǒng)的有效方法僅僅將單分子附著至固體基片表面的成功率僅約35%或 更少。因此本發(fā)明提供的方法與現(xiàn)在已有的有效方法相比，成功率顯著更高。當(dāng)受體-配體復(fù)合物是雙鏈DNA (dsDNA)，即與互補的DNA雜交的DNA時，有多種方 法用于修飾受體-配體復(fù)合物。在許多情況下，修飾步驟包括直接修飾dsDNA本身(即受 體_配體復(fù)合物)，即未使dsDNA “變性”。其他情況下，修飾步驟包括使受體_配體復(fù)合物 “去復(fù)合”，即是使dsDNA變性重新形成ssDNA，并與不同于已經(jīng)通過變性去除的互補DNA的其他互補ssDNA雜交，如與已經(jīng)連接至像探針、標(biāo)簽、酶、催化劑等其他部分的另一種互補SsDNA0在一個特別的實施方案中，修飾受體-配體復(fù)合物的步驟進一步包括在足以產(chǎn)生表 面經(jīng)修飾的固體基片的條件下，使雙鏈寡核苷酸與嵌入劑-金屬催化復(fù)合物相接觸，所述 固體基片包括具有插入其中的嵌入劑_金屬催化劑的表面結(jié)合的雙鏈寡核苷酸。在一些實施方案里，修飾受體-配體復(fù)合物的步驟包括使雙鏈寡核苷酸變性以產(chǎn)生單鏈寡核苷酸結(jié)合的基片；和將單鏈寡核苷酸(i)在足以產(chǎn)生表面經(jīng)修飾的固體基片的條件下，與經(jīng)標(biāo)記的互補寡核苷酸雜交， 所述表面經(jīng)修飾的固體基片包括表面結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記的雙鏈寡核苷酸；或(ii)在足以產(chǎn)生表面經(jīng)修飾的固體基片的條件下，與包括酶或催化劑的互補寡 核苷酸雜交，所述表面經(jīng)修飾的固體基片包括附著至表面結(jié)合的雙鏈寡核苷酸的酶或催化 劑。在一些實施方案中，本發(fā)明的方法進一步包括在使雙鏈寡核苷酸變性的步驟之 前，從固體基片表面上切割下至少部分未結(jié)合的單鏈寡核苷酸的步驟。在這種方式下，在修 飾受體-配體復(fù)合物之前，將未反應(yīng)或未復(fù)合的受體(即ssDNAs)從固體基片表面去除。這 樣的去除減少了非期望的受體可能帶來的反應(yīng)競爭。通常，將全部或幾乎全部未反應(yīng)的受 體從固體基片表面切割下來或者使其變得相對不易發(fā)生反應(yīng)。對于ssDNA，可以使用本領(lǐng)域 技術(shù)人員熟知的ssDNA裂解酶達到這一目的。在其他的實施方案中，修飾受體-配體復(fù)合物的步驟還進一步包括在足以形成雙 鏈寡核苷酸-金屬離子復(fù)合物的條件下，使雙鏈寡核苷酸與金屬離子相接觸；以及在足以 產(chǎn)生表面經(jīng)修飾的固體基片的條件下，還原金屬離子，所述表面經(jīng)修飾的固體基片包括與 表面結(jié)合的金屬納米棒。在其他的實施方案中，受體_配體復(fù)合物還可以是抗原-抗體復(fù)合物。在這些實 施方案里，某些情況下修飾受體_配體組合物的步驟包括在足以產(chǎn)生表面經(jīng)修飾的固體基 片的條件下，使抗原-抗體復(fù)合物與第二抗體相接觸，所述表面經(jīng)修飾的固體基片包括抗 原_抗體_第二抗體的表面結(jié)合的復(fù)合物。這些實施方案里的其他情況下，修飾受體_配 體組合物的步驟進一步包括在足以產(chǎn)生表面經(jīng)修飾的固體基片的條件下，加入酶連接的第 二抗體，所述表面經(jīng)修飾的固體基片包括抗體_抗原_酶連接的第二抗體的表面結(jié)合的復(fù) 合物。在這些實施方案里另外的情況下，修飾受體_配體復(fù)合物的步驟進一步包括在足以 產(chǎn)生表面經(jīng)修飾的固體基片的條件下，加入金屬連接的第二抗體，所述表面經(jīng)修飾的固體 基片包括抗體_抗原_金屬連接的第二抗體的表面結(jié)合的復(fù)合物。這些情況中適宜的條件 為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知。在另外的實施方案中，受體通過表面結(jié)合的接頭附著至第一固體基片，在這些實 施方案里的特定情況下，表面結(jié)合的接頭包括中心原子；通過接頭附著至中心原子，并附著至受體的官能團；和附著至中心原子，并具有附著至第一固體支持物的表面的多個末端的基礎(chǔ)部分。許多情況下，表面結(jié)合的接頭具有下式<formula>formula see original document page 7</formula>
I其中，m、a、b和c各自獨立地是0或1 ；當(dāng)c是0時，χ是1，或當(dāng)c是1時，χ是從1到Q4-I的氧化態(tài)的整數(shù)；當(dāng)b是0時，y是1，或當(dāng)b是1時，y是從1到Q3-I的氧化態(tài)的整數(shù)；當(dāng)a是0時，ζ是1，或當(dāng)a是1時，ζ是從1到Q2-I的氧化態(tài)的整數(shù)；η是從1到Q1-I的氧化態(tài)的整數(shù)；Q1是具有至少3的氧化態(tài)的中心原子；Q2、Q3、Q4各自獨立地是具有至少3的氧化態(tài)的分支原子；R1、R2、R3、R4和R5各自獨立地是接頭；Z是附著至受體的官能團；和Y各自獨立地是所述基礎(chǔ)部分的末端上的官能團，其中倘若η、χ、y和ζ的積至少為3，有多個Y附著至所述固體支持物的所述第一表面。應(yīng)當(dāng)了解當(dāng)a、b或c為1時，對應(yīng)的x、y或ζ是分別小于Q2-1、Q3-1、Q4-1的氧化 態(tài)，附著至Q1、Q2、Q3、Q4的剩余原子分別為氫。這里使用的“Q”指的是Q1、Q2、Q3、Q4中的任 何一個或全部。通常，Q是周期表IVA或VA族的任意原子。示例性的Q原子包括，但不限 于N、P、C、Si、Ge等。通常情況下，Q是N、P、C或Si。如式I中可以看到的，Z任選地通過接頭R1附著至中心原子。通常a是1，這樣Z 就通過接頭R1附著至中心原子。在另外的實施方案中，Z包括選自N、0、S、P及其組合的雜原子。Y各自獨立地是官能團。即，Y各自獨立于其他Y基團。但是，通常所有的Y是同 樣的官能團。而一般Z與Y是不同的官能團。在一些情況下，Z和Y可以是相同的官能團， 但一個或者另一個處于受保護形式。官能團和/或存在保護基團的這些差異使得Z和Y的 反應(yīng)性存在差異，由此使得可以通過多個Y將樹突附著至固體支持物并可以在Z上附著探 針。應(yīng)當(dāng)了解的是第一和/或第二固體基片可以包括表面結(jié)合的接頭。而且第一和/ 或第二固體基片的表面結(jié)合的接頭可以是樹突(dendron)。第一和第二固體基片的樹突不 必相同。在一些實施方案里，第一固體基片包含樹突作為表面結(jié)合的接頭。在其他實施方 案里，第二固體基片包含樹突作為表面結(jié)合的接頭。在另外的實施方案中，第一和第二固體 基片還可以均包含樹突作為表面結(jié)合的接頭。在后面的情況下，第一和第二固體基片的樹 突不必相同。在一些特別的實施方案里，樹突如式I所示。在一個特別的實施方案中，第一固體基片是原子力顯微鏡針尖。本發(fā)明的其他方面提供了適合進行分析性分析的，包括凸起表面的固體基片。凸起表面包括多個表面結(jié)合的樹突，這些樹突包含適合與配體形成復(fù)合物的受體，這樣當(dāng)多 個受體與結(jié)合至第二固體基片表面的配體相接觸時，僅有所述多個受體中的部分與配體進 行復(fù)合。在一些實施方案中，固體基片是原子力顯微鏡針尖。在其他的實施方案中，樹突如式I所示。
