專利名稱：包含植物內(nèi)生產(chǎn)之血凝素的流感病毒樣顆粒(vlp)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及病毒樣顆粒的生產(chǎn)。更具體而言，本發(fā)明涉及包含流感抗原的病毒樣 顆粒的生產(chǎn)。
背景技術(shù)：
流感是人中由于呼吸道病毒引起的死亡的首要原因。常見的癥狀包括發(fā)熱、喉嚨 疼痛、氣短和肌肉酸痛等。在流感季節(jié)，流感病毒感染全世界10 20%的人口，每年導(dǎo)致 250 500，000人死亡。流感病毒是從哺乳動(dòng)物受感染細(xì)胞質(zhì)膜出芽的包膜病毒。根據(jù)所存在的核蛋白和 基質(zhì)蛋白抗原，流感病毒分為A型、B型或C型。根據(jù)所存在的血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶 (NA)表面糖蛋白的組合，A型流感病毒可進(jìn)一步分成若干亞型。HA支配病毒與宿主細(xì)胞結(jié) 合以及穿入宿主細(xì)胞的能力。NA從宿主細(xì)胞和病毒表面蛋白的聚糖鏈上除去末端唾液酸殘 基，這防止病毒聚集并有利于病毒運(yùn)動(dòng)。目前，已鑒定出16種HA(H1-H16)和9種NA(N1_N9) 亞型。每種A型流感病毒具有一種HA糖蛋白類型和一種NA糖蛋白類型。一般而言，每種 亞型均表現(xiàn)出物種特異性；例如，已知所有HA和NA亞型均感染鳥類，而只有H1、H2、H3、H5、 H7、H9、H10、Ni、N2、N3 和 N7 顯示感染人類(Horimoto 2006 ；Suzuki 2005)。含有 H5、H7 和H9的流感病毒被認(rèn)為是致病性最強(qiáng)的A型流感病毒形式，并且最有可能引起將來的大流 行。流感大流行通常由高傳播性且致病性強(qiáng)的流感病毒引起，并可導(dǎo)致全球性疾病和 死亡水平升高。在20世紀(jì)，新的A型流感亞型的出現(xiàn)導(dǎo)致四次主要的大流行。1918 1919 年由Hmi病毒引起的西班牙流感在1917年至1920年之間導(dǎo)致世界范圍內(nèi)超過五千萬人 死亡。當(dāng)前，新亞型出現(xiàn)的風(fēng)險(xiǎn)或者動(dòng)物中特有的亞型向人傳播的風(fēng)險(xiǎn)總是存在。特別受 到關(guān)注的是高致病性形式的禽流感(也稱作“鳥流感”)，據(jù)報(bào)道其已經(jīng)在全世界若干國家 爆發(fā)。在許多情形下，該禽流感可在48小時(shí)內(nèi)導(dǎo)致接近100%的死亡率。據(jù)推測，1997年 在香港首次鑒定的禽流感病毒(H5N1)向其它亞洲國家和歐洲的傳播與野生鳥類的遷徙模 式有關(guān)。目前對抗人中流感的方法是每年接種疫苗。疫苗通常是預(yù)測為即將到來之“流感 季節(jié)”強(qiáng)勢毒株(dominant strain)的幾種毒株的組合。所述預(yù)測由世界衛(wèi)生組織來協(xié)調(diào) 完成。一般而言，每年生產(chǎn)的疫苗劑量數(shù)不足以接種全世界的人群。例如，加拿大和美國獲 得足以免疫其約三分之一人口的疫苗劑量，而歐盟僅有17%的人口可接種疫苗。很顯然，在 世界范圍的流感大流行到來時(shí)，目前全世界的流感疫苗生產(chǎn)不能滿足需求。即使所需的年 產(chǎn)量在給定年份中可以某種方式實(shí)現(xiàn)，然而強(qiáng)勢毒株每年都在變化，因此在一年的低需求 時(shí)間大量儲備是不切實(shí)際的。經(jīng)濟(jì)地、大規(guī)模地生產(chǎn)有效流感疫苗是政府和私營企業(yè)等非 常關(guān)心的。用于疫苗中的病毒儲液是在受精的蛋中生產(chǎn)的。收獲病毒顆粒，為了得到滅活病 毒疫苗，通過去污劑干擾進(jìn)行滅活。減毒活疫苗由適于在低溫下生長的流感病毒制備，這意味著在正常體溫下所述疫苗的毒力減弱。這樣的疫苗在美國被批準(zhǔn)用于5 49歲的個(gè)體。 全病毒滅活疫苗是通過化學(xué)試劑滅活而變?yōu)闊o害的，并且其已在胚蛋或哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng) 物中生產(chǎn)。所有這些類型的疫苗都顯示出一些特定的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。全病毒來源之疫苗的一 個(gè)優(yōu)點(diǎn)是這種疫苗所引起的免疫類型。通常，裂解型疫苗誘導(dǎo)強(qiáng)的抗體應(yīng)答，而由全病毒制 得的疫苗誘導(dǎo)抗體(體液)應(yīng)答和細(xì)胞應(yīng)答。盡管功能性抗體應(yīng)答是與疫苗誘導(dǎo)的保護(hù)作 用相關(guān)的獲批標(biāo)準(zhǔn)，然而越來越多的證據(jù)表明T細(xì)胞應(yīng)答對流感免疫也很重要，其還可為 老年人提供更好的保護(hù)。為了誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答，開發(fā)了由全病毒制得的疫苗。由于流感毒株(例如H5W) 的高致病性，因此在BL3+設(shè)備中生產(chǎn)這些疫苗。對于高致病性流感毒株(例如H5N1)來 說，為了降低流感毒株的致病性、使其無毒且更容易在胚蛋或哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物中生產(chǎn)， 一些制造商對血凝素的基因序列進(jìn)行了修飾。另一些人還使用重排列(reassortant)流感 株，其中血凝素和神經(jīng)氨酸酶蛋白的基因序列被克隆進(jìn)高產(chǎn)量、低致病性的流感供體株(A/ PR/8/34 ；Quan F-S等，2007)中。盡管這些方法可產(chǎn)生有用的疫苗，但是它們不能提供以滿 足正常年份全球需求的所需規(guī)模來大量、低成本及快速生產(chǎn)疫苗的解決方法，并且當(dāng)大流 行到來時(shí)幾乎必然地不能滿足需求。利用該反向遺傳技術(shù)，還可能需要對HA蛋白的基因序列進(jìn)行突變以使其無毒。就 高致病性流感株而言，全病毒疫苗的生產(chǎn)需要防護(hù)(confinement)程序或者所得疫苗不與 循環(huán)病毒的基因序列完全匹配。在減毒活疫苗的情形中，仍存在所施用的疫苗可與來自宿 主的流感病毒重組而產(chǎn)生新流感病毒的風(fēng)險(xiǎn)。盡管該方法保持了抗原表位和翻譯后修飾，但是該方法存在許多缺點(diǎn)，包括由于 使用全病毒而引起的污染風(fēng)險(xiǎn)以及取決于病毒株的可變的產(chǎn)量。亞最佳水平的保護(hù)可由以 下原因?qū)е掠捎趯⒉《疽氲爸卸鸬牟《具z傳異質(zhì)性。其它缺點(diǎn)包括為了獲得蛋而 進(jìn)行大量計(jì)劃，由于在純化中使用的化學(xué)品引起的污染風(fēng)險(xiǎn)以及生產(chǎn)時(shí)間長。此外，對蛋中 蛋白質(zhì)過敏的人可能不適于接種所述疫苗。在大流行的情形中，裂解型疫苗的生產(chǎn)受到需要使毒株適于在蛋中生長以及所得 產(chǎn)量不同的限制。盡管此技術(shù)用于生產(chǎn)季節(jié)性疫苗已使用了多年，但是它很難在合理的時(shí) 間范圍內(nèi)響應(yīng)于大流行，并且世界范圍的生產(chǎn)能力有限。為了避免使用蛋，已經(jīng)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物中(例如在MDCK或PERC. 6細(xì)胞等 中)生產(chǎn)流感病毒。另一種方法是反向遺傳方法，其中通過用病毒基因轉(zhuǎn)化細(xì)胞來生產(chǎn)病 毒。然而，這些方法也需要使用全病毒以及精準(zhǔn)的方法和特定的培養(yǎng)環(huán)境。已開發(fā)了幾種作為候選重組流感疫苗的重組產(chǎn)物。這些方法關(guān)注A型流感病毒HA 和NA蛋白的表達(dá)、制備以及純化，包括利用桿狀病毒感染的昆蟲細(xì)胞(Crawford等，1999 ； Johansson, 1999)、病毒載體和DNA疫苗構(gòu)建體(Olsen等，1997)來表達(dá)這些蛋白質(zhì)。流感病毒感染的特異性是公知的。簡言之，感染循環(huán)是從病毒體表面HA蛋白與含 有唾液酸的細(xì)胞受體(糖蛋白和糖脂)結(jié)合開始的。NA蛋白介導(dǎo)對唾液酸受體的處理，病 毒穿入細(xì)胞則取決于HA依賴性受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用。在含有流感病毒體的內(nèi)化內(nèi)涵體的 酸性界限內(nèi)，HA蛋白發(fā)生構(gòu)象變化，這導(dǎo)致病毒與細(xì)胞膜融合，病毒脫殼以及M2介導(dǎo)的從 核衣殼相關(guān)核糖核蛋白(RNP)釋放Ml蛋白，Ml蛋白遷移到細(xì)胞核內(nèi)用于病毒RNA合成。抗 HA蛋白的抗體通過中和病毒感染性來預(yù)防病毒感染，而抗NA蛋白的抗體介導(dǎo)其對病毒復(fù)
4制早期步驟的作用。Crawford等(1999)公開了流感病毒HA在桿狀病毒感染的昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)。 所表達(dá)的蛋白質(zhì)被描述為能夠預(yù)防由禽類H5和H7流感亞型引起的致命性流感疾病。 Johansson等(1999)教導(dǎo)了桿狀病毒表達(dá)的流感病毒HA和NA蛋白在動(dòng)物中誘導(dǎo)了優(yōu)于常 規(guī)疫苗所誘導(dǎo)之應(yīng)答的免疫應(yīng)答。桿狀病毒表達(dá)的馬流感病毒血凝素的免疫原性和效力可 與同源DNA候選疫苗相比較(Olsen等，1997)?？傊@些數(shù)據(jù)表明，使用多種實(shí)驗(yàn)方法以 及在不同動(dòng)物模型中，可利用重組HA或NA蛋白誘導(dǎo)針對流感病毒攻擊的高度保護(hù)。由于先前的研究已顯示表面流感病毒糖蛋白HA和NA是用于誘導(dǎo)針對流感病毒之 保護(hù)性免疫的主要靶標(biāo)，并且Ml提供了用于流感病毒之細(xì)胞免疫的保守性靶標(biāo)，所以新的 候選疫苗可包含作為蛋白質(zhì)大分子顆粒(例如病毒樣顆粒(VLP))的這些病毒抗原。作為 疫苗產(chǎn)品，VLP提供了如下優(yōu)點(diǎn)比亞基或重組抗原更強(qiáng)的免疫原性，能刺激體液和細(xì)胞免 疫應(yīng)答(Grgacic和Anderson，2006)。此外，含有這些流感抗原的顆?？烧故境鰳?gòu)象表位， 其誘導(dǎo)針對多種流感病毒株的中和抗體。生產(chǎn)用于疫苗目的的非感染性流感病毒株是避免發(fā)生意外感染的一種方法。作為 替代，已研究出用作培養(yǎng)病毒之替代物的病毒樣顆粒(VLP)。VLP模擬病毒衣殼的結(jié)構(gòu)，但 缺少基因組，因此不能復(fù)制或提供二次感染的機(jī)會。一些研究表明，使用哺乳動(dòng)物表達(dá)質(zhì)?；驐U狀病毒載體，重組流感病毒蛋白在細(xì) 胞培養(yǎng)物中自組裝成 VLP (Gomez-Puertas 等，1999 ；Neumann 等，2000 ；Latham 和 Galarza， 2001)。Gomez-Puertas等(1999)公開了流感病毒VLP的有效形成取決于幾種病毒蛋白質(zhì) 的表達(dá)水平。Neumann等(2000)建立了基于哺乳動(dòng)物表達(dá)質(zhì)粒的系統(tǒng)，其用于完全從克隆 cDNA產(chǎn)生感染性流感病毒樣顆粒。Latham和Galarza(2001)報(bào)道了在用共表達(dá)HA、NA、M1 和M2基因的重組桿狀病毒感染的昆蟲細(xì)胞中形成流感病毒VLP。這些研究表明，流感病毒 體蛋白質(zhì)可在真核細(xì)胞中共表達(dá)后進(jìn)行自組裝。Gomez-Puertas等(2000)教導(dǎo)，除了血凝素(HA)以外，流感病毒的基質(zhì)蛋白(Ml) 對于VLP從昆蟲細(xì)胞出芽也是必需的。然而，Chen等(2007)教導(dǎo)了 Ml可能不是VLP形成 所需的，并觀察到Ml和VLP的有效釋放需要存在HA和由NA提供的唾液酸酶活性。NA切割 產(chǎn)生VLP之細(xì)胞表面上的糖蛋白的唾液酸，并將VLP釋放到介質(zhì)中。Quan等(2007)教導(dǎo)了在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(昆蟲細(xì)胞)中產(chǎn)生的VLP疫苗誘導(dǎo) 針對某些流感病毒株(A/PR8/34 (Hmi))的保護(hù)性免疫。經(jīng)觀察，Quan所研究的VLP從質(zhì) 膜出芽，并被認(rèn)為具有合適的大小和形態(tài)，與在哺乳動(dòng)物系統(tǒng)(MDCK系統(tǒng))中得到的相似。包膜病毒可在從感染細(xì)胞“出芽”時(shí)獲得脂質(zhì)包膜，并且從質(zhì)膜獲得膜，或者從內(nèi) 部細(xì)胞器的質(zhì)膜獲得膜。流感病毒顆粒和VLP從宿主細(xì)胞的質(zhì)膜出芽。例如，在哺乳動(dòng)物 或桿狀病毒細(xì)胞系統(tǒng)中，流感病毒從質(zhì)膜出芽(Quan等，2007)。已知僅有少數(shù)包膜病毒感 染植物(例如，番茄斑萎病毒屬(Topovirus)和彈狀病毒屬(Rhabdovirus)的成員)。在已 知的植物包膜病毒中，它們的特征在于從宿主細(xì)胞的內(nèi)膜出芽，而不是從質(zhì)膜出芽。雖然已 在植物宿主中產(chǎn)生了少數(shù)的重組VLP，但是它們均非源自質(zhì)膜，于是提出了這樣的問題—— 是否可以在植物中生產(chǎn)質(zhì)膜來源的VLP(包括流感病毒VLP)。目前的流感病毒VLP生產(chǎn)技術(shù)依賴于多種病毒蛋白質(zhì)的共表達(dá)，這種依賴性代表 了這些技術(shù)的缺點(diǎn)，這是因?yàn)樵谌澜绱罅餍泻兔磕炅餍械那樾沃?，反?yīng)時(shí)間對于疫苗接種來說是至關(guān)重要的。為了加快疫苗的開發(fā)，需要僅依賴于表達(dá)一種病毒蛋白質(zhì)的更為簡 單的VLP生產(chǎn)體系。為了保護(hù)全世界人口免于患流感并且擊退將來的大流行，疫苗生產(chǎn)商需要開發(fā)有 效的、快速的生產(chǎn)疫苗制劑的方法。目前使用受精的蛋生產(chǎn)疫苗不能滿足需求，并且生產(chǎn)過 程長。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供改進(jìn)的流感病毒樣顆粒(VLP)。本發(fā)明提供了核酸，其包含編碼來自包膜病毒之抗原的核苷酸序列，所述核苷酸 序列與在植物中有活性的調(diào)控區(qū)有效連接。所述抗原可以是流感病毒血凝素(HA)。本發(fā)明還提供了在植物中生產(chǎn)流感病毒樣顆粒(VLP)的方法，其包括a)將與在植物中有活性的調(diào)控區(qū)有效連接的、編碼來自包膜病毒之抗原(例如流 感病毒血凝素(HA))的核酸導(dǎo)入植物或其部分中，以及b)在允許表達(dá)所述核酸的條件下培養(yǎng)所述植物或其部分，從而產(chǎn)生VLP。所述方法還包括收獲所述植物以及從所述植物組織中純化或分離VLP的步驟。本發(fā)明包括上述方法，其中在導(dǎo)入步驟(步驟a)中，所述核酸可在植物中瞬時(shí)表 達(dá)或在植物中穩(wěn)定表達(dá)。此外，可使用體積排阻色譜對VLP進(jìn)行純化。本發(fā)明還提供了病毒樣顆粒(VLP)，其包含流感病毒HA蛋白以及一種或多種植物 脂質(zhì)。 此外，本發(fā)明還涉及組合物，其包含含有流感病毒HA蛋白的有效劑量VLP、一種或 多種植物脂質(zhì)以及可藥用載體。本發(fā)明還涉及在植物中形成VLP的HA蛋白片段或部分。所述VLP可包含一種或多種亞型的HA蛋白，包括HI、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、 H9、H10、HlU H12、H13、H14、H15或H16或者其片段或部分。含有這些HA蛋白的亞型的 實(shí)例包括A/新喀里多尼亞/20/99 (HlNl)、A/印度尼西亞/5/2006 (H5N1)、A/雞/紐約 /1995、A/ 銀鷗 /DE/677/88 (H2N8)、A/ 得克薩斯 /32/2003、A/ 綠頭鴨 /MN/33/00、A/ 鴨 / 上海 /1/2000、A/ 針尾鴨 /TX/828189/02、A/ 火雞 / 安大略 /6118/68 (H8N4)、A/ 琵嘴鴨 / 伊朗 /G54/03、A/ 雞 / 德國 /Ν/1949 (H10N7)、A/ 鴨 / 英格蘭 /56(H11N6)、A/ 鴨 / 阿爾伯達(dá) /60/76 (H12N5)、A/ 鷗 / 馬里蘭 /704/77 (H13N6)、A/ 綠頭鴨 /Gur jev/263/82、A/ 鴨 / 澳大 利亞 /341/83 (H15N8)、A/ 紅嘴鷗 / 瑞典 /5/99 (H16N3)、B/Lee/40、C/ 約翰內(nèi)斯堡 /66、A/ 波多黎各 /8/34 (Hmi)、A/ 布里斯班 /59/2007 (HlNl)、A/ 所羅門群島 3/2006 (HlNl)、A/ 布 里斯班 10/2007 (H3N2)、A/ 威斯康星 /67/2005 (H3N2)、B/ 馬來西亞 /2506/2004、B/ 佛羅里 達(dá) /4/2006、A/ 新加坡 /1/57 (H2N2)、A/ 安徽 /1/2005 (H5N1)、A/ 越南 /1194/2004 (H5N1)、 A/ 水鴨 / 香港 /W312/97 (H6N1)、A/ 馬 / 布拉格 /56 (H7N7)、A/ 香港 /1073/99 (H9N2)。在本發(fā)明的一個(gè)方面中，所述HA蛋白可以是H1、H2、H3、H5、H6、H7或H9亞型。在另 一方面中，所述Hl蛋白可來自A/新喀里多尼亞Λ0/99 (HlNl)、A/波多黎各/8/34 (HlNl)、 A/布里斯班/59/2007 (HlNl)或A/所羅門群島3/2006 (HlNl)株。所述H3蛋白可來自A/ 布里斯班10/2007 (H3N2)或A/威斯康星/67/2005 (H3N2)株。在本發(fā)明的又一方面中，所述 H2蛋白可來自A/新加坡/1/57(H2N2)株。所述Η5蛋白可來自A/安徽/1/2005 (H5m)、Α/越南/1194/2004 (H5N1)或A/印度尼西亞/5/2005株。在本發(fā)明的一個(gè)方面中，所述H6蛋 白可來自A/水鴨/香港/W312/97 (H6N1)株。所述H7蛋白可來自A/馬/布拉格/56 (H7N7) 株。在本發(fā)明的一個(gè)方面中，所述H9蛋白來自A/香港/1073/99(H9N2)株。在本發(fā)明的又 一方面中，所述HA蛋白可來自可以是B型病毒的流感病毒，包括B/馬來西亞/2506/2004 或B/佛羅里達(dá)/4/2006。來自Hl、Η2、Η3、Η5、Η6、Η7或Η9亞型的HA蛋白的氨基酸序列的 實(shí)例包括 SEQ ID NO 48-59 ο所述流感病毒HA蛋白可以是Η5(印度尼西亞)。本發(fā)明還提供了包含編碼HA蛋白之序列的核酸分子。所述核酸分子還可包含與 所述編碼HA蛋白之序列有效連接的一個(gè)或多個(gè)調(diào)控區(qū)。所述核酸分子可包含編碼Η1、Η2、 Η3、Η4、Η5、Η6、Η7、Η8、Η9、Η10、Hll、Η12、Η13、Η14、Η15 或 Η16 的序列。在本發(fā)明的一個(gè)方 面中，由所述核酸分子編碼的撤蛋白可以是!11、!12、!13、!15、!16、!17或!19亞型。所述核酸分 子編碼的Hl蛋白來自A/新喀里多尼亞/20/99 (HlNl)、A/波多黎各/8/34 (HlNl)、A/布里 斯班/59/2007 (HlNl)或A/所羅門群島3/2006 (HlNl)株。在本發(fā)明的一個(gè)方面中，所述核 酸分子編碼的Η3蛋白可來自A/布里斯班10/2007 (Η3Ν2)或A/威斯康星/67/2005 (Η3Ν2) 株。在本發(fā)明的又一方面中，所述核酸分子編碼的Η2蛋白可來自A/新加坡/1/57 (Η2Ν2) 株。所述核酸分子編碼的Η5蛋白可來自A/安徽/1/2005 (Η5Ν1)、Α/越南/1194/2004 (Η5Ν1) 或A/印度尼西亞/5/2005株。在本發(fā)明的一個(gè)方面中，所述核酸分子編碼的Η6蛋白可來 自A/水鴨/香港/W312/97(H6m)株。所述核酸分子編碼的H7蛋白可來自A/馬/布拉格 /56(H7N7)株。另外，所述核酸分子編碼的H9蛋白可來自A/香港/1073/99 (H9N2)株。編 碼來自HI、H2、H3、H5、H6、H7或H9亞型的這些HA蛋白的核酸分子序列的實(shí)例包括SEQID NO 36-47 和 60-73。所述核酸序列可編碼流感病毒HA蛋白H5 (印度尼西亞)?？膳c編碼HA蛋白之序列有效連接的調(diào)控區(qū)包括在植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞或酵母細(xì) 胞中可操作的調(diào)控區(qū)。這樣的調(diào)控區(qū)可包括質(zhì)體藍(lán)素調(diào)控區(qū)、核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶 / 力口氧Bl (Ribulose 1, 5-bisphosphatecarboxylase/oxygenase, RuBisCO) i周控區(qū)、卩十參錄素 a/b結(jié)合蛋白(CAB)、ST-LS1、多角體蛋白調(diào)控區(qū)或gp64調(diào)控區(qū)。其它調(diào)控區(qū)包括5’ UTR、 3’UTR或終止子序列。所述質(zhì)體藍(lán)素調(diào)控區(qū)可以是苜蓿質(zhì)體藍(lán)素調(diào)控區(qū)；所述5’UTR、3’UTR 或終止子序列也可以是苜蓿序列。還提供了誘導(dǎo)對象中針對流感病毒感染之免疫的方法，該方法包括施用含有流感 病毒HA蛋白、一種或多種植物脂質(zhì)和可藥用載體的病毒樣顆粒。所述病毒樣顆粒可經(jīng)口、 皮內(nèi)、鼻內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)或皮下施用給對象。本發(fā)明還涉及病毒樣顆粒(VLP)，其包含源于選自流感病毒、麻疹病毒、埃博拉病 毒、馬爾堡病毒和HIV病毒之病毒的一種或多種蛋白質(zhì)，以及源于非唾液酸化宿主生產(chǎn)細(xì) 胞的一種或多種脂質(zhì)。所述HIV蛋白可以是p24、gpl20或gp41 ；所述埃博拉病毒蛋白可以 是VP30或VP35 ；所述馬爾堡病毒蛋白可以是Gp/SGP ；所述麻疹病毒蛋白可以是H蛋白或F 蛋白。另外，本發(fā)明涉及含有流感病毒HA蛋白和一種或多種宿主脂質(zhì)的病毒樣顆粒 (VLP) 0例如，如果宿主是昆蟲，那么所述病毒樣顆粒(VLP)可包含流感病毒HA蛋白和一種 或多種昆蟲脂質(zhì)，或者，如果宿主是酵母，那么所述病毒樣顆粒(VLP)可包含流感病毒HA蛋白和一種或多種酵母脂質(zhì)。本發(fā)明還涉及組合物，其包含兩種或更多種流感毒株或亞型的VLP。所述兩種或更 多種亞型或毒株可選自-Al新喀里多尼亞/20/99 (HlNl)、A/印度尼西亞/5/2006 (H5N1)、A/ 雞 / 紐約 /1995、A/ 銀鷗 /DE/677/88 (H2N8)、A/ 得克薩斯 /32/2003、A/ 綠頭鴨 /MN/33/00、 A/ 鴨 / 上海 /1/2000、A/ 針尾鴨 /TX/828189/02、A/ 火雞 / 安大略 /6118/68 (H8N4)、A/ 琵嘴 鴨 / 伊朗 /G54/03、A/ 雞 / 德國 /Ν/1949 (H10N7)、A/ 鴨 / 英格蘭 /56(H11N6)、A/ 鴨 / 阿爾 伯達(dá) /60/76 (H12N5)、A/ 鷗 / 馬里蘭 /704/77 (H13N6)、A/ 綠頭鴨 /Gur jev/263/82、A/ 鴨 / 澳大利亞 /341/83 (H15N8)、A/ 紅嘴鷗 / 瑞典 /5/99(H16N3)、B/Lee/40、C/ 約翰內(nèi)斯堡 /66、 A/ 波多黎各 /8/34 (HlNl)、A/ 布里斯班 /59/2007 (HlNl)、A/ 所羅門群島 3/2006 (HlNl)、A/ 布里斯班 10/2007 (H3N2)、A/ 威斯康星 /67/2005 (H3N2)、B/ 馬來西亞 /2506/2004、B/ 佛羅 里達(dá) /4/2006,A/ 新加坡 /1/57 (H2N2)、A/ 安徽/1/2005 (H5N1)、A/ 越南/1194/2004 (H5N1)、 A/ 水鴨 / 香港 /W312/97 (H6N1)、A/ 馬 / 布拉格 /56 (H7N7)或 A/ 香港/1073/99 (H9N2)。所 述兩種或更多種亞型或毒株的VLP可以大致相等的量存在；或者，一種或多種亞型或毒株 可以占所存在毒株或亞型的大部分。本發(fā)明涉及誘導(dǎo)動(dòng)物或靶標(biāo)生物中針對流感病毒感染之免疫的方法，其包括施用 含有一種或多種VLP的有效劑量疫苗，所述VLP是利用非唾液酸化宿主(例如植物宿主、昆 蟲宿主或酵母宿主)生產(chǎn)的。所述疫苗可經(jīng)口、皮內(nèi)、鼻內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)或皮下施 用。所述靶標(biāo)生物可選自人、靈長類、馬、豬、鳥(禽)類、水禽、候鳥、鵪鶉、鴨、鵝、家禽、雞、 駱駝、犬科動(dòng)物、狗、貓科動(dòng)物、貓、虎、豹、麝貓、水貂、石貂、雪貂、寵物、家畜、小鼠、大鼠、海 豹、鯨等。本發(fā)明提供了用于在能夠生產(chǎn)VLP的合適宿主(例如植物、昆蟲或酵母)中生產(chǎn) 含有來自不同流感毒株之血凝素(HA)的VLP的方法。在植物中生產(chǎn)的VLP含有植物來源 的脂質(zhì)，在昆蟲細(xì)胞中生產(chǎn)的VLP含有來自昆蟲細(xì)胞質(zhì)膜的脂質(zhì)(通常稱為“昆蟲脂質(zhì)”)， 在酵母中生產(chǎn)的VLP含有來自酵母細(xì)胞質(zhì)膜的脂質(zhì)(通常稱為“酵母脂質(zhì)”)。與在昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)物中生產(chǎn)VLP相比，在植物中生產(chǎn)這些顆粒具有若干優(yōu)點(diǎn)。植 物脂質(zhì)可刺激特異性免疫細(xì)胞并增強(qiáng)所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答。植物的膜由脂質(zhì)、磷脂酰膽堿 (PC)和磷脂酰乙醇胺(PE)組成，并且還含有植物以及某些細(xì)菌和原生動(dòng)物所特有的鞘糖 脂。鞘脂類之所以不常見的原因是，它們不是甘油酯(例如PC或PE)，而是由與含有18個(gè) 以上碳的脂肪酸鏈形成酰胺連接的長鏈氨基醇組成。PC和PE以及鞘糖脂可結(jié)合哺乳動(dòng)物 免疫細(xì)胞(例如抗原呈遞細(xì)胞(APC)，如樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)和另一些細(xì)胞(包括胸腺 和肝臟中的B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞))中表達(dá)的⑶1分子(Tsuji M，.2006)。此外，除了 植物脂質(zhì)的存在具有潛在的佐劑作用以外，植物N-聚糖促進(jìn)抗原呈遞細(xì)胞捕獲糖蛋白抗 原的能力(Saint-JOre-Dupas，2007)也可能是在植物中生產(chǎn)VLP的優(yōu)點(diǎn)。不希望受理論限制，預(yù)計(jì)由植物生產(chǎn)的VLP會比在其它生產(chǎn)體系中制得的VLP誘 導(dǎo)出更強(qiáng)的免疫反應(yīng)，并且與活的或減毒的全病毒疫苗誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)相比，由這些植物 生產(chǎn)的VLP誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)會更強(qiáng)。與由全病毒制得的疫苗相比，VLP具有優(yōu)勢，這是因?yàn)樗鼈儫o感染性，因此限制性 生物防范問題不再像使用感染性全病毒時(shí)那么重要，并且不是生產(chǎn)所必需的。由植物生產(chǎn) 的VLP的另一優(yōu)點(diǎn)是，允許表達(dá)系統(tǒng)生長在溫室或田間，從而具有更顯著的經(jīng)濟(jì)效益并適于擴(kuò)大規(guī)模。另外，植物不含有參與合成唾液酸殘基以及將唾液酸殘基添加到蛋白質(zhì)中的酶。 VLP的生產(chǎn)可以不需要神經(jīng)氨酸酶(NA)，并且不需要共表達(dá)NA或者用唾液酸酶(神經(jīng)氨酸 酶)處理生產(chǎn)細(xì)胞或提取物以確保在植物中生產(chǎn)VLP。根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)的VLP不包含已知與RNA結(jié)合的Ml蛋白。RNA是VLP制備物中的 污染物，其在VLP產(chǎn)品獲得監(jiān)管部門審批時(shí)是不期望的。所述發(fā)明內(nèi)容不必然描述本發(fā)明的所有特征。


