專利名稱：：用于乙醇生產(chǎn)的嗜熱微生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及適合用于生產(chǎn)乙醇的微生物的生產(chǎn)。具體而言，本發(fā)明涉及使微生物能夠利用淀粉作為發(fā)酵底物的修飾。
背景技術(shù)：
：細(xì)菌代謝可以通過多種機制進(jìn)行，取決于細(xì)菌的種類和環(huán)境條件。包括所有病原體在內(nèi)的異養(yǎng)細(xì)菌由有機化合物的氧化來獲取能量，碳水化合物(特別是葡萄糖)、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)為最常見的可被氧化的化合物。細(xì)菌對這些有機化合物的生物氧化導(dǎo)致一種化學(xué)能源——ATP的合成。該過程還允許產(chǎn)生細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)行生物合成反應(yīng)所需的更加簡單的有機化合物(前體分子)。淀粉是一種豐富的天然碳水化合物，并且是植物中主要的葡萄糖貯存絡(luò)合物。淀粉分子由分別被稱為直鏈淀粉和支鏈淀粉的兩種多糖構(gòu)成。直鏈淀粉為含500-20000個D葡萄糖單元的線性聚合物，其經(jīng)由α-1，4糖苷鍵連接在一起形成螺旋結(jié)構(gòu)。另外存在α-1，6糖苷鍵可形成支鏈淀粉，這種淀粉具有一個分支結(jié)構(gòu)。淀粉通常包括20-30%的直鏈淀粉和70-80%的支鏈淀粉。在植物細(xì)胞中，不可溶的淀粉被包裝成固體顆粒，其中支鏈淀粉聚集在晶質(zhì)區(qū)域，而直鏈淀粉在整個顆粒的各處均有分布。淀粉的溶解度隨溫度而增加；支鏈淀粉晶體變成凝膠狀，顆粒最終解體。淀粉酶是一種鈣依賴性糖苷水解酶類金屬酶。存在三種形式的淀粉酶(α、β和Y)，所述淀粉酶的形式根據(jù)其水解的具體鍵而變化。α淀粉酶催化內(nèi)部a-D_l，4糖苷鍵的隨機水解，釋放簡單的發(fā)酵糖，包括葡萄糖、麥芽糖(由兩個葡萄糖單元形成的二糖)。糊精(短的低分子量0-1，4_連接的0葡萄糖聚合物)由支鏈淀粉水解釋放，而麥芽三糖和麥芽糖由淀粉酶水解釋放。β淀粉酶從淀粉鏈的非還原端開始起作用，催化第二個α-1，4糖苷鍵的水解以切割出兩個葡萄糖單元(麥芽糖)。Y淀粉酶具備切割支鏈淀粉中α-1，6鍵的能力。α淀粉酶在自然界中被廣泛合成，理由是許多生物體可以消化淀粉。在人體生理學(xué)中，α淀粉酶主要存在于唾液和胰液中。微生物α淀粉酶分為溶解型(隨機切割多糖以形成短鏈)或糖化型(產(chǎn)生單糖、二糖或三糖單元)，取決于對葡萄糖聚合物鏈進(jìn)行水解的位點。細(xì)菌對合適底物進(jìn)行代謝的一般過程是糖酵解，它是將葡萄糖轉(zhuǎn)化為丙酮酸并產(chǎn)生ATP的一系列反應(yīng)。丙酮酸在產(chǎn)生代謝能過程中的代謝方向根據(jù)微生物和環(huán)境條件會不同。四種主要的丙酮酸反應(yīng)在圖1中示出。第一種反應(yīng)，在有氧條件下，許多微生物可利用檸檬酸循環(huán)并由丙酮酸脫氫酶(PDH)催化將丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A產(chǎn)生能量。第二種反應(yīng)，在缺氧條件下，某些產(chǎn)乙醇的生物可以通過下述途徑進(jìn)行乙醇發(fā)酵由丙酮酸脫羧酶(PDC)催化將丙酮酸脫羧成乙醛，并隨后由乙醇脫氫酶(ADH)催化通過NADH將乙醛還原為乙醇。第三種反應(yīng)，也是在缺氧條件下，由丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)催化將丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶Α。乙酰輔酶A隨后被乙醛脫氫酶(AcDH)轉(zhuǎn)化為乙醛，并且由ADH催化通過還原乙醛產(chǎn)生乙醇。第四種反應(yīng)為通過乳酸脫氫酶(LDH)的催化將丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸。目前利用微生物來生產(chǎn)乙醇的研究已受到諸多關(guān)注，這些研究利用了可進(jìn)行天然無氧發(fā)酵的微生物或利用了整合有丙酮酸脫羧酶和乙醇脫氫酶基因的重組微生物。使用這類經(jīng)修飾以增強對作為代謝底物的淀粉的利用的微生物，能夠由廉價的、豐富的、未精制的植物材料有效地生產(chǎn)乙醇。嗜熱細(xì)菌已被提出用于乙醇生產(chǎn)，并且使用它們的優(yōu)勢是可使發(fā)酵在較高的溫度下進(jìn)行，這使得所產(chǎn)生的乙醇在50°c以上的溫度下有可能作為蒸氣移除；這還允許使用較高的底物濃度進(jìn)行發(fā)酵。然而，需要用于由淀粉基培養(yǎng)基生產(chǎn)乙醇的改良微生物。