在另外的實施方案中，受體是寡核苷酸、寡肽、抗體、抗原、受體、酶、適體或者生物 學(xué)或藥學(xué)活性化合物。本發(fā)明的其他方面還提供了適合在原子力顯微鏡中使用的部件，其包括凸起表面 和附著至凸起表面頂端的3個或更少的探針分子。在一些實施方案中，凸起表面僅包括單 個探針分子。本發(fā)明的其他方面還提供了修飾固體基片的凸起表面的方法，所述固體基片包括 凸起表面結(jié)合的ssDNA。該方法通常包括在足以產(chǎn)生凸起表面經(jīng)修飾的固體基片的條件 下，使凸起表面結(jié)合的ssDNA與接頭ssDNA相接觸，所述接頭ssDNA與附著至另一個固體基 片表面的ssDNA雜交，所述凸起表面經(jīng)修飾的固體基片包括與附著至固體基片凸起表面的 ssDNA相復(fù)合的接頭ssDNA，其中接頭ssDNA包括(i)能夠與附著至固體基片凸起表面的ssDNA雜交的第一 DNA部分；(ii)能夠與附著至另一個固體基片表面的ssDNA雜交的第二 DNA部分；和(iii)任選的探針或標(biāo)簽。在一些實施方案中，這些方法使用了樹突，如本文公開的樹突(即式I的樹突)和 本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的其他樹突。在其他的實施方案中，這些方法提供了將10個或更少分子，通常5個或更少，經(jīng)常 3個或更少分子，更經(jīng)常是單個分子附著至固體基片凸起表面上。方法也包括在與接頭ssDNA接觸前將ssDNA附著至固體基片凸起表面。另外，如此處公開的，對接頭ssDNA以及與接頭ssDNA雜交的ssDNA進行進一步修 飾。附圖簡述

圖1是顯示了典型的AFM針尖和AFM針尖頂端的放大示意圖；圖2A和2B是顯示了使用自組裝單層技術(shù)(如固定化寡核苷酸)分別修飾AFM針 尖和基質(zhì)表面的方法的示意圖；圖3是在AFM針尖頂端選擇性固定化生物分子的示意圖；圖4A和2B是顯示了使用自組裝單層技術(shù)和mesospaced技術(shù)(如固定化樹突分 子和寡核苷酸)分別修飾AFM針尖和基質(zhì)表面的示意圖；圖5是使用酶促反應(yīng)在AFM針尖上保留一個完整的單鏈(SS)寡核苷酸的方法的 示意圖；圖6A是加入裂解酶之前，引入到AFM針尖上的單鏈寡核苷酸的HPLC分析圖；圖6B是加入裂解酶15分鐘后，引入到AFM針尖上的單鏈寡核苷酸的HPLC分析 圖；圖6C是加入裂解酶30分鐘后，引入到AFM針尖上的單鏈寡核苷酸的HPLC分析 圖；圖6D是加入裂解酶45分鐘后，引入到AFM針尖上的單鏈寡核苷酸的HPLC分析 圖；圖6E是加入裂解酶60分鐘后，引入到AFM針尖上的單鏈寡核苷酸的HPLC分析 圖；圖7A是加入裂解酶之前，引入到基質(zhì)表面上的單鏈寡核苷酸的HPLC分析圖7B是加入裂解酶15分鐘后，引入到基質(zhì)表面上的單鏈寡核苷酸的HPLC分析 圖；圖7C是加入裂解酶30分鐘后，引入到基質(zhì)表面上的單鏈寡核苷酸的HPLC分析 圖；圖7D是加入裂解酶45分鐘后，引入到基質(zhì)表面上的單鏈寡核苷酸的HPLC分析 圖；圖7E是加入裂解酶60分鐘后，引入到基質(zhì)表面上的單鏈寡核苷酸的HPLC分析 圖；圖8A是加入裂解酶之前，單鏈寡核苷酸和雙鏈寡核苷酸混合物的的HPLC分析 圖；圖8B是加入裂解酶15分鐘后，單鏈寡核苷酸和雙鏈寡核苷酸混合物的的HPLC分 析圖；圖8C是加入裂解酶30分鐘后，單鏈寡核苷酸和雙鏈寡核苷酸混合物的的HPLC分 析圖；圖8D是加入裂解酶45分鐘后，單鏈寡核苷酸和雙鏈寡核苷酸混合物的的HPLC分 析圖；圖8E是加入裂解酶60分鐘后，單鏈寡核苷酸和雙鏈寡核苷酸混合物的的HPLC分 析圖；圖9是對于綠豆核酸酶的反應(yīng)，緩沖液中DNA-DNA相互作用力的柱狀圖；圖10是使用抗原_抗體反應(yīng)修飾AFM針尖頂端的示意圖；圖11是形成圍繞雙鏈寡核苷酸的金屬納米棒的示意圖；圖12是使用嵌入劑_金屬催化劑綴合物修飾AFM針尖頂端的示意圖；圖13是使用經(jīng)標(biāo)記的(如磁納米顆粒)雙鏈寡核苷酸修飾AFM針尖頂端的示意 圖；圖14是固定化在固體基質(zhì)表面的基片與附著至AFM針尖頂端的催化劑(或酶) 之間的區(qū)域選擇性催化反應(yīng)的示意圖；圖15顯示了使用包括納米顆粒的寡核苷酸修飾AFM針尖頂端的方法，通過將納米 顆粒結(jié)合的寡核苷酸與接頭寡核苷酸的互補(雜交)部分結(jié)合；圖16A-C對應(yīng)⑴顯示怎樣生成27酸樹突修飾的基片和AFM針尖以及怎樣將DNA 探針分子附著至與樹突頂端的示意圖；(ii) 27酸分子的結(jié)構(gòu)；(iii)分別顯示APDES修飾 的基片與含有緊密間隔的DNA探針分子的AFM針尖的示意圖；圖17A-C顯示了分離單個DNA固定化的AuNP的結(jié)果；具體而言，圖17A顯示的是接頭DNA固定化的AuNP的3%瓊脂糖凝膠電泳(泳道1為磷化氫加帽的AuNP作為參考)， 圖17B顯示用于與AFM針尖上的捕獲的接頭DNA雜交的互補DNA固定化的AuNP的3%瓊脂 糖凝膠電泳(泳道1為磷化氫加帽的AuNP作為參考)；如圖17A和17B所示，每個條帶間 的分離足以切割、收集只含有單個DNA固定化的AuNP ；圖17C顯示了硫醇化的DNA分子的 序列。圖18A是顯示了捕獲單個接頭DNA的示意圖；圖18B顯示了 AFM試驗中使用的DNA序列；
圖18C是顯示了 AFM針尖頂部上的金標(biāo)記的單個接頭DNA的TEM圖像；圖18D是顯示了金標(biāo)記DNA分子與捕獲的金標(biāo)記的接頭DNA的雜交示意圖；圖18E是顯示了與另一個金標(biāo)記的DNA分子雜交的捕獲的金標(biāo)記的接頭DNA的 TEM圖像；圖19是顯示了成功捕獲單個接頭DNA分子的AFM針尖的TEM圖像。發(fā)明詳述本文提到的“適體”是指單鏈、部分單鏈、部分雙鏈或雙鏈核苷酸序列，有利地可復(fù) 制核酸序列，能夠通過沃森_克里克堿基配時或三聯(lián)體形成機制特異性識別所選的非寡核 苷酸分子或分子基團的分子。本文提到的“雙功能”，“三功能”和“多功能”，在使用時指的是合成聚合物或多價 同或雜多聚雜交結(jié)構(gòu)，視情況而定，為兩價，三價或多價，或包括兩個，三個或多個特定的識 別元件，確定的序列片段或附著位點。本文提到的“樹突狀分子”是指表現(xiàn)出規(guī)律的樹突狀分支的分子，通過向核心或從 核心連續(xù)或成代添加分支層而形成。術(shù)語“樹突”是指表現(xiàn)出規(guī)律的樹突狀分支的聚合物，通過向核心或從核心連續(xù)或 成代添加分支層而形成。術(shù)語樹突狀聚合物包括“樹狀聚合物”，其特點在于核心，至少有一 個內(nèi)部分支層和表面分支層(見，如Petar等人，第641-645頁Chem. in Britain, (August 1994))?！皹渫弧笔且环N具有從焦點或中心原子散發(fā)出的分支的樹狀聚合物，焦點或中心原 子是核心或者可以連接至核心上，直接或通過連接部分而形成樹狀聚合物。