通過以下描述以及參考附圖，本發(fā)明的這些和其它特征會更加明顯，其中圖IA顯示根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案用于表達(dá)Hl的基于苜蓿質(zhì)體藍(lán)素之表達(dá)盒 的序列(SEQ ID NO :8)。下劃線標(biāo)示蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(protein disulfide isomerase, PDI)信號肽。粗體顯示用于克隆的BglII (AGATCT)和SacI (GAGCTC)限制性位點(diǎn)。圖IB顯 示流感病毒血凝素的功能結(jié)構(gòu)域的示意圖。切割HAO后，HAl和HA2片段仍通過二硫橋結(jié) 合在一起。圖2A顯示被組裝用于表達(dá)HA之Hl亞型的質(zhì)粒540的示意圖。圖2B顯示被組裝 用于表達(dá)HA之H5亞型的質(zhì)粒660的示意圖。圖3顯示來自產(chǎn)生血凝素Hl或H5的葉的蛋白質(zhì)提取物的體積排阻色譜。圖3A 顯示Hl的洗脫模式；Blue Dextran 2000 (三角形)和蛋白質(zhì)(菱形)。圖3B顯示在體積 排阻色譜(S500HR珠)后Hl洗脫級分的免疫檢測(Western印跡；抗Hl抗體)。圖3C顯 示H5的洗脫模式；Blue Dextran 2000 (三角形)和蛋白質(zhì)(菱形)。圖3D顯示在體積排 阻色譜(S500HR珠)后H5洗脫級分的免疫檢測(Western印跡；抗H5抗體)。圖4顯示來自體積排阻柱洗脫級分9的大的血凝素Hl和H5結(jié)構(gòu)的電子顯微鏡顯 微照片。圖4A顯示對來自Hl的VLP放大50000倍，顯示出存在多個(gè)相似的結(jié)構(gòu)(比例尺 表示200nm)。圖4B顯示對來自Hl的VLP放大150000倍(比例尺表示IOOnm)。圖4C顯 示對來自H5的VLP放大50000倍，顯示出存在多個(gè)相似的結(jié)構(gòu)(比例尺表示50nm)。圖5A顯示Hl的N末端片段序列(SEQ ID NO :1)。圖5B顯示Hl的C末端片段 (SEQ ID NO :2)。圖5C顯示編碼Hl的HAO的全長序列(SEQ ID NO 28)。圖6顯示編碼H5的序列，其側(cè)翼為緊鄰起始ATG上游的HindIII位點(diǎn)以及緊鄰終 止密碼子(TAA)下游的SacI位點(diǎn)(SEQ ID NO :3)。圖7A顯示引物Plasto_443c的序列(SEQ ID NO :4)。圖7B顯示引物 SpHA(Ind)-Plasto. r 的序列(SEQ ID NO :5)。圖 7C 顯示引物 Plasto-SpHA (Ind). c 的序列 (SEQ ID NO :6)。圖 7D 顯示引物 HA(Ind)-Sac. r 的序列(SEQ ID NO :7)。圖8A顯示HAl肽序列的氨基酸序列(SEQ ID NO 9)。圖8B顯示HA5肽序列的氨 基酸序列(SEQ ID N0:10)。粗體指示天然信號肽。圖9顯示A型流感病毒H7亞型的HA序列(SEQ ID NO :11)。圖IOA顯示A型流感病毒HA的H2亞型序列(SEQ ID NO :12)。圖IOB顯示A型流 感病毒HA的H3亞型序列(SEQ ID NO 13)。圖IOC顯示A型流感病毒HA的H4亞型序列 (SEQ ID NO: 14)。圖IOD顯示A型流感病毒HA的H5亞型序列(SEQ ID NO: 15)。圖IOE顯示A型流感病毒HA的H6亞型序列(SEQ ID NO :16)。圖IOF顯示A型流感病毒HA的H8 亞型序列(SEQ ID NO: 17)。圖IOG顯示A型流感病毒HA的H9亞型序列(SEQ ID NO: 18)。 圖IOH顯示A型流感病毒HA的HlO亞型序列(SEQ ID NO :19)。圖101顯示A型流感病毒 HA的Hll亞型序列(SEQ ID NO :20)。圖IOJ顯示A型流感病毒HA的H12亞型序列(SEQ ID N0:21)。圖IOK顯示A型流感病毒HA的H13亞型序列(SEQ ID NO :22)。圖IOL顯示 A型流感病毒HA的H14亞型序列(SEQ ID NO 23)。圖IOM顯示A型流感病毒HA的H15亞 型序列(SEQ ID NO 24)。圖ION顯示A型流感病毒HA的H16亞型序列(SEQ ID NO 25)。 圖100顯示B型流感病毒的HA序列(SEQID NO :26)。圖IOP顯示C型流感病毒的HA序列 (SEQ ID N0:27)。圖 IOQ 顯示引物 Xmal-pPlas. c 的序列(SEQ ID NO :29)。圖 IOR 顯示引 物 SacI-ATG-pPlas. r 的序列(SEQ ID NO :30)。圖 IOS 顯示引物 SacI-PlasTer. c 的序列 (SEQ ID NO 31)。圖 IOT 顯示引物 EcoRI-PlasTer. r 的序列(SEQ ID NO 32)。圖11顯示本文使用的幾種構(gòu)建體的示意圖。構(gòu)建體660包含與質(zhì)體藍(lán)素啟動(dòng)子 (Plasto)和終止子(Pter)有效連接的編碼HA之H5亞型的核苷酸序列；構(gòu)建體540包含 編碼HA的Hl亞型連同苜蓿蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶信號肽(SP PDI)的核苷酸序列，并且其與 質(zhì)體藍(lán)素啟動(dòng)子(Plasto)和終止子(Pter)有效連接；構(gòu)建體544被組裝用于表達(dá)HA的 Hl亞型，編碼Hl的核苷酸序列與苜蓿蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶信號肽(SP PDI)和GCMpII亮 氨酸拉鏈(替代Hl的跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)尾)相組合并與質(zhì)體藍(lán)素啟動(dòng)子(Plasto)和終止 子(Pter)有效連接；用于表達(dá)流感A/PR/8/34之Ml編碼區(qū)的構(gòu)建體750與煙草蝕紋病毒 (tobacco etch virus, TEV)的5，UTR相組合，并與雙35S啟動(dòng)子和Nos終止子有效連接。圖12顯示使用抗H5 (越南)抗體對用構(gòu)建體660轉(zhuǎn)化的本塞姆氏煙草 (N. benthamiana)葉蛋白質(zhì)提取物中的H5進(jìn)行免疫檢測(泳道3)。使用來自流感病毒A/ 越南/1203/2004的市售H5作為檢測的陽性對照(泳道1)，用空載體轉(zhuǎn)化的葉蛋白質(zhì)提取 物用作陰性對照(泳道2)。圖13顯示通過體積排阻色譜對血凝素結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。利用S-500HR通過凝膠過 濾分離來自產(chǎn)生H5、H1、可溶性Hl或Hl以及Ml之各生物質(zhì)的蛋白質(zhì)提取物。還對市售的 玫瑰花結(jié)形式的Hl進(jìn)行分級分離(Hl玫瑰花結(jié))。圖13A顯示用于分析相對蛋白質(zhì)含量 的洗脫級分(相對蛋白質(zhì)水平——顯示生物質(zhì)分級分離的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)洗脫模式)。標(biāo)出了 Blue Dextran 2000 (2MDa標(biāo)準(zhǔn)參照物)的洗脫峰。圖13B顯示通過使用抗H5 (越南)抗體 (針對H5)進(jìn)行免疫印跡用于分析洗脫級分中的血凝素存在情況。圖13C顯示用于分析針 對Hl之抗A型流感病毒抗體的洗脫級分。圖13D顯示用于分析針對可溶性Hl之抗A型流 感病毒抗體的洗脫級分。圖13E顯示用于分析針對Hl玫瑰花結(jié)之抗A型流感病毒抗體的 洗脫級分。圖13F顯示用于分析針對H1+M1之抗A型流感病毒抗體的洗脫級分。圖14顯示通過蔗糖梯度離心濃縮流感病毒H5結(jié)構(gòu)以及對血凝素濃縮級分進(jìn)行電 子顯微鏡檢查。圖14A顯示由蔗糖密度梯度離心得到的級分的表征。通過利用抗H5(越 南)抗體進(jìn)行免疫印跡(上圖)分析每一級分中H5的存在及其相對蛋白質(zhì)含量和血細(xì)胞 凝集能力(曲線圖)。圖14B顯示來自蔗糖梯度離心的合并級分17、18和19的負(fù)染色透射 電子顯微鏡檢查。比例尺表示lOOnm。圖15顯示流感病毒H5VLP的純化。圖15A顯示純化步驟和胎球蛋白親和純化步 驟中用考馬斯藍(lán)染色的SDS-PAGE分析蛋白質(zhì)含量。在純化步驟中，泳道1，粗提物；泳道2，PH6經(jīng)調(diào)節(jié)提取物；泳道3，經(jīng)熱處理的提取物；泳道4，經(jīng)DE過濾的提取物；在胎球蛋白親 和純化步驟中，泳道5，加樣；泳道6，清洗；泳道7，洗脫(10倍濃縮)。圖15B顯示對純化的 H5 VLP樣品的負(fù)染色透射電子顯微鏡檢查。比例尺表示lOOnm。圖15C顯示放大的經(jīng)分離 H5VLP以顯示結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)。圖15D顯示利用考馬斯染色的還原型SDS-PAGE (泳道A)以及利用 針對來自A/越南/1203/2004毒株(H5N1)的HA產(chǎn)生的兔多克隆抗體進(jìn)行的Western印跡 (泳道B)顯示的H5VLP產(chǎn)物。圖16顯示A型流感病毒(A/新喀里多尼亞/20/99 (HlNl))血凝素(HA)基因全長 cds 的核苷酸序列。GenBank 登錄號 AY289929 (SEQID NO 33)。圖17顯示紫花苜蓿(Medicago sativa)的蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶mRNA的核苷酸序 列。GenBank 登錄號 Zl 1499 (SEQ ID NO :34)。圖18顯示A型流感病毒(A/波多黎各/8/34 (HlNl))區(qū)段7全長序列的核苷酸序 列。GenBank 登錄號 NC_002016. 1 (SEQ ID NO 35)。圖19顯示正染色透射電子顯微鏡所觀察的產(chǎn)生H5之組織的VLP累積定位。CW 細(xì)胞壁，ch 葉綠體，pm 質(zhì)膜，VLP 病毒樣顆粒。比例尺表示lOOnm。圖20顯示在用植物生產(chǎn)的流感病毒H5 VLP或重組可溶性HA接種的Balb/c小 鼠中加強(qiáng)后14天誘導(dǎo)的血清抗體應(yīng)答。圖20(A)通過肌內(nèi)注射免疫的小鼠的抗體應(yīng)答。 圖20⑶通過鼻內(nèi)施用免疫的小鼠的抗體應(yīng)答。測量針對失活的H5W全病毒(A/印度尼 西亞/5/05)的抗體應(yīng)答。GMT:幾何平均效價(jià)。數(shù)值是每組中五只小鼠的終點(diǎn)效價(jià)倒數(shù)的 GMT(Iog2)。短線表示平均偏差。與重組可溶性HA相比，*p < 0. 05。圖21顯示在用植物生產(chǎn)的流感病毒H5VLP或重組可溶性HA接種的Balb/c小鼠中 加強(qiáng)后14天的血細(xì)胞凝集抑制(hemagglutinationinhibition，HAI)抗體應(yīng)答。圖21(A) 通過肌內(nèi)注射免疫的小鼠的抗體應(yīng)答。圖21(B)通過鼻內(nèi)施用免疫的小鼠的抗體應(yīng)答。使 用失活的H5W全病毒(A/印度尼西亞/5/05)測量HAI抗體應(yīng)答。GMT 幾何平均效價(jià)。數(shù) 值是每組中五只小鼠的終點(diǎn)效價(jià)倒數(shù)的GMT(lo&)。短線表示平均偏差。與重組可溶性HA 相比，*p < 0. 05，**p < 0· 01。圖22顯示佐劑對小鼠中VLP免疫原性的作用。圖22 (A)明礬對通過肌內(nèi)注射免 疫之小鼠的作用。圖22(B)殼聚糖對通過鼻內(nèi)施用免疫之小鼠的作用。使用失活的H5W 全病毒(A/印度尼西亞/5/05)測量HAI抗體應(yīng)答。GMT:幾何平均效價(jià)。數(shù)值是每組中五 只小鼠的終點(diǎn)效價(jià)倒數(shù)的GMT(Iog2)15短線表示平均偏差。與相應(yīng)的重組可溶性HA相比，
< 0. 05。圖23顯示施用VLP的抗體應(yīng)答。圖23(A)通過肌內(nèi)注射接種的小鼠加強(qiáng)后30 天的抗印度尼西亞/5/05免疫球蛋白同種型。數(shù)值是每組中五只小鼠的終點(diǎn)效價(jià)倒數(shù)的 GMT(Iog2)。使用失活全病毒作為涂覆劑進(jìn)行ELISA。短線表示平均偏差。與相應(yīng)的重組可 溶性HA相比，*p < 0. 05，< 0. 001。圖23 (B)針對失活全病毒的抗體效價(jià)。所有組均 與陰性對照具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。圖24顯示初次劑量后2周(第2周)、加強(qiáng)后14天(第5周)或加強(qiáng)后30天(第 7周)的針對同源失活全病毒(A/印度尼西亞/5/05)的抗體效價(jià)。GMT:幾何平均效價(jià)。數(shù) 值是每組中五只小鼠的終點(diǎn)效價(jià)倒數(shù)的GMT(Iog2)。與重組可溶性HA相比，*p < 0. 05。圖25顯示血清抗體的體外交叉反應(yīng)性。(A)針對失活全病毒的抗體效價(jià)。(B)針對多種失活全病毒的血細(xì)胞凝集抑制效價(jià)。數(shù)值是每組中五只小鼠的終點(diǎn)效價(jià)倒數(shù)的 GMT(Iog2)。短線表示平均偏差。所有組均與陰性對照具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與相應(yīng)的重組可 溶性 HA 相比，*P < 0. 05，**p < 0. 001。圖26顯示由植物生產(chǎn)的H5VLP的效力。㈧用10倍LD5tl (4. 09 X IO5CCID50)的流 感毒株A/土耳其/582/06 (H5W)攻擊后小鼠的存活率。(B)攻擊后免疫小鼠的體重。數(shù)值 是存活小鼠的平均體重。圖27顯示植物來源的流感病毒VLP的來源。(A)純化的流感病毒VLP的極性 脂質(zhì)組成。將包含在相當(dāng)于40 μ g蛋白質(zhì)中的脂質(zhì)從上述VLP中提取出來，通過HP-TLC 進(jìn)行分離，并與從高度純化的煙草質(zhì)膜(PM)中分離的脂質(zhì)的遷移模式進(jìn)行比較。脂質(zhì)縮 寫如下D⑶G，雙半乳糖二酰甘油；gluCER，葡萄糖神經(jīng)酰胺；PA，磷酸；PC，磷脂酰膽堿； PE，磷脂酰乙醇胺；PG，磷脂酰甘油；PI，磷酯酰肌醇；PS，磷脂酰絲氨酸；SG，類固醇糖苷 (Steryl-glycoside)。(B)純化的流感病毒VLP的中性脂質(zhì)組成。將包含在相當(dāng)于20 μ g 蛋白質(zhì)中的脂質(zhì)從上述VLP中提取出來，通過HP-TLC進(jìn)行分離，并與谷固醇的遷移進(jìn)行比 較。(C)對純化的VLP、來自煙草葉的高度純化PM(PMJ和BY2煙草細(xì)胞(PMby2)的高度純化 PM中質(zhì)膜標(biāo)志物質(zhì)子泵ATP酶(PMA)進(jìn)行免疫檢測。在每一泳道中加入18 μ g蛋白質(zhì)。圖28顯示克隆體774的DraIII至SacI位點(diǎn)之間的序列——A/布里斯班 /59/2007 (HlNl)的核苷酸序列(SEQ ID NO :36)。所述編碼序列的側(cè)翼是在5，端以DraIII 限制性位點(diǎn)起始的質(zhì)體藍(lán)素調(diào)控區(qū)，以及3’端的終止密碼子和SacI位點(diǎn)。限制性位點(diǎn)用 下劃線標(biāo)出；ATG以粗體表示并用下劃線標(biāo)出。圖29顯示克隆體775的DraIII至SacI位點(diǎn)之間的序列——A/所羅門群島 3/2006 (HlNl)的核苷酸序列(SEQ ID NO :37)。所述編碼序列的側(cè)翼是在5，端以DraIII 限制性位點(diǎn)起始的質(zhì)體藍(lán)素調(diào)控區(qū)，以及3’端的終止密碼子和SacI位點(diǎn)。限制性位點(diǎn)用 下劃線標(biāo)出；ATG以粗體表示并用下劃線標(biāo)出。 圖30顯示克隆體776的DraIII至SacI位點(diǎn)之間的序列——A/布里斯班 10/2007 (HlNl)的核苷酸序列(SEQ ID NO :38)。所述編碼序列的側(cè)翼是在5，端以DraIII 限制性位點(diǎn)起始的質(zhì)體藍(lán)素調(diào)控區(qū)，以及3’端的終止密碼子和SacI位點(diǎn)。限制性位點(diǎn)用 下劃線標(biāo)出；ATG以粗體表示并用下劃線標(biāo)出。圖31顯示克隆體777的DraIII至SacI位點(diǎn)之間的序列——A/威斯康星 /67/2005 (H3N2)的核苷酸序列(SEQ ID NO :39)。所述編碼序列的側(cè)翼是在5，端以DraIII 限制性位點(diǎn)起始的質(zhì)體藍(lán)素調(diào)控區(qū)，以及3’端的終止密碼子和SacI位點(diǎn)。限制性位點(diǎn)用 下劃線標(biāo)出；ATG以粗體表示并用下劃線標(biāo)出。圖32顯示克隆體778的DraIII至SacI位點(diǎn)之間的序列——B/馬來西亞 /2506/2004的核苷酸序列(SEQ ID NO :40)。所述編碼序列的側(cè)翼是在5，端以DraIII限 制性位點(diǎn)起始的質(zhì)體藍(lán)素調(diào)控區(qū)，以及3’端的終止密碼子和SacI位點(diǎn)。限制性位點(diǎn)用下 劃線標(biāo)出；ATG以粗體表示并用下劃線標(biāo)出。圖33顯示克隆體779的DraIII至SacI位點(diǎn)之間的序列——B/佛羅里達(dá)/4/2006 的核苷酸序列(SEQ ID NO :41)。所述編碼序列的側(cè)翼是在5’端以DraIII限制性位點(diǎn)起始 的質(zhì)體藍(lán)素調(diào)控區(qū)，以及3’端的終止密碼子和SacI位點(diǎn)。限制性位點(diǎn)用下劃線標(biāo)出；ATG 以粗體表示并用下劃線標(biāo)出。
圖34顯示克隆體780的DraIII至SacI位點(diǎn)之間的序列——A/新加坡 /1/57 (H2N2)的核苷酸序列(SEQ ID NO :42)。所述編碼序列的側(cè)翼是在5，端以DraIII限 制性位點(diǎn)起始的質(zhì)體藍(lán)素調(diào)控區(qū)，以及3’端的終止密碼子和SacI位點(diǎn)。限制性位點(diǎn)用下 劃線標(biāo)出；ATG以粗體表示并用下劃線標(biāo)出。圖35顯示克隆體781的DraIII至SacI位點(diǎn)之間的序列——A/安徽 /1/2005 (H5N1)的核苷酸序列(SEQ ID NO :43)。所述編碼序列的側(cè)翼是在5，端以DraIII 限制性位點(diǎn)起始的質(zhì)體藍(lán)素調(diào)控區(qū)，以及3’端的終止密碼子和SacI位點(diǎn)。限制性位點(diǎn)用 下劃線標(biāo)出；ATG以粗體表示并用下劃線標(biāo)出。圖36顯示克隆體782的DraIII至SacI位點(diǎn)之間的序列——A/越南 /1194/2004(H5N1)的核苷酸序列(SEQ ID NO :44)。所述編碼序列的側(cè)翼是在5，端以 DraIII限制性位點(diǎn)起始的質(zhì)體藍(lán)素調(diào)控區(qū)，以及3’端的終止密碼子和SacI位點(diǎn)。限制性 位點(diǎn)用下劃線標(biāo)出；ATG以粗體表示并用下劃線標(biāo)出。圖37顯示克隆體783的DraIII至SacI位點(diǎn)之間的序列——A/水鴨/香港/ W312/97(H6N1)的核苷酸序列(SEQ ID NO :45)。所述編碼序列的側(cè)翼是在5，端以DraIII 限制性位點(diǎn)起始的質(zhì)體藍(lán)素調(diào)控區(qū)，以及3’端的終止密碼子和SacI位點(diǎn)。限制性位點(diǎn)用 下劃線標(biāo)出；ATG以粗體表示并用下劃線標(biāo)出。圖38顯示克隆體784的DraIII至SacI位點(diǎn)之間的序列——A/馬/布拉格 /56 (H7N7)的核苷酸序列(SEQ ID NO :46)。所述編碼序列的側(cè)翼是在5，端以DraIII限制 性位點(diǎn)起始的質(zhì)體藍(lán)素調(diào)控區(qū)，以及3’端的終止密碼子和SacI位點(diǎn)。限制性位點(diǎn)用下劃 線標(biāo)出；ATG以粗體表示并用下劃線標(biāo)出。圖39顯示克隆體785的DraIII至SacI位點(diǎn)之間的序列——A/香港 /1073/99 (H9N2)的核苷酸序列(SEQ ID NO :47)。所述編碼序列的側(cè)翼是在5，端以DraIII 限制性位點(diǎn)起始的質(zhì)體藍(lán)素調(diào)控區(qū)，以及3’端的終止密碼子和SacI位點(diǎn)。限制性位點(diǎn)用 下劃線標(biāo)出；ATG以粗體表示并用下劃線標(biāo)出。圖40A顯示由克隆體774 (A/布里斯班/59/2007 (HlNl))翻譯的多肽的氨基酸序 列(SEQ ID N0:48)?？寺◇w774的開放閱讀框從圖28中所示的ATG開始。圖40B顯示由 克隆體775 (A/所羅門群島3/2006 (HlNl))翻譯的多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO :49)。克 隆體775的開放閱讀框從圖29中所示的ATG開始。圖41A顯示由克隆體776 (A/布里斯班/10/2007 (H3N2))翻譯的多肽的氨基酸序 列(SEQ ID N0:50)?？寺◇w776的開放閱讀框從圖30中所示的ATG開始。圖41B顯示由 克隆體777 (A/威斯康星/67/2005 (H3N2))翻譯的多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO :51)?？?隆體777的開放閱讀框從圖31中所示的ATG開始。圖42A顯示由克隆體778 (B/馬來西亞/2506/2004)翻譯的多肽的氨基酸序列 (SEQ ID NO 52)?？寺◇w778的開放閱讀框從圖32中所示的ATG開始。圖42B顯示由克 隆體779 /佛羅里達(dá)/4//2006)翻譯的多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO :53)?？寺◇w779的 開放閱讀框從圖33中所示的ATG開始。圖43A顯示由克隆體780(A/新加坡/1/57(H2N2))翻譯的多肽的氨基酸序列(SEQ ID Ν0:54)?？寺◇w780的開放閱讀框從圖34中所示的ATG開始。圖43Β顯示由克隆體 781 (A/安徽/1/2005 (Η5Ν1))翻譯的多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO :55)?？寺◇w781的開放閱讀框從圖35中所示的ATG開始。圖44A顯示由克隆體782 (A/越南/1194/2004 (H5N1))翻譯的多肽的氨基酸序列 (SEQ ID N0:56)。克隆體782的開放閱讀框從圖36中所示的ATG開始。圖44B顯示由克 隆體783 (A/水鴨/香港/W312/97 (H6N1))翻譯的多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO :57)。克 隆體783的開放閱讀框從圖37中所示的ATG開始。圖45A顯示由克隆體784 (A/馬/布拉格/56(H7N7))翻譯的多肽的氨基酸序列 (SEQ ID N0:58)。克隆體784的開放閱讀框從圖38中所示的ATG開始。圖45B顯示由克隆 體785 (A/香港/1073/99 (H9N2))翻譯的多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO :59)?？寺◇w785 的開放閱讀框從圖39中所示的ATG開始。圖46顯示在體積排阻色譜之后對由植物生產(chǎn)的VLP的洗脫級分進(jìn)行免疫檢測 (Western印跡)。顯示了血凝素亞型HI、H2、H5、H6和H9。在級分7_14中檢出血凝素，其 對應(yīng)于VLP洗脫物。圖47顯示來自年度流行毒株的一系列Hl血凝素之表達(dá)的免疫印跡分析。將10 μ g 和20 μ g蛋白質(zhì)提取物分別加至泳道1和2中。圖48顯示來自潛在大流行毒株的一系列H5血凝素之表達(dá)的免疫印跡分析。將 10 μ g和20 μ g蛋白質(zhì)提取物分別加至泳道1和2中。圖49顯示來自利用AGL1/660農(nóng)桿菌滲入的煙草(Nicotianatabacum)葉之蛋白 質(zhì)提取物中A/印度尼西亞/5/2005毒株H5的免疫印跡。對兩株植物進(jìn)行滲入，并將10 μ g 和20 μ g來自各植物的可溶性蛋白質(zhì)分別加至泳道1和2中。圖50顯示血清抗體的體外交叉反應(yīng)性。用植物生產(chǎn)的流感病毒H5 VLP(A)第一 次免疫后14天以及⑶第二次加強(qiáng)后14天，雪貂血清中的血細(xì)胞凝集抑制(HI)效價(jià)。使 用下述失活H5W全病毒測量HAI抗體應(yīng)答-Al火雞/ 土耳其/1/05、A/越南/1194/04、Α/ 安徽/5/05以及同源株A/印度尼西亞/5/05。數(shù)值是每組中五只雪貂的終點(diǎn)效價(jià)倒數(shù)的 GMT (Iog2)。斜條紋一A/印度尼西亞/6/06 (進(jìn)化枝2. 1.3)；方格圖案一A/火雞/ 土耳其 /1/05(進(jìn)化枝2.2)；白柱一 A/越南/1194/04 (進(jìn)化枝1)；黑柱一 A/安徽/5/05。標(biāo)出了 響應(yīng)者。短線表示平均偏差。圖51顯示HA表達(dá)盒的核酸序列，其含有苜蓿質(zhì)體藍(lán)素啟動(dòng)子和5’ UTR、來自A/ 印度尼西亞/5/2005 (構(gòu)建體#660)的Η5的血凝素編碼序列、苜蓿質(zhì)體藍(lán)素3，UTR和終止 子序列。圖52顯示HA表達(dá)盒的核酸序列，其含有苜蓿質(zhì)體藍(lán)素啟動(dòng)子和5’ UTR、來自A/ 新喀里多尼亞/20/1999 (構(gòu)建體#540)的Hl的血凝素編碼序列、苜蓿質(zhì)體藍(lán)素3，UTR和終 止子序列。圖53顯示HA表達(dá)盒的核酸序列，其含有苜蓿質(zhì)體藍(lán)素啟動(dòng)子和5’ UTR、來自A/ 布里斯班/59/2007 (構(gòu)建體#774)的Hl的血凝素編碼序列、苜蓿質(zhì)體藍(lán)素3’ UTR和終止子 序列。圖54顯示HA表達(dá)盒的核酸序列，其含有苜蓿質(zhì)體藍(lán)素啟動(dòng)子和5’ UTR、來自A/ 所羅門群島/3/2006 (HlNl)(構(gòu)建體#775)的Hl的血凝素編碼序列、苜蓿質(zhì)體藍(lán)素3’ UTR 和終止子序列。圖55顯示HA表達(dá)盒的核酸序列，其含有苜蓿質(zhì)體藍(lán)素啟動(dòng)子和5’ UTR、來自A/新加坡/1/57 (H2N2)(構(gòu)建體#780)的H2的血凝素編碼序列、苜蓿質(zhì)體藍(lán)素3，UTR和終止 子序列。圖56顯示HA表達(dá)盒的核酸序列，其含有苜蓿質(zhì)體藍(lán)素啟動(dòng)子和5’ UTR、來自A/ 安徽/1/2005 (H5N1)(構(gòu)建體#781)的H5的血凝素編碼序列、苜蓿質(zhì)體藍(lán)素3，UTR和終止 子序列。圖57顯示HA表達(dá)盒的核酸序列，其含有苜蓿質(zhì)體藍(lán)素啟動(dòng)子和5’ UTR、來自A/ 越南/1194/2004 (H5N1)(構(gòu)建體#782)的H5的血凝素編碼序列、苜蓿質(zhì)體藍(lán)素3，UTR和終 止子序列。圖58顯示HA表達(dá)盒的核酸序列，其含有苜蓿質(zhì)體藍(lán)素啟動(dòng)子和5’ UTR、來自A/ 水鴨/香港/W312/97 (H6N1)(構(gòu)建體#783)的H6的血凝素編碼序列、苜蓿質(zhì)體藍(lán)素3，UTR 和終止子序列。圖59顯示HA表達(dá)盒的核酸序列，其含有苜蓿質(zhì)體藍(lán)素啟動(dòng)子和5’ UTR、來自A/ 香港/1073/99 (H9N2)(構(gòu)建體#785)的H9的血凝素編碼序列、苜蓿質(zhì)體藍(lán)素3，UTR和終止 子序列。圖60顯示HA表達(dá)盒的核酸序列，其含有苜蓿質(zhì)體藍(lán)素啟動(dòng)子和5，UTR、來自A/ 布里斯班/10/2007 (H3N2)的H3的血凝素編碼序列、苜蓿質(zhì)體藍(lán)素3，UTR和終止子序列。圖61顯示HA表達(dá)盒的核酸序列，其含有苜蓿質(zhì)體藍(lán)素啟動(dòng)子和5’ UTR、來自A/ 威斯康星/67/2005 (H3N2)的H3的血凝素編碼序列、苜蓿質(zhì)體藍(lán)素3，UTR和終止子序列。圖62顯示HA表達(dá)盒的核酸序列，其含有苜蓿質(zhì)體藍(lán)素啟動(dòng)子和5’ UTR、來自A/ 馬/布拉格/56(H7N7)的H7的血凝素編碼序列、苜蓿質(zhì)體藍(lán)素3’ UTR和終止子序列。圖63顯示HA表達(dá)盒的核酸序列，其含有苜蓿質(zhì)體藍(lán)素啟動(dòng)子和5’ UTR、來自B/ 馬來西亞/2506/2004的HA的血凝素編碼序列、苜蓿質(zhì)體藍(lán)素3，UTR和終止子序列。圖64顯示HA表達(dá)盒的核酸序列，其含有苜蓿質(zhì)體藍(lán)素啟動(dòng)子和5’ UTR、來自B/ 佛羅里達(dá)/4/2006的HA的血凝素編碼序列、苜蓿質(zhì)體藍(lán)素3’ UTR和終止子序列。圖65顯示A/新喀里多尼亞/20/99 (HlNl)(由SEQ ID NO :33編碼)、A/布里斯班 /59/2007 (HlNl) (SEQ ID NO 48)、A/ 所羅門群島 /3/2006 (HlNl) (SEQ ID NO 49)的 HA 和 SEQ ID NO 9的共有氨基酸序列(SEQ ID NO :74)。Xl (第3位)是A或V ;X2 (第52位) 是D或N;X3(第90位)是K或R;X4(第99位)是K或T;X5(第111位)是Y或H;X6(第 145位)是V或T ;X7 (第154位)是E或K ;X8 (第161位)是R或K ;X9 (第181位)是 V或A;X10(第203位)是D或N;X11(第205位)是R或K ;X12 (第210位)是T或K; X13 (第225位)是R或K ；X14 (第268位)是W或R ；X15 (第283位)是T或N ；X16 (第 290位)是E或K ；X17 (第432位)是I或L ；X18 (第489位)是N或D。圖66顯示由SEQ ID NO :33編碼的Hl (新喀里多尼亞)(AAP34324. 1)的氨基酸序 列。圖67顯示由SEQ ID NO :35編碼的Hl (波多黎各)(NC_0409878. 1)的氨基酸序 列。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及病毒樣顆粒的生產(chǎn)。更具體而言，本發(fā)明涉及含有流感病毒抗原的病 毒樣顆粒的生產(chǎn)。
下面的描述是優(yōu)選的實(shí)施方案。本發(fā)明提供了含有編碼來自包膜病毒的抗原(例如流感血凝素(HA))之核苷酸序 列的核酸，其與在植物中有活性的調(diào)控區(qū)有效連接。此外，本發(fā)明提供了在植物中生產(chǎn)病毒樣顆粒(VLP)的方法。所述方法包括將編 碼抗原并與在植物中有活性之調(diào)控區(qū)有效連接的核酸導(dǎo)入所述植物或其部分中，以及在允 許所述核酸表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述植物或其部分，從而產(chǎn)生VLP。VLP可由流感病毒制得，然而，VLP還可由其它質(zhì)膜來源的病毒制得，包括但不限 于麻疹病毒、埃博拉病毒、馬爾堡病毒和HIV。本發(fā)明包括可感染人的所有類型流感病毒的VLP，包括例如但不限于非常流行的 A型(HlNl)亞型(例如A/新喀里多尼亞/20/99 (HlNl) )、A/印度尼西亞/5/05亞型(H5N1) (SEQ ID NO 60)以及較不常見的 B 型(例如 SEQ ID NO :26，圖 100)、C 型(SEQ ID NO :27， 圖10P)以及從其它流感病毒亞型得到的HA。本發(fā)明中其它流感病毒亞型的VLP還包括例 如 A/布里斯班/59/2007 (Hmi ;SEQ ID NO :48)、A/所羅門群島/3/2006 (H1N1 ;SEQ ID NO: 49)、A/ 新加坡 /1/57 (H2N2 ；SEQ ID NO 54)、A/ 安徽 /1/2005 (H5N1 ；SEQ ID NO 55)、A/ 越 南/1194/2004 (H5N1 ；SEQ ID NO :56)、A/水鴨 / 香港/W312/97 (H6N1 ；SEQID N0:57)、A/香 港/1073/99 (H9N2 ；SEQ ID NO 59)、A/ 布里斯班/10/2007 (H3N2 ；SEQ ID NO 50)、A/ 威斯 康星 /67/2005 (H3N2 ；SEQ IDNO :51)、A/ 馬 / 布拉格 /56 (H7N7 ；SEQ ID NO 58)、B/ 馬來西 亞/2506/2004 (SEQ ID NO 52)或 B/佛羅里達(dá)/4/2006 (SEQ ID NO :53)。本發(fā)明還涉及感染其它哺乳動(dòng)物或宿主動(dòng)物的流感病毒，所述哺乳動(dòng)物或宿主動(dòng) 物為例如人、靈長類、馬、豬、鳥類、禽類、水禽、候鳥、鵪鶉、鴨、鵝、家禽、雞、駱駝、犬科動(dòng)物、 狗、貓科動(dòng)物、貓、虎、豹、麝貓、水貂、石貂、雪貂、寵物、家畜、小鼠、大鼠、海豹、鯨等?？稍谫|(zhì)膜來源的病毒中表達(dá)的其它抗原的非限制性實(shí)例包括HIV的衣殼蛋白 P24 ；包膜蛋白gpl20、gp41 ；結(jié)構(gòu)蛋白VP30和VP35 ；絲狀病毒(例如埃博拉病毒或馬爾堡 病毒)的Gp/SGP(糖基化內(nèi)膜蛋白)，或副粘病毒(例如麻疹病毒)的H蛋白以及F蛋白。本發(fā)明還包括但不限于從細(xì)胞質(zhì)膜獲得脂質(zhì)包膜的流感病毒來源的VLP，所述 VLP蛋白在所述細(xì)胞中表達(dá)。例如，如果VLP在基于植物的系統(tǒng)中表達(dá)，那么VLP可從該細(xì) 胞的質(zhì)膜獲得脂質(zhì)包膜。一般而言，術(shù)語“脂質(zhì)”是指脂溶性的(親脂性的)天然分子。更具體地，該術(shù)語 還用于指脂肪酸及其衍生物(包括甘油三酯、甘油二酯和甘油單酯以及磷脂)以及其它脂 溶性的含固醇的代謝物或固醇類。磷脂連同糖脂、固醇和蛋白質(zhì)是所有生物膜的主要組分。 磷脂的實(shí)例包括磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿、磷脂酰肌醇、磷脂酰絲氨酸等。固醇的實(shí)例包 括動(dòng)物固醇(例如膽固醇)和植物固醇。已經(jīng)在多種植物中鑒定了超過200種的植物固醇， 最常見的有菜油固醇、豆固醇、麥角固醇、菜子固醇、Δ-7-豆固醇、Δ-7-燕麥固醇、胡蘿卜 固醇(daunosterol)、谷固醇、24-甲基膽固醇、膽固醇或β-谷固醇。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng) 理解，細(xì)胞質(zhì)膜的脂質(zhì)組成可隨細(xì)胞或獲得細(xì)胞之生物體的培養(yǎng)或生長條件而變化。細(xì)胞膜通常包含脂雙層以及各種功能的蛋白質(zhì)。在脂雙層中可發(fā)現(xiàn)局部濃縮的特 定脂質(zhì)，稱為“脂質(zhì)筏”。不希望受理論限制，脂質(zhì)筏可在內(nèi)吞和胞吐作用、病毒或其它感染 原的進(jìn)入或逸出、細(xì)胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、與細(xì)胞或生物體的其它結(jié)構(gòu)組分(例如細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞 外基質(zhì))相互作用中起重要作用。
針對流感病毒，本文所用的術(shù)語“血凝素”或“HA”是指存在于流感病毒顆粒外部 的糖蛋白。HA是同三聚體I型膜糖蛋白，通常含有信號肽、HAl結(jié)構(gòu)域和HA2結(jié)構(gòu)域，所述 HA2結(jié)構(gòu)域含有C端的跨膜錨定位點(diǎn)以及小的胞質(zhì)尾(圖1B)。編碼HA的核苷酸序列是 公知的并且是可用的，參見例如BioDefence Public Health base (流感病毒；參見URL biohealthbase. org)或美國國立生物技術(shù)信息中心(參見URL :ncbi. nlm. nih. gov)，其均 通過引用并入本文。術(shù)語“同三聚體”或“同三聚體的”表示寡聚體由三個(gè)HA蛋白分子形成。不希望受 理論限制，HA蛋白是作為約75kDa的單體前體蛋白(HAO)合成的，其在表面處組裝成長形 的三聚體蛋白。在三聚化發(fā)生之前，前體蛋白在保守的活化切割位點(diǎn)(也稱為“融合肽”) 處被切割成2條通過二硫鍵連接的多肽鏈——HAl和HA2 (包含跨膜區(qū))。HAl區(qū)段的長度 可以為328個(gè)氨基酸，HA2區(qū)段的長度可以為221個(gè)氨基酸。盡管該切割對于病毒感染性 可以是重要的，但是其對于蛋白質(zhì)三聚化卻不是必需的。HA插入宿主細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)膜 內(nèi)，信號肽切割和蛋白質(zhì)糖基化是共翻譯事件。正確的HA重折疊需要蛋白質(zhì)糖基化以及形 成6個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵。HA三聚體在順式-和反式-高爾基體復(fù)合物內(nèi)組裝，跨膜結(jié)構(gòu)域在三 聚化加工中起作用。經(jīng)菠蘿蛋白酶處理的HA蛋白(缺少跨膜結(jié)構(gòu)域)的晶體結(jié)構(gòu)顯示在 流感毒株之間具有高度保守的結(jié)構(gòu)。還已明確，HA在感染過程中發(fā)生重大的構(gòu)象變化，這 需要將前體HAO切割成2條多肽鏈(HAl和HA2)。HA蛋白可被加工(即包含HAl和HA2結(jié) 構(gòu)域)，或者可以不進(jìn)行加工(即包含HAO結(jié)構(gòu)域)。本發(fā)明涉及包含跨膜結(jié)構(gòu)域并包含HAl和HA2結(jié)構(gòu)域的HA蛋白的用途，例如所述 HA蛋白可以是ΗΑ0，或是包含HAl和HA2的經(jīng)加工HA。所述HA蛋白可用于利用植物、植物 細(xì)胞或表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)或形成VLP。本發(fā)明的HA可得自任意亞型。例如，HA可以是H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、 H10、H11、H12、H13、H14、H15或H16亞型。本發(fā)明的重組HA還可包含基于本領(lǐng)域公知的任 意血凝素序列的氨基酸序列——參見例如BioDefence Public Health base(流感病毒；參 見URL :biohealthbase. org)或者美國國立生物技術(shù)信息中心(參見URL :ncbi. nlm. nih. gov)。此外，HA可基于從一種或多種新發(fā)現(xiàn)的或新鑒定出的流感病毒中分離出的血凝素的 序列。本發(fā)明還包括VLP，其包含得自一種或多種流感病毒亞型的HA。例如，VLP可包含 來自以下亞型的一種或多種HA :H1 (由SEQ IDN0:28編碼)、H2(由SEQ ID而12編碼)、 H3 (由 SEQ ID NO 13 編碼)、H4 (由 SEQ ID NO 14 編碼)、H5 (由 SEQ ID NO 15 編碼)、 H6(由 SEQ ID N0:16 編碼)、H7(由 SEQ ID NO :11 編碼)、H8 (由 SEQ ID N0:17 編碼)、 H9(由 SEQ ID NO 18 編碼)、H10(由 SEQ IDNO :19 編碼)、H11(由 SEQ ID NO 20 編碼)、 H12 (由 SEQ ID NO 21 編碼)、H13 (由 SEQ ID NO 27 編碼)、H14 (由 SEQ ID NO 23 編碼)、 H15(由SEQ ID NO :24編碼)、H16(由SEQ ID NO :25編碼)或其組合。來自一種或多種流 感病毒亞型的一種或多種HA可以在植物或昆蟲細(xì)胞內(nèi)共表達(dá)，以確保所述一種或多種HA 的合成導(dǎo)致形成含有得自一種或多種流感病毒亞型之HA組合的VLP。對HA之組合的選擇 可通過由VLP制得之疫苗的目的用途來確定。例如，用于接種鳥類的疫苗可包含HA亞型的 任意組合，而用于接種人的VLP可包含一種或多種H1、H2、H3、H5、H7、H9、H10、N1、N2、N3和 N7亞型。然而，也可根據(jù)接種用途來制備其它HA亞型的組合。
因此，本發(fā)明涉及含有一種或多種HA亞型的VLP。本發(fā)明還提供了編碼血凝素的核酸，當(dāng)其在植物中表達(dá)時(shí)形成VLP。流感病毒HA蛋白在分子量、等電點(diǎn)、大小、聚糖成分等方面表現(xiàn)出一系列相似之處和不同之處。各種血凝素的物理化學(xué)性質(zhì)可用于區(qū)分在植物、昆蟲細(xì)胞或酵母系統(tǒng)中表 達(dá)的HA，并且當(dāng)多于一種HA在單一系統(tǒng)中共表達(dá)時(shí)其可具有特殊用途。所述物理化學(xué)性質(zhì) 的實(shí)例示于表1中。
核苷酸序列；在嚴(yán)格的雜交條件下與SEQ ID NO 28, SEQ ID NO :3、SEQ ID NO 1互補(bǔ)序列雜交的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列編碼當(dāng)表達(dá)時(shí)形成VLP的血凝素蛋白，并且當(dāng)施 用給對象時(shí)所述VLP誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生。例如，所述核苷酸序列在植物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)形成VLP，所 述VLP可用于產(chǎn)生能結(jié)合HA (包括一種或多種流感病毒類型或亞型的成熟HA、HAO、HAl或 HA2)的抗體。當(dāng)施用給對象時(shí)，所述VLP誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。在嚴(yán)格雜交條件下雜交是本領(lǐng)域公知的(參見例如CurrentProtocols in Molecular Biology, Ausubel 等編，1995 及增干Ij ；Maniatis 等，Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring HarborLaboratory, 1982 ；Sambrook 禾口 Russell, Molecular Cloning =ALaboratory Manual，第3版，2001 ；所有這些均通過引用并入本文)。 所述嚴(yán)格雜交條件的一個(gè)實(shí)例可以是在65°C下于4XSSC中雜交約16 20小時(shí)，然后在 65°C下于0. IXSSC中清洗1小時(shí)，或在65°C下于0. IXSSC中清洗兩次(每次20或30分 鐘)?；蛘?，一個(gè)示例性的嚴(yán)格雜交條件可以是在42°C下于50%甲酰胺、4XSSC中過夜 (16 20小時(shí))，然后在65°C下于0. IXSSC中清洗1小時(shí)，或在65°C下于0. IXSSC中清 洗2次(每次20或30分鐘或者過夜(16 20小時(shí)))，或者在65°C下于Church水性磷酸 鹽緩沖液(7% SDS ；0. 5M NaPO4 緩沖液 pH 7. 2 ；IOmM EDTA)中雜交，在 50°C下于 0. IX SSC, 0. 1% SDS中清洗2次(每次20或30分鐘)，或者在65°C下于2XSSC、0. 1% SDS中清洗2 次(每次20或30分鐘)。另外，本發(fā)明包括核苷酸序列，其特征在于與編碼Hl (SEQ IDNO :28)、H5 (SEQ ID N0:3)或H7(SEQ ID NO :11)之 HA 的核苷酸序列具有約 70%、75%、80%、85%、87%、90%、 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100% 或其間任意量的序列同一性或 序列相似性，其中所述核苷酸序列編碼當(dāng)表達(dá)時(shí)形成VLP的血凝素蛋白，并且所述VLP誘導(dǎo) 抗體產(chǎn)生。例如，所述核苷酸序列在植物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)形成VLP，所述VLP可用于產(chǎn)生能結(jié)合 HA (包括成熟HA、HA0、HA1或HA2)的抗體。當(dāng)施用給對象時(shí)，所述VLP誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。類似地，本發(fā)明包括與下述亞型相關(guān)的HA :H1 (由SEQ ID NO :28編碼)、H2 (由 SEQ ID NO 12 編碼)、H3 (由 SEQ ID NO 13 編碼)、H4 (由 SEQ ID NO 14 編碼)、H5 (由 SEQ ID NO 15 編碼)、H6(由 SEQ IDNO :16 編碼)、H7(由 SEQ ID NO 11 編碼)、H8 (由 SEQ ID NO 17 編碼)、H9(由 SEQ ID NO :18 編碼)、H10(由 SEQ ID NO 19 編碼)、H11(由 SEQ ID NO 20 編碼)、H12 (由 SEQ ID NO 21 編碼)、H13 (由 SEQ IDNO 27 編碼)、H14 (由 SEQ ID NO 23 編碼)、H15(由 SEQ ID NO :24 編碼)、H16(由 SEQ ID NO 25 編碼)，參見圖 10A 至 10P，以及特征在于與 Hl (SEQ ID NO :28)、H2 (SEQ ID NO :12)、H3 (SEQ ID NO 13)、H4 (SEQ ID NO :14)、H5(SEQ ID NO 15)、H6 (SEQ ID NO 16)、H7 (SEQ ID NO :11)、H8 (SEQ ID NO: 17)、H9(SEQ ID NO 18)、HlO (SEQ ID NO : 19)、Hll (SEQ ID NO :20)、H12 (SEQ ID NO :21)、 H13(SEQ ID NO :27)、H14(SEQ ID NO :23)、Hl5 (SEQ ID NO :24)、H16 (SEQ ID NO :25)具有約 70 100%或其中任意量、80 100%或其中任意量、90 100%或其中任意量或者95 100%或其中任意量的序列同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列編碼當(dāng)表達(dá)時(shí)形成 VLP的血凝素蛋白，并且所述VLP誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生。例如，所述核苷酸序列在植物細(xì)胞內(nèi)表達(dá) 形成VLP，所述VLP可用于產(chǎn)生能結(jié)合HA (包括成熟HA、HA0、HA1或HA2)的抗體。當(dāng)施用 給對象時(shí)，所述VLP誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。“免疫應(yīng)答”一般是指獲得性免疫系統(tǒng)的應(yīng)答。所述獲得性免疫系統(tǒng)通常包括體液應(yīng)答和細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答。體液應(yīng)答是由B淋巴細(xì)胞譜系的細(xì)胞(B細(xì)胞)中產(chǎn)生的分泌型 抗體所介導(dǎo)的免疫方面。分泌型抗體結(jié)合入侵微生物(例如病毒或細(xì)菌)表面上的抗原， 標(biāo)示它們以進(jìn)行破壞。體液免疫一般用于指抗體產(chǎn)生和伴隨抗體產(chǎn)生的過程，以及抗體的 效應(yīng)器功能，包括Th2細(xì)胞活化和細(xì)胞因子產(chǎn)生、記憶細(xì)胞形成、調(diào)理素促進(jìn)吞噬作用、病 原體清除等。術(shù)語“調(diào)節(jié)”等指根據(jù)通常知曉或使用的任意幾種測定方法(其中一些在本 文中舉例說明)測定的特定應(yīng)答或參數(shù)的升高或降低。 細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答是這樣的免疫應(yīng)答，其不涉及抗體，而涉及巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì) 胞(NK)、抗原特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的活化，以及多種細(xì)胞因子響應(yīng)于抗原而釋放。細(xì) 胞介導(dǎo)的免疫一般用于指某些Th細(xì)胞的活化、Tc細(xì)胞的活化以及T細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答。細(xì) 胞介導(dǎo)的免疫在響應(yīng)于病毒感染中尤為重要。例如，可使用ELISP0T測定來測量對抗原特異性CD8+T淋巴細(xì)胞的誘導(dǎo)；可使用增 殖測定來測量對CD4+T淋巴細(xì)胞的刺激?？墒褂肊LISA測定來定量抗流感病毒抗體的效價(jià)； 還可使用抗同種型抗體的抗體(例如抗IgG的抗體、抗IgA的抗體、抗IgE的抗體或抗IgM 的抗體)來測量抗原特異性或交叉反應(yīng)性抗體的同種型。實(shí)施這些測定的方法和技術(shù)是本 領(lǐng)域中熟知的。血細(xì)胞凝集抑制(HI或HAI)測定也可用于證明由疫苗或疫苗組合物所誘導(dǎo)的抗 體效力可抑制由重組HA所致的血紅細(xì)胞(RBC)凝集。血清樣品的血細(xì)胞凝集抑制性抗體 效價(jià)可利用微量滴定HAI來評估(Aymard等，1973)?？墒褂脕碜匀我鈳讉€(gè)物種的紅細(xì)胞， 例如馬、火雞、雞等。該測定給出有關(guān)HA三聚體在VLP表面上組裝的間接信息，證實(shí)了 HA 抗原位點(diǎn)的正確展示。交叉反應(yīng)性HAI滴定還可用于證明免疫應(yīng)答對與疫苗亞型相關(guān)的其它病毒株的 效力。例如，來自用第一毒株的疫苗組合物(例如A/印度尼西亞5/05的VLP)免疫之對象 的血清可用于利用第二株全病毒或病毒顆粒(例如A/越南/1194/2004)的HAI測定中，并 且可測定HAI效價(jià)。還可對細(xì)胞因子的存在或水平進(jìn)行定量。例如，利用ELISA (例如BD Biosciences OptEIA試劑盒)測量IFN- γ和IL-4分泌細(xì)胞來表征T輔助細(xì)胞應(yīng)答(Thl/Th2)。可培養(yǎng)從 對象得到的外周血單核細(xì)胞(PBMC)或脾細(xì)胞，并分析上清。還可使用標(biāo)志物特異性熒光標(biāo) 記和本領(lǐng)域公知的方法通過熒光激活細(xì)胞分選(fluorescence-activated cellsorting， FACS)對T淋巴細(xì)胞定量。還可進(jìn)行微量中和測定來表征對象中的免疫應(yīng)答，參見例如Rowe等，1973的方 法?？赏ㄟ^幾種方法得到病毒中和效價(jià)，包括1)在對細(xì)胞進(jìn)行結(jié)晶紫固定/著色之后，計(jì) 數(shù)裂解斑(空斑測定)；2)顯微鏡觀察培養(yǎng)物中的細(xì)胞裂解；3)對NP病毒蛋白(與病毒感 染宿主細(xì)胞有關(guān))進(jìn)行ELISA和分光光度檢測。序列同一性或序列相似性可利用核苷酸序列比較程序來確定，例如DNASIS所提 供的(例如，使用但不限于下述參數(shù)空隙罰分5、頂部對角線編號(# of top diagonal) 5, 固定的空隙罰分10、k元祖2、游隙10，窗口大小5)。然而，其它用于比較的序列比對方法是 本領(lǐng)域熟知的，例如 Smith & Waterman 算法(1981，Adv. Appl. Math. 2 482)、Needleman & Wunsch (J. Mol. Biol. 48 443,1970)胃夕去、Pearson &Lipm￡in (1988，Proc. Nat’ 1. Acad. Sci. USA 85 2444)算法，以及這些算法的計(jì)算機(jī)化執(zhí)行(例如GAP、BESTFIT、FASTA和BLAST)或者人工比對和目視檢查。術(shù)語“血凝素結(jié)構(gòu)域”是指含有HAO結(jié)構(gòu)域或者HAl及HA2結(jié)構(gòu)域的肽。所述血凝素結(jié)構(gòu)域不包含天然蛋白質(zhì)中存在的信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)域或胞質(zhì)尾。術(shù)語“病毒樣顆粒(VLP) ”是指自組裝并且含有結(jié)構(gòu)蛋白(例如流感病毒HA蛋白) 的結(jié)構(gòu)。VLP通常在形態(tài)上和抗原性上與感染中產(chǎn)生的病毒體相似，但是缺少足以進(jìn)行復(fù)制 的遺傳信息，因此是不具有感染性的。在一些實(shí)例中，VLP可含有一種蛋白質(zhì)或多于一種蛋 白質(zhì)。對于含有多于一種蛋白質(zhì)的VLP而言，所述蛋白質(zhì)種類可來自同種病毒，或者可包含 來自不同種、屬、亞科或科之病毒的蛋白質(zhì)(如ICTV命名法所指定)。在另一些實(shí)例中，可 對VLP包含的一種或多種蛋白質(zhì)的天然序列進(jìn)行修飾。VLP可以在合適的宿主細(xì)胞(包括 植物和昆蟲宿主細(xì)胞)中產(chǎn)生。在從宿主細(xì)胞中提取、分離以及在合適條件下進(jìn)一步純化 之后，VLP可作為完整結(jié)構(gòu)被純化。根據(jù)本發(fā)明，由流感來源的蛋白質(zhì)產(chǎn)生的VLP不含有Ml蛋白。已知Ml蛋白結(jié)合 RNA(Wakefield和Brownlee，1989)，RNA是VLP制備物中的污染物。當(dāng)獲得VLP產(chǎn)品的監(jiān) 管部門審批時(shí)，不期望存在RNA，因此不含RNA的VLP制備物可以是有利的。本發(fā)明的VLP可以在特征在于缺少使蛋白質(zhì)唾液酸化之能力(例如不含唾液酸 酶)的宿主細(xì)胞中產(chǎn)生，所述宿主細(xì)胞例如植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、真菌和其它生物(包括海 綿動(dòng)物、腔腸動(dòng)物、環(huán)節(jié)動(dòng)物、節(jié)肢動(dòng)物、軟體動(dòng)物、線形動(dòng)物(nemathelminthea)、擔(dān)輪動(dòng)物 (trochelmintes)、扁形動(dòng)物、毛顎動(dòng)物、觸手動(dòng)物、衣原體、螺旋體、革蘭氏陽性細(xì)菌、藍(lán)細(xì) 菌、古細(xì)菌，如 glycoforum 中所鑒定的(參見例如 URL :glycoforum. gr. jp/science/word/ evolution/ES-A03E. html) 0如本文所述生產(chǎn)的VLP通常不含有神經(jīng)氨酸酶(NA)。然而，如 果需要包含HA和NA的VLP，可以將NA與HA共表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明的一些方面，在植物中生產(chǎn)的VLP可與植物來源的脂質(zhì)復(fù)合。所述VLP 可包含HA0、HA1或HA2肽。所述植物來源的脂質(zhì)可以是脂雙層形式，并且還可包含圍繞VLP 的包膜。所述植物來源的脂質(zhì)可包含產(chǎn)生VLP之植物的質(zhì)膜脂質(zhì)組分，包括但不限于磷脂 酰膽堿(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、鞘糖脂、植物固醇或其組合。植物來源的脂質(zhì)還可稱為 “植物脂質(zhì)”。植物固醇的實(shí)例是本領(lǐng)域公知的，包括例如豆固醇、谷固醇、24-甲基膽固醇和 膽固醇，參見例如Mongrand等，2004?？赏ㄟ^例如血細(xì)胞凝集測定、電子顯微鏡或體積排阻色譜來評估VLP的結(jié)構(gòu)和大 小。對于體積排阻色譜而言，可通過以下方法從植物組織中提取全部可溶性蛋白質(zhì) 將冷凍粉碎的植物材料樣品在提取緩沖液中勻漿(Polytron)，并通過離心除去不溶性的物 質(zhì)。利用PEG沉淀也可以是有益的。對可溶性蛋白質(zhì)定量，并將提取物通過S印hacryl 柱。 BlueDextran 2000可用作校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)施色譜之后，可通過免疫印跡進(jìn)一步分析級分以確 定所述級分中蛋白質(zhì)成分。不希望受理論限制，HA結(jié)合來自不同動(dòng)物之RBC的能力是由HA對唾液酸α 2，3 或α 2，3的親和力以及RBC表面上存在這些唾液酸來驅(qū)動(dòng)的。馬和鳥的流感病毒HA使來 自所有幾個(gè)物種(包括火雞、雞、鴨、豚鼠、人、綿羊、馬和牛)的紅細(xì)胞凝集；而人HA將結(jié)合 火雞、雞、鴨、豚鼠、人和綿羊的紅細(xì)胞(還參見Ito Τ.等，1997，Virology，卷227,493-499 頁；以及Medeiros R等，2001，Virology，卷289，74-85頁)。不同流感株的HA的物種反應(yīng)性實(shí)例顯示在表2A和2B中。表2A 所選的季節(jié)性流感株之HA所結(jié)合RBC的物種 表2Β 所選的大流行流感株之HA所結(jié)合RBC的物種 本文所用的“蛋白質(zhì)” 一般是指通過肽鍵連接的氨基酸鏈，其可折疊成二級、三級 或四級結(jié)構(gòu)以獲得特定的形態(tài)?；蛘?，術(shù)語“多肽”、“肽”或“肽片段”可用在相似的語境中。蛋白質(zhì)、融合蛋白或多肽的片段或部分包括含有特定蛋白質(zhì)或多肽之一部分氨基 酸組成的肽或多肽，前提是當(dāng)表達(dá)時(shí)所述片段可形成VLP。所述片段可以例如包含抗原區(qū) 域、應(yīng)激應(yīng)答誘導(dǎo)區(qū)域或含有該蛋白質(zhì)或多肽之功能結(jié)構(gòu)域的區(qū)域。所述片段還可包含同 一家族的蛋白質(zhì)共有的區(qū)域或結(jié)構(gòu)域，或者所述片段可包含足以特異性鑒別其來源的全長 蛋白質(zhì)的氨基酸序列。例如，片段或部分可包含蛋白質(zhì)全長的約60%至約100%或其間任意量，前提是 當(dāng)表達(dá)時(shí)該片段可形成VLP。例如，蛋白質(zhì)全長的約60%至約100%、約70%至約100%、約 80%至約100%、約90%至約100%、約95%至約100%，或其間任意量?；蛘?，片段或部分 可以取決于HA為約150至約500個(gè)氨基酸或其間任意量，前提是當(dāng)表達(dá)時(shí)所述片段可形成 VLP。例如，片段或部分可以取決于HA為約150至約500個(gè)氨基酸或其間任意量、約200至 約500個(gè)氨基酸或其間任意量、約250至約500個(gè)氨基酸或其間任意量、約300至約500個(gè)氨基酸或其間任意量、約350至約500個(gè)氨基酸或其間任意量、約400至約500個(gè)氨基酸或 其間任意量、約450至約500個(gè)氨基酸或其間任意量，前提是當(dāng)表達(dá)時(shí)所述片段可形成VLP。 例如，可從HA蛋白的C端、N端或者N和C端去除約5、10、20、30、40或50個(gè)氨基酸或其間 任意量，前提是當(dāng)表達(dá)時(shí)所述片段可形成VLP。任意給 定序列中的氨基酸編號是相對于該特定序列而言的，然而，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可根據(jù)結(jié)構(gòu)和/或序列容易地確定序列中特定氨基酸的“等同性”。例如，如果當(dāng)為了結(jié) 晶而構(gòu)建克隆時(shí)去除了 6個(gè)N端氨基酸，那么這將改變氨基酸的具體編碼標(biāo)識(例如，相對 于蛋白質(zhì)全長而言)，但是不會改變氨基酸在所述結(jié)構(gòu)中的相對位置?？墒褂肂LAST 算法(Altschul 等，1990，J. Mol Biol 215 :403_410)進(jìn)行序列比 較。BLAST檢索允許將查詢序列與特定的序列或序列組進(jìn)行比較，或者與較大的序列文庫或 數(shù)據(jù)庫(例如GenBank或GenP印t)進(jìn)行比較，并且不但鑒定具有100%同一性的序列，還 鑒定同一性程度較低的序列?？墒褂肂LAST算法比較核酸或氨基酸序列。此外，兩個(gè)或更 多個(gè)序列之間的同一性可通過將序列一起比對并測定序列間的同一性百分比來確定?？墒?用 BLAST 算法(例如可利用 GenBank，URL :ncbi. nlm. nih. gov/cgi-bin/BLAST/，使用默認(rèn) 的參數(shù)程序blastn ；數(shù)據(jù)庫nr ；期望值10 ；過濾默認(rèn)；比對成對比對；查詢序列的遺 傳密碼標(biāo)準(zhǔn)(1)；或者通過 EMBL (URL :embl-heidelberg. de/Services/index. html)利用 BLAST2，使用默認(rèn)的參數(shù)=Matrix BLOSUM 62 ；過濾默認(rèn)；回聲過濾(echofilter)打開； 期望值10 ；臨界值默認(rèn)；鏈兩者；描述50 ；比對50 ；或利用FASTA，使用默認(rèn)的參數(shù)) 或人工比較序列進(jìn)行比對并計(jì)算同一性百分比。本發(fā)明描述了(但不限于)將編碼HA的核酸克隆到植物表達(dá)載體中，并從適于 生產(chǎn)疫苗的植物中生產(chǎn)流感病毒VLP。所述核酸的實(shí)例包括例如但不限于流感病毒A/新 喀里多尼亞Λ0/99 (HlNl)病毒HA (例如SEQ ID NO :61)、來自A/印度尼西亞/5/05亞型 (H5N1)的 HA (例如 SEQID NO 60)、來自 A/ 布里斯班 /59/2007 (HlNl)的 HA (例如 SEQ ID 而36、48、62)、來自六/所羅門群島/3/2006 011附)的HA(例如SEQ ID NO :37、49、63)、來自 A/新加坡/1/57(H2N2)的 HA (例如 SEQ ID NO :42、54、64)、來自 A/安徽/1/2005 (Η5Ν1)的 HA(例如 SEQ ID NO :43、55、65)、來自 A/越南/1194/2004 (H5m)的 HA(例如 SEQ ID NO: 44、56、66)、來自六/水鴨/香港/1312/97 016附)的 HA (例如 SEQ ID NO :45、57、67)、來自 A/ 香港/1073/99 (H9N2)的 HA (例如 SEQ ID NO :47、59、68)、來自 A/布里斯班/10/2007 (H3N2) 的 HA(例如 SEQ ID NO :38、50、69)、來自 A/威斯康星/67/2005(H3N2)的 HA(例如 SEQ ID NO :39、51、70)、來自六/馬/布拉格/56 017町)的 HA(例如 SEQ ID NO :46、58、71)、來自 B/馬 來西亞 /2506/2004 的 HA (例如 SEQ ID NO :40、52、72)、來自 B/ 佛羅里達(dá) /4/2006 的 HA (例 如SEQ ID N0:41、53、73)。這些毒株的對應(yīng)克隆或構(gòu)建體編號提供在表1中。對應(yīng)于SEQ ID NO 36-47的核酸序列包含質(zhì)體藍(lán)素啟動(dòng)子，其位于每個(gè)類型或亞型HA編碼序列的上游 并與其有效連接，如圖28-39所示。對應(yīng)于SEQ ID NO 60-73的核酸序列包含HA表達(dá)盒， 其含有苜蓿質(zhì)體藍(lán)素啟動(dòng)子和5’ UTR、HA的血凝素編碼序列、苜蓿質(zhì)體藍(lán)素3’ UTR和終止 子序列，如圖51-64所示。所述VLP還可用于生產(chǎn)由重組流感病毒結(jié)構(gòu)蛋白組成的試劑，其在經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主 細(xì)胞(例如植物細(xì)胞或昆蟲細(xì)胞)中自組裝成功能性和免疫原性的同型大分子蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu) (包括流感亞病毒顆粒和流感病毒VLP)。