許多樹狀聚合 物包括附著至一個共同的核心上的兩個或兩個以上樹突。樹突包括但不限于對稱的或非對稱的樹狀聚合物，階式(cascade)分子，喬木枝 形(arbord)等。在一些實施方案中，分支臂是等長的。然而，也可考慮使用不對稱樹狀聚 合物。本文提到的術(shù)語“固定化”和“附著(至固體基片表面)”在本文中可以交替使用， 意思是使不溶解或包括、附著至或有效結(jié)合不溶的、部分不溶的、膠體的、顆粒的、分散的、 懸浮和/或脫水的物質(zhì)或分子或者包括或附著至固體支持物的固相。本文提到的“核苷酸”是指天然和合成核苷酸分子，合成的核苷酸分子可以在核酸 合成和加工中，如酶促和化學(xué)的合成與加工代替天然發(fā)生的堿基。因此，核苷酸包括能夠堿 基配對的經(jīng)修飾的核苷酸和任選地合成的堿基，所述堿基不包括腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、 胸腺嘧啶、尿嘧啶或稀有堿基。例如，“核苷酸”包括但不限于，經(jīng)修飾的嘌呤和嘧唳，稀有堿 基，可變的核苷，嘌呤和嘧啶的結(jié)構(gòu)類似物，標(biāo)記的、衍生的和經(jīng)修飾的核苷和核苷酸，綴合 的核苷和核苷酸，序列修飾物，末端修飾物，間隔修飾物，以及主干被修飾的核苷酸，其中包 括但不限于核糖修飾的核苷酸、硫代磷酸(酯)、氨基磷酸酯、亞磷酰胺、甲基膦酸酯、甲基 亞磷酰胺、甲基ph0Sph0namiditeS、5' -β _氰乙基亞磷酰胺、亞甲基膦酸酯、二硫代磷酸 酯、肽核酸、非手性和中性的核苷酸間鍵合以及核苷酸橋，如聚乙二醇、芳香族聚酰胺和脂 類。本文提到的“多肽”，“肽”和“蛋白質(zhì)”是交替使用的，指的是氨基酸殘基或類似物的聚合物。該術(shù)語也適用于其中一個或更多的氨基酸殘基是對應(yīng)的天然氨基酸以及天然氨 基酸的聚合物的人工化學(xué)類似物的氨基酸聚合物。這個術(shù)語還包括結(jié)合氨基酸組成多肽的傳統(tǒng)肽鍵的變體。本文提到的“保護基”是指連接至分子上的反應(yīng)基團(例如，羥基或胺基)的基團。 選擇保護基以在一個或多個化學(xué)反應(yīng)步驟中阻止特定基團的反應(yīng)。一般來說，選擇特定的 保護基以允許在稍后被去除以恢復(fù)反應(yīng)基團，而不改變分子里存在的其他反應(yīng)基團。選擇 保護基是待保護的特定基團和特定基團將與之反應(yīng)的化合物的函數(shù)。保護基團的選擇是本 令頁域技術(shù)人員公知白勺。如見 Greeneet al. , Protective Groups in Organic Synthesis, 2nd ed.，John Wiley &Sons, Inc. Somerset, N. J. (1991)，通過引用將其全文納入其全文。本文提到的“固體支持物”是指包括固定化基質(zhì)的組合物，所述固定化基片包括但 不限于不溶化物質(zhì)、固相、表面、基片、層、包衣、織物或無紡纖維、基質(zhì)、晶體、膜、不溶性聚 合物、塑料、玻璃、具有生物性或生物相容性或可生物消化或可生物降解的聚合物或基質(zhì)、 微顆?；蚣{米顆粒。固體支持物包括，例如但不限于，單層、雙層、商業(yè)膜、樹脂、基質(zhì)、纖維、 分離介質(zhì)、色譜支持物、聚合物、塑料、玻璃、云母、黃金、珠、微球、納米球、硅、砷化鎵、有機 和無機金屬、半導(dǎo)體、絕緣體、微結(jié)構(gòu)和納米結(jié)構(gòu)。微結(jié)構(gòu)和納米結(jié)構(gòu)包括但不限于，微型 化、納米級和超分子的探針、尖端、條、樁、插頭、棒、套、線、絲和管。本文提到的“基片”指的是物質(zhì)、結(jié)構(gòu)、表面或材料，表示一種組合物，其包括非生 物的，合成的，無生命，平面的、球形的或平滑的表面，迄今已知不包括特定的結(jié)合、雜交或 催化識別位點，或者超過組成表面、結(jié)構(gòu)或材料的不同分子數(shù)目的多個不同的識別位點或 一定數(shù)量的不同的識別位點?；梢园?，例如但不限于，半導(dǎo)體、合成(有機)金屬、 合成半導(dǎo)體、絕緣體和摻雜物；金屬、合金、元素、化合物和礦物質(zhì)；合成的、裂解的、蝕刻 的、平版印刷的、印刷的、加工的和微加工的薄片、裝置、結(jié)構(gòu)和表面；工業(yè)聚合物、塑料、膜； 硅、硅酸鹽、玻璃、金屬和陶瓷；木材、紙張、紙板、棉花、羊毛、布料、織物和無紡纖維、材料和 織物；沒有通過分支/線性聚合物被固定化探針分子修飾過的納米結(jié)構(gòu)和微結(jié)構(gòu)。除非文意另有所指外，術(shù)語“配體”是指能夠與探針選擇性結(jié)合的任何物質(zhì)。配 體可以是抗原、抗體、寡核苷酸、寡肽(包括蛋白質(zhì)，激素等)、酶、底物、藥物、藥物受體、細 胞表面、受體激動劑、部分激動劑、混合激動劑、拮抗劑、反應(yīng)誘導(dǎo)或刺激分子、藥物、激素、 信息素、遞質(zhì)、自分泌物、生長因子、細胞因子、輔基、輔酶、輔助因子、基質(zhì)、前體、維生素、毒 素、調(diào)節(jié)因子、抗原、半抗原、碳水化合物、分子模擬物、結(jié)構(gòu)分子、效應(yīng)分子、可選擇分子、生 物素、地高辛、交叉反應(yīng)物、這些分子的類似物、競爭物或衍生物，以及可以特異性結(jié)合所選 靶標(biāo)的文庫中選出的寡核苷酸和通過將這些分子中的任意與第二種分子附著形成的綴合 物，以及與相應(yīng)探針選擇性結(jié)合的任何其他分子。應(yīng)當(dāng)明確，術(shù)語“配體”和“受體”不是指任何特定的物質(zhì)或尺度關(guān)系。這些詞語僅 是為說明配體與相應(yīng)探針間的選擇性結(jié)合而使用的術(shù)語，在這樣的選擇性結(jié)合中，被結(jié)合 至基片表面的部分被稱為探針而選擇性結(jié)合至探針的物質(zhì)被稱為配體。因此，如果抗體被 附著至基片表面，該抗體即為探針，對應(yīng)的抗原則為配體。而如果抗原被附著至基片表面， 該抗原即為探針，對應(yīng)的抗體則成為配體。術(shù)語“核酸”，“聚核苷酸”和“寡核苷酸”在本文中可以交替使用，是指單鏈或雙鏈 形式的脫氧核糖核酸和核糖核酸聚合物，除非另有限制的，包括以與天然核苷酸相同的方 式與核酸雜交的已知天然核苷酸類似物。這些類似物的例子包括但不限，硫代磷酸(酯)、 氨基磷酸酯、甲基膦酸酯，手性甲基膦酸酯，2-0-甲基核糖核苷酸和肽-核酸(PNA)?！靶蛄小被颉皡^(qū)段”是指包括較長的核苷酸序列的部分的核苷酸序列。術(shù)語“互補的”是指一個核酸與另一個核酸分子相同或可與之選擇性雜交。當(dāng)比 完全缺乏特異性更具選擇性的雜交發(fā)生時存在雜交的選擇性。通常情況下，在與一條至少 14-25個核苷酸的鏈具有至少有55 %的同一性，通常至少65 %，經(jīng)常至少75 %，更經(jīng)常至少 90%時，發(fā)生選擇性雜交。術(shù)語“相同”或百分比的“同一性”在兩個或更多的核酸或多肽情況下是指，當(dāng)就最 大的相關(guān)性比較和比時時，使用如下面所述例如通過目視檢查的序列比對算法所測量的， 兩個或多個序列或子序列是相同的或有一定百分比的核苷酸或氨基酸殘基相同。