因此，本發(fā)明提供了 VLP以及通過表達(dá)單一包膜蛋白在植物表達(dá)系統(tǒng)中生產(chǎn)病毒VLP的方法。所述VLP可以是流感病毒VLP，或者是由其它質(zhì)膜來源的病毒(包括但不限于 麻疹病毒、埃博拉病毒、馬爾堡病毒和HIV)產(chǎn)生的VLP。還可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的來自其它包膜病毒的蛋白質(zhì)，所述包膜病毒例如 但不限于絲狀病毒科(例如埃博拉病毒、馬爾堡病毒等)、副粘病毒科(例如麻疹病毒、 腮腺炎病毒、呼吸道合胞病毒、肺病毒等)、逆轉(zhuǎn)錄病毒科(例如人類免疫缺陷病毒-1、人 類免疫缺陷病毒_2、人T細(xì)胞白血病病毒-1等)、黃病毒科(例如西尼羅河腦炎、登革病 毒、丙型肝炎病毒、黃熱病毒等)、布尼病毒科(例如漢坦病毒等)、冠狀病毒科(例如冠 狀病毒、SARS等)?？稍谫|(zhì)膜來源的病毒中表達(dá)之抗原的非限制性實(shí)例包括HIV衣殼蛋 白p24 ；HIV糖蛋白gpl20或gp41 ；絲狀病毒蛋白質(zhì)，包括埃博拉病毒的VP30或VP35，或馬 爾堡病毒的Gp/SGP，或麻疹副粘病毒的H蛋白或F蛋白。例如，HIV的P24(例如GenBank 編號gi :19172948)是對HIV病毒基因組gag序列(例如GenBank編號gi =9629357)進(jìn) 行翻譯和切割而得到的蛋白質(zhì)；HIV的gpl20和gp41是對由HIV病毒基因組的env編碼 的gpl60蛋白(例如GenBank編號gi =9629363)進(jìn)行翻譯和切割而得到的糖蛋白。埃博 拉病毒的VP30(GenP印t編號gi =55770813)是對埃博拉病毒基因組的vp30序列(例如 GenBank編號gi =55770807)進(jìn)行翻譯而得到的蛋白質(zhì)；埃博拉病毒的VP35 (GenP印t編 號gi =55770809)是對埃博拉病毒基因組的vp35序列進(jìn)行翻譯而得到的蛋白質(zhì)。馬爾堡 病毒的Gp/SGP (GenP印t編號gi =296965)是對馬爾堡病毒基因組序列(GenBank編號gi 158539108)進(jìn)行翻譯而得到的蛋白質(zhì)。H蛋白(GenP印t編號gi =9626951)是麻疹病毒基 因組的H序列(GenBank編號gi =9626945)的蛋白質(zhì)；F蛋白(GenP印t編號gi =9626950) 是麻疹病毒基因組的F序列的蛋白質(zhì)。然而，本發(fā)明方法中也可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它外殼蛋白。因此，本發(fā)明提供了包含編碼HIV-p24、HIV-gpl20、HIV-gp41、埃博拉病毒-VP30、 埃博拉病毒-VP35、馬爾堡病毒Gp/SGP、麻疹病毒-H蛋白或-F蛋白之序列的核酸分子。所 述核酸分子與在昆蟲、酵母或植物細(xì)胞中或在特定植物組織中有活性的調(diào)控區(qū)有效連接。本發(fā)明還提供了將編碼HA (例如但不限于人流感病毒A/印度尼西亞/5/05病毒 (H5N1)的HA)的核酸克隆到植物或昆蟲表達(dá)載體(例如桿狀病毒表達(dá)載體)中，并在經(jīng)轉(zhuǎn) 化的植物細(xì)胞或經(jīng)轉(zhuǎn)化的昆蟲細(xì)胞中產(chǎn)生流感候選疫苗或試劑，所述疫苗或試劑包含自組 裝成功能性和免疫原性同型大分子蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)(包括流感亞病毒顆粒和流感病毒VLP)的 重組流感病毒結(jié)構(gòu)蛋白?？衫缡褂脳U狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在合適的細(xì)胞系(例如草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)細(xì)胞(如Sf_9細(xì)胞系；ATCC PTA-4047))中表達(dá)編碼流感病毒亞型之HA 的核酸，所述流感亞型例如但不限于A/新喀里多尼亞/20/99 (HlNl)、A/印度尼西亞 /5/05 亞型(H5N1)、A/ 布里斯班 /59/2007 (HlNl)、A/ 所羅門群島 /3/2006 (HlNl)、A/ 新 加坡 /1/57 (H2N2)、A/ 安徽 /1/2005 (H5N1)、A/ 越南 /1194/2004 (H5N1)、A/ 水鴨 / 香港 /W312/97(H6N1)、A/ 香港 /1073/99 (H9N2)、A/ 布里斯班 /10/2007 (H3N2)、A/ 威斯康星 /67/2005 (H3N2)、A/ 馬 / 布拉格 /56 (H7N7)、B/ 馬來西亞 /2506/2004、B/ 佛羅里達(dá) /4/2006。 還可使用其它昆蟲細(xì)胞系?；蛘撸幋aHA的核酸可在植物細(xì)胞或植物中表達(dá)?？墒褂肏A RNA通過逆轉(zhuǎn)錄和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)來合成編碼HA的核酸。例如，所述RNA可從人流感病毒A/新喀里多尼亞/20/99 (HlNl)病毒或人流感病毒A/印度尼西亞/5/05 (H5N1)病毒或其它流感病毒(例 如 A/ 布里斯班 /59/2007 (HlNl)、A/ 所羅門群島 /3/2006 (HlNl)、A/ 新加坡 /1/57 (H2N2)、 A/ 安徽 /1/2005 (H5N1)、A/ 越南 /1194/2004 (H5N1)、A/ 水鴨 / 香港 /W312/97 (H6N1)、A/ 香港 /1073/99 (H9N2)、A/ 布里斯班 /10/2007 (H3N2)、A/ 威斯康星 /67/2005 (H3N2)、A/ 馬 /布拉格/56 (H7N7)、B/馬來西亞/2506/2004，B/佛羅里達(dá)/4/2006)中分離，或者從被流 感病毒感染的細(xì)胞中分離。對于逆轉(zhuǎn)錄和PCR而言，可使用特異性針對HA RNA的寡核苷 酸引物，所述HA例如但不限于人流感病毒A/新喀里多尼亞/20/99 (HlNl)病毒的HA序 列，或人流感病毒A/印度尼西亞/5/05 (H5N1)病毒的HAO序列，或來自流感病毒亞型A/ 布里斯班 /59/2007 (HlNl)、A/ 所羅門群島 /3/2006 (HlNl)、A/ 新加坡/1/57 (H2N2)、A/ 安 徽 /1/2005 (H5N1)、A/ 越南 /1194/2004 (H5N1)、A/ 水鴨 / 香港 /W312/97 (H6N1)、A/ 香港 /1073/99 (H9N2)、A/ 布里斯班 /10/2007 (H3N2)、A/ 威斯康星 /67/2005 (H3N2)、A/ 馬 / 布拉 格/56 (H7N7)、B/馬來西亞/2506/2004、B/佛羅里達(dá)/4/2006的HA序列。另外，可使用本 領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來化學(xué)合成編碼HA的核酸。根據(jù)宿主表達(dá)系統(tǒng)的要求，可將這些基因所得的cDNA拷貝克隆進(jìn)合適的表達(dá)載 體中。以下描述了用于植物的合適表達(dá)載體的實(shí)例，或者說，可利用已知的方法以及制造商 說明書中提供的信息，使用桿狀病毒表達(dá)載體(例如pFastBacl (InVitrogen))得到基于 pFastBacl 的質(zhì)粒，。本發(fā)明還涉及包含編碼HA之核酸的基因構(gòu)建體，如上所述，其與在植物中可用 的調(diào)控元件有效連接。在植物細(xì)胞中有效并可用在本發(fā)明中的調(diào)控元件的實(shí)例包括但不 限于質(zhì)體藍(lán)素調(diào)控區(qū)(US 7，125，978;其通過引用并入本文)或核酮糖_1，5-二磷酸羧化 酶/加氧酶(RuBisCO ；US4, 962，028 ；其通過引用并入本文)、葉綠素a/b結(jié)合蛋白(CAB ； Leutwiler等；1986 ；其通過引用并入本文)、ST_LS1 (與光系統(tǒng)II的放氧復(fù)合物相關(guān)，并描 述于Stockhaus等1987、1989中；其通過引用并入本文)的調(diào)控區(qū)。質(zhì)體藍(lán)素調(diào)控區(qū)的實(shí) 例是包含SEQ ID NO 36的第10 85位核苷酸或SEQ ID NO 37 47任一序列中的相似 區(qū)域的序列。如果構(gòu)建體在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)，在昆蟲細(xì)胞中可用的調(diào)控元件的實(shí)例包括 但不限于多角體蛋白啟動(dòng)子(Possee 和 Howard 1987. Nucleic AcidsResearch 15 10233-10248)、gp64 啟動(dòng)子(Kogan 等，1995. J Virology69 1452-1461)等。因此，本發(fā)明的一個(gè)方面提供了包含調(diào)控區(qū)和編碼流感病毒HA之序列的核 酸。所述調(diào)控區(qū)可以是質(zhì)體藍(lán)素調(diào)控元件，所述流感病毒HA可選自包含以下的流感毒 株或亞型A/新喀里多尼亞/20/99 (HlNl)、A/印度尼西亞/5/05亞型(H5N1)、A/布里 斯班 /59/2007 (HlNl)、A/ 所羅門群島 /3/2006 (HlNl)、A/ 新加坡 /1/57 (H2N2)、A/ 安徽 /1/2005 (H5N1)、A/ 越南 /1194/2004 (H5N1)、A/ 水鴨 / 香港 /W312/97 (H6N1)、A/ 香港 /1073/99 (H9N2)、A/ 布里斯班 /10/2007 (H3N2)、A/ 威斯康星 /67/2005 (H3N2)、A/ 馬 / 布 拉格/56 (H7N7)、B/馬來西亞/2506/2004、B/佛羅里達(dá)/4/2006。本文中通過SEQ ID NO 36 47舉例說明了包含質(zhì)體藍(lán)素調(diào)控元件和流感病毒HA的核酸序列。已知，當(dāng)在蛋或哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如MDCK細(xì)胞)中培養(yǎng)流感病毒時(shí)，或者當(dāng)從被 感染的對象中分離流感病毒時(shí)，流感病毒血凝素的氨基酸序列或編碼它們的核酸序列可存在序列差異。這樣的差異的非限制性實(shí)例在本文中舉例說明，包括實(shí)施例18。此外，本領(lǐng)域 技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到，由于另外的突變繼續(xù)出現(xiàn)，因此可在來自新毒株的流感病毒血凝素 中觀察到其它變異。由于不同流感病毒血凝素之間的已知序列變異，本發(fā)明包括可利用任 意流感病毒血凝素制備的VLP，前提是當(dāng)如本文所述在宿主中表達(dá)時(shí)流感病毒血凝素形成 VLP?？墒褂帽绢I(lǐng)域中已 知的幾種軟件包中的任意一種例如MULTALIN(F. CORPET, 1988， Nucl. Acids Res.，16 (22)，10881-10890)來確定序列比對和共有序列，或者可人工比對序 列并測定序列之間的相似性和差異。已深入研究了血凝素的結(jié)構(gòu)，并且已知所述結(jié)構(gòu)是高度保守的。在將血凝素的結(jié) 構(gòu)進(jìn)行重疊時(shí)，觀察到高度的結(jié)構(gòu)保守性(rmsd<2A)。即使某些位置中的氨基酸序列可改 變，仍可觀察到這種結(jié)構(gòu)保守性(參見例如Skehel和Wiley，2000 Ann Rev Biochem 69: 531-69 ；Vaccaro等2005)。血凝素的區(qū)域也是非常保守的，例如結(jié)構(gòu)域ΗΑ0多肽被切割以提供成熟的HA。HA是同三聚體，其中每個(gè)單體包含通 過一個(gè)二硫鍵連接的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(HAl)和膜錨定結(jié)構(gòu)域(HA2) ；HA2亞基的N端20個(gè) 殘基還稱為“HA融合結(jié)構(gòu)域(或序列)”。還存在“尾”區(qū)域(被膜內(nèi)部)。每種血凝素均 包含這些區(qū)域或結(jié)構(gòu)域。各區(qū)域或結(jié)構(gòu)域的長度通常是保守的。所有血凝素含有相同數(shù)目和位置的分子內(nèi)和分子間二硫橋。參與二硫橋網(wǎng)絡(luò)之半 胱氨酸的氨基酸序列的數(shù)目和位置在HA中是保守的。舉例說明特征性分子內(nèi)和分子間二 硫橋和其它保守氨基酸及其相對位置之結(jié)構(gòu)的實(shí)例描述于例如Gamblin等2004(Science 303 1838-1842)中。示例性結(jié)構(gòu)和序列包括1RVZ、1RVX、1RVT、1RV0、1RUY、1RU7，其可從蛋 白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(URL :www. rcsb. org)獲取。胞質(zhì)尾一大多數(shù)血凝素在保守位置包含3個(gè)半胱氨酸。作為翻譯后修飾，這些半 胱氨酸中的一個(gè)或多個(gè)可被棕櫚酸化。流感病毒的血凝素可容忍氨基酸變異。該變異提供了不斷鑒定出的新毒株。所述 新毒株之間的感染性可以不同。然而，保持了血凝素三聚體的形成，其隨后形成VLP。因此， 本發(fā)明提供了血凝素氨基酸序列或編碼血凝素氨基酸序列的核酸，其在植物中形成VLP，并 包括已知的序列及其可能出現(xiàn)的變異序列。圖65舉例說明這些已知變異的實(shí)例。該圖顯示下述Hmi毒株之HA的共有氨基 酸序列(SEQ ID NO 74)A/新喀里多尼亞/20/99 (HlNl)(由SEQ ID NO :33編碼)、A/布里斯班 /59/2007 (HlNl) (SEQ ID NO 48)、A/ 所羅門群島 /3/2006 (HlNl) (SEQID NO 49)以及 SEQ ID N0:9。Xl(第3位)是A或V;X2(第52位)是D或N;X3(第90位)是K或R;X4(第 99位)是K或T;X5(第111位)是Y或H;X6(第145位)是V或T;X7(第154位)是E 或Κ;Χ8(第161位)是R或K ;Χ9(第181位)是V或A ;Χ10 (第203位)是D或Ν;Χ11(第 205位)是R或K ；Χ12 (第210位)是T或K ；Χ13 (第225位)是R或K ；Χ14 (第268位) 是W或R ；Χ15 (第283位)是T或N ；Χ16 (第290位)是E或K ；Χ17 (第432位)是I或L ； Xl8 (第4洲位)是N或D。作為這種變異的另一實(shí)例，A/新喀里多尼亞/20/99 (HlNl)(由SEQID NO :33編 碼)、Α/布里斯班/59/2007 (HlNl) (SEQ ID NO :48)、Α/所羅門群島/3/2006 (HlNl) (SEQ IDNO 49)、A/波多黎各/8/34 (HlNl)之HA禾口 SEQ ID NO 9的序列比對和共有序列示于如下表3中。表3 所選Hmi毒株之HA的序列比對和共有序列SEQ ID NO.序列15075MKAKLLVLLC TFTATYADTI CIGYHANNST DTVDTVLEKN VTVTHSVNLL9MKAKLLVLLC TFTATYADTI CIGYHANNST DTVDTVLEKN VTVTHSVNLL48MKVKLLVLLC TFTATYADTI CIGYHANNST DTVDTVLEKN VTVTHSVNLL49MKVKLLVLLC TFTATYADTI CIGYHANNST DTVDTVLEKN VTVTHSVNLL76..................................................共有序列mkxkllvllc tftatyadti cigyhannst dtvdtvlekn vtvthsvnll5110075EDSHNGKLCL LKGIAPLQLG NCSVAGffILG NPECELLISK ESffSYIVETP9EDSHNGKLCL LKGIAPLQLG NCSVAGffILG NPECELLISK ESffSYIVETP48ENSHNGKLCL LKGIAPLQLG NCSVAGffILG NPECELLISK ESffSYIVEKP49EDSHNGKLCL LKGIAPLQLG NCSVAGffILG NPECELLISR ESffSYIVEKP76..................................................共有序列exshngklcl lkgiaplqlg ncsvagwilg npecellis. eswsyive. ρ10115075NPENGTCYPG YFADYEELRE QLSSVSSFER FEIFPKESSff PNHTVTGVSA9NPENGTCYPG YFADYEELRE QLSSVSSFER FEIFPKESSff PNHTVTGVSA48NPENGTCYPG HFADYEELRE QLSSVSSFER FEIFPKESSff PNHTVTGVSA49NPENGTCYPG HFADYEELRE QLSSVSSFER FEIFPKESSff PNHTTTGVSA76..................................................共有序歹llnpengtcypg xfadyeelre qlssvssfer feifpkessw pnhtxtgvsa15120075SCSHNGKSSF YRNLLffLTGK NGLYPNLSKS YVNNKEKEVL VLffGVHHPPN9SCSHNGKSSF YRNLLffLTGK NGLYPNLSKS YVNNKEKEVL VLffGVHHPPN48SCSHNGESSF YRNLLffLTGK NGLYPNLSKS YANNKEKEVL VLffGVHHPPN49SCSHNGESSF YKNLLffLTGK NGLYPNLSKS YANNKEKEVL VLffGVHHPPN76..................................................共有序列scshngxssf yxnllwltgk nglypnlsks yxnnkekevl vlwgvhhppn20125075IGNQRALYHT ENAYVSVVSS HYSRRFTPEI AKRPKVRDQE GRINYYffTLL9IGNQRALYHT ENAYVSVVSS HYSRRFTPEI AKRPKVRDQE GRINYYffTLL48IGDQKALYHT ENAYVSVVSS HYSRKFTPEI AKRPKVRDQE GRINYYffTLL49IGDQRALYHK ENAYVSVVSS HYSRKFTPEI AKRPKVRDQE GRINYYffTLL76...............MSLLT EVETYVLSII PSGPLKAEIA QRLEDVFAGK共有序列igxqxalyhx enayvsvvss hysrxftpel akrPkvr#qe gRi#yywtll
251300 75 EPGDTIIFEA NGNLIAPffYA FALSRGFGSG IITSNAPMDECDAKCQTPQG9 EPGDTIIFEA NGNLIAPffYA FALSRGFGSG IITSNAPMDECDAKCQTPQG48 EPGDTIIFEA NGNLIAPRYA FALSRGFGSG IINSNAPMDKCDAKCQTPQG49 EPGDTIIFEA NGNLIAPRYA FALSRGFGSG IINSNAPMDECDAKCQTPQG76 NTDLEVLMEff . . . LKTRPIL SPLTKGILGF VFTLTVPSERGLQRRRFVQN^nW^^II #pgdt!ifEa ngnLiapxya faLsrGfgsg !itsnaPm#xcdakcqtpQg30135075 AINSSLPFQN VHPVTIGECP KYVRSAKLRM VT. GLRNIPSIQSRGLFGAI9 AINSSLPFQN VHPVTIGECP KYVRSAKLRM VT. GLRNIPSIQSRGLFGAI48 AINSSLPFQN VHPVTIGECP KYVRSAKLRM VT. GLRNIPSIQSRGLFGAI49 AINSSLPFQN VHPVTIGECP KYVRSAKLRM VT. GLRNIPSIQSRGLFGAI76 ALNG..... N GDPNNMDKAV KLYRKLKREI TFHGAKEISLSYSAGALASCAiNsslpfqN vhPvtigecp KyvRsaKlrm vtxGlr#IpsiqSrGlfgai35140075 AGFIEGGffTG MVDGffYGYHH QNEQGSGYAA DQKSTQNAINGITNKVNSVI9 AGFIEGGffTG MVDGffYGYHH QNEQGSGYAA DQKSTQNAINGITNKVNSVI48 AGFIEGGffTG MVDGffYGYHH QNEQGSGYAA DQKSTQNAINGITNKVNSVI49 AGFIEGGffTG MVDGffYGYHH QNEQGSGYAA DQKSTQNAINGITNKVNSVI76 MGLIYNRM. G AVTTEVAFGL VCATCEQIAD SQHRSHRQMVTTTNPLIRHE共有序列 aGfIeggwtG mVdgwyg% hh qneqgsgyAa dQkstqnain giTNkvnsvi40145075 EKMNTQFTAV GKEFNKLERR MENLNKKVDD GFLDIffTYNAELLVLLENER9 EKMNTQFTAV GKEFNKLERR MENLNKKVDD GFLDIffTYNAELLVLLENER48 EKMNTQFTAV GKEFNKLERR MENLNKKVDD GFIDIffTYNAELLVLLENER49 EKMNTQFTAV GKEFNKLERR MENLNKKVDD GFIDIffTYNAELLVLLENER76 NRMVLASTTA . KAMEQMAGS SEQAAEAMEV A........SQARQMVQAMR共有序列 #kMntqfTav gKef#k$err mE#lnkkv#d gfxdiwtyna#llv$l#neR45150075 TLDFHDSNVK NLYEKVKSQL KNNAKEIGNG CFEFYHKCNNECMESVKNGT9 TLDFHDSNVK NLYEKVKSQL KNNAKEIGNG CFEFYHKCNNECMESVKNGT48 TLDFHDSNVK NLYEKVKSQL KNNAKEIGNG CFEFYHKCNDECMESVKNGT49 TLDFHDSNVK NLYEKVKSQL KNNAKEIGNG CFEFYHKCNDECMESVKNGT76 TIGTHPSSSA GLKNDLLENL QAYQKRMGVQ MQRFK...............共有序列 TldfHdSnvk nLy#kvks#L knnaKeiGng cfeFyhkcnxecmesvkngt50155075 YDYPKYSEES KLNREKIDGV KLESMGVYQI LAIYSTVASSLVLLVSLGAI9 YDYPKYSEES KLNREKIDGV KLESMGVYQI LAIYSTVASSLVLLVSLGAI48 YDYPKYSEES KLNREKIDGV KLESMGVYQI LAIYSTVASSLVLLVSLGAI
49 YDYPKYSEES KLNREKIDGV KLESMGVYQI LAIYSTVASS LVLLVSLGAI76 ..................................................共有序歹ll ydypkysees klnrekidgv klesmgvyqi laiystvass lvllvslgai55156675 SFWMCSNGSL QCRICI9 SFWMCSNGSL QCRICI48 SFWMCSNGSL QCRICI49 SFWMCSNGSL QCRICI76 ................共有序列 sfwmcsngsl gcrici共有序列中大寫字母表示所有序列在指定位置處共有的氨基酸；小寫字母表示至 少一半或大部分序列共有的氨基酸；符號“ ！”是I或V中任意一個(gè)；符號“$”是L或M中 任意一個(gè)；符號“ ％ ”是F或Y中任意一個(gè)，符號“#”是N、D、Q、E、B或Z中任意一個(gè)；符號 “.”是無氨基酸(例如缺失)；第3位的X是A或V中任意一個(gè)；第52位的X是E或N中 任意一個(gè)；第90位的X是K或R ；第99位的X是T或K ；第111位的X是Y或H中任意一 個(gè)；第145位的X是V或T中任意一個(gè)；第157位的X是K或E ；第162位的X是R或K ；第 182位的X是V或A ；第203位的X是N或D ；第205位的X是R或K ；第210位的X是T或 K ；第225位的X是K或Y ；第333位的X是H或缺失；第433位的X是I或L ；第49位的X 是N或D。作為這種變異的另一實(shí)例，A/安徽/1/2005 (H5m) (SEQ ID N0:55)、A/越南 /1194/2004 (H5N1)和 A/ 印度尼西亞 /5/2006 (H5N1) (SEQ ID NO 10)之 HA 的序列比對和 共有序列示于如下表4中。表4 所選Hmi毒株之HA的序列比對和共有序列SEQ ID NO.序列15010 MEKIVLLLAI VSLVKSDQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE56 MEKIVLLFAI VSLVKSDQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE55 MEKIVLLLAI VSLVKSDQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE共有序列MEKIVLL1AI VSLVKSDQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE5110010 KTHNGKLCDL DGVKPLILRD CSVAGffLLGN PMCDEFINVP EffSYIVEKAN56 KTHNGKLCDL DGVKPLILRD CSVAGffLLGN PMCDEFINVP EffSYIVEKAN55 KTHNGKLCDL DGVKPLILRD CSVAGffLLGN PMCDEFINVP EffSYIVEKAN共有序列KTHNGKLCDL DGVKPLILRD CSVAGffLLGN PMCDEFINVP EffSYIVEKAN10115010 PTNDLCYPGS FNDYEELKHL LSRINHFEKI QIIPKSSffSD HEASSGVSSA56 PVNDLCYPGD FNDYEELKHL LSRINHFEKI QlIPKSSffSS HEASLGVSSA55 PANDLCYPGN FNDYEELKHL LSRINHFEKI QIIPKSSffSD HEASSGVSSA共有序列PxNDLCYPGx FNDYEELKHL LSRINHFEKI QIIPKSSffSd HEASsGVSSA
15120010 CPYLGSPSFF RNVVffLIKKN STYPTIKKSY NNTNQEDLLV LffGIHHPNDA56 CPYQGKSSFF RNVVffLIKKN STYPTIKRSY NNTNQEDLLV LffGIHHPNDA55 CPYQGTPSFF RNVVffLIKKN NTYPTIKRSY NNTNQEDLLILffGIHHSNDA共有序列CPYqGxpSFF RNVVffLIKKN sTYPTIKrSY NNTNQEDLL!LffGIHHpNDA20125010 AEQTRLYQNP TTYISIGTST LNQRLVPKIA TRSKVNGQSG RMEFFffTILK56 AEQTKLYQNP TTYISVGTST LNQRLVPRIA TRSKVNGQSG RMEFFffTILK55 AEQTKLYQNP TTYISVGTST LNQRLVPKIA TRSKVNGQSG RMDFFffTILK共有序列AEQTkLYQNP TTYIS !GTST LNQRLVPkIA TRSKVNGQSG RM#FFWTILK25130010 PNDAINFESN GNFIAPEYAY KIVKKGDSAI MKSELEYGNC NTKCQTPMGA56 PNDAINFESN GNFIAPEYAY KIVKKGDSTI MKSELEYGNC NTKCQTPMGA55 PNDAINFESN GNFIAPEYAY KIVKKGDSAI VKSEVEYGNC NTKCQTPIGA共有序列PNDAINFESN GNFIAPEYAY KIVKKGDSaI mKSElEYGNC NTKCQTPmGA30135010 INSSMPFHNI HPLTIGECPK YVKSNRLVLA TGLRNSPQRESRRKKRGLFG56 INSSMPFHNI HPLTIGECPK YVKSNRLVLA TGLRNSPQRERRRKKRGLFG55 INSSMPFHNI HPLTIGECPK YVKSNKLVLA TGLRNSPLRERRRK. RGLFG共有序列INSSMPFHNI HPLTIGECPK YVKSNrLVLA TGLRNSPqRErRRKkRGLFG35140010 AIAGFIEGGff QGMVDGffYGY HHSNEQGSGY AADKESTQKA IDGVTNKVNS56 AIAGFIEGGff QGMVDGffYGY HHSNEQGSGY AADKESTQKA IDGVTNKVNS55 AIAGFIEGGff QGMVDGffYGY HHSNEQGSGY AADKESTQKA IDGVTNKVNS共有序列AIAGFIEGGW QGMVDGffYGY HHSNEQGSGY AADKESTQKA IDGVTNKVNS40145010 IIDKMNTQFE AVGREFNNLE RRIENLNKKM EDGFLDVffTY NAELLVLMEN56 IIDKMNTQFE AVGREFNNLE RRIENLNKKM EDGFLDVffTY NAELLVLMEN55 IIDKMNTQFE AVGREFNNLE RRIENLNKKM EDGFLDVffTY NAELLVLMEN共有序列IIDKMNTQFE AVGREFNNLE RRIENLNKKM EDGFLDVffTY NAELLVLMEN45150010 ERTLDFHDSN VKNLYDKVRL QLRDNAKELG NGCFEFYHKC DNECMESIRN56 ERTLDFHDSN VKNLYDKVRL QLRDNAKELG NGCFEFYHKC DNECMESVRN55 ERTLDFHDSN VKNLYDKVRL QLRDNAKELG NGCFEFYHKC DNECMESVRN共有序列ERTLDFHDSN VKNLYDKVRL QLRDNAKELG NGCFEFYHKC DNECMES ！ RN50155010 GTYNYPQYSE EARLKREEIS GVKLESIGTY QILSIYSTVA SSLALAIMMA56 GTYDYPQYSE EARLKREEIS GVKLESIGIY QILSIYSTVA SSLALAIMVA55 GTYDYPQYSE EARLKREEIS GVKLESIGTY QILSIYSTVA SSLALAIMVA
共有序列GTY#YPQYSE EARLKREEIS GVKLESIGtY QILSIYSTVA SSLALAIMvA55156810 GLSLWMCSNG SLQCRICI56 GLSLWMCSNG SLQCRICI55 GLSLWMCSNG SLQCRICI共有序列GLSLWMCSNG SLQCRICI共有序列中大寫字母表示所有序列在指定位置處共有的氨基酸；小寫字母表示至少一半或大部分序列共有的氨基酸；符號“ ！”是I或V中任意一個(gè)；符號“$”是L或M中任 意一個(gè)；符號“ ％ ”是F或Y中任意一個(gè)，符號“#”是N、D、Q、E、B或Z中任意一個(gè)；第102 位的X是T、V或A;第110位的X是S、D或N;第156位的X是S、K或T。以上例舉和描述的比對和共有序列是血凝素氨基酸序列中變異的非限制性實(shí)例， 所述氨基酸序列可用于本發(fā)明多個(gè)實(shí)施方案中以在植物中生產(chǎn)VLP?？扇菀椎販y定編碼氨基酸序列的核酸，因?yàn)槊糠N氨基酸的密碼子是本領(lǐng)域公 知的。因此，提供氨基酸序列則可得出編碼它的簡并核酸序列。因此，本發(fā)明提供了編 碼本文所述的流感毒株和亞型(例如A/新喀里多尼亞/20/99 (HlNl)、A/印度尼西亞 /5/2006 (H5N1)、A/ 雞 / 紐約 /1995、A/ 銀鷗 /DE/677/88 (H2N8)、A/ 得克薩斯 /32/2003、 A/綠頭鴨/MN/33/00、A/鴨/上海/1/2000、A/針尾鴨/TX/828189/02、A/火雞/安大略 /6118/68 (H8N4)、A/ 琵嘴鴨 / 伊朗 /G54/03、A/ 雞 / 德國 /N/1949 (H10N7)、A/ 鴨 / 英格蘭 /56 (H11N6)、A/ 鴨 / 阿爾伯達(dá) /60/76 (H12N5)、A/ 鷗 / 馬里蘭 /704/77 (H13N6)、A/ 綠頭鴨 /Gur jev/263/82、A/ 鴨 / 澳大利亞 /341/83 (H15N8)、A/ 紅嘴鷗 / 瑞典 /5/99 (H16N3)、B/ Lee/40,C/ 約翰內(nèi)斯堡 /66、A/ 波多黎各 /8/34 (HlNl)、A/ 布里斯班 /59/2007 (HlNl)、A/ 所 羅門群島 3/2006 (HlNl)、A/ 布里斯班 10/2007 (H3N2)、A/ 威斯康星 /67/2005 (H3N2)、B/ 馬 來西亞 /2506/2004、B/ 佛羅里達(dá) /4/2006、A/ 新加坡 /1/57 (H2N2)、A/ 安徽 /1/2005 (H5N1)、 A/ 越南 /1194/2004 (H5N1)、A/ 水鴨 / 香港 /W312/97 (H6N1)、A/ 馬 / 布拉格 /56 (H7N7)、A/ 香港/1073/99 (H9N2))之血凝素的核酸序列以及編碼上述血凝素的簡并序列。此外，可容易地測定核酸編碼的氨基酸序列，因?yàn)槊糠N氨基酸的密碼子是公知的。 因此，提供核酸則可得出其編碼的氨基酸序列。因此，本發(fā)明提供了本文所述的流感毒株 和亞型(例如A/新喀里多尼亞/20/99 (HlNl)、A/印度尼西亞/5/2006 (H5N1)、A/雞/紐 約 /1995、A/ 銀鷗 /DE/677/88 (H2N8)、A/ 得克薩斯 /32/2003、A/ 綠頭鴨 /MN/33/00、A/ 鴨 / 上海 /1/2000、A/ 針尾鴨 /TX/828189/02、A/ 火雞 / 安大略 /6118/68 (H8N4)、A/ 琵嘴鴨 / 伊朗 /G54/03、A/ 雞 / 德國 /N/1949 (H10N7)、A/ 鴨 / 英格蘭 /56(H11N6)、A/ 鴨 / 阿爾伯達(dá) /60/76 (H12N5)、A/ 鷗 / 馬里蘭 /704/77 (H13N6)、A/ 綠頭鴨 /Gur jev/263/82、A/ 鴨 / 澳大 利亞 /341/83 (H15N8)、A/ 紅嘴鷗 / 瑞典 /5/99 (H16N3)、B/Lee/40、C/ 約翰內(nèi)斯堡 /66、A/ 波多黎各 /8/34 (Hmi)、A/ 布里斯班 /59/2007 (HlNl)、A/ 所羅門群島 3/2006 (HlNl)、A/ 布 里斯班 10/2007 (H3N2)、A/ 威斯康星 /67/2005 (H3N2)、B/ 馬來西亞 /2506/2004、B/ 佛羅里 達(dá) /4/2006、A/ 新加坡 /1/57 (H2N2)、A/ 安徽 /1/2005 (H5N1)、A/ 越南 /1194/2004 (H5N1)、 A/ 水鴨 / 香港 /W312/97 (H6N1)、A/ 馬 / 布拉格 /56 (H7N7)、A/ 香港 /1073/99 (H9N2))之血 凝素的氨基酸序列。在植物中，流感病毒VLP從質(zhì)膜中出芽(參見實(shí)施例5和圖19)，因此，VLP的脂質(zhì)組成反映了其來源。根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)的VLP包含一種或多種類型或亞型流感病毒的HA，其與植物來源的脂質(zhì)復(fù)合。植物脂質(zhì)可刺激特異性免疫細(xì)胞以及增強(qiáng)所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答。植 物的膜包含脂質(zhì)、磷脂酰膽堿(PC)和磷脂酰乙醇胺(PE)，并且還包含鞘糖脂、皂苷和植物 固醇。此外，植物質(zhì)膜中還存在脂質(zhì)筏一這些微小區(qū)域富含鞘脂和固醇。在植物中，已知存 在多種植物固醇，包括豆固醇、谷固醇、24-甲基膽固醇和膽固醇(Mongrand等，2004)。PC和PE以及鞘糖脂可結(jié)合哺乳動(dòng)物免疫細(xì)胞表達(dá)的CDl分子，所述免疫細(xì)胞例 如抗原呈遞細(xì)胞(APC)(例如樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)以及其它細(xì)胞包括胸腺和肝臟中的 B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞(Tsuji M，.2006)。⑶1分子在結(jié)構(gòu)上與主要組織相容性復(fù)合體 (MHC) I類分子相似，其作用是將糖脂抗原呈遞給NKT細(xì)胞(自然殺傷T細(xì)胞)?；罨?，NKT 細(xì)胞激活先天免疫細(xì)胞(例如NK細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞)并且還激活獲得性免疫細(xì)胞(例如 產(chǎn)生抗體的B細(xì)胞和T細(xì)胞)。在質(zhì)膜中可發(fā)現(xiàn)多種植物固醇一該特異性組成可因物種、生長條件、營養(yǎng)源或病 原體狀態(tài)而異(以上因素僅為舉例說明)。一般而言，谷固醇是最豐富的植物固醇。存在于與脂雙層(例如質(zhì)膜來源的包膜)復(fù)合的流感病毒VLP中的植物固醇可提 供有利的疫苗組合物。不希望受理論限制，與脂雙層(例如質(zhì)膜來源的包膜)復(fù)合的由植 物生產(chǎn)的VLP可誘導(dǎo)比在其它表達(dá)系統(tǒng)中制得的VLP更強(qiáng)的免疫反應(yīng)，并且可與由活的或 減毒的全病毒疫苗誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)相似。因此，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了與植物來源之脂雙層復(fù)合的VLP。在一些 實(shí)施方案中，所述植物來源的脂雙層可包含VLP的包膜。在植物內(nèi)生產(chǎn)的VLP可誘導(dǎo)含有植物特異性N-聚糖的ΗΑ。因此，本發(fā)明還提供了 包含具有植物特異性N-聚糖之HA的VLP。此外，植物中N-聚糖的修飾是公知的(參見例如U. S. 60/944，344，其通過引用并 入本文)，并且可產(chǎn)生含有經(jīng)修飾N-聚糖的ΗΑ。可得到包含經(jīng)修飾糖基化模式(例如巖藻 糖基化減少、木糖基化減少、或二者均減少)之N-聚糖的ΗΑ，或者可得到含有經(jīng)修飾糖基 化模式的ΗΑ，其中蛋白質(zhì)缺少巖藻糖基化、木糖基化或兩者皆缺少，并包含增加的半乳糖基 化。此外，與表達(dá)HA的野生型植物相比，翻譯后修飾的調(diào)節(jié)(例如末端添加半乳糖)可導(dǎo) 致所表達(dá)HA的巖藻糖基化和木糖基化降低。例如(但不視為限制)，合成具有經(jīng)修飾糖基化模式的HA可通過使目的蛋白質(zhì)與 編碼β-1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(GalT)(例如但不限于哺乳動(dòng)物GalT或人GalT，然而，也可 以使用其它來源的GalT)的核苷酸序列共表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。還可將GalT的催化結(jié)構(gòu)域與N-乙 酰氨基葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(GNTl)的CTS結(jié)構(gòu)域(即胞質(zhì)尾、跨膜結(jié)構(gòu)域、主干區(qū))融合以產(chǎn) 生GNTl-GalT雜合酶，并且該雜合酶可與HA共表達(dá)。HA還可與編碼N-乙酰氨基葡萄糖基 轉(zhuǎn)移酶III(GnT-III)(例如但不限于哺乳動(dòng)物GnT-III或人GnT-III，還可使用其它來源 的GnT-III)的核苷酸序列共表達(dá)。另外，還可使用包含與GnT-III融合的GNTl之CTS的 GNTl-GnT-III 雜合酶。因此，本發(fā)明還包括含有HA的VLP，所述HA具有經(jīng)修飾的N-聚糖。不希望受理論限制，HA上存在植物N-聚糖可通過促進(jìn)抗原呈遞細(xì)胞與HA的結(jié)合 來刺激免疫應(yīng)答。Saint-jore-Dupas等(2007)已提出使用植物N-聚糖來刺激免疫應(yīng)答。 此外，VLP的構(gòu)象對于抗原呈遞可以是有利的，并且當(dāng)與植物來源的脂質(zhì)層復(fù)合時(shí)增強(qiáng)VLP的佐劑作用?！罢{(diào)控區(qū)”、“調(diào)控元件”或“啟動(dòng)子”意指通常(但不總是)位于基因的蛋白質(zhì)編碼區(qū)上游的一部分核酸，其可包括DNA或RNA或者DNA和RNA兩者。當(dāng)調(diào)控區(qū)有活性并與目 的基因有效結(jié)合或有效連接時(shí)，可導(dǎo)致所述目的基因的表達(dá)。調(diào)控元件可以介導(dǎo)器官特異 性，或控制發(fā)育基因或時(shí)序基因的活化?！罢{(diào)控區(qū)”包括啟動(dòng)子元件、表現(xiàn)出啟動(dòng)子基礎(chǔ)活性 的核心啟動(dòng)子元件、可響應(yīng)于外部刺激而誘導(dǎo)的元件、介導(dǎo)啟動(dòng)子活性的元件(例如負(fù)調(diào) 控元件或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子)。本文所用的“調(diào)控區(qū)”還包括在轉(zhuǎn)錄后具有活性的元件，例如調(diào)節(jié) 基因表達(dá)的調(diào)控元件(例如翻譯增強(qiáng)子和轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子、翻譯抑制子和轉(zhuǎn)錄抑制子)、上游激 活序列以及mRNA不穩(wěn)定性決定子(mRNA instability determinant)。這后幾種元件中有 幾種可位于編碼區(qū)附近。在本公開內(nèi)容中，術(shù)語“調(diào)控元件”或“調(diào)控區(qū)”一般是指通常(但不總是)位于 結(jié)構(gòu)基因編碼序列上游(5，)的DNA序列，其通過識別RNA聚合酶和/或轉(zhuǎn)錄所需的其它因 子來控制編碼區(qū)在特定位點(diǎn)起始表達(dá)。然而，應(yīng)當(dāng)理解的是，位于內(nèi)含子中或序列3’端的 其它核苷酸序列也可有助于調(diào)節(jié)目的編碼區(qū)的表達(dá)。識別RNA聚合酶或其它轉(zhuǎn)錄因子以確 保在特定位點(diǎn)起始的調(diào)控元件的一個(gè)實(shí)例是啟動(dòng)子元件。大多數(shù)(但不是全部)真核生物 啟動(dòng)子元件包含TATA盒，其是由腺苷和胸苷核苷酸堿基對組成的保守核酸序列，通常位于 轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游約25個(gè)堿基對處。啟動(dòng)子元件包含負(fù)責(zé)起始轉(zhuǎn)錄的基礎(chǔ)啟動(dòng)子元件以 及修飾基因表達(dá)的其它調(diào)控元件(如上文所述)。存在幾種類型的調(diào)控區(qū)，包括受發(fā)育調(diào)節(jié)的、誘導(dǎo)型的或組成型的調(diào)控區(qū)。受發(fā)育 調(diào)節(jié)的調(diào)控區(qū)或?qū)λ刂苹虻牟町愋员磉_(dá)進(jìn)行控制的調(diào)控區(qū)在特定器官或器官之組織 中、在發(fā)育過程中的特定時(shí)間在所述器官或組織中被活化。然而，受發(fā)育調(diào)節(jié)的一些調(diào)控區(qū) 也可偏好性地在某些器官或組織的特定發(fā)育階段具有活性，它們還可以以受發(fā)育調(diào)節(jié)的方 式具有活性，或在所述植物的其它器官或組織內(nèi)具有基礎(chǔ)水平的活性。組織特異性調(diào)控區(qū) (例如參見特異性調(diào)控區(qū))的實(shí)例包括napin啟動(dòng)子和cruciferin啟動(dòng)子(Rask等，1998， J. Plant Physiol. 152 :595_599 ；Bilodeau 等，1994，Plant Cell 14 125-130)。葉特異性 啟動(dòng)子的實(shí)例包括質(zhì)體藍(lán)素啟動(dòng)子(圖Ib或SEQ ID NO 23)，US 7，125，978，其通過引用 并入本文。誘導(dǎo)型調(diào)控區(qū)是能夠響應(yīng)于誘導(dǎo)物而直接或間接激活一種或多種DNA序列或基 因之轉(zhuǎn)錄的調(diào)控區(qū)。當(dāng)不存在誘導(dǎo)物時(shí)，所述DNA序列或基因不會被轉(zhuǎn)錄。通常，特異性結(jié) 合誘導(dǎo)型調(diào)控區(qū)以激活轉(zhuǎn)錄的蛋白因子可以無活性形式存在，然后通過誘導(dǎo)物直接或間接 轉(zhuǎn)化成活性形式。然而，也可以不存在蛋白因子。所述誘導(dǎo)物可以是化學(xué)劑，例如蛋白質(zhì)、代 謝物、生長調(diào)節(jié)劑、除草劑或酚類化合物，或通過加熱、致冷、鹽或毒性元素直接施加的生理 脅迫；或通過病原體或致病劑(例如病毒)的作用間接產(chǎn)生的生理脅迫?？赏ㄟ^向細(xì)胞或植 物外部施加誘導(dǎo)物(例如通過噴霧、澆水、加熱或類似方法)使含有誘導(dǎo)型調(diào)控區(qū)的植物細(xì) 胞暴露于誘導(dǎo)物。誘導(dǎo)型調(diào)控元件可來源于植物基因或非植物基因(例如Gatz，C.和Lenk， I.R.P.，1998，Trends Plant Sci. 3，352-358，其通過引用并入本文)。可能的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子 的實(shí)例包括但不限于四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(Gatz，C.，1997，Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48，89-108，其通過引用并入本文)、類固醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(Aoyama, T.和Chua， N. H. ,1997, Plant J. 2，397-404，其通過引用并入本文)和乙醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(Salter,Μ. G.等，1998，Plant Journall6,127-132 ；Caddick, Μ. X.等，1998，Nature Biotech. 16， 177-180，其通過引用并入本文)、細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)型IB6和CKIl基因(Brandstatter，I.和 Kieber,J. J.，1998，Plant Cell 10，1009-1019 ；Kakimoto,Τ.，1996，Science274,982-985， 其通過引用并入本文)以及生長素誘導(dǎo)型元件DR5(UlmaS0V，T.等，1997，Plant Cell 9， 1963-1971，其通過引用并入本文)。組成型調(diào)控區(qū)指導(dǎo)基因在植物各部分以及整個(gè)植物發(fā)育過程中持續(xù)表達(dá)。已知的組成型調(diào)控元件的實(shí)例包括與以下轉(zhuǎn)錄物相關(guān)的啟動(dòng)子CaMV 35S轉(zhuǎn)錄物(Odell等， 1985,Nature, 313 :810_812)、水稻肌動(dòng)蛋白 1 (Zhang 等，1991 ,Plant Cell, 3 :1155_1165)、 肌動(dòng)蛋白 2 (An 等，1996，PlantJ. ,10 :107_121)或 tms 2 (U. S. 5,428, 147，其通過引用并入 本文)以及磷酸丙糖異構(gòu)酶1基因(Xu等，1994，Plant Physiol. 106 :459_467)、玉米泛素 1 基因(Cornejo 等，1993，Plant Mol. Biol. 29 :637_646)、擬南芥泛素 1 和 6 基因(Holtorf 等，1995，Plant Mol. Biol. 29 :637_646)、煙草翻譯起始因子 4A 基因(Mandel 等，1995， Plant Mol.Biol.29 :995-1004)。本文所用的術(shù)語“組成型”不一定是指受所述組成型調(diào) 控區(qū)控制的基因在所有細(xì)胞類型中以相同水平表達(dá)，而是指所述基因在多種細(xì)胞類型中表 達(dá)，即使常常觀察到不同的豐度?！坝行нB接”意指特定序列(例如調(diào)控元件與目的編碼區(qū))直接或間接地相互作用 以實(shí)現(xiàn)預(yù)定功能(例如介導(dǎo)或調(diào)節(jié)基因表達(dá))。有效連接的序列之間的相互作用可例如通 過與所述有效連接之序列相互作用的蛋白質(zhì)來介導(dǎo)。本發(fā)明的一種或多種核苷酸序列可在由本發(fā)明的核苷酸序列、構(gòu)建體或載體轉(zhuǎn)化 的任意合適的植物宿主中表達(dá)。合適宿主的實(shí)例包括但不限于農(nóng)作物，包括苜蓿、油菜、蕓 苔屬物種、玉米、煙草屬物種、苜蓿、馬鈴薯、人參、豌豆、燕麥、水稻、大豆、小麥、大麥、向日 葵和棉花等。本發(fā)明的一種或多種嵌合基因構(gòu)建體還可包含3’非翻譯區(qū)。3’非翻譯區(qū)是指這 樣的基因部分，其包含含有多腺苷酸化信號和能夠影響mRNA加工或基因表達(dá)之任意其它 調(diào)控信號的DNA區(qū)段。所述多腺苷酸化信號的特征一般在于向mRNA前體的3’端添加多腺 苷酸鏈。多腺苷酸化信號常通過存在經(jīng)典形式的5’ AATAAA-3’同源物來鑒定，但是也會出 現(xiàn)變異。需要時(shí)，本發(fā)明的一種或多種嵌合基因構(gòu)建體還可包含另外的增強(qiáng)子(翻譯增強(qiáng) 子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子)。這些增強(qiáng)子區(qū)域是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且可包括ATG起始密碼子 和鄰近序列。所述起始密碼子必須在編碼序列的讀碼框內(nèi)，以確保翻譯出完整序列。合適的3’區(qū)的非限制性實(shí)例是含有以下基因的多腺苷酸化信號的3’經(jīng)轉(zhuǎn)錄的非 翻譯區(qū)農(nóng)桿菌致瘤(Ti)質(zhì)粒基因(例如胭脂堿合酶(Nos基因))以及植物基因(例如大 豆貯藏蛋白基因)、核酮糖-1，5- 二磷酸羧化酶的小亞基基因(ssRUBISCO ；US 4，962，028， 其通過引用并入本文)、用于調(diào)節(jié)質(zhì)體藍(lán)素表達(dá)的啟動(dòng)子(Pwee和Gray 1993，其通過引用 并入本文)。質(zhì)體藍(lán)素啟動(dòng)子的實(shí)例描述于US 7，125，978 (其通過引用并入本文)中。如本文所述，已發(fā)現(xiàn)包含增強(qiáng)子(經(jīng)證實(shí)其在葉表達(dá)中具有效力)序列的啟動(dòng)子 在瞬時(shí)表達(dá)中有效。不希望受理論限制，通過將光合作用基因的上游調(diào)控元件與核基質(zhì)結(jié) 合可介導(dǎo)強(qiáng)的表達(dá)。例如，可使用豌豆質(zhì)體藍(lán)素基因的翻譯起始位點(diǎn)至-784位來介導(dǎo)強(qiáng)的 報(bào)告基因表達(dá)。為了幫助鑒定轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，可進(jìn)一步處理本發(fā)明的構(gòu)建體使其包含植物選擇標(biāo)記?？捎玫倪x擇標(biāo)記包括提供針對化學(xué)品(例如抗生素，如慶大霉素、潮霉素、卡那霉素；或 除草劑，如膦絲菌素(phosphinothrycin)、草甘膦、氯磺隆等)之抗性的酶。類似地，可使用 產(chǎn)生可通過顏色變化進(jìn)行鑒定之化合物的酶(例如GUS(i3-葡萄糖醛酸酶))或化學(xué)發(fā)光 的酶(螢光素酶或GFP)。本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的嵌合基因構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因植物、植物細(xì)胞或種子。由植物細(xì)胞再生完整植物的方法也是本領(lǐng)域公知的。一般而言，將轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞培養(yǎng)在合適 的培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基可包含選擇劑(例如抗生素)，其中選擇標(biāo)記有利于鑒定轉(zhuǎn)化植物 細(xì)胞。愈傷組織一經(jīng)形成，可根據(jù)已知的方法應(yīng)用合適的植物激素來促進(jìn)芽的形成，并將芽 移至生根培養(yǎng)基中用于再生植物。然后，通過種子或利用植物無性繁殖技術(shù)，所述植物可反 復(fù)用于形成子代。也可以不使用組織培養(yǎng)物來形成轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明還涉及包含嵌合基因構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因植物、樹木、酵母、細(xì)菌、真菌、昆蟲和 動(dòng)物細(xì)胞，所述嵌合基因構(gòu)建體含有編碼用于根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生VLP之重組HAO的核酸。為了在一系列可用于轉(zhuǎn)化或瞬時(shí)表達(dá)的宿主生物中表達(dá)，可以將本發(fā)明的調(diào)控元 件與目的編碼區(qū)相組合。這樣的生物包括但不限于植物(單子葉植物和雙子葉植物)，例如 但不限于玉米、谷類植物、小麥、大麥、燕麥、煙草屬物種、蕓苔屬物種、大豆、豌豆、苜蓿、馬 鈴薯、番茄、人參和擬南芥。用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)化以及再生這些生物的方法已在本領(lǐng)域中建立并且是本領(lǐng)域技術(shù)人 員公知的。獲得轉(zhuǎn)化植物和再生植物的方法對本發(fā)明來說不是關(guān)鍵性的?！稗D(zhuǎn)化”意指表現(xiàn)為基因型、表型或二者兼有的遺傳信息在種間的穩(wěn)定轉(zhuǎn)移。遺傳 信息從嵌合構(gòu)建體向宿主進(jìn)行種間轉(zhuǎn)移可以是可遺傳的，認(rèn)為所述遺傳信息的轉(zhuǎn)移是穩(wěn)定 的；或者，所述轉(zhuǎn)移可以是瞬時(shí)的，這時(shí)所述遺傳信息是不可遺傳的。術(shù)語“植物物質(zhì)”意指來源于植物的任何材料。植物物質(zhì)可包括完整植株、組織、 細(xì)胞或其任意部分。此外，植物物質(zhì)可包括細(xì)胞內(nèi)植物組分、細(xì)胞外植物組分、植物的液體 或固體提取物，或者其組合。此外，植物物質(zhì)可包括來自植物葉、莖、果實(shí)、根或其組合的植 物、植物細(xì)胞、組織、液體提取物或其組合。植物物質(zhì)可包括未進(jìn)行任何處理步驟的植物或 其部分。然而，還應(yīng)當(dāng)考慮的是，可對所述植物材料施加下文定義的最低限度處理步驟或更 嚴(yán)格的處理，包括使用本領(lǐng)域公知的技術(shù)(包括但不限于色譜、電泳等)進(jìn)行部分或大量蛋 白質(zhì)純化。術(shù)語“最低限度處理”意指部分純化包含目的蛋白的植物物質(zhì)(例如植物或其部 分)以得到植物提取物、勻漿、植物勻漿的級分等(即最低限度處理)。部分純化可包括但 不限于破壞植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)從而產(chǎn)生含有可溶性植物組分和不溶性植物組分的組合物，所述 不溶性植物組分可通過例如但不限于離心、過濾或其組合進(jìn)行分離。在此方面，使用真空或 離心提取可容易地獲得分泌到葉或其它組織的細(xì)胞外空間內(nèi)的蛋白質(zhì)，或可以利用通過滾 軸或研磨等在壓力下進(jìn)行組織提取從而將所述蛋白從細(xì)胞外空間中擠壓或釋放。最低限度 處理還可包括制備可溶性蛋白質(zhì)的粗提物，因?yàn)檫@些制備物中將含有可忽略不計(jì)的來自次 植物產(chǎn)物的污染。另外，最低限度處理可包括從葉中用水性溶液提取可溶性蛋白質(zhì)，然后用 任意合適的鹽進(jìn)行沉淀。其它方法可包括大規(guī)模的浸漬和汁液提取，從而允許直接使用所 述提取物?？蓪⒅参镂镔|(zhì)(采取植物材料或組織的形式)經(jīng)口遞送給對象。所述植物物質(zhì)可作為膳食補(bǔ)充劑的一部分與其它食物一起施用，或者被裝入膠囊中。植物物質(zhì)或組織還可以被濃縮以改善或增進(jìn)適口性，或者在需要時(shí)與其它材料、成分或藥物賦形劑一起提供?？