短語“基本上相同”在兩個核酸的情況下，是指當(dāng)就最大的相關(guān)性比較和比時時， 使用如下面所述例如通過目視檢查的序列比時算法所測量的，兩個或多個序列或子序列有 至少75 %，通常至少80 %或85 %，經(jīng)常至少90 %，95 %或更高的核苷酸同一性。一般而言， 基本上相同存在于至少大約40-60個核苷酸長的序列區(qū)域，在其他情況下，為至少60-80個 核苷酸長的區(qū)域，在另外的情況下，為至少90-100個核苷酸長的區(qū)域，在另一些情況下，在 所比較的全長序列上序列基本上相同，所述序列例如核苷酸的編碼區(qū)。原子力顯微鏡(AFM)由于具有感知皮牛頓尺度的作用力的高敏感度，已經(jīng)被用做 研究分子相互作用的工具。在原子力顯微鏡(AFM)針尖上固定化生物分子的傳統(tǒng)方法導(dǎo)致 生物分子不僅附著在針尖頂端或附近，還附著在AFM針尖的許多其他位置，這種AFM針尖上 的生物分子的相對非選擇性附著導(dǎo)致了 AFM的分辨率相對降低。為僅僅研究單分子間的相 互作用，許多研究人員使用化合物和納米線修飾了原子力顯微鏡的針尖和基片。最近，報道 了一種自下而上組裝DNA模式的方法，使用了由自組裝單分子膜測造的AFM針尖和控制針 尖頂端上官能團密度的長接頭。這種方法在捕獲單個DNA和轉(zhuǎn)移捕獲的DNA到目標(biāo)區(qū)域方 面只有35%的成功概率。本發(fā)明的一些方面提供了附著少量化合物(如10個或更少，通常5個或更少，經(jīng) 常3個或更少，更經(jīng)常是單分子)至AFM針尖頂端上或任何有凸起表面的固體的頂端上的 方法。一些實施方案中提供了僅將一個分子附著至AFM針尖頂端上的方法?？梢愿街?AFM針尖頂端的示例物質(zhì)包括本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的那些，例如但不限于，生物分子(如寡 核苷酸、寡肽、酶、催化劑、受體、蛋白質(zhì)、DNA等)、小分子(如藥物、藥物候選物、標(biāo)簽、探針 等)，納米顆粒、納米線、碳納米管以及它們中兩個或多個的組合。如圖1所示意的，AFM針尖頂端通常直徑為幾納米，并且如圖2所示，頂端可以通過的自組裝反應(yīng)用多種官能團進行修飾。這些官能團可以與例如生物分子、化學(xué)化合物、納米 顆粒和納米線的多種化合物結(jié)合?？梢允褂眠@種自組裝反應(yīng)將這樣的化合物固定化在AFM 針尖的表面上，理論上以圖3所示的方法僅僅修飾具有所需化合物的針尖頂端。例如，在將 DNA和互補DNA分別固定化到AFM針尖和基片表面上后，在足以僅僅在AFM針尖頂端形成少 量雙鏈DNA DNA對的條件下，使AFM針尖接近基質(zhì)表面。添加裂解單鏈DNA (ssDNA)于是保 留在針尖頂端上形成的dsDNA的酶。dsDNA可以被修飾成多種基團，例如可以引入探針、標(biāo) 簽、嵌入劑，并且可以從雙鏈DNA形成多種納米結(jié)構(gòu)。這種修飾技術(shù)不僅適用于DNA-DNA復(fù) 合物，還適用于DNA-RNA、DNA-蛋白質(zhì)、RNA-蛋白質(zhì)、抗原-抗體或生物分子-化學(xué)分子復(fù) 合物。此外，本文公開的或本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何技術(shù)與圖4所示的meso-spaced技術(shù)的組合使得能夠?qū)⒒衔锘蚍肿觾H固定化到AFM針尖頂端上。去除生物分子之間的多重相互作用是用AFM精確測量生物分子相互作用的重要因素之一。不受任何理論的約束， 相信在一些情況下，meso-spaced技術(shù)可以使雜交的DNA DNA對僅在針尖頂端上形成，并且 使用體內(nèi)納米機制引入酶促反應(yīng)，可以使化合物僅固定化在針尖頂端上(圖5)。因此，本發(fā) 明的方法使AFM有了新的研究和應(yīng)用。本發(fā)明的一些方面，包括使用ssDNA選擇性裂解酶切割附著在表面上的ssDNA而 保留雜交的DNA-DNA對。使用這樣的酶保留了在AFM針尖頂端上的dsDNA而去除未雜交的 ssDNA。有許多可用的方法進一步修飾dsDNA。例如，通過與用各種物質(zhì)，如生物分子、化學(xué) 分子、納米顆粒、納米線和納米碳管修飾的DNA的再次雜交，AFM針尖頂端可以用這些化合 物進行修飾。在一些實施方案中，包括金屬顆粒的dsDNA的金屬化反應(yīng)產(chǎn)生相應(yīng)的金屬納 米線。在其他的實施方案中，可以使用分別用催化劑或酶修飾的AFM針尖來分析催化劑或 酶的特性。在另外的實施方案中，可以修飾AFM針尖頂端以研究抗原-抗體相互作用、蛋 白_蛋白相互作用、蛋白質(zhì)-DNA相互作用、蛋白質(zhì)-RNA相互作用、化合物-化合物相互作 用和化合物_生物分子相互作用。本發(fā)明的一些實施方案使用了本發(fā)明發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的自組裝錐形樹突。這些樹突對 附著至樹突頂端的反應(yīng)部分(例如，DNA分子)提供了有效的分隔。這樣的控制分隔消除 了橫向立體位阻，增強雜交效率和可重復(fù)性，并極大地簡化了力-距離曲線。預(yù)計這些特點 和結(jié)果導(dǎo)致樹突功能化的末端從而大大提高測量單分子力的成功概率。為了說明樹突的適 用性，設(shè)計了如圖18所示的基于DNA雜交的簡單DNA捕獲系統(tǒng)。參考圖18，每個基片和AFM針尖最初用N-(3-(三乙氧基)丙基)_0_聚氧乙烯聚 氨酯(TPU)單層進行包被。然后，經(jīng)酯化反應(yīng)，將樹突層引入到硅烷化的表面上(圖16A)。 在引入樹突層之后，將探針和靶DNA分子共價附著至樹突頂端。探針DNA頂端的20bp部分 是為與接頭DNA雜交設(shè)計的，插入底部的由連續(xù)胞嘧啶序列組成的另外15bp部分以給予被 拴系(tether)在接頭DNA上的5nm金納米顆粒以自由空間(圖18B)。接頭DNA被設(shè)計成 與基片上的探針DNA以及AFM針尖上的靶DNA雜交。為了在透射電子顯微鏡(TEM)上觀察 接頭DNA，使用了 5nm金納米顆粒。AFM實驗前，金標(biāo)記的接頭DNA分子先雜交至硅基片上的探針DNA分子，然后將用 靶DNA修飾的AFM針尖以及雜交了接頭DNA的基片定位在AFM上。每一個AFM針尖在一個 點上重復(fù)地接近和縮回5次，總共掃描5個點。由于接頭DNA的自由40bp延伸段與和靶 DNA之間的斷裂力大于接頭DNA的另外20bp部分與探針DNA之間的斷裂力，可以預(yù)料AFM 針尖可以從基片上移走接頭DNA。掃描后，使用TEM觀察AFM針尖，沒有做任何進一步的處 理。由于每個接頭DNA只標(biāo)記了 1個金納米顆粒，AFM針尖上的金鈉米顆粒數(shù)目對應(yīng)于 與AFM針尖上的靶DNA分子相互作用的接頭DNA的數(shù)目。如圖18C所示，只觀察到AFM針 尖頂部上的一個金納米顆粒。測試了總共16個AFM針尖，12個僅顯示出一個金納米顆粒并 且其他沒有顯示出金納米顆粒(圖19)。嘗試另外一個金-DNA綴合物與捕獲的接頭DNA的游離ssDNA部分的雜交以清楚 地驗證針尖上金標(biāo)記的DNA是通過特定的相互作用而引入的(圖18D)。如圖18E所示，觀 察到AFM針尖上的兩個金納米顆粒。這些結(jié)果指明樹突修飾了的AFM針尖和基片提供了特異的單分子相互作用。與現(xiàn)有的方法相比，本發(fā)明的方法可以用于使AFM針尖以顯著更高的成功率(如至少約75%)只識別單分子相互作用。AFM針尖的TEM圖像顯示了單個特定相互作用的 直接證據(jù)。本發(fā)明的一些方面使用了樹突包被的針尖，所述針尖顯著提高了制造適用于測 量生物分子間單分子作用力、單分子制造和用于控制單分子的其他應(yīng)用的AFM針尖的成功 率。本發(fā)明的組合物與裝置也提供了研究單催化反應(yīng)和單傳遞機制的工具，例如通過用酶、 有機金屬催化劑或半導(dǎo)體顆粒交換金納米顆粒。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過研究下面的實施例明了本發(fā)明其他的目的、優(yōu)點和新的 特征，這些實施例的目的不是為了做限制。實施例中，推斷實現(xiàn)的步驟使用現(xiàn)在時描述，已 經(jīng)在試驗室中實施過的步驟使用過去時態(tài)表達。
實施例實施例1硅烷偶聯(lián)劑N-(3-(三乙氧,某硅)聚氧,乙烯硅烷偶聯(lián)劑N-(3_(三乙氧基硅)丙基)0_聚氧乙烯聚氨酯(TPU)購自Gelest。 其他化學(xué)品為試劑級，購自Sigma-Aldrich。UV級熔融石英板購自CVILaser。拋光硅(100) 晶片(摻雜物磷；電阻率1. 5-2. 1 Ω · cm)購自MEMCElectronic Materials。使蒸餾水 通過Bamstead E-pure 3-Module系統(tǒng)而獲得去離子水(18 Ω .cm)。所有的寡核苷酸均購 自 Bionics (韓國)。清洗基片硅晶片和熔融石英板(用于樹突表面覆蓋分析；數(shù)據(jù)未顯示)在piranha溶液[濃 縮的H2SO4 30% H2O2 = 7 3 (ν/ν)]中超聲4小時。然后用去離子水徹底洗滌基片并將 其浸在特氟隆燒杯里由去離子水、濃縮的氨溶液和30%過氧化氫[5 1 l(v/v/v)]組成 的混合物中。將燒杯置于水浴中并加熱至80°C保持10分鐘。從溶液中取出基片，并用去 離子水徹底沖洗。將基片再次置于含有去離子水、濃縮的HCl和30% H202 [6 1 1 (ν/ν/ ν)]特氟隆燒杯中。將燒杯加熱至80°C保持10分鐘。從溶液中取出基片，并用去離子水徹 底洗滌。潔凈的基片在真空室內(nèi)(30-40mTorr)干燥約30min并立即用于下一個步驟。AFM探針預(yù)處理將帶有錐形針尖的標(biāo)準(zhǔn)矩形硅懸臂(SICON，Applied NanoStructures ；k = 0. 2N/ m)通過浸沒于80%硝酸溶液中而首先進行氧化，然后加熱至80°C保持20分鐘。將懸臂被從 溶液中取出，用去離子水徹底洗滌。將干凈的懸臂在真空室內(nèi)(30-40mTorr)干燥約30min 并立即用于下一個步驟。。硅烷化在氮氣環(huán)境里，將硅/ 二氧化硅基片和懸臂浸于含有硅烷偶聯(lián)劑(0. 2mL)的無水 甲苯(20mL)中4小時，用甲苯洗滌，然后加熱至110°C保持30分鐘?；错樞蛟诩妆健⒓?苯-甲醇[1 1 (ν/ν)]和甲醇浸沒并在每種洗滌溶液中超聲3分鐘。懸臂按順序用甲苯 和甲醇進行徹底沖洗。將得到的基片和懸臂在真空中(30-40mTorr)干燥。制備樹突修飾的表面將上述羥基化的基片和懸臂在一種二氯甲烷溶液中浸沒12-24小時，該二氯甲烷溶液包括27-酸樹突(1. OmM)、偶聯(lián)劑、1，3-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC) (29. 7mM)、4_ 二甲 氨基吡啶(DMAP) (2. 9mM)。該操作中使用的27-酸樹突，9-蒽甲基-3-({[三({[(1_(三 [(2-{[(三{[2-羧乙氧基]甲基}-甲基)氨基]羰基}乙氧基)甲基]甲基}氨基)羰 基]-2-乙氧基}甲基)甲基]-氨基}羰基)丙基氨基甲酸酯(或27-酸，圖16B)按照已 知的方法制備。加入到二氯甲烷之前，將這些化合物溶解在最小量的二甲基甲酰胺(DMF) 中。反應(yīng)之后，將基片按順序浸沒在二氯甲烷、甲醇和水中并在每個洗滌步驟中超聲3分 鐘。將懸臂按順序使用二氯甲烷、甲醇和水徹底沖洗。將基片和懸臂使用甲醇洗滌，并在真 空中(30-40mTorr)干燥。9-蒽基甲氧羰基基團的脫保護樹突修飾的懸臂和基片在含有三氟乙酸(TFA) (1. 0M)的二氯甲烷溶液中攪拌2小 時。反應(yīng)后，將它們浸泡在含20% (ν/ν) 二異丙基乙胺(DIPEA)的二氯甲烷溶液中10分 鐘。在二氯甲烷和甲醇中對基片進行超聲各3分鐘，并將懸臂按順序使用二氯甲烷和甲醇 進行徹底沖洗。將基片和懸臂在真空中(30-40mTorr)干燥。準(zhǔn)備NHS修飾的基片在氮氣環(huán)境下，將上述以胺基末端的基片和懸臂浸沒在含二(N，N' -二酰亞胺) 碳酸酯(鹽)或N，N' - 二琥珀酰亞胺基碳酸酯(鹽)(DSC) (25mM)和DIPEA (1. OmM)的乙 腈溶液中4小時(圖16A)。反應(yīng)后，將基片和懸臂置于二甲基甲酰胺中30分鐘，并使用甲 醇洗滌。將基片和懸臂在真空中(30-40mTorr)干燥。DNA的固定化上述拴系了(tethered) NHS的基片和懸臂被浸沒在DNA溶液中(40 μ M在含5. OmM 氯化鎂的25mM的NaHCO3緩沖液(pH 8. 5)中)12小時。DNA分子有一個末端氨基，其可以 與錨定在基片上的激活的NHS-酯反應(yīng)(圖16A)。反應(yīng)后，將基片和懸臂在雜交緩沖液(含 7. OmM十二烷基硫酸鈉的2XSSPE緩沖液(pH7.4))中在37°C攪拌1小時，并用水徹底沖洗 以去除沒有特異性結(jié)合的寡核苷酸。將基片和懸臂在真空中(30-40mTorr)干燥。對照試驗將硅基片和懸臂在甲苯溶液中與0. 1% (ν/ν)的APDES反應(yīng)3小時(圖16C)。硅烷化后，將基片和懸臂除不用樹突外，按照上述方式進行處理。金標(biāo)記的DNA使用了以前報告過的用于金標(biāo)記的DNA的合成方法。見，例如，Alivisatoset al.，in Nature，1996，382，609-611 =Loweth et al.，in Angew. Chem. Int. Ed.，1999，111， 1925-1929 ；和 Fu et al.，J Am. Chern. Soc.，2004，126，10832-10833。因此，添加二(對磺 化苯基)苯基膦脫水二磷酸鹽(Img)到金納米顆粒(AuNP)溶液中(IOmL)，并且將溶液在 22°C下孵育過夜。然后加入NaCl以沉淀AuNP，直到溶液變成藍色。離心后，徹底去除上清 液并將AuNP重新分散在0. 5xTBE緩沖液中。AuNP的濃度為2 μ M。以摩爾比1 1將AuNP 溶液和硫醇化的DNA溶液進行混合，并在22°C下孵育過夜。孵育后，通過含有0. 5xTBE緩沖 液作為運行緩沖液的3%瓊脂糖電泳只分離單DNA固定化的AuNP。圖17。將對應(yīng)于單接 頭DNA固定化的AuNP的條帶從凝膠中切下并置于充滿0. 5xTBE的透析膜中。