墒┯帽景l(fā)明VLP的對象或目標(biāo)生物的實(shí)例包括但不限于人、靈長類、鳥類、水 禽、候鳥、鵪鶉、鴨、鵝、家禽、雞、豬、綿羊、馬科動(dòng)物、馬、駱駝、犬科動(dòng)物、狗、貓科動(dòng)物、貓、 虎、豹、麝貓、水貂、石貂、雪貂、寵物、家畜、兔、小鼠、大鼠、豚鼠或其它嚙齒動(dòng)物、海豹、鯨 等。這些目標(biāo)生物是示例性的，并且不視為限制本發(fā)明的應(yīng)用和用途。根據(jù)需要和情形，可以考慮以多種方式將含有目的蛋白的植物或表達(dá)含有目的蛋 白之VLP的植物施用給對象或目標(biāo)生物。例如，在使用之前，得自所述植物的目的蛋白可以 粗提物、部分純化或純化的形式被提取。如果對蛋白質(zhì)進(jìn)行純化，那么所述蛋白可以在可食 用植物或不可食用植物中產(chǎn)生。此外，如果經(jīng)口施用蛋白質(zhì)，則可以收集所述植物組織并直 接向?qū)ο箫曃?，或者可在飼喂之前進(jìn)行干燥，或者可以不預(yù)先收集而使動(dòng)物在所述植物上 進(jìn)食。本發(fā)明還涉及將收集的植物組織作為動(dòng)物飼料的食物補(bǔ)充劑。如果向動(dòng)物飼喂的植 物組織不進(jìn)行或幾乎不進(jìn)行進(jìn)一步處理的話，則優(yōu)選所施用的植物組織是可食用的。轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)可參與限制轉(zhuǎn)基因在植物中的表達(dá)，來自馬鈴薯Y病毒的 沉默抑制子(HcPro)的共表達(dá)可用于抵抗轉(zhuǎn)基因mRNA的特異性降解(Brigneti等，1998)。 可替代的沉默抑制子是本領(lǐng)域熟知的并且可如本文所述使用(Chiba等，2006，Virology 346 :7-14，其通過引用并入本文)，例如但不限于TEV-pl/HC-Pro(煙草蝕紋病毒-pl/ HC-Pro)、BYV-p21、番茄叢矮病毒的pl9(TBSV pl9)、番茄皺縮病毒的衣殼蛋白(TCV-CP)、黃 瓜花葉病毒的2b (CMV-2b)、馬鈴薯X病毒的p25(PVX-p25)、馬鈴薯M病毒的pll(PVM-pll)、 馬鈴薯S病毒的pll (PVS-pll)、藍(lán)莓枯黃病毒的pl6 (BScV-pie)、柑橘衰退病毒 (Citrustristexa virus)的 p23 (CTV_p23)、葡萄卷葉相關(guān)病毒-2 的 p24 (GLRaV_2p24)、 葡萄病毒A的？10(6￥4- 10)、葡萄病毒8的？14(6￥8- 14)、白芷潛伏性病毒(Heracleum latent virus)的plO (HLV-plO)或大蒜普通潛伏性病毒的pl6 (GCLV_pl6)。因此，沉 默抑制子(例如但不限于 HcPro、TEV-p 1/HC-Pro、BYV_p21、TBSV pl9、TCV-CP, CMV_2b、 PVX-p25、PVM-p11、PVS-p11、BScV-p16、CTV_p23、GLRaV_2p24、GBV_p14、HLV-p10、GCLV-p16 或GVA-plO)可與編碼目的蛋白的核酸序列共表達(dá)以進(jìn)一步確保在植物中生產(chǎn)高水平蛋白 質(zhì)。此外，可生產(chǎn)含有多種HA亞型之組合的VLP。例如，VLP可包含來自HI、H2、H3、 H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16 亞型或其組合的一種或多種 HA0 HA 組合的選擇可由VLP制得之疫苗的目的用途來確定。例如，用于接種鳥的疫苗可包含HA亞 型的任意組合，而用于接種人的VLP可包含HI、H2、H3、H5亞型的一種或多種亞型。然而， 根據(jù)VLP的用途，也可制備其它的HA亞型組合。為了生產(chǎn)含有HA亞型組合的VLP，可將期 望的HA亞型在同一細(xì)胞(例如植物細(xì)胞)中共表達(dá)。此外，如本文所述生產(chǎn)的VLP不包含神經(jīng)氨酸酶(NA)。然而，如果含有HA和NA的 VLP是所期望，則可將NA與HA共表達(dá)。此外，本發(fā)明還包括合適的載體，其含有適用于穩(wěn)定或瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)中的嵌合構(gòu) 建體。所述遺傳信息還可提供在一種或多種構(gòu)建體中。例如，可將編碼目的蛋白的核苷酸 序列引入一種構(gòu)建體中，可將編碼修飾目的蛋白糖基化之蛋白質(zhì)的第二核苷酸序列引入單 獨(dú)的構(gòu)建體中。然后，可將這些核苷酸序列在植物中共表達(dá)。然而，也可使用包含編碼目的蛋白和修飾目的蛋白糖基化之蛋白質(zhì)的核苷酸序列的構(gòu)建體。在此情形中，所述核苷酸序 列將包含第一序列和第二序列，所述第一序列包含與啟動(dòng)子或調(diào)控區(qū)有效連接的編碼目的 蛋白的第一核酸序列，所述第二序列包含與啟動(dòng)子或調(diào)控區(qū)有效連接的編碼修飾目的蛋白 糖基化之蛋白質(zhì)的第二核酸序列?！肮脖磉_(dá)”意指兩種或兩種以上核苷酸序列大致同時(shí)在植物中以及在植物的同一組織中表達(dá)。然而，所述核苷酸序列不必嚴(yán)格地同時(shí)表達(dá)。而是說，所述兩種或更多種核苷 酸序列的表達(dá)使得所編碼產(chǎn)物有機(jī)會相互作用。例如，所述修飾目的蛋白糖基化的蛋白質(zhì) 可在目的蛋白表達(dá)前或表達(dá)期間表達(dá)，以允許發(fā)生對目的蛋白的糖基化修飾?？墒褂盟矔r(shí) 表達(dá)系統(tǒng)共表達(dá)兩種或兩種以上的核苷酸序列，其中所述兩種或更多種序列大致同時(shí)在適 于這兩種序列表達(dá)的條件下被導(dǎo)入植物中?；蛘?，可以用所述核苷酸序列之一(例如，編碼 目的蛋白的序列)以瞬時(shí)或穩(wěn)定方式轉(zhuǎn)化含有編碼修飾所述目的蛋白糖基化之蛋白質(zhì)的 序列的平臺植物(platformplant)。在此情形中，編碼修飾目的蛋白糖基化之蛋白質(zhì)的序 列可在期望的發(fā)育階段表達(dá)在期望的組織內(nèi)，或者可使用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子誘導(dǎo)其表達(dá)，而編 碼目的蛋白的其它序列可在相似條件下在同一組織內(nèi)表達(dá)，以確保所述核苷酸序列的共表 達(dá)?？墒褂肨i質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電穿孔等將本發(fā) 明的構(gòu)建體導(dǎo)入植物細(xì)胞中。這些技術(shù)的綜述參見例如Weissbach和Weissbach，Methods for Plant Molecular Biology, Academy Press,紐約 VIII，421-463 頁(1988) ；Geierson 和 Corey， PlantMolecular Biology,第 2 版(1988)以及 Miki 和 Iyer， Fundamentals ofGene Transfer in Plants. Plant Metabolism, 第 2 版，DT. Dennis, DHTurpin, DD Lefebrve, DB Layzell(編)，Addison ffesly, Langmans Ltd. London, 561-579 Jlt (1997)。 其它的方法包括直接DNA攝入、使用脂質(zhì)體、電穿孔(例如使用原生質(zhì)體)、顯微注射、 微彈(microprojectile)或whisker以及真空滲入。參見例如Bilang等(Gene 100 247-250(1991))、Scheid 等(Mol. Gen. Genet. 228 104-112，1991)、Guerche 等(Plant Science 52:111_116，1987)、Neuhause 等(Theor. Appl Genet. 75 :30_36，1987)、Klein 等，Nature 327 :70_73(1987)、Howell 等(Science 208 1265，1980)、Horsch 等(Science 227 :1229-1231，1985)、DeBlock 等，Plant Physiology 91 :694_701，1989)，Methods for Plant MolecularBiology(Weissbach 禾口 Weissbach 編，Academic Press Inc. ,1988)> Methods in Plant Molecular Biology (Schuler 禾口 Zielinski 編，AcademicPress Inc., 1989)、Liu 和 Lomonossoff (J. Virol Meth, 105 :343_348，2002)；美國專利 No. 4，945，050 ； 5，036，006和5，100,792 ；美國專利申請序列號08/438，666 (1995年5月10日提交)以及 07/951，715 (1992年9月25日提交)(所有這些文獻(xiàn)均通過引用并入本文)?？墒褂盟矔r(shí)表達(dá)法表達(dá)本發(fā)明的構(gòu)建體(參見Liu和Lomonossoff，2002，Journal of Virological Methods，105 :343_348，其通過引用并入本文)。或者，可使用基于真空的 瞬時(shí)表達(dá)法，如Kapila等1997 (其通過引用并入本文)所述。這些方法可包括例如但不限 于農(nóng)桿菌接種法或農(nóng)桿菌滲入法，然而，也可使用其它瞬時(shí)方法，如上文所述。使用農(nóng)桿菌 接種法或農(nóng)桿菌滲入法時(shí)，含有期望核酸的農(nóng)桿菌混合物進(jìn)入組織(例如葉)的細(xì)胞間隙、 植物的地上部分(包括莖、葉和花)、植物的其它部分(莖、根、花)或整個(gè)植株中。穿過表 皮后，所述農(nóng)桿菌感染細(xì)胞并將t-DNA拷貝移至細(xì)胞中。所述t-DNA以附加體形式轉(zhuǎn)錄并且其mRNA被翻譯，導(dǎo)致在感染細(xì)胞中產(chǎn)生目的蛋白，然而，t-DNA在細(xì)胞核內(nèi)的這種傳遞是 瞬時(shí)的。如果目的核苷酸序列編碼的產(chǎn)物對所述植物具有直接或間接的毒性，則通過使用 本發(fā)明的方法可降低對整株植物的毒性，其通過在期望的組織中或者在期望的植物發(fā)育階 段中選擇性表達(dá)目的核苷酸序列來實(shí)現(xiàn)。此外，當(dāng)在植物中制備毒性產(chǎn)物時(shí)，由瞬時(shí)表達(dá)導(dǎo) 致的有限表達(dá)時(shí)間也可降低所述作用。可使用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、組織特異性啟動(dòng)子或細(xì)胞特 異性啟動(dòng)子來選擇性指導(dǎo)目的序列的表達(dá)。
本發(fā)明VLP的重組HA可與現(xiàn)有的流感病毒疫苗組合使用，以補(bǔ)充所述疫苗，使它 們更加有效，以及降低所需的施用劑量。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知地，疫苗可針對一種或多 種流感病毒。合適的疫苗的實(shí)例包括但不限于Sanofi-Pasteur、ID Biomedical、Merial、 Sinovac> Chiron、Roche、MedImmune> GlaxoSmithKline、Novartis、Sanofi-Aventis> Serono> Shire Pharmaceuticals需要時(shí)，可將本發(fā)明的VLP與本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的合適佐劑混合。此外，VLP可 用于疫苗組合物中，其含有用于治療靶標(biāo)生物的有效劑量VLP，如上文所述。此外，根據(jù)本發(fā) 明生產(chǎn)的VLP可與使用不同流感病毒蛋白質(zhì)(例如神經(jīng)氨酸酶(NA))得到的VLP相組合。因此，本發(fā)明提供了用于誘導(dǎo)動(dòng)物或靶標(biāo)生物中針對流感病毒感染之免疫的方 法，其包括施用有效劑量的疫苗，所述疫苗含有一種或多種VLP。所述疫苗可經(jīng)口、皮內(nèi)、鼻 內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)或皮下施用。根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)的VLP的施用描述于實(shí)施例6中。與施用可溶性HA相比，施用由 植物生產(chǎn)的Η5 VLP產(chǎn)生顯著更高的應(yīng)答(參見圖21Α和21Β)。如圖26Α和26Β所示，施用A/印度尼西亞/5/05 Η5 VLP的對象產(chǎn)生了針對流感 病毒A/土耳其/582/06 (H5W ；“土耳其H5m”)攻擊的交叉保護(hù)。在攻擊之前施用印度尼 西亞H5 VLP不導(dǎo)致體重的任何減輕。然而，未施用H5 VLP但用土耳其H5W攻擊的對象表 現(xiàn)出顯著的體重減輕，并且有幾只對象死亡。 因此，這些數(shù)據(jù)表明由植物生產(chǎn)的含有H5血凝素病毒蛋白的流感病毒VLP誘導(dǎo)特 異性針對病原性流感毒株的免疫應(yīng)答，并且該病毒樣顆粒可從植物質(zhì)膜出芽。因此，本發(fā)明提供了包含含有流感病毒HA蛋白的有效劑量VLP、一種或多種植物 脂質(zhì)以及可藥用載體的組合物。所述流感病毒HA蛋白可以是H5印度尼西亞/5/2006。還 提供了誘導(dǎo)對象中針對流感病毒感染之免疫的方法。該方法包括施用含有流感病毒HA蛋 白的病毒樣顆粒、一種或多種的植物脂質(zhì)以及可藥用載體。所述病毒樣顆粒可經(jīng)口、皮內(nèi)、 鼻內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)或皮下施用給對象。本發(fā)明多個(gè)實(shí)施方案的組合物可包含兩種或更多種流感毒株或亞型的VLP。“兩 種或更多種”是指兩種、三種、四種、五種、六種、七種、八種、九種、十種或更多種毒株或 亞型。所示毒株或亞型可以是單一亞型(例如，所有都為H1N1，或所有都為H5W)，或者 可以是亞型的組合。示例性的亞型和毒株包括但不限于本文所述的那些，例如A/新喀 里多尼亞/20/99 (HlNl)、A/印度尼西亞/5/2006 (H5N1)、A/雞/紐約/1995、A/銀鷗/ DE/677/88 (H2N8)、A/ 得克薩斯 /32/2003、A/ 綠頭鴨 /MN/33/00、A/ 鴨 / 上海 /1/2000、A/ 針 尾鴨 /TX/828189/02、A/ 火雞 / 安大略 /6118/68 (H8N4)、A/ 琵嘴鴨 / 伊朗 /G54/03、A/ 雞 / 德國 /Ν/1949 (H10N7)、A/ 鴨 / 英格蘭 /56(H11N6)、A/ 鴨 / 阿爾伯達(dá) /60/76 (H12N5)、A/ 區(qū)鳥/ 馬里蘭 /704/77 (H13N6)、A/ 綠頭鴨 /Gur jev/263/82、A/ 鴨 / 澳大利亞 /341/83 (H15N8)、 A/ 紅嘴鷗 / 瑞典 /5/99(H16N3)、B/Lee/40、C/ 約翰內(nèi)斯堡 /66、A/ 波多黎各 /8/34(HlNl)、 A/ 布里斯班 /59/2007(HlNl)、A/ 所羅門群島 3/2006 (H1N1)、A/ 布里斯班 10/2007 (H3N2)、 A/威斯康星/67/2005 (H3N2)、B/馬來西亞/2506/2004、B/佛羅里達(dá)/4/2006、A/新加 坡 /1/57(H2N2)、A/ 安徽 /l/2005(H5m)、A/ 越南 /1194/2004(H5m)、A/ 水鴨 / 香港 / W312/97 (H6N1)、A/ 馬 / 布拉格 /56 (H7N7)、A/ 香港 /1073/99 (H9N2)。對毒株和亞型之組合的選擇可取決于可能暴露于流感病毒之對象的地區(qū)；動(dòng) 物物種(例如水禽類、農(nóng)業(yè)動(dòng)物(例如豬)等)與待免疫人群的接近程度以及所述動(dòng) 物物種攜帶、暴露或可能暴露的毒株；對亞型或毒株內(nèi)抗原漂移的預(yù)測；或者這些因素 的組合。過去幾年所使用的組合的實(shí)例可見于URL :who. int/csr/dieease/influenza/ vaccinerecommendationsl/en?？蓪⑦@些毒株中的某些或全部應(yīng)用于所示組合中，或產(chǎn)生 疫苗組合物的其它組合中。更特別地，示例性組合可包括來自兩種或更多種選自以下的毒株或亞型的 VLP :A/布里斯班/59/2007(HlNl)、A/布里斯班/59/2007 (H1N1)樣病毒、A/布里斯班 /10/2007 (H3N2)、A/布里斯班/10/2007 (H3N2)樣病毒、B/佛羅里達(dá)/4/2006或B/佛羅里 達(dá)/4/2006樣病毒。另一示例性組合可包括來自兩種或更多種選自以下的毒株或亞型的VLP :A/印度 尼西亞/5/2005、A/印度尼西亞/5/2005樣病毒、A/越南/1194/2004、A/越南/1194/2004樣 病毒、A/安徽/1/05、A/安徽/1/05樣病毒、A/鵝/貴陽/337/2006、A/鵝/貴陽/337/2006 樣病毒、A/雞/山西/2/2006或A/雞/山西/2/2006樣病毒。另一示例性組合可包括A/雞/意大利/13474/99 (H7型)或A/雞/英屬哥倫比 亞省/04(H7N3)流感毒株的VLP。另一示例性組合可包括A/雞/香港/G9/97或A/香港/1073/99的VLP。另一示例 性組合可包括A/所羅門群島/3/2006的VLP。另一示例性組合可包括A/布里斯班/10/2007 的VLP。另一示例性組合可包括A/威斯康星/67/2005的VLP。另一示例性組合可包括B/ 馬來西亞/2506/2004、B/佛羅里達(dá)/4/2006或B/布里斯班/3/2007毒株或亞型的VLP。所述兩種或更多種VLP可單獨(dú)表達(dá)，隨后將純化的或半純化的VLP相組合?；蛘?， VLP可在同一宿主(例如植物)中共表達(dá)。VLP可以期望的比例(例如大致相等的比例) 組合或生產(chǎn)，或者可以組合以使一種亞型或毒株占組合物中VLP的大部分。因此，本發(fā)明提供了包含兩種或更多種毒株或亞型之VLP的組合物。包膜病毒的VLP通常從它們出芽時(shí)所穿過的膜獲得它們的包膜。植物質(zhì)膜具有可 具有免疫刺激作用的植物固醇成分。為了研究該可能性，在存在或不存在佐劑的情形下將 由植物生產(chǎn)的H5 VLP施用給動(dòng)物并測定HAI (血細(xì)胞凝集抑制抗體反應(yīng))(圖22A、22B)。 在未添加佐劑的情形中，由植物產(chǎn)生的H5 VLP表現(xiàn)出顯著的HAI，這表示對施用抗原的全 身免疫應(yīng)答。此外，在存在或不存在佐劑的情形中，所施用VLP的抗體同種型譜相似(圖 23A)。表5列出了本發(fā)明多個(gè)實(shí)施方案中提供的序列。表5 針對序列標(biāo)識的序列描述本發(fā)明將通過僅參考下述非限制性實(shí)施例的方式進(jìn)行詳述。方法和材料1.表汰盒的組裝使用Sambrook和Russell (2001 ；其通過參考并入本文)的一般分子生物學(xué) 操作方法完成所有操作。第一個(gè)克隆步驟是組裝受體質(zhì)粒，其包含苜蓿質(zhì)體藍(lán)素基因 的上游和下游調(diào)控元件。使用寡核苷酸引物Xmal-DPlas. c(SEQ ID NO :29 ；圖10Q)和 SacI-ATG-pPlas. r (SEQ IDNO :30 ；圖10R)從苜?；蚪MDNA中擴(kuò)增質(zhì)體藍(lán)素啟動(dòng)子和5’ UTR序列。所得擴(kuò)增產(chǎn)物用Xmal和SacI消化并與預(yù)先用同樣的酶進(jìn)行消化的 pCAMBIA2300(Cambia, Canberra, Australia)連接以形成 pCAMBIApromoPlasto。類似地， 使用引物 SacI-PlasTer. c(SEQ ID NO 31 ；圖 10S)和 EcoRI-PlasTer. r (SEQ ID NO 32 ；圖 10T)從苜?；蚪MDNA中擴(kuò)增質(zhì)體藍(lán)素基因的3’ UTR序列和終止子，所得產(chǎn)物用SacI和 EcoRI消化，然后插入到pCAMBIApromoPlasto的同樣位點(diǎn)中以形成pCAMBIAPlasto。將流感毒株A/新喀里多尼亞/20/99(HlNl)之HI基因的開放閱讀框作為兩個(gè)片 段來合成(Plant Biotechnology Institute, NationalResearch Council, Saskatoon, Canada)。所合成的第一片段對應(yīng)于缺少了 5’端信號肽編碼序列和3’端跨膜結(jié)構(gòu)域編碼 序列的野生型HI編碼序列(GenBank登錄號AY289929 ;SEQ ID N0:33;圖16)。將Bglll 限制性位點(diǎn)添加在編碼序列的5’端，將SacI/StuI雙位點(diǎn)添加在緊鄰該片段3’端終止密 碼子下游，得到SEQ ID NO :1 (圖5A)。還合成了編碼HI蛋白C端(包含跨膜結(jié)構(gòu)域和胞 質(zhì)尾)的第二片段，其從Kpnl位點(diǎn)至終止密碼子，并且其3’側(cè)翼是SacI/StuI限制性位點(diǎn) (SEQ ID NO. 2 ；圖 5B)。所述第一 HI片段用Bglll和SacI消化，并克隆到含有質(zhì)體藍(lán)素啟動(dòng)子和5’ UTR 之二元載體(pCAMBIAPlasto)的同樣位點(diǎn)中，并與苜蓿蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)基因 (32-103位核苷酸；登錄號Z11499 ；SEQ ID NO 34 ；圖17)的信號肽融合得到PDI-H1嵌合 基因，該嵌合基因位于質(zhì)體藍(lán)素調(diào)控元件的下游。含有PDI信號肽的基于質(zhì)體藍(lán)素的盒序 列示于圖1中(SEQ ID NO 8)。所得質(zhì)粒包含與PDI信號肽融合的HI編碼區(qū)，并且側(cè)翼為 質(zhì)體藍(lán)素調(diào)控元件。通過將預(yù)先用Kpnl和SacI消化的合成片段(SEQ ID NO :2 ；圖5B)插 入到HI表達(dá)質(zhì)粒中來添加C端編碼區(qū)(編碼跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)尾)。所得質(zhì)粒稱為540， 其示于圖11中(還參見圖2A)。2. H5表達(dá)盒的組裝利用Epoch Bio labs (Sugar Land, TX，USA)合成編碼流感毒株A/印度尼西亞 /5/05(H5m ；登錄號LANL ISDN125873)之血凝素的片段。所產(chǎn)生的片段示于SEQ ID NO: 3 (圖6)中，其包含H5全長編碼區(qū)，所述全長編碼區(qū)包含天然信號肽，其側(cè)翼為緊鄰起始 ATG上游的Hindlll位點(diǎn)以及緊鄰終止密碼子(TAA)下游的SacI位點(diǎn)。通過Darveau等 (1995)中所示的基于PCR的連接方法將H5編碼區(qū)克隆到基于質(zhì)體藍(lán)素的表達(dá)盒中。簡 言之，使用引物 Plato-443c(SEQ ID NO :4 ；圖 7A)和 SpHA (Ind)-Plasto. r (SEQ ID NO: 5 ；圖7B)，以pCAMBIApromoPlasto作為模板進(jìn)行第一次PCR擴(kuò)增。平行地，使用引物 Plasto-SpHA(Ind). c(SEQ ID NO :6 ；圖 7C)和 HA (Ind)-Sac. r (SEQ IDN0 :7 ；圖 7D)，以 H5 編碼片段作為模板進(jìn)行第二次擴(kuò)增。將由上述兩個(gè)反應(yīng)得到的擴(kuò)增物混合，將所得混合物 作為模板，使用 Plato-443c(SEQ ID NO :4 ；圖 7A)和 HA (Ind)-Sac. r (SEQ ID NO :7 ；圖 7D) 作為引物進(jìn)行第三次反應(yīng)(組裝反應(yīng))。用BamHI (在質(zhì)體藍(lán)素啟動(dòng)子中)和SacI (在所述 片段的3’端)消化所得片段并將其克隆到先前用同樣的酶進(jìn)行消化的pCAMBIAPlasto中。 所得質(zhì)粒稱為660，其示于圖2B中(還參見圖11)。通過用編碼亮氨酸拉鏈GCMpII變體的片段替換編碼540中跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)尾 的區(qū)域來制備編碼可溶形式HI的盒(Harbury等，1993，Science 1993 ；262 1401-1407)。 將該片段合成成側(cè)翼具有Kpnl和SacI位點(diǎn)以促進(jìn)克隆。由該替換得到的質(zhì)粒稱為544，該 表達(dá)盒示于圖11中。
合成馬鈴薯蝕紋病毒(TEV)5，UTR與流感病毒A/PR/8/34 Ml基因(登錄號 NC_002016)開放閱讀框的融合蛋白，其在終止密碼子下游加入了側(cè)翼SacI位點(diǎn)。該片段 用Swal (在TEV 5，UTR中)和SacI消化，并克隆到pCAMBIA 二元質(zhì)粒中基于2X35S/TEV的 表達(dá)盒中。所得質(zhì)粒具有受控于2X35S/TEV啟動(dòng)子的Ml編碼區(qū)和5，UTR以及N0S終止子 (構(gòu)建體750 ；圖11)。如Hamilton等(2002)所述制備HcPro構(gòu)建體(35HcPro)。對所有克隆進(jìn)行測序以 證實(shí)構(gòu)建體的完整性。所述質(zhì)粒用于通過電穿孔轉(zhuǎn)化根瘤農(nóng)桿菌(AGL1 ；ATCC, Manassas, VA 20108,USA) (Mattanovich等，1989)。通過限制性酶切圖譜證實(shí)所有根瘤農(nóng)桿菌株的完整性。3. ■勿物馳H搟中、傾■■■在填裝市售的泥炭基質(zhì)的平地中用種子培養(yǎng)本塞姆氏煙草或普通煙草 (Nicotiana tabacum)。使植物生長在溫室中，16/8光照周期，溫度采用白天25V /晚上 20°C。播種3周后，挑出各株幼苗，移栽到盆中，并在同樣的環(huán)境條件下在溫室中再生長3 周。轉(zhuǎn)化前，在不同時(shí)間通過掐掉植物的芽或通過化學(xué)處理植物而除去頂芽和腋芽。在補(bǔ)充有10mM 2_[N_嗎啉]乙磺酸(MES)、20 u M乙酰丁香酮、50 u g/ml卡那霉 素和25 ii g/ml羧芐青霉素的YEB培養(yǎng)基(pH 5. 6)中培養(yǎng)用構(gòu)建體660、540、544、750或 35SHcPro轉(zhuǎn)染的農(nóng)桿菌，直至其0D_為0. 6 1. 6。使用前將農(nóng)桿菌混懸液離心并重懸在 滲入培養(yǎng)基(10mM MgCl2 禾P 10mM MES, pH 5. 6)中。如 Liu 和 Lomonossoff (2002，Journal of Virological Methods，105 :343_348)所述進(jìn)行注射器滲入。對于真空滲入而言，將根 瘤農(nóng)桿菌混懸液離心，重懸在滲入培養(yǎng)基中，并儲存在4°C過夜。在滲入當(dāng)天，將分批培養(yǎng)物 稀釋成2. 5倍培養(yǎng)物體積并在使用前溫?zé)帷Ｔ?0-40托真空下，使本塞姆氏煙草或普通煙 草的整個(gè)植株倒置于氣密性不銹鋼罐中的細(xì)菌混懸液中2分鐘。注射器或真空滲入后，將 植株移回溫室中培養(yǎng)4-5天直至收獲。4.葉片取樣和總蛋白質(zhì)提取培養(yǎng)后，收獲植株的地上部分，冷凍在-80°C，進(jìn)行破碎。通過將每個(gè)冷凍破碎植物 材料的樣品在3倍體積的冷的50mM Tris(pH 7. 4)、0. 15M NaCl和ImM苯甲基磺酰氟中勻漿 (Polytron)來提取總的可溶性蛋白質(zhì)。勻漿后，于4°C下以20，000g對漿液離心20分鐘， 將這些澄清的粗提物(上清)用于分析。使用牛血清白蛋白作為參照標(biāo)準(zhǔn)，通過Bradford 測定(Bio-Rad，Hercules，CA)來測定經(jīng)純化粗提物的總蛋白質(zhì)含量。5.蛋白質(zhì)提取物的體積排阻餼譜±真裝有 32ml S印hacryl S-500 高分辨率珠(S-500HR :GEHealthcare, Uppsala, Sweden,貨號17_0613_10)的體積排阻色譜(SEC)柱用平衡/洗脫緩沖液(50mM的 Tris(pH8),150mM NaCl)平衡。將1. 5mL粗蛋白質(zhì)提取物加到該柱上，然后用45mL平衡/ 洗脫緩沖液進(jìn)行洗脫。以1. 5mL級分收集洗脫液，洗脫級分的相對蛋白質(zhì)含量通過將10 y L 級分與200 u L稀釋的Bio-Rad蛋白染色試劑(Bio-Rad，Hercules, CA)混合來監(jiān)測的。用 2倍柱體積的0. 2N NaOH清洗該柱，然后用10倍柱體積的50mM Tris (pH8)、150mM NaCl和 20% 乙醇溶液清洗。每次分離之后用 Blue Dextran 2000 (GE Healthcare Bio-Science Corp.，Piscataway, NJ, USA)校準(zhǔn)所述柱。在每次分離之間對Blue Dextran 2000和宿主 可溶性蛋白質(zhì)的洗脫曲線進(jìn)行比較，以確保所用柱之間的洗脫曲線的一致性。
6.蛋白質(zhì)分析與免疫印跡通過BCA蛋白質(zhì)測定(Pierce Biochemicals, Rockport IL)來測定蛋白質(zhì)濃度。 在還原條件下通過SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，并用考馬斯藍(lán)染色。對經(jīng)染色的凝膠進(jìn)行掃描， 并使用Image J Software (NIH)進(jìn)行密度分析。用丙酮沉淀來自SEC洗脫級分的蛋白質(zhì)(Bollag等，1996)，重懸在1/5體積的平 衡/洗脫緩沖液中，在還原條件下通過SDS-PAGE分離并電轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜 (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN) ；fe貞@flj。貞￡p mr， 用Tris緩沖鹽水(TBS-T)中5%脫脂奶和0. 1% Tween-20在4°C下封閉所述膜16 18小 時(shí)。通過用2 u g/ml合適的抗體(表6)(在2%脫脂奶、0. 1% TBS-Tween20溶液中) 孵育進(jìn)行免疫印跡。用于化學(xué)發(fā)光檢測的第二抗體示于表4中，如所示在2%脫脂奶、0. 1% TBS-Tween 20。貞M luminol (Roche Diagnostics Corporation)