另一次運行 之后，仔細收集膜中的溶液，通過離心濃縮DNA固定化的AuNP。將這些濃縮的AuNP標(biāo)記的 DNA分子重新分散在含50mM NaCl的0. 5xTBE緩沖液中。AuNP標(biāo)記的DNA溶液的終濃度約ΙΟΟηΜ。使用紫外-可見分光光度儀測定每種溶液的濃度。單接頭DN捕獲A所有單接頭DNA捕獲試驗都是用NanoWizard AFM(JPK Instrument)進行的,所 有的AFM實驗是在室溫下，含有50mMNaCl的新鮮0. 5xTBE緩沖液(pH 8. 0)中進行。在每 個點將每個AFM針尖進行接近和收回重復(fù)5次，總共掃描5個點。針尖速度固定在0. 2 μ m/S.實施例2Wl 13]選擇能夠選擇性裂解的單鏈DNA (ssDNA)的綠豆核酸酶作為在本實驗中使 用的酶。Sl核酸酶可以取代這種酶，然而可以使用任何能選擇性裂解SSDNA的酶。AFM針 尖附著有 5' -NH2-TM AAA AAA AAA AGC GGT AAG GGA MT CGCGTC ATA MA AM TAT CGA GT-3'。基片表面附著有 5' -NH2-ACT CGA TAT TTT TTTATG ACG CGA TTT CCC TTA CCG CTT TTT TTT TTT TA-3'5'末端上的氨基用于將寡核苷酸固定化到表面上。50個核苷酸的長度用于識別 被酶裂解的短DNA。使用高效液相色譜(HPLC)分析合成的DNA和帶有綠豆核酸酶的反應(yīng) 產(chǎn)物，以確定DNA是否被綠豆核酸酶裂解以及dsDNA和ssDNA之間是否有選擇性。將用于 AFM針尖的合成的ssDNA與綠豆核酸酶反應(yīng)并使用C-18反相柱通過HPLC進行分析。結(jié)果 顯示在圖6A-6E中，其中圖6A顯示了向ssDNA溶液中加入綠豆核酸酶之前，完整ssDNA的 檢測(即保留)時間。在確定檢測時間之后，添加綠豆核酸酶到DNA溶液中，并且15分鐘 觀察裂解程度。因為DNA骨架上的負電荷減少，來自酶裂解的較短的ssDNA比較長的完整 ssDNA更晚檢測到。如圖6B所示，大部分的50-mer ssDNA已經(jīng)在15分鐘內(nèi)已經(jīng)被裂解，并 且30分鐘后(圖6C)幾乎所有的50-mer ssDNA都被裂解。在實驗使用的緩沖液和HPLC 條件如下綠豆核酸酶反應(yīng)緩沖液(pH 4.6) ；30mM醋酸鈉，50mM氯化鈉，ImM醋酸鋅，ImM半 胱氨酸，0. 001% Triton X-100，5%甘油，HPLC 運行緩沖液(pH 5.0) ；30mM 醋酸鈉，IOOmM 氯化鈉，ImM醋酸鋅，5%甘油；HPLC洗脫運行緩沖液MeOH(V/V) =7:3 ；流速=2毫升 /分鐘；溫度=25 0C ；DNA濃度=3mM ；綠豆核酸酶=90單位。相似地，用于基質(zhì)表面的ssDNA與酶反應(yīng)并如上所述在相同的條件下通過HPLC進 行分析，結(jié)果顯示在圖7A至7E中。圖7A顯示了加入綠豆核酸酶之前，ssDNA溶液的HPLC 作圖，而圖B-E分別顯示了加入綠豆核酸酶15分鐘、30分鐘、45分鐘、60分鐘之后，相同的 溶液的HPLC色譜圖。結(jié)果表明，AFM針尖DNA和基質(zhì)表面DNA都在60分鐘內(nèi)完全裂解。ssDNA 與 ddDNA將dsDNA和ssDNA的混合物在相同的條件下暴露于綠豆核酸酶，以確定ssDNA和 dsDNA之間的選擇性。通過上述的ssDNA中的一種與互補的ssDNA的雜交形成雙鏈DNA。因 為dsDNA在其骨架上比ssDNA帶更多的負電荷，檢測(即，保留)時間短于ssDNA的檢測時 間。ssDNA和dsDNA的保留時間如圖8A所示。圖8B-8E分別是加入酶15分鐘、30分鐘、45 分鐘后的HPLC分析結(jié)果。如圖8A-8E所示，dsDNA保持未裂解，只有ssDNA被選擇性裂解。使用mesospaced技術(shù)，修飾(S卩，附著)上述實驗中公開的AFM針尖和帶有50_mer ssDNA的基質(zhì)表面。DNA DNA的雜交力在用于綠豆核酸酶反應(yīng)的緩沖液中進行測量。結(jié)果 表明雜交力為49. 2士5. 4pN(圖9)。進行試驗以確定綠豆核酸酶裂解AFM上的DNA所需的時間。簡言之，添加綠豆核酸酶，并非常緩慢的測量雜交力(例如，9秒一次力測量)。結(jié)果表明，實驗中使用的所有八個 (8)樣品在1小時內(nèi)損失雜交力。使用附著至樹突修飾的AFM針尖和樹突修飾的基質(zhì)表面 的ssDNA，重復(fù)在實際AFM上的ssDNA的水解過程。通過與樹突上的胺基交聯(lián)而附著ssDNA。 將針尖和基質(zhì)安裝在AFM中之后，加入緩沖液，隨后加入綠豆核酸酶。引導(dǎo)針尖以接近基質(zhì) 表面，從而確定測量DNA-DNA相互作用力的位置，然后針尖從加入綠豆核酸酶的位置輕壓 基質(zhì)表面保持一個小時。此后，快速從表面升起針尖，將其浸沒在溶解于綠豆核酸酶反應(yīng)緩 沖液中的0.01%十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液中10分鐘，用滅菌水洗滌，并保存在真空中。實施例3使用抗原_抗體反應(yīng)用單分子修飾AFM針尖
除了使用在上述實施例1和2中示例顯示的DNA DNA相互作用的方法之外，AFM針 尖頂端使用抗原-抗體反應(yīng)用單分子進行修飾(圖10)。硅(Si)晶片表面使用mesospaced 技術(shù)用樹突進行修飾后，將樹突通過交聯(lián)反應(yīng)與兔抗BSA(牛血清白蛋白)結(jié)合。洗去剩余 的兔抗BSA溶液后，通過將基質(zhì)浸入含BSA的溶液，弓I入結(jié)合于硅晶片表面的兔抗BSA和溶 液中的BSA以通過抗原-抗體反應(yīng)特異性地相互結(jié)合。與硅晶片相同，先用樹突修飾AFM 針尖，再通過交聯(lián)劑用兔抗BSA進行修飾。將硅晶片和AFM針尖安裝在AFM設(shè)備中，隨后引 導(dǎo)針尖以接近硅表面。經(jīng)過反復(fù)接近嘗試，將固定化在硅晶片表面上的BSA通過抗原-抗 體反應(yīng)轉(zhuǎn)移到AFM針尖。隨后將得到的AFM針尖暴露于含兔抗BSA的溶液，結(jié)果得到了頂 端只有一個抗原_抗體_抗原復(fù)合物的AFM針尖。實施例4AFM針尖上的金屬納米棒許多金屬離子可以通過靜電相互作用和配位共價鍵結(jié)于dsDNA。結(jié)合的金屬離子 可以通過還原反應(yīng)被還原成金屬顆粒。見，例如，J Mater. Chem.，2004，14，611-616?？梢?被還原的適用金屬離子包括，但不限于銅、鉬和銀。這種金屬還原方法的優(yōu)點之一是，納米 線的厚度可通過調(diào)整還原時間來控制。這里展示了一種在AFM針尖頂端上形成銀(多種金屬之一)納米線的方法。見圖 11。銀金屬化需要四種溶液。每種溶液的組成如下溶液1 溶于水的IOmMCsNO3 ；溶液2 溶 于水的 10% NH4OH, IOmM CsNO3,0. ImM AgNO3 ；溶液 3 溶于水的 10% NH4OH, 10% 甲醛，IOmM CsNO3 ；以及溶液4 溶于水的10% NH4OH, 10%甲醛，IOmM CsNO3,0. ImM AgNO30相信其中溶 液1起到防止非期望的金屬化，以Cs+離子覆蓋硅氧化物表面。