過化學(xué)發(fā)光檢測免疫反應(yīng)性復(fù)合物。使用EZ-Link Plus 活化辣根過氧化物酶綴合試劑 盒(Pierce，Rockford, IL)進(jìn)行人IgG抗體的辣根過氧化物酶綴合。表6 用于所表達(dá)蛋白質(zhì)免疫印跡的電泳條件、抗體和稀釋度 FII :Fitzgerald Industries International, Concord, MA, USA ；NISBIC :National Institute for Biological Standards and Control ；JIR Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA ；BEI NR :Biodefense and emerging infections research resources repository ；ITC Immune Technology Corporation, Woodside, NY,USA針對H5的血凝素分析是基于Nayak.和Reichl (2004)所述的方法。簡言之，在含 有100 y L PBS的V形底96孔微滴定板中進(jìn)行測試樣品的兩倍系列稀釋(100 u L)，使每孔 中含有100ii L稀釋樣品。將100ii L0. 25%火雞紅細(xì)胞懸液(Bio Link Inc.，Syracuse, NY)加到每孔中，將板在室溫下孵育2小時(shí)。將顯示完全血細(xì)胞凝集的最高稀釋度的倒數(shù) 記錄為HA活性。平行地，用PBS稀釋重組HA標(biāo)準(zhǔn)物(A/越南/1203/2004H5N1) (Protein Science Corporation, Meriden, CT)，并作為每個(gè)板的對照。7.蔗糖梯度超離心將對含有H5的生物質(zhì)進(jìn)行凝膠過濾色譜而洗脫得到的lmL級分9、10和11合并， 并加到20 60% (重量/體積)不連續(xù)蔗糖密度梯度中，以125 000g(4°C )離心17. 5小 時(shí)。從頂部起，將梯度物分級分離成19個(gè)3mL級分，并在免疫分析和血細(xì)胞凝集測定之前 通過透析除去蔗糖。8.電子顯微鏡首先，使用30MWC0超濾裝置(Millipore，Billerica, MA, USA)將待通過電子顯微 鏡(EM)觀察的來自SEC的洗脫級分進(jìn)行濃縮。在4°C下，將所述濃縮級分在含有2%戊二 醛的PBS(pH7. 4)中固定24小時(shí)。一經(jīng)固定，將所述樣品吸附在經(jīng)Formvar涂敷的200目 鎳網(wǎng)(Canemco，Lakefield, Canada)上2分鐘，用去離子水清洗網(wǎng)兩遍，然后用磷鎢酸 染色。在放大倍數(shù)為10000X至150000X的透射電子顯微鏡下進(jìn)行觀察(圖4A和4B中 的圖像)?；蛘?，將100ii L 待測樣品置于 Airfuge 超離心管(Beckmanlnstruments，Palo Alto,CA,USA)中。將網(wǎng)置于該管的底部，然后將所述管以120 000g離心5分鐘。取出網(wǎng)，溫和干燥并置于3%磷鎢酸(pH6)液滴上進(jìn)行染色。利用Hitachi 7100透射電子顯微鏡 (TEM)檢測網(wǎng)(圖14BU5B和15C中的圖像)。對于圖19中的圖像而言，將約1mm3的葉塊用含有2. 5%戊二醛的PBS固定，并用 含有3%蔗糖的PBS清洗，然后用1.33%四氧化鋨再次固定。用Spun 樹脂對固定樣品進(jìn) 行包埋，并將超薄切片鋪于網(wǎng)上。用5%醋酸雙氧鈾和0. 2%檸檬酸鉛對樣品進(jìn)行正染色， 然后觀察。利用Hitachi 7100透射電子顯微鏡(TEM)觀察網(wǎng)。9.質(zhì)膜脂質(zhì)分析根據(jù)Mongrand等人利用聚乙二醇3350/葡聚糖T-500 (各6. 6% )在水性聚合物 兩相系統(tǒng)中分配而進(jìn)行細(xì)胞分級分離后，從煙草葉和培養(yǎng)的BY2細(xì)胞得到質(zhì)膜(PM)。所有 步驟均在4°C下進(jìn)行。根據(jù)Bligh和Dyer所述，從不同級分提取和純化脂質(zhì)。使用Lefebvre等所述的 溶劑體系通過一維HP-TLC分離極性和中性脂質(zhì)。如Macala等所述，用醋酸銅染色后檢測 脂質(zhì)的PM級分。通過比較脂質(zhì)的遷移時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)物的遷移時(shí)間來鑒定脂質(zhì)(除了 SG得自 Matreya, Pleasant Gap, PA, USA 以外，其它所有標(biāo)準(zhǔn)物均得自 Sigma-Aldrich，St-Louis， MO, USA)。10. H5 VLP 的純化使用市售的攪拌器，在1. 5倍體積的50mM Tris (pH 8)、NaCl 150mM和0. 04%偏 亞硫酸氫鈉溶液中對冷凍的經(jīng)660滲入的本塞姆氏煙草葉進(jìn)行勻漿。向所得提取物中添 加ImM PMSF，并用1M醋酸調(diào)節(jié)至pH6，然后在42°C加熱5分鐘。將硅藻土(DE)添加到經(jīng) 熱處理的提取物中，以吸附由PH變化和熱處理所沉淀出的污染物，并通過Whatman濾紙 過濾所述漿液。所得澄清的提取物在室溫下以lOOOOXg離心10分鐘以除去殘留的DE， 通過0.8/0.2iim Acropack 20濾器，并加到胎球蛋白-瓊脂糖親和柱(Sigma-Aldrich, St-Louis,M0,USA)上。用 400mM NaCl、25mM Tris(pH 6)清洗后，用 1. 5M NaCl、50mMMES(pH 6)洗脫所結(jié)合的蛋白質(zhì)。向洗脫的VLP中添加Tween-80使終濃度為0. 0005% (體積/體 積)。利用100kDa MWC0 Amicon膜濃縮VLP，在40°C以10000 X g離心30分鐘，并用含有 0.01% Tween-80和0. 01 %硫柳汞的PBS (pH7. 4)重懸。使用之前對混懸的VLP進(jìn)行過濾除 菌。1. 1動(dòng)物研究小鼠利用6 8周齡雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories)對流感病毒 VLP施用的免疫應(yīng)答進(jìn)行研究。將70只小鼠隨機(jī)分到14組中，每組5只。8組用于肌內(nèi)免 疫，6組用于測試鼻內(nèi)施用途徑。所有組均以兩劑方案免疫，即初次免疫后3周進(jìn)行加強(qiáng)免 疫。對于在后肢進(jìn)行肌內(nèi)施用而言，用由植物生產(chǎn)的VLP H5疫苗(0. 1、1、5或12 y g) 或?qū)φ昭?HA)抗原免疫未麻醉的小鼠。對照HA含有基于A/印度尼西亞/5/05 H5N1 毒株制備并從293細(xì)胞培養(yǎng)物(Immune Technology Corp.，New York, USA)中純化的重組 可溶性血凝素(除非另外指明，每劑注射使用5iig)。緩沖液對照是PBS。該抗原由HA蛋 白的18 530位氨基酸組成，并具有組氨酸標(biāo)簽(His-tag)和經(jīng)修飾的切割位點(diǎn)。電子顯 微鏡觀察證實(shí)了該市售產(chǎn)品不是VLP形式。
為了測量佐劑的作用，用5 y g由植物生產(chǎn)的VLP H5疫苗外加1倍體積的2%鋁膠 (明鞏，Accurate Chemical & Scientific Corporation, ffestbury, NY, US)或用 5 y g 從 293細(xì)胞培養(yǎng)物中純化的重組血凝素外加1倍體積的明礬來分別免疫兩組動(dòng)物。將70只小 鼠隨機(jī)分到14組中，每組5只。8組用于肌內(nèi)免疫，6組用于測試鼻內(nèi)施用途徑。所有組均 根據(jù)初免_加強(qiáng)方案進(jìn)行免疫，即初次免疫后3周進(jìn)行加強(qiáng)免疫。對于在后肢進(jìn)行肌內(nèi)施用而言，用由植物生產(chǎn)的VLP H5疫苗(0. 1、1、5或12 y g) 或?qū)φ昭?HA)抗原(5 yg)或PBS免疫未麻醉的小鼠。在免疫之前以1 1體積比將各 抗原制備物與 鋁膠(明鞏，Accurate Chemical & Scientific Corporation,ffestbury, NY, US)混合。為了測量佐劑的作用，用不含任何佐劑的5iig由植物生產(chǎn)的VLPH5疫苗或 者用不含任何佐劑的5 u g對照HA抗原分別免疫兩組動(dòng)物。對于鼻內(nèi)施用而言，使用自動(dòng)吸氣室通過吸入異氟烷短暫麻醉小鼠。然后，用由植 物生產(chǎn)的VLP疫苗(0. 1或1 y g)或者用對照HA抗原(1 u g)或者用PBS以4 yl滴/鼻孔 來免疫小鼠。在免疫之前將各抗原制備物與殼聚糖谷氨酸(ProtosamNovamatrix/FMC BioPolymer，Norway)混合。然后，使小鼠在所述溶液中呼吸。為了驗(yàn)證鼻內(nèi)施用途徑中佐 劑的作用，用lPg由植物生產(chǎn)的VLP H5疫苗或用lyg對照HA抗原來分別免疫兩組動(dòng)物。雪貂使用10組雪貂(雄性，18 24周齡，重量約為1kg)，每組5只。如表7中所述對 每組進(jìn)行處理。所用的佐劑是2%鋁膠(明礬)(SuperfosBiosector，Denmark)(終濃度為 1%)0疫苗組合物是如所述制備的膜相關(guān)的A/印度尼西亞/5/05(H5m)VLP。疫苗對照(陽 性對照)是來自印度尼西亞毒株的完全糖基化的膜結(jié)合重組H5，其由ImmimeTechnology Corporation(ITC)使用293細(xì)胞培養(yǎng)物中的腺病毒來制備。表7.處理組 *i.m.肌內(nèi)在研究期間定期評價(jià)雪貂的整體健康情況和外觀(體重、直腸溫度、姿態(tài)、皮毛、 運(yùn)動(dòng)模式、呼吸、排泄)。在第0、14和28天向四頭肌中肌內(nèi)注射(0.5 1.0倍總體積)來 免疫動(dòng)物；對于引入佐劑的方案而言，在免疫之前以1 1體積比將疫苗組合物與鋁膠混 合。在第0天(免疫前)以及第21和第35天獲取血清樣品。在第40 45天處死(放血 /心臟穿刺)動(dòng)物，收集脾臟并進(jìn)行尸檢。可使用同源或異源的失活H5W病毒，利用ELISA測定來定量抗流感病毒的抗體效 價(jià)。如Aymard等(1973)所述，利用微滴定HAI評估血清樣品(免疫前、第21天和第 35天)的血細(xì)胞凝集抑制抗體效價(jià)。簡言之，用受體破壞酶對血清進(jìn)行預(yù)處理，熱失活并 與紅細(xì)胞(經(jīng)清洗的血紅細(xì)胞(RBC))混懸液混合。推薦使用來自Lampire的經(jīng)清洗的馬 RBC(10%)，考慮到該測定可根據(jù)RBC來源而變化(馬依賴型)，測試了來自10匹馬的經(jīng)清 洗RBC，以選擇最敏感的批次?；蛘?，可使用火雞的RBC?？贵w效價(jià)表示為完全抑制血細(xì)胞 凝集的最高稀釋度的倒數(shù)。交叉反應(yīng)性HAI效價(jià)用針對A/印度尼西亞/5/05 (進(jìn)化枝2. 1)的疫苗免疫的雪 貂的HAI效價(jià)使用來自另一亞進(jìn)化枝或進(jìn)化枝的失活H5W流感毒株(例如進(jìn)化枝1越南 毒株(A/越南/1203/2004和A/越南/1194/2004)或者A/安徽/01/2005 (亞進(jìn)化枝2. 3) 或八/火雞/土耳其/1/05(亞進(jìn)化枝2.2))測量。所有分析均是針對單個(gè)樣品進(jìn)行的。數(shù)據(jù)分析對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(AN0VA)以確定組與組之間的差異是否具 有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。致命性攻擊的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(小鼠)將128只小鼠隨機(jī)分到16組中，每組8只動(dòng)物，1組未免疫且未受攻擊(陰性對 照)。所有組均以兩劑方案通過肌內(nèi)施用進(jìn)行免疫，在初次免疫后2周進(jìn)行第二次免疫。對于在后肢進(jìn)行肌內(nèi)施用而言，用由植物生產(chǎn)的H5 VLP疫苗(1、5或15iig)或 15ug對照HA抗原或PBS免疫未麻醉的小鼠。在免疫之前將各抗原制備物與1倍體積的
鋁膠(明礬，Accurate Chemical &Scientific Corporation, ffestbury, NY, US)混合。在免疫期間，每周為小鼠稱重一次，并觀察和監(jiān)測注射部位的局部反應(yīng)。第二次免疫后第 22 天，在 BL4 防護(hù)實(shí)驗(yàn)室(P4-JeanM6rieux_INSERM，Lyon, France)對經(jīng)麻醉小鼠鼻內(nèi)攻擊(i. n.)4. 09X 106的50%細(xì)胞培養(yǎng)物感染劑量(CCID50)的 流感病毒A/土耳其/582/06病毒(由法國里昂大學(xué)的Bruno Lina博士饋贈)。攻擊之后， 在14天內(nèi)觀察小鼠的疾病臨床癥狀并每日稱重。將具有嚴(yán)重感染癥狀且體重減輕> 25% 的小鼠麻醉后處以安樂死。血液收集、肺和鼻腔清洗以及脾臟收集在初次免疫后第14天和第二次免疫后第14天收集未麻醉動(dòng)物的側(cè)隱靜脈之靜脈血。以8000g離心10分鐘收集血清。在第二次免疫后4周，利用CO2氣體麻醉小鼠并在終止后馬上進(jìn)行心臟穿刺以收 集血液。最后放血后，將導(dǎo)管朝向肺插入氣管中，將Iml冷的PBS-蛋白酶抑制劑混合溶液 置于與所述導(dǎo)管相連的Icc注射器中并注射到肺中，然后取出用于分析。該清洗步驟進(jìn)行 2次。對肺清洗物進(jìn)行離心以除去細(xì)胞碎片。對于鼻內(nèi)清洗而言，將導(dǎo)管朝鼻區(qū)方向插入， 將0.5ml PBS-蛋白酶抑制劑混合溶液通過所述導(dǎo)管推進(jìn)鼻腔中，然后收集。對鼻清洗物進(jìn) 行離心以除去細(xì)胞碎片。收集用5 μ g添加佐劑的由植物生產(chǎn)之疫苗或5 μ g添加佐劑的重 組H5抗原進(jìn)行肌內(nèi)免疫的小鼠以及用1 μ g添加佐劑的由植物生產(chǎn)之疫苗或1 μ g添加佐 劑的重組H5抗原進(jìn)行鼻內(nèi)免疫的小鼠的脾臟。將收集的脾臟置于補(bǔ)充有慶大霉素的RPMI 中，并用IOml注射器的推筒將所述脾臟研碎到50ml錐形管中。清洗研碎的脾臟2次，以 2000rpm離心5分鐘，室溫下用ACK裂解緩沖液重懸5分鐘。用PBS-慶大霉素清洗脾細(xì)胞， 重懸在5% RPMI中并計(jì)數(shù)。脾細(xì)胞用于增殖測定?？贵w效價(jià)在初次免疫后第14天以及第二次免疫后第14天和第28天測量血清的抗流感病 毒抗體效價(jià)。使用失活病毒A/印度尼西亞/5/05作為包被抗原，利用酶聯(lián)免疫吸附測定 (ELISA)測定效價(jià)。終點(diǎn)效價(jià)表示為達(dá)到高出陰性對照樣品至少0. 1的OD值的最高稀釋度 的倒數(shù)。對于抗體種類測定而言(IgGl、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM)，如上文所述通過ELISA 評估效價(jià)。血細(xì)胞凝集抑制(HI)效價(jià)如先前所述(WHO 2002 ；Kendal 1982)，在第二次免疫后第14天和第28天測量血 清的血細(xì)胞凝集抑制(HI)效價(jià)。將A/印度尼西亞/5/05或A/越南/1203/2004毒株的失 活病毒制備物用于測試小鼠血清樣品的HI活性。用由霍亂弧菌(Kendal 1982)制得的受 體破壞酶II (RDE II) (DenkaSeiken Co. ,Tokyo, Japan)對血清進(jìn)行預(yù)處理。用0. 5%火雞 血紅細(xì)胞進(jìn)行HI測定。HI抗體效價(jià)被定義為引起完全凝集抑制的最高稀釋度的倒數(shù)。
實(shí)施例實(shí)施例1.通過農(nóng)桿菌滲入法在本塞姆氏煙草植物中瞬時(shí)表達(dá)流感病毒A/印度尼 西亞/5/05 (H5N1)血凝素通過A/印度尼西亞/5/05 (H5m)毒株之H5亞型的表達(dá)來測定瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生 流感病毒血凝素的能力。如圖11所示，首先將帶有天然信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域的血凝素基因 編碼序列(登錄號EF541394)組裝在質(zhì)體藍(lán)素表達(dá)盒(來自苜蓿質(zhì)體藍(lán)素基因的啟動(dòng)子、 5，UTR,3' UTR以及轉(zhuǎn)錄終止序列)中，將所組裝的盒(660)插入到pCAMBIA 二元質(zhì)粒中。 然后，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到農(nóng)桿菌(AGLl)中，得到重組株AGL1/660，其用于瞬時(shí)表達(dá)。用AGL1/660滲入本塞姆氏煙草植物，并在6天的培養(yǎng)期后收獲葉。為了測定H5是 否在農(nóng)桿菌滲入的葉中積累，首先從經(jīng)滲入的葉組織中提取蛋白質(zhì)并通過Western印跡利 用抗_H5(越南)多克隆抗體進(jìn)行分析。檢測到提取物中約72kDa的獨(dú)特條帶(圖12)，其大 小對應(yīng)于未切割的流感病毒血凝素HAO形式。用作陽性對照的市售H5 (A/越南/1203/2004 ；Protein Science Corp.，Meriden, CT, USA)被檢測為約 48kDa 和 28kDa 的兩個(gè)條帶，分別 對應(yīng)于HAl和HA2片段的分子量。這表明H5在經(jīng)滲入葉中的表達(dá)導(dǎo)致未切割之翻譯產(chǎn)物 的累積。來自經(jīng)AGL1/660轉(zhuǎn)化的葉的粗蛋白質(zhì)提取物能夠凝集火雞血紅細(xì)胞，證明形成 了活性HA三聚體(數(shù)據(jù)未顯示)。實(shí)施例2 使用體積排阻色譜表征植物提取物中含有血凝素的結(jié)構(gòu)通過凝膠過濾對由植物生產(chǎn)的流感病毒血凝素組裝成高分子量結(jié)構(gòu)進(jìn)行評估。通 過體積排阻色譜(SEC)利用 S印hacryl S-500HR 柱(GEHealthcare Bio-Science Corp.， Piscataway,NJ,USA)對經(jīng)AGL1/660滲入之植物的粗蛋白質(zhì)提取物(1. 5mL)進(jìn)行分級分離。 使用抗HA抗體通過免疫檢測測定洗脫級分的總蛋白質(zhì)含量和HA豐度(圖13A)。如圖13A 所示，Blue Dextran(2MDa)洗脫物早在級分10中出現(xiàn)峰值，而大部分宿主蛋白質(zhì)仍保留在 柱中并在級分14與22之間被洗脫出來。當(dāng)利用丙酮沉淀法將來自200yL各SEC洗脫級 分的蛋白質(zhì)濃縮(5倍)并通過Western印跡(圖15A，H5)分析時(shí)，血凝素(H5)主要存在 于級分9 14中(圖13B)。不希望受理論限制，這表明HA蛋白已被組裝成大的超級結(jié)構(gòu) 或已附著于高分子量結(jié)構(gòu)上。將第二表達(dá)盒與來自A/新喀里多尼亞/20/99(HlNl) (SEQ ID NO :33 ；圖16 ； GenBank登錄號AY289929)的Hl核酸序列進(jìn)行組裝以產(chǎn)生構(gòu)建體540 (圖11)。設(shè)計(jì)嵌合 基因構(gòu)建體以產(chǎn)生可溶性三聚體形式的H1，其中信號肽源自植物蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶基 因，Hl的跨膜結(jié)構(gòu)域被GCN4亮氨酸拉鏈的pll變體替代，其已顯示可自組裝成三聚體的肽 (Harbury等，1993)(盒544，圖11)。雖然缺乏跨膜結(jié)構(gòu)域，但是該可溶性三聚體形式仍具 有血細(xì)胞凝集能力(數(shù)據(jù)未顯示)。通過SEC對用AGL1/540或AGL1/544滲入之植物的蛋白提取物進(jìn)行分級分離，用 抗A型流感病毒抗體(Fitzgerald，Concord, MA, USA)通過Western印跡檢測Hl洗脫級分 的存在。在經(jīng)AGL1/540滲入的葉中，Hl主要以很高分子量的結(jié)構(gòu)累積，其中峰朝較小結(jié)構(gòu) 偏離(Hl ；圖13C)。在經(jīng)AGL1/544滲入的葉中，可溶性形式的Hl作為分離的三聚體累積， 這可通過與宿主蛋白質(zhì)洗脫曲線平行的凝膠過濾洗脫曲線來證明(可溶性Hl ；圖13D)。相 比較而言，由5 6個(gè)血凝素三聚體微團(tuán)組成的Hl玫瑰花結(jié)(Protein Science Corp.， Meriden, CT, USA)在級分12 16中洗脫出來(圖13E)，早于可溶性Hl (圖13D)但晚于天 然 Hl (圖 13C)。為了評價(jià)Ml共表達(dá)對血凝素組裝成結(jié)構(gòu)的影響，使用對應(yīng)于A/PR/8/34 (HlNl) Ml 編碼序列(SEQ ID NO 35 ；圖18 ；GenBank登錄號NC_002016)的核酸組裝了Ml表達(dá)盒。該構(gòu) 建體稱為750，示于圖11中。對于Ml和Hl共表達(dá)而言，在滲入前以相等體積混合AGL1/540 和AGL1/750混懸液。多種農(nóng)桿菌混懸液的共滲入允許共表達(dá)多種轉(zhuǎn)基因。對SEC洗脫級 分的Western印跡分析表明Ml共表達(dá)不改變Hl結(jié)構(gòu)的洗脫曲線，但導(dǎo)致經(jīng)農(nóng)桿菌滲入的 葉中Hl累積減少(參見圖13F)。實(shí)施例3 通過蔗糖梯度離心分離H5結(jié)構(gòu)并在電子顯微鏡下觀察在電子顯微鏡(EM)下觀察血凝素結(jié)構(gòu)需要的濃度和純度水平比從SEC獲得的葉 蛋白質(zhì)粗提物更高。為了能通過EM觀察H5結(jié)構(gòu)，首先通過PEG沉淀(20%聚乙二醇)濃 縮葉蛋白質(zhì)粗提物，然后重懸在1/10體積的提取緩沖液中。將所濃縮的蛋白提取物通過S-500HR凝膠過濾進(jìn)行分級分離，并合并洗脫級分9、10和11 (對應(yīng)于柱的空隙體積)，通過 20 60%蔗糖密度梯度超速離心，進(jìn)一步與宿主蛋白質(zhì)分離。在分析之前，從頂部開始進(jìn) 行蔗糖梯度分級分離，將級分透析，并利用100NMWL離心過濾裝置進(jìn)行濃縮。如Western印 跡和血細(xì)胞凝集結(jié)果所示(圖14A)，H5主要累積在級分16 19中，其含有約60%蔗糖，而 大多數(shù)宿主蛋白質(zhì)在級分13中出現(xiàn)峰值。合并級分17、18和19，進(jìn)行負(fù)染色，并在EM下觀 察。對樣品的觀察清楚地表明存在大小為80 300nm的刺突球狀結(jié)構(gòu)，其與流感病毒VLP 的形態(tài)學(xué)特征相吻合(圖14B)。實(shí)施例4 來自植物生物質(zhì)的流感病毒H5VLP的純化除了含量豐富的可溶性蛋白質(zhì)以外，植物的葉提取物中含有可溶性糖、核酸和脂 質(zhì)的復(fù)雜混合物。通過改變PH和熱處理然后利用硅藻土過濾對粗提物進(jìn)行純化(參見“材 料和方法”部分中有關(guān)純化方法的詳述)。圖15A(泳道1 4)表示考馬斯藍(lán)染色的凝膠， 其比較了多個(gè)純化步驟的蛋白質(zhì)含量。粗提物(泳道1)和經(jīng)純化提取物(泳道4)中蛋白 質(zhì)含量的比較表明，純化步驟能降低總蛋白質(zhì)含量以及除去葉粗提物中的大多數(shù)主要污染 物(顯示為50kDa)。所述50kDa條帶對應(yīng)于RuBisCO大亞基，占葉總蛋白質(zhì)的高達(dá)30%。通過親和色譜利用胎球蛋白柱對來自這些經(jīng)澄清提取物的流感病毒H5VLP進(jìn)行 純化。對加樣級分(圖15A，泳道5)、流穿(圖15A，泳道6)以及經(jīng)洗脫VLP (圖15A，泳道 7)的比較表明胎球蛋白親和柱對經(jīng)澄清植物提取物中的流感病毒H5VLP具有特異性。如利用考馬斯藍(lán)染色的SDS-PAGE凝膠的密度測定所示(圖15，泳道7)，純化步 驟導(dǎo)致H5的純度大于75%。為了評價(jià)所純化產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)質(zhì)量，利用100NMWL(nominal molecular weight limit，名義分子量極限)離心過濾裝置對經(jīng)純化的H5進(jìn)行濃縮，并在 負(fù)染色后于EM下觀察。圖15B顯示了表示存在大量VLP的代表性部分。更加細(xì)致地觀察 證實(shí)了 VLP上存在刺突(圖15C)。如圖15D所示，基于考馬斯藍(lán)染色的H5血凝素的密度以及基于通過BCA法測定 的總蛋白質(zhì)含量，利用胎球蛋白柱親和色譜將來自經(jīng)澄清葉提取物的H5VLP純化至純度約 89%。通過凝集火雞紅細(xì)胞的能力證實(shí)HA VLP生物活性(數(shù)據(jù)未顯示)。圖20B還通過Western印跡目測以及利用抗H5多克隆血清(A/越南/1203/2004) 進(jìn)行的免疫檢測驗(yàn)證了純化VLP的身份。檢測到約72kDa的獨(dú)特條帶，其大小對應(yīng)于未切 割的HAO形式流感病毒血凝素。圖15c顯示所述疫苗的VLP結(jié)構(gòu)，其中血凝素刺突覆蓋其 結(jié)構(gòu)。通過0. 22 μ m濾器過濾來制備用于免疫小鼠的VLP，利用內(nèi)毒素LVL(Limulus Amebocyte Lysate)檢測試劑盒(Lonza，Walkserville，MS，USA)測定內(nèi)毒素含量。經(jīng)過濾 的疫苗含有105. 8士 11. 6% EU/ml (內(nèi)毒素單位/ml)。實(shí)施例5 流感病毒VLP在植物中的定位為了對VLP定位并證實(shí)其質(zhì)膜來源，將產(chǎn)生H5的植物的葉薄切片固定，并在正染 色后于TEM下觀察。對葉細(xì)胞的觀察表明VLP存在于由質(zhì)膜內(nèi)陷形成的細(xì)胞外腔中(圖 19)。所觀察的VLP的形態(tài)和位置表明，盡管其質(zhì)膜附著在細(xì)胞壁上，但是植物細(xì)胞具有產(chǎn) 生來源于其質(zhì)膜的流感VLP并將它們累積在質(zhì)外體空隙中所需的可塑性。實(shí)施例6 質(zhì)膜脂質(zhì)分析