溶液2提供了 dsDNA之間 結(jié)合的銀離子。溶液3使得用于金屬化的種子形成，還原溶液2中與dsDNA結(jié)合的Ag+。最 后，溶液4提供從溶液3形成的種子開始的晶體生長。為形成在AFM針尖頂端上的銀納米線，使用了上述實施例1和2中得到的雜交AFM 針尖上的DNA的雜交。通過將雜交緩沖液從90°C緩慢地冷卻至室溫進行雜交。產(chǎn)生的AFM 針尖在溶液1中浸沒30分鐘以用Cs+離子封閉表面。然后將針尖在溶液2中浸沒約30分 鐘，使用溶液1洗滌5秒以去除過量的Ag+離子，并在溶液3中浸沒5分鐘以還原與DNA雙 鏈體結(jié)合的Ag+離子。最后，將AFM針尖浸沒在溶液4中以形成納米線。使用TEM鑒定得 到的銀納米線?？梢酝ㄟ^調(diào)整在溶液4中的反應(yīng)時間來控制銀鈉米線的直徑。用銀納米線修飾的AFM針尖也可適用于電子力顯微鏡(EFM)。簡單來說，將導(dǎo)電聚 合物包被在Si晶片上并將這種導(dǎo)電聚合物的拓撲結(jié)構(gòu)和EFM模式的導(dǎo)電圖進行比較。這兩個圖像相互符合。這樣，用銀納米線修飾的AFM針尖可以用于研究表面的電特征。實施例5AFM針尖上的嵌入劑-金屬催化劑多種有機化合物和金屬結(jié)合在dsDNA之間。這些材料被稱為嵌入劑。它們包括如 環(huán)磷酰胺、美法侖、白消安、苯丁酸氮芥、絲裂霉素、順鉬、博來霉素、依立替康、米托蒽醌、放 線菌素等。這些材料的優(yōu)點在于，它們有多種衍生物和良好的適用性。本實施例示例說明了使用在其伯胺基團上交聯(lián)到金屬催化劑上的絲裂霉素衍生 物將金屬催化劑固定化到AFM針尖頂端上的過程。見圖12。使用上面實施例1和2中描述的步驟制備AFM針尖，并且使用上面實施例1和2 中描述的步驟將AFM針尖雜交到dsDNA以形成dsDNA。將少量的絲裂霉素溶解在與雜交液 相同的成分的緩沖液中。將AFM針尖在室溫下置于絲裂霉素溶液中12小時，移出并用去離 子水洗滌，并在真空中干燥。干燥后，將絲裂霉素交聯(lián)到之前制備的包含伯胺基團的氧化 鈦納米顆粒。包含伯胺基團的氧化鈦納米顆粒通過在空氣中噴灑四羥化鈦形成，并通過與 APTES (氨基-丙基三乙氧基硅烷)的自我組裝反應(yīng)獲得。TEM分析表明得到的AFM針尖用 納米顆粒進行修飾。為了驗證光催化性能，將得到的AFM針尖浸沒在含有H2O2的溶液中并用UV線照 射。對得到的溶液的分析顯示H2O2被還原，表明用氧化鈦納米顆粒修飾的AFM有光催化性 能。實施例6固定化在AFM針尖上的磁性顆粒本實施例示例顯示了在AFM針尖頂端上固定化磁性顆粒的方法。見圖13。為了引入胺基到Fe3O4納米顆粒上，APTES是自組裝的。使用UV交聯(lián)方法將DNA的 固定化到Fe3O4表面。離心得到的Fe3O4以去除多余的DNA。使用上面實施例1的方法，將 與引入到Fe3O4表面上的ssDNA互補的ssDNA固定化到AFM針尖頂端上。使用實施例1和 2的方法將Fe3O4納米顆粒和AFM針尖進行相互雜交。用磁性顆粒修飾的AFM針尖適用于磁力顯微鏡(MFM)。通過將強磁體放置在AFM 針尖上來誘導(dǎo)Fe3O4的磁化，然后比較含分散的磁性材料的Si晶片上的拓撲圖像和磁力圖 像。這樣，AFM針尖可以用于高分辨率磁力顯微鏡。實施例7表面上位點特異件的酶和催化反應(yīng)如圖14所示，通過將附著至AFM針尖的ssDNA(按上面實施例1和2的方法制備)和連接至蛋白激酶的DNA進行雜交，可以將蛋白激酶附著至AFM針尖頂端。用mesospaced技術(shù)和交聯(lián)方法，將具有絲氨酸殘基末端的寡肽被附著至具有表 面結(jié)合的樹突的硅晶片表面。將得到的AFM針尖和Si晶片安裝到AFM中。使AFM針尖在 含有ATP的緩沖液中接觸Si晶片表面。通過在表面上緩慢移動針尖，針尖軌跡上的羥基被 磷酸基取代。通過這種方式，形成高分辨率模式，而且，在針尖軌跡和其他部分之間使用不 同功能基，可以獲得模式擴增和選擇性引入其他化合物。實施例8單分子附著
本實施例示例顯示了向結(jié)合AFM針尖頂端引入連接至DNA的納米顆粒的方法。見 圖15。將相對長的DNA附著至具有表面結(jié)合的樹突的AFM針尖。將相對短的DNA附著至 硅晶片。將可以與AFM針尖和硅晶片兩者的DNA雜交的接頭DNA與硅晶片上的DNA進行雜 交。通過將AFM針尖接近硅表面，將附著至硅晶片表面的接頭DNA的其余部分與AFM針尖 DNA雜交。將AFM針尖從硅晶片上分離時，接頭DNA通過相對結(jié)合力差異而被拉向AFM針 尖。為了驗證這種方法成功與否，將帶有能與捕獲的接頭DNA的未雜交部分雜交的序列的 DNA引入到金納米顆粒上。金鈉米顆粒連接的DNA的雜交顯示了只有一個納米顆粒被附著 至AFM針尖頂端。結(jié)果表明，納米顆粒、納米線、催化劑、金屬、化學(xué)分子和生物分子都可以被固定化 在AFM針尖頂端上。本發(fā)明上述討論的目的在于示例和說明。以上內(nèi)容不是為了將發(fā)明限制到本文所 公開的形式中。雖然本發(fā)明的描述包括一個或多個實施例及特定的變化和修改的描述，但 在理解了本公開之后其他變化和修改也在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)，例如，在本領(lǐng)域技術(shù)和 知識范圍內(nèi)的變化和修改。本發(fā)明目的在于獲得允許范圍內(nèi)的，包括了替代的實施方案的 權(quán)利，其中包括要求保護的內(nèi) 容替代的、互換的和/或等同的結(jié)構(gòu)、功能、范圍、步驟，無論 這些替代的、互換的和/或等同的結(jié)構(gòu)、功能、范圍、步驟是否在此處公開，本發(fā)明也沒有計 劃公開的貢獻任何可以被授予專利權(quán)的主題。
權(quán)利要求
一種修飾固體基片表面的方法，包括將受體附著至第一固體基片表面的凸起表面，以產(chǎn)生包含多個受體的受體結(jié)合的基片；在足以產(chǎn)生受體-配體復(fù)合物結(jié)合的固體基片的條件下，使受體結(jié)合的基片與結(jié)合至第二固體基片表面的配體相接觸，其中只有所述多個受體中的部分與配體復(fù)合；以及修飾受體-配體復(fù)合物以產(chǎn)生表面經(jīng)修飾的固體基片。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中約3個或者更少的受體與配體復(fù)合。
3.權(quán)利要求2所述的方法，其中僅有單個受體與配體復(fù)合。
4.權(quán)利要求1所述的方法，其中受體_配體復(fù)合物是雙鏈寡核苷酸、抗原_抗體復(fù)合 物、寡肽_小分子復(fù)合物或寡肽_寡肽復(fù)合物。
5.權(quán)利要求4所述的方法，其中受體-配體復(fù)合物是雙鏈寡核苷酸。
6.權(quán)利要求5所述的方法，其中修飾受體_配體復(fù)合物的所述步驟進一步包括在足以形成雙鏈寡核苷酸-金屬離子復(fù)合物的條件下，使雙鏈寡核苷酸與金屬離子相 接觸；以及，在足以產(chǎn)生表面經(jīng)修飾的固體基片的條件下還原金屬離子，所述表面經(jīng)修飾的固體基 片包括表面結(jié)合的金屬納米棒。
7.權(quán)利要求5所述的方法，其中修飾受體_配體復(fù)合物的所述步驟進一步包括在足以 產(chǎn)生表面經(jīng)修飾的固體基片的條件下，使雙鏈寡核苷酸與嵌入劑_金屬催化劑復(fù)合物相接 觸，所述表面經(jīng)修飾的固體基片包括表面結(jié)合的雙鏈寡核苷酸和插入其中的嵌入劑-金屬 催化劑。
8.權(quán)利要求5所述的方法，其中修飾受體_配體復(fù)合物的所述步驟進一步包括 使雙鏈寡核苷酸變性以產(chǎn)生單鏈寡核苷酸結(jié)合的基片；和將單鏈寡核苷酸；(i)在足以產(chǎn)生表面經(jīng)修飾的固體基片的條件下，與經(jīng)標(biāo)記的互補寡核苷酸雜交，所述 表面經(jīng)修飾的固體基片包括表面結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記的雙鏈寡核苷酸；或( )在足以產(chǎn)生表面經(jīng)修飾的固體基片的條件下，與包括酶或催化劑的互補寡核苷酸 雜交，所述表面經(jīng)修飾的固體基片包括附著至表面結(jié)合的雙鏈寡核苷酸的酶或催化劑。
9.權(quán)利要求8所述的方法，進一步包括在使雙鏈寡核苷酸變性的所述步驟之前，從固 體基片表面上切割下至少部分未結(jié)合的單鏈寡核苷酸的步驟。
10.權(quán)利要求5所述的方法，其中使受體結(jié)合的基片與結(jié)合至第二固體基片表面的配 體相接觸的所述步驟包括在足以產(chǎn)生受體-配體復(fù)合物結(jié)合的固體基片的條件下，使第一固體基片表面結(jié)合的 ssDNA與接頭ssDNA相接觸，所述接頭ssDNA與附著至第二固體基片表面的ssDNA雜交，其 中接頭ssDNA包括(i)能夠與附著至第一固體基片表面上的ssDNA雜交的第一 DNA部分； ( )能夠與附著至第二固體基片表面上的ssDNA雜交的第二 DNA部分；和 (iii)任選的探針。
11.權(quán)利要求10所述的方法，其中接頭ssDNA包括探針。
12.權(quán)利要求4所述的方法，其中受體_配體復(fù)合物是抗原_抗體復(fù)合物。
13.權(quán)利要求12所述的方法，其中修飾受體_配體復(fù)合物的所述步驟包括在足以產(chǎn)生 表面經(jīng)修飾的固體基片的條件下，使抗原-抗體復(fù)合物與第二抗體相接觸，所述表面經(jīng)修 飾的固體基片包括抗原_抗體_第二抗體的表面結(jié)合的復(fù)合物。
14.權(quán)利要求13所述的方法，其中修飾受體_配體復(fù)合物的所述步驟進一步包括在足 以產(chǎn)生表面經(jīng)修飾的固體基片的條件下，加入酶連接的第二抗體，所述表面經(jīng)修飾的固體 基片包括抗體_抗原_酶連接的第二抗體的表面結(jié)合的復(fù)合物。
15.權(quán)利要求13所述的方法，其中修飾受體_配體復(fù)合物的所述步驟進一步包括在足 以產(chǎn)生表面經(jīng)修飾的基片的條件下，加入金屬連接的第二抗體，所述表面經(jīng)修飾的基片包 括抗體_抗原_金屬連接的第二抗體的表面結(jié)合的復(fù)合物。
16.權(quán)利要求1所述的方法，其中受體通過表面結(jié)合的接頭附著至第一固體基片。
17.權(quán)利要求16所述的方法，其中表面結(jié)合的接頭包括 中心原子；通過接頭附著至中心原子，并附著至受體的官能團；和附著至所述中心原子，并具有附著至所述固體支持物的所述第一表面的多個末端的基 礎(chǔ)部分。
18.權(quán)利要求17所述的方法，其中表面結(jié)合的接頭具有下式 Z- [R1Iffl-Q1-{[R2-Q2] a- {(R3-Q3) b- [ (R4-Q4) c- (R5-Y) J y} J nI其中，m、a、b和c各自獨立地是O或1 ；當(dāng)c是O時，χ是1，或當(dāng)c是1時，χ是從1到Q4-I的氧化態(tài)的整數(shù)；當(dāng)b是O時，y是1，或當(dāng)b是1時，y是從1到Q3-I的氧化態(tài)的整數(shù)；當(dāng)a是O時，ζ是1，或當(dāng)a是1時，ζ是從1到Q2-I的氧化態(tài)的整數(shù)；η是從1到Q1-I的氧化態(tài)的整數(shù)；Q1是具有至少3的氧化態(tài)的中心原子；Q2> Q3> Q4各自獨立地是具有至少3的氧化態(tài)的分支原子；R1、R2、R3、R4和R5各自獨立地是接頭；Z是附著至受體的官能團；和Y各自獨立地是所述基礎(chǔ)部分的末端上的官能團，其中倘若n、x、y和ζ的積至少為3，有多個Y附著至所述固體支持物的所述第一表面。
19.權(quán)利要求18所述的方法，其中Z包括選自N、O、S、P及其組合的雜原子。
20.權(quán)利要求1所述的方法，其中第一固體基片是原子力顯微鏡針尖。
21.適合進行分析性分析的固體基片，包括凸起表面，其中所述的凸起表面包括多個表 面結(jié)合的樹突，這些樹突包含適合與配體形成復(fù)合物的受體，使得當(dāng)多個受體與結(jié)合至第 二固體基片表面的配體相接觸時，僅有所述多個受體中的部分與配體進行復(fù)合。
22.權(quán)利要求21所述的固體基片，其中所述固體基片是原子力顯微鏡針尖。
23.權(quán)利要求21所述的固體基片，其中所述樹突具有下式 Z- [R1Iffl-Q1-{[R2-Q2] a- {(R3-Q3) b- [ (R4-Q4) c- (R5-Y) J y} J nI其中，m、a、b和c各自獨立地是O或1 ；當(dāng)c是O時，χ是1，或當(dāng)c是1時，χ是從1到Q4-I的氧化態(tài)的整數(shù)；當(dāng)b是O時，y是1，或當(dāng)b是1時，y是從1到Q3-I的氧化態(tài)的整數(shù)；當(dāng)a是O時，ζ是1，或當(dāng)a是1時，ζ是從1到Q2-I的氧化態(tài)的整數(shù)；η是從1到Q1-I的氧化態(tài)的整數(shù)；Q1是具有至少3的氧化態(tài)的中心原子；Q2> Q3> Q4各自獨立地是具有至少3的氧化態(tài)的分支原子；R1、R2、R3、R4和R5各自獨立地是接頭；Z是連接至所述受體的官能團；和Y各自獨立地是所述基礎(chǔ)部分的末端上的官能團，其中倘若n、x、y和ζ的積至少為3，有多個Y附著至所述固體支持物的所述第一表面。
24.權(quán)利要求21所述的固體基片，其中所述受體為寡核苷酸、寡肽、抗體、抗原、受體、 酶、適體或其他生物學(xué)或藥學(xué)活性化合物。
25.適合在原子力顯微鏡中使用的部件，包括凸起表面和附著至所述凸起表面頂端的 3個或更少的探針分子。
26.權(quán)利要求25所述的部件，其中所述凸起表面包括單個探針分子。
全文摘要
本發(fā)明提供了凸起表面如頂端上，包含少量分子，如10個或者更少分子的固體基片，以及其生產(chǎn)和使用方法。
文檔編號C12Q1/68GK101821617SQ200880107437
公開日2010年9月1日 申請日期2008年9月17日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月17日
發(fā)明者樸準(zhǔn)遠, 洪鳳振, 金*會 申請人:浦項工科大學(xué)校產(chǎn)學(xué)協(xié)力團;Posco