對植物流感病毒VLP的組成和來源的進(jìn)一步驗(yàn)證來自于對脂質(zhì)成分的分析。從經(jīng) 純化的VLP提取脂質(zhì)，并通過高效薄層色譜(HP-TLC)將其組成與高度純化的煙草質(zhì)膜的組 成進(jìn)行比較。來自VLP與對照質(zhì)膜的極性和中性脂質(zhì)的遷移模式相似。經(jīng)純化的VLP包含 在質(zhì)膜中發(fā)現(xiàn)的主要磷脂(磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺)和鞘脂(葡萄糖神經(jīng)酰胺)(圖 27A)，并且二者均含有作為唯一中性脂質(zhì)的游離固醇(圖27B)。然而，對經(jīng)純化VLP提取物 中質(zhì)膜蛋白質(zhì)標(biāo)志物(ATP酶)的免疫檢測表明，VLP脂雙層不包含與植物質(zhì)膜相關(guān)的主要 蛋白質(zhì)中任一種，這表明宿主蛋白質(zhì)可能在VLP從植物細(xì)胞中出芽的過程中被排除在膜以 外(圖27C)。實(shí)施例7 :H5 VLP的免疫原性以及施用途徑的影響通過肌內(nèi)注射或鼻內(nèi)(吸入)向小鼠施用由植物生產(chǎn)的H5 VLP。根據(jù)所述的方 法，將0. 1 12μ g VLP肌內(nèi)注射給小鼠，以明礬作為佐劑。使用最低抗原量即觀察到了峰 值抗，其幅度與5 μ g重組可溶性血凝素(HA)相似(圖20A)。0. 1 1 μ g由植物生產(chǎn)的H5 VLP與殼聚糖佐劑一起鼻內(nèi)施用所提供的抗體應(yīng)答 大于重組可溶性HA與明礬佐劑所提供的抗體應(yīng)答(圖20B)。對于這兩種施用途徑而言，在一定的抗原量范圍內(nèi)，在所有測試小鼠中均觀察到 血清轉(zhuǎn)換。重組H5可溶性抗原產(chǎn)生低的(< 1/40)或可忽略不計(jì)的(1 < 1/10，對于未加 佐劑的重組H5而言)HI效價(jià)。實(shí)施例8 :H5 VLP的血細(xì)胞凝集抑制抗體效價(jià)(HAI)圖21A、21B示意在用由植物生產(chǎn)的H5VLP或重組可溶性HA“加強(qiáng)”后第14天的血 細(xì)胞凝集抑制(HAI)抗體應(yīng)答。當(dāng)肌內(nèi)施用時(shí)最低劑量的抗原(0. 1 μ g)所產(chǎn)生的HAI應(yīng) 答是施用5 μ g重組可溶性HA的10倍。與最低劑量相比，H5 VLP的劑量增加導(dǎo)致HAI適 度增加。鼻內(nèi)施用后，與施用Iyg重組可溶性HA的小鼠(其與陰性對照類似)相比，施 用由植物生產(chǎn)的H5 VLP(1.0或0. Iyg)之小鼠的HAI應(yīng)答顯著提高。通過肌內(nèi)注射H5 VLP(0.1 12yg)免疫的所有小鼠的HAI效價(jià)均高于用對照HA抗原免疫的小鼠(圖4a 圖21A)。對于同樣的5 μ g劑量，VLP誘導(dǎo)的HAI效價(jià)是相應(yīng)劑量的對照HA抗原的20倍。 當(dāng)通過鼻內(nèi)途徑遞送時(shí)，VLP誘導(dǎo)的HAI效價(jià)也顯著高于對照HA抗原(圖21b)。對于給定 劑量的H5 VLP而言，鼻內(nèi)免疫之小鼠的HAI效價(jià)水平低于肌內(nèi)免疫的小鼠；當(dāng)肌內(nèi)施用時(shí)， 1 μ g VLP誘導(dǎo)的平均HAI效價(jià)為210，而鼻內(nèi)施用同樣劑量所誘導(dǎo)的平均HAI效價(jià)為34。當(dāng)肌內(nèi)施用時(shí)，所有劑量VLP均誘導(dǎo)高水平的能與失活的同源全病毒結(jié)合的抗體 (圖20b和24)。由植物生產(chǎn)的VLP疫苗與對照HA抗原之間無顯著差異(除了加強(qiáng)后第14 天的12 μ g VLP組以外)，因?yàn)檫@兩種抗原制備物均誘導(dǎo)針對同源毒株的高結(jié)合抗體效價(jià)。 然而，當(dāng)鼻內(nèi)施用時(shí)，VLP誘導(dǎo)的結(jié)合抗體效價(jià)高于對照HA抗原(圖20b)。當(dāng)與殼聚糖混 合時(shí)，用1 μ g VLP免疫誘導(dǎo)的平均Ab效價(jià)倒數(shù)為5500，其是在用1 μ g對照HA抗原免疫的 小鼠中水平(平均Ab效價(jià)倒數(shù)為920)的8. 6倍。然后，通過在小鼠中進(jìn)行劑量范圍研究來研究由植物生產(chǎn)的流感VLP的免疫原 性。以3周的間隔用配制在明礬(1 1比例)中的O.lyg至12yg含有來自流感病毒A/ 印度尼西亞/5/05 (H5N1)之HA的VLP肌內(nèi)免疫數(shù)組BALB/c小鼠(每組5只)。使用失活 全病毒抗原(A/印度尼西亞/5/05 (H5W))測量第二次免疫后第14天收集之血清的血細(xì)胞凝集抑制效價(jià)(HI)。用低至0. Iyg劑量VLP進(jìn)行的免疫誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生，所述抗體在高稀釋 度下抑制病毒凝集紅細(xì)胞(圖21A)。用5 μ g非VLP、明礬佐劑化的對照H5抗原(同樣來 自A/印度尼西亞/5/05)平行免疫小鼠所誘導(dǎo)的HI應(yīng)答比用最低VLP劑量所產(chǎn)生的HI應(yīng) 答低2 3個(gè)對數(shù)值。對于兩種施用途徑而言，在一定的抗原量范圍內(nèi)，施用VLP之小鼠的HAI應(yīng)答均更佳。實(shí)施例9 佐劑對H5 VLP免疫原性的作用由植物生產(chǎn)的H5 VLP具有質(zhì)膜來源(圖19，實(shí)施例5)。不希望受理論限制，包膜 病毒或包膜病毒的VLP通常從其出芽的膜獲得包膜。植物質(zhì)膜含有植物固醇成分(即使在 動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，也非常稀少)，并且已表明這些固醇的某一些表現(xiàn)出免疫刺激作用。在佐劑存在或不存在下，向小鼠肌內(nèi)(圖22A)或鼻內(nèi)(圖22B)施用由植物生產(chǎn)的 H5 VLP,并測定HAI (血細(xì)胞凝集抑制抗體應(yīng)答)。在添加或不添加佐劑(明礬或殼聚糖，如 這些實(shí)施例中所示)下，以任一施用體系施用VLP表現(xiàn)出比重組可溶性HA顯著更高的HAI 血細(xì)胞凝集抑制。即使不添加佐劑(即明礬或殼聚糖)，由植物生產(chǎn)的H5 VLP仍表現(xiàn)出顯 著的HAI，這表示對施用所述抗原的全身免疫應(yīng)答。明礬使肌內(nèi)施用VLP的平均HAI效價(jià)水平提高至5倍(圖22a)，使對照HA抗原的 平均HAI效價(jià)水平提高至3. 7倍。當(dāng)肌內(nèi)施用時(shí)，5 μ gVLP誘導(dǎo)的平均HAI效價(jià)比對應(yīng)劑量 的對照HA抗原高12倍。殼聚糖不提高對照HA抗原的平均HAI水平(圖22b)，而其使鼻內(nèi) 施用1 μ gVLP免疫的小鼠的平均HAI水平提高5倍。實(shí)施例10 抗體同種型在存在或不存在明礬作為所添加佐劑的情形下，施用由植物生產(chǎn)的H5 VLP或重組 可溶性HA的小鼠表現(xiàn)出多種免疫球蛋白同種型(圖23A)。在添加佐劑的情形下，VLP與HA的抗體同種型模式相似，其中IgGl是主要的同種 型。當(dāng)不添加佐劑而施用VLP或HA時(shí)，IgGl應(yīng)答降低，但仍是響應(yīng)于VLP的主要同種型， IgM、IgG2a、IgG2B和IgG3保持與添加佐劑時(shí)相似的效價(jià)。當(dāng)不添加佐劑而施用HA時(shí)，IgGl、 IgG2a和IgG2b效價(jià)顯著降低。因此，這些數(shù)據(jù)表明，由植物生產(chǎn)的VLP不需要添加佐劑來激發(fā)宿主的抗體應(yīng)答。圖23B示意在添加抗原的情形下肌內(nèi)施用由植物生產(chǎn)的VLP或可溶性重組HA的 小鼠中抗失活全流感病毒株(A/印度尼西亞/5/05 ;A/越南/I 203/04)的抗體效價(jià)。在施 用1 μ g或5 μ g VLP或者5 μ g可溶性HA的小鼠中未觀察到針對這些流感毒株之抗體效價(jià) 的顯著差異。實(shí)施例11 :H5 VLP疫苗誘導(dǎo)的血清抗體的交叉反應(yīng)性評價(jià)了 H5VLP疫苗誘導(dǎo)的血清抗體針對不同的失活全流感病毒株的交叉反應(yīng)性。 所有VLP劑量(0. 1 12 μ g)以及5 μ g對照HA抗原均誘導(dǎo)針對進(jìn)化枝1毒株(A/越南 /1194/04)、進(jìn)化枝2. 1的同源毒株A/印度尼西亞/5/05以及進(jìn)化枝2.2毒株A/火雞/ 土 耳其/1/05的高的結(jié)合抗體效價(jià)(圖25A)。然而，只有由植物生產(chǎn)的VLP誘導(dǎo)針對A/火雞/ 土耳其/1/05毒株的HAI效價(jià) (圖25b)。VLP針對A/印度尼西亞/5/05的HAI效價(jià)高。實(shí)施例12 由植物生產(chǎn)的H5 VLP進(jìn)行免疫所提供的交叉保護(hù)
向如上文所述先前已施用兩劑方案之A/印度尼西亞/5/05 H5 VLP的小鼠隨后用 流感病毒A/土耳其/582/06 (H5W) ( “土耳其H5m”)感染性病毒進(jìn)行鼻內(nèi)攻擊，并觀察。 每只動(dòng)物所施用的劑量為IOLD5tl (4. 09 X IO5CCID5tl)。攻擊后7天內(nèi)，只有37. 5%的施用PBS疫苗對照的小鼠在暴露于土耳其H5W后存 活(圖26A)。100%的施用對照抗原(HA)或者1、5或15 μ g印度尼西亞H5 VLP的動(dòng)物在 攻擊后存活至17天(此時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)束)。還在實(shí)驗(yàn)期間監(jiān)測了小鼠的體重，并繪制了存活小鼠的平均體重圖(圖26B)。在 攻擊之前施用1、5或15μ g印度尼西亞H5 VLP的小鼠在實(shí)驗(yàn)過程中沒有可覺察的體重?fù)p 失，特別是施用5yg VLP的小鼠似乎體重明顯增加。陰性對照小鼠(未用土耳其H5W攻 擊)沒有可覺察的體重增加或減輕。陽性對照小鼠(未施用VLP，但用土耳其H5W攻擊) 在實(shí)驗(yàn)過程中表現(xiàn)出體重顯著減輕，并且其中有3只小鼠死亡。由于體重是所有同組小鼠 的平均值，所以去除“患病最嚴(yán)重的”小鼠(死亡的3只)可導(dǎo)致體重明顯呈整體增加，然 而，需注意的是陽性對照組的平均體重仍然顯著低于陰性組或VLP處理組的平均體重。因此，這些數(shù)據(jù)表明，由植物生產(chǎn)的含有H5血凝素病毒蛋白的流感病毒VLP誘導(dǎo) 特異性針對病原性流感毒株的免疫應(yīng)答，并且病毒樣顆?？蓮闹参镔|(zhì)膜出芽。因此，這些數(shù)據(jù)表明，植物能夠生產(chǎn)流感病毒樣顆粒，并且還首次表明病毒樣顆粒 可從植物質(zhì)膜出芽。此外，使用現(xiàn)有的瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)，在得到靶標(biāo)HA序列后僅用16天就生產(chǎn)了第一批 抗原。按照當(dāng)前的H5 VLP產(chǎn)量，以及示例性的5 μ g/對象的劑量，每千克經(jīng)滲入的葉可生 產(chǎn)約20000劑疫苗。除了其它實(shí)施方案以外，這種平臺簡單、能大量生產(chǎn)以及具有強(qiáng)免疫原 性的獨(dú)特組合為響應(yīng)于大流行提供了新的方法。實(shí)施例13 使用體積排阻色譜表征植物提取物中含有血凝素的結(jié)構(gòu)通過凝膠過濾對由植物生產(chǎn)的不同亞型流感病毒血凝素組裝成高分子量結(jié) 構(gòu)進(jìn)行評估。通過體積排阻色譜(SEC)利用S印hacryl S-500HR柱(GE Healthcare Bio-Science Corp. , Piscataway, NJ, USA)對經(jīng) AGL1/660、AGL1/540、AGL1/783、AGL1/780 和AGL1/785滲入之植物的蛋白質(zhì)粗提物或經(jīng)濃縮蛋白質(zhì)提取物(1. 5mL)進(jìn)行分級分離。如 圖46所示，Blue Dextran (2MDa)洗脫物早在級分10中出現(xiàn)峰值。當(dāng)利用丙酮沉淀法將來 自200 μ L各SEC洗脫級分的蛋白質(zhì)濃縮(5倍)并通過Western印跡(圖46)分析時(shí)，血 凝素主要存在于級分7 14中，這表示HA已并入VLP中。不希望受理論限制，這表明HA 蛋白已被組裝成大的超級結(jié)構(gòu)或者其已附著于高分子量結(jié)構(gòu)上，而與所產(chǎn)生的亞型無關(guān)。實(shí)施例14 通過農(nóng)桿菌滲入在本塞姆氏煙草植物中瞬時(shí)表達(dá)季節(jié)性流感病毒血 凝素通過表達(dá)來自毒株A/布里斯班/59/2007 (HlNl) (774號質(zhì)粒)、A/新喀里多尼亞 /20/1999 (HlNl) (540號質(zhì)粒)以及A/所羅門群島/3/2006 (Hmi) (775號質(zhì)粒)的Hl亞型 來測定瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生季節(jié)性流感病毒血凝素的能力。首先將血凝素基因編碼序列組裝 在質(zhì)體藍(lán)素表達(dá)盒(苜蓿質(zhì)體藍(lán)素基因的啟動(dòng)子、5’UTR、3’UTR以及轉(zhuǎn)錄終止序列)中，將 所組裝的盒插入pCAMBIA 二元質(zhì)粒中。然后將所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到農(nóng)桿菌(AGLl)中，分別產(chǎn)生 農(nóng)桿菌株 AGLl/774、AGLl/540 和 AGL1/775。用AGL1/774、AGL1/540和AGL1/775滲入本塞姆氏煙草植物，并在6天培養(yǎng)期后收集葉。為了測定Hl是否累積在經(jīng)農(nóng)桿菌滲入的葉中，首先從經(jīng)滲入的葉組織中提取蛋白 質(zhì)，并用抗Hl抗體通過Western印跡進(jìn)行分析。檢測到提取物中約72kDa的獨(dú)特條帶(圖
47)，其大小對應(yīng)于流感病毒血凝素的未切割的HAO形式。這表明不同的年度流行毒株的血 凝素在經(jīng)滲入葉中的表達(dá)導(dǎo)致未切割翻譯產(chǎn)物的累積。實(shí)施例15 通過農(nóng)桿菌滲入在本塞姆氏煙草棺物中瞬時(shí)表汰潛在大流行流感病
毒血凝素通過表達(dá)來自毒株A/安徽/1/2005 (H5N1) (781號質(zhì)粒)、A/印度尼西亞 /5/2005 (H5N1) (660號質(zhì)粒)以及A/越南/1194/2004 (H5N1) (782號質(zhì)粒)的H5亞型來測 定瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生潛在流感病毒血凝素的能力。首先將血凝素基因編碼序列組裝在質(zhì)體 藍(lán)素表達(dá)盒(苜蓿質(zhì)體藍(lán)素基因的啟動(dòng)子、5’UTR、3’UTR以及轉(zhuǎn)錄終止序列)中，將所組裝 的盒插入pCAMBIA 二元質(zhì)粒中。然后將所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到農(nóng)桿菌(AGLl)中。用AGL1/781、AGL1/660和AGL1/782滲入本塞姆氏煙草植物，并在6天培養(yǎng)期后 收集葉。為了測定H5是否累積在經(jīng)農(nóng)桿菌滲入的葉中，首先從經(jīng)滲入的葉組織中提取蛋白 質(zhì)，并用抗H5抗體通過Western印跡進(jìn)行分析。檢測到提取物中約72kDa的獨(dú)特條帶(圖
48)，其大小對應(yīng)于流感病毒血凝素的未切割的HAO形式。這表明不同的潛在大流行毒株的 血凝素在經(jīng)滲入葉中的表達(dá)導(dǎo)致未切割的翻譯產(chǎn)物的累積。實(shí)施例16 通過農(nóng)桿菌滲入在普通煙草棺物中瞬時(shí)表汰H5通過表達(dá)來自毒株A/印度尼西亞/5/2005 (H5N1) (660號質(zhì)粒)的H5亞型來分析 瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)在普通煙草的葉中產(chǎn)生流感病毒血凝素的能力。首先將血凝素基因編碼序列 組裝在質(zhì)體藍(lán)素表達(dá)盒(苜蓿質(zhì)體藍(lán)素基因的啟動(dòng)子、5’ UTR,3' UTR以及轉(zhuǎn)錄終止序列) 中，將所組裝的盒插入pCAMBIA 二元質(zhì)粒中。然后將所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到農(nóng)桿菌(AGLl)中。用AGL1/660滲入普通煙草植物，并在6天培養(yǎng)期后收集葉。為了測定H5是否 累積在經(jīng)農(nóng)桿菌滲入的葉中，首先從經(jīng)滲入的葉組織中提取蛋白質(zhì)，并用抗H5抗體通過 Western印跡進(jìn)行分析。檢測到提取物中約72kDa的獨(dú)特條帶(圖49)，其大小對應(yīng)于未切 割的HAO形式的流感病毒血凝素。這表明血凝素在經(jīng)滲入普通煙草葉中的表達(dá)導(dǎo)致未切割 翻譯產(chǎn)物的累積。實(shí)施例17 由植物生產(chǎn)的來自A/印度尼西亞/5/05 (H5N1)的H5W VLP疫苗在雪 貂中的免疫原性在雪貂中進(jìn)行劑量漸增的研究以評價(jià)由植物生產(chǎn)的VLP的免疫原性。使用第一劑 疫苗后第14天(圖50A)和第二劑后第14天(圖50B)采集的血清，通過另外三種H5W毒株 (A/火雞/ 土耳其/1/05 (進(jìn)化枝2. 2)、A/越南/1194/04 (進(jìn)化枝1)以及A/安徽/5/05 (所 有均為失活全病毒))的血細(xì)胞凝集抑制來評價(jià)3種劑量(1、5和15yg)下H5VLP疫苗所 誘導(dǎo)血清抗體的體外交叉反應(yīng)性。在所有3種劑量濃度下，均觀察到交叉反應(yīng)性。實(shí)施例17 根據(jù)CHMP標(biāo)準(zhǔn)分析免疫原性結(jié)果EMEA ^AfflEiTzfeβπ^Λ^ (Committee for MedicinalProducts for Human Use7CHMP) (http://www. emea. europa. eu/htms/general/contacts/CHMP/CHMP. html)確立 了疫苗效力的三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)(適用于第二劑之后)1_血清轉(zhuǎn)換的數(shù)目或HI效價(jià)顯著增加(4 倍)> 40% ;2_幾何平均值增加至少2. 5 ；3-達(dá)到1/40HI效價(jià)的對象比例應(yīng)當(dāng)為至少70%。 在雪貂模型中對這些標(biāo)準(zhǔn)的分析示于表8 11中。(*)表示符合或超出CHMP標(biāo)準(zhǔn)。與用于頒發(fā)許可的CHMP標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)的交叉免疫原性分析的總結(jié)于表12中。每天評價(jià)動(dòng)物的體重、體溫和總體狀況。在研究期間沒有記錄到患病或不適的跡 象。在研究期間體重和體溫在正常范圍內(nèi)。所述疫苗是安全的并被研究動(dòng)物耐受。
表12 與用于頒發(fā)許可的CHMP標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)的交叉免疫原性分析的總結(jié) 實(shí)施例18 血凝素核苷酸序列的選擇從流感病毒序列數(shù)據(jù)庫(參見URL :flu. lanl. gov)或NCBI流感病毒源(參見 URL :ncbi. nlm. nih. gov/genomes/FLU/FLU. html)獲取 HA 的核苷酸序列。對于幾種 HA 核酸 序列而言，所述數(shù)據(jù)庫中列了多個(gè)條目(表13)。一些變異主要與培養(yǎng)體系(來源-MDCK、 蛋、未知、病毒RNA/臨床分離株)有關(guān)；例如，當(dāng)B型流感病毒在蛋的尿囊液中表達(dá)時(shí)，HA 的第194位(以成熟蛋白質(zhì)編號)的糖基化位點(diǎn)不存在(還參見Chen等，2008)。對一些 序列而言，可缺少結(jié)構(gòu)域(例如不完全克隆、測序假象等)。血凝素序列可分為5個(gè)結(jié)構(gòu)域 信號肽(SP)、HA1、HA2、跨膜(DTm)和胞質(zhì)尾。一個(gè)序列的結(jié)構(gòu)域可與另一已有序列的結(jié)構(gòu) 域相組合，例如一種毒株之序列的信號肽可與另一毒株血凝素編碼序列的平衡相組合以提 供完整的編碼序列。表13 流感病毒亞型中所選HA編碼序列的變異 Y，N-分別為是、否SP-信號肽序列的存在是/否HAl-全長HAl結(jié)構(gòu)域是/否HA2-全長HA2結(jié)構(gòu)域是/否
DTm-全長跨膜結(jié)構(gòu)域是/否
毒株A/所羅門群島/3/2006的Hl
比較了 8種氨基酸序列并鑒定了變異(表14)。在一些序列中，第171位表現(xiàn)出甘 氨酸(G)或精氨酸(R)變異。表14 =A/所羅門群島/3/2006的氨基酸變異 從起始M編號毒株A/布里斯班/59/2007的Hl第203位表現(xiàn)出天冬氨酸(D)、異亮氨酸(I)或天冬酰胺(N)變異。毒株A/布里斯班/10/2007的H3在5個(gè)位置觀察到序列變異(表15)。在兩個(gè)采樣序列的第215位觀察到缺失。表15 =A/布里斯班/10/2007的H3的氨基酸變異 *從起始M編號毒株A/威斯康星/67/2005的H3在該株的4個(gè)位置觀察到序列變異(表16)。表16 =A/威斯康星/67/2005的H3的氨基酸變異 *從成熟蛋白開始編號毒株B/馬來西亞/2506/2004的B型在兩個(gè)位置觀察到變異(表17)。第120位不是糖基化位點(diǎn)；第210位參與糖基 化；在蛋中培養(yǎng)之后該糖基化被消除。表17 來自B/馬來西亞/2506/2004的血凝素的氨基酸變異 *從SP中部開始編號毒株來自B/佛羅里達(dá)/4/2006的血凝素；ISDN261649所觀察的變異包括第211位的氨基酸序列變異，這取決于培養(yǎng)系統(tǒng)。在從MDCK細(xì) 胞分離的序列中觀察到天冬酰胺(N)，而在從蛋分離的序列中觀察到谷氨酸(D)。第211位 是糖基化位點(diǎn)，并且在蛋中培養(yǎng)后被消除。毒株來自A/新加坡/1/1957的H2
在6個(gè)位置觀察到序列變異(表18)。表18 來自A/新加坡/1/1957的H2的氨基酸變異 1從成熟蛋白開始編號毒株來自A/越南/1194/2004的H5以及來自A/安徽/1/2005的H5與這些H5株任一的一級序列比對，未觀察到氨基酸序列的變異。毒株來自A/水鴨/香港/W312/1997的H6毒株(AF250179)僅有一個(gè)條目可獲取。毒株來自A/馬/布拉格/56的H7在數(shù)據(jù)庫中總共發(fā)現(xiàn)2個(gè)序列條目。條目AB298877被排除在外，因此其是由實(shí)驗(yàn)
室重組的。毒株來自A/ 香港 /1073/1999 的 H9 ；AJ404626在數(shù)據(jù)庫中總計(jì)發(fā)現(xiàn)2個(gè)序列條目。只有一個(gè)是完整的。所有引文通過引用并入本文。本發(fā)明通過一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案進(jìn)行了描述。然而，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯 然的是，可在不背離權(quán)利要求中所述的本發(fā)明范圍的情形下進(jìn)行多種改動(dòng)和改進(jìn)。參考文獻(xiàn)Aymard,H M，M T Coleman,W R Dowdle,ff G Laver,G C Schild，and R Gffebster 1973 Influenza virus neuraminidase-inhibition test procedures Bullff H 0 48 199-202Bollag, D Μ. , Rozycki, M D, and Edelstein, S J (1996) Protein methods(2ndedition)ffiley-Liss, New York, USABligh, E G，& Dyer，W J Can J Med Sci 37,911-917(1959)Chen, B J, Leser, G P，Mor i ta，E，and Lamb R. A (2007) Influenza virushemagglutinin and neuraminidase, but not the matrix protein, are required forassembly and budding of plasmid—derived virus-like particles J Virol 81, 7111_7123Chen Z,Aspelund A,Jin H 2008 Stabilizing the glycosylation pattern of influenza Bhemagglutinin following adaptation to growth in eggs Vaccine vol 26ρ 361-371Crawford, J，Wilkinson, B，Vosnesensky, A，Smith，G，Garcia，M，Stone，H，and Perdue， M L(1999)Baculovirus-derived hemagglutinin vaccines protectagainst lethal influenza infections by avian H5 and H7 subtypes Vaccine 17，2265-2274Darveau, A，Pelletier, A & Perreault, J PCR-mediated synthesis of chimericmolecules Methods Neurosc. 26，77-85(1995)Grgacic EVL, Anderson DA.Virus-like particles passport to immune recognitionMethods 2006，40 60-65Gillim-Ross， L， and Subbarao, K(2006)Emerging respiratory viruses chanllengesand vaccine strategies Clin Microbiol Rev 19，614—636Gomez-Puertas， P， Mena， I， Castillo， M， Vivo, A， Perez-Pastrana, E and Portela，A (1999)Efficient formation of influenza virus-like particles dependence on theexpression level of viral proteins J Gen Virol 80， 1635-1645Gomez_Puertas，P，Albo，C，Perez-Pastrana, E，Vivo, A，and Portela, A(2000) Influenza Virus protein is the major driving force in virus budding J Virol 74， 11538-11547Hamilton，A，Voinnet, 0，Chappell，L & Baulcombe，D Two classes of shortinterfering RNA in RNA silencing. EMBO J 21，4671—4679 (2002)Hofgen, R & Willmitzer, L Storage of competent cells for Agrobacteriumtransformation Nucleic Acid Res 16,9877 (1988)Harbury PB, Zhang T，Kim PS, Alber T (1993)A switch between two—， three-, andfour—stranded coiled coils in GCN4 leucine zipper mutants Science ；262 1401-1407)Horimoto T， Kawaoka Y Strategies for developing vaccines against h5Nl influenzaa viruses Trends in Mol Med 2006，12(11) 506—514Huang Z，Elkin G，Maloney BJ, Beuhner N，Arntzen CJ, Thanavala Y，Mason HSVirus-Iike particle expression and assembly in plants hepatitis B and Norwalkviruses Vaccine 2005 Mar 7，23 (15) 1851-8Johansson, B E(1999)Immunization with influenza A virus hemagglutinin andneuraminidase produced in recombinant baculovirus results in a balanced andbroadened immune response superior to conventional vaccine Vaccine 17， 2073-2080Latham，T，and Galarza，J M (2001) Formation of wild-type and chimericinfluenza virus-like particles following simultaneous expression of only fourstructural proteins J Virol 75，6154-6165Lefebvre,B et al Plant Physiol 144，402-418 (2007)Leutwiler LS et al 1986 Nucleic Acid Sresearch 14910)4051—64Liu,L & Lomonossoff，G P Agroinfection as a rapid method for propagating Cowpeamosaic virus-based constructs J Virol Methods 105，343—348 (2002)
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核酸，其包含與在植物中有活性之調(diào)控區(qū)有效連接的編碼流感病毒血凝素(HA)的核苷酸序列。
2.權(quán)利要求1的核酸，其中所述流感病毒血凝素選自H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、 H10、H11、H12、H13、H14、H15 和 H16。
3.在植物中生產(chǎn)流感病毒樣顆粒(VLP)的方法，其包括a)將權(quán)利要求1的核酸導(dǎo)入所述植物或其部分中，以及b)在允許所述核酸表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述植物，從而產(chǎn)生VLP。
4.權(quán)利要求3的方法，其中在所述導(dǎo)入步驟(步驟a)中，所述核酸在植物中瞬時(shí)表達(dá)。
5.權(quán)利要求3的方法，其中在所述導(dǎo)入步驟(步驟a)中，所述核酸在植物中穩(wěn)定表達(dá)。
6.權(quán)利要求3的方法，其還包括以下步驟c)收獲所述宿主并純化所述VLP。
7.病毒樣顆粒(VLP)，其包含流感病毒HA蛋白以及一種或多種源自植物的脂質(zhì)。
8.權(quán)利要求7的病毒樣顆粒(VLP)，其中所述流感病毒HA蛋白是H5印度尼西亞。
9.組合物，其包含有效劑量的權(quán)利要求7之VLP以及可藥用載體。
10.誘導(dǎo)對象中針對流感病毒感染之免疫的方法，其包括施用權(quán)利要求7的病毒樣顆粒。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述病毒樣顆粒經(jīng)口、皮內(nèi)、鼻內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi) 或皮下施用給對象。
12.病毒樣顆粒(VLP)，其包含具有植物特異性N-聚糖或經(jīng)修飾N-聚糖的流感病毒HA。
13.組合物，其包含有效劑量的權(quán)利要求12之VLP以及可藥用載體。
14.誘導(dǎo)對象中針對流感病毒感染之免疫的方法，其包括施用權(quán)利要求13的組合物。
15.權(quán)利要求11的方法，其中所述組合物經(jīng)口、皮內(nèi)、鼻內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)或皮 下施用給對象。
全文摘要
本發(fā)明提供了在植物或植物部分內(nèi)合成流感病毒樣顆粒(influenzavirus-like particle，VLP)的方法。所述方法包括在植物中表達(dá)流感HA并通過體積排阻色譜進(jìn)行純化。本發(fā)明還涉及包含流感HA蛋白和植物脂質(zhì)的VLP。本發(fā)明還涉及編碼流感HA的核酸以及載體。所述VLP可用于配制流感疫苗，或者可用于充實(shí)現(xiàn)有的疫苗。
文檔編號C12N15/44GK101883856SQ200880107072
公開日2010年11月10日 申請日期2008年7月11日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月13日
發(fā)明者弗雷德里克·奧爾斯, 皮埃爾-奧列弗·拉瓦, 米凱萊·拉吉斯, 索尼婭·特雷帕尼耶, 納薩莉·蘭德里, 路易斯-菲利普·韋齊納, 馬克-安德烈·德奧斯特, 馬農(nóng)·科圖雷 申請人:麥迪卡格公司