發(fā)明內(nèi)容根據(jù)本發(fā)明的第一方面，對一種嗜熱微生物進(jìn)行修飾以與野生型相比增加淀粉酶基因表達(dá)，其中第一種修飾為插入一種異源淀粉酶基因，該基因處于一種適合的啟動子或一系列不同啟動子的控制之下。還可對所述微生物進(jìn)行進(jìn)一步修飾以使得乙醇生產(chǎn)增加，所述修飾為上調(diào)天然丙酮酸脫氫酶基因，以及使天然丙酮酸甲酸裂解酶和乳酸脫氫酶基因失活。本發(fā)明的微生物與野生型相比顯示出增強的淀粉水解和增加的乙醇生產(chǎn)。根據(jù)本發(fā)明的第二方面，一種用于生產(chǎn)乙醇的方法包括，在存在淀粉的情況下，在適合的條件下培養(yǎng)根據(jù)上文的定義的微生物。參照附圖來描述本發(fā)明，其中圖1圖解示出了糖酵解的代謝途徑；圖2示出了pGEM-τEasy載體；圖3示出了推定的PDH復(fù)合體的啟動子區(qū)域和基因；圖4示出了使用pTMOlll對淀粉酶基因——amyS進(jìn)行整合；圖5為amyS的核酸編碼序列；圖6的曲線圖示出了TM304菌株在5%w/v可溶性淀粉培養(yǎng)物中的分批發(fā)酵結(jié)果；禾口圖7的曲線圖示出了TM333菌株在5%w/v可溶性淀粉培養(yǎng)物中的分批發(fā)酵結(jié)果。具體實施例方式本發(fā)明基于對嗜熱微生物進(jìn)行修飾以使得淀粉酶基因表達(dá)增強。淀粉酶基因表達(dá)的增加使得所述微生物可以將淀粉水解為葡萄糖單體單元，所述葡萄糖單體單元隨后可以被用作糖分解底物用于形成丙酮酸，然后形成乙醇。增加淀粉酶表達(dá)和酶活性的方法優(yōu)選地包括使用強的上游啟動子來調(diào)節(jié)該基因的轉(zhuǎn)錄，以及整合表達(dá)頻率高于天然淀粉酶基因的其他淀粉酶基因?？蓪Ρ景l(fā)明的嗜熱微生物進(jìn)行進(jìn)一步的修飾，以破壞天然乳酸脫氫酶基因的表達(dá)和上調(diào)PDH基因。乳酸脫氫酶基因的失活有助于阻止丙酮酸分解為乳酸，從而通過使用丙酮酸脫羧酶和乙醇脫氫酶(在合適的條件下)促進(jìn)丙酮酸分解為乙醇。優(yōu)選地，通過基因內(nèi)缺失或者通過基因缺失來破壞乳酸脫氫酶基因。上調(diào)PDH基因可促進(jìn)丙酮酸轉(zhuǎn)化成乙酰輔酶A，在合適的條件下乙酰輔酶A可用于產(chǎn)生乙醛，并且最終使用乙醛脫氫酶產(chǎn)生乙醇。上調(diào)PDH的另一個優(yōu)點是可降低丙酮酸水平，丙酮酸對葡萄糖攝取和糖酵解具有抑制效應(yīng)。這也會促進(jìn)乙醇的產(chǎn)生。本文所定義的術(shù)語“強啟動子”是指使對應(yīng)蛋白的表達(dá)水平超過0.5%的細(xì)胞內(nèi)可溶性蛋白的啟動子。所述微生物可以是任何嗜熱微生物，但優(yōu)選地，所述微生物為桿菌屬(Bacillus)種。具體而言，所述微生物優(yōu)選為地芽胞桿菌屬(Geobacillus)種的野生型微生物，特別是熱葡糖苷酶地芽孢桿菌(Geobacillusthermoglucosidasius)。在優(yōu)選的實施方案中，被選擇進(jìn)行修飾的微生物被稱為“野生型”，即它們不是實驗室產(chǎn)生的突變體。所述微生物可從預(yù)計含有嗜熱生物的環(huán)境樣品中分離。分離的野生型微生物具有有限的淀粉酶活性，但當(dāng)在含有淀粉作為主要碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時該淀粉酶活性不足以進(jìn)行乙醇生產(chǎn)。分離的野生型微生物具有從丙酮酸產(chǎn)生乙醇的能力，但由于沒有經(jīng)過修飾，乳酸可能會是主要的發(fā)酵產(chǎn)物。優(yōu)選地，本發(fā)明的微生物具有某些所需的特征，所述特征使得可在發(fā)酵過程中使用該微生物。所述微生物應(yīng)優(yōu)選地不具有限制系統(tǒng)，由此避免需要進(jìn)行體內(nèi)甲基化。優(yōu)選地，所述微生物可以被高頻率轉(zhuǎn)化。此外，所述微生物應(yīng)在至少3%w/v乙醇，優(yōu)選至少5-10%w/v乙醇的條件下是穩(wěn)定的。所述微生物在連續(xù)培養(yǎng)中的生長速率應(yīng)能支持0.31Γ1及以上的稀釋速率。所述微生物應(yīng)是嗜熱生物并可在40°C_85°C的溫度范圍內(nèi)生長。優(yōu)選地，所述微生物可在50°C-7(TC的溫度范圍內(nèi)生長。另外，微生物的理想生長條件在pH7.2或以下，尤其是PH4.5-pH6.9。所述培養(yǎng)基優(yōu)選包含至少1%w/v的淀粉，優(yōu)選至少10%w/v的淀粉，最優(yōu)選至少20%w/v的淀粉。淀粉可以是可溶性的或不可溶的(例如谷物淀粉)。所述培養(yǎng)基的其他優(yōu)選組分可包括但不限于表1中所列出的那些。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>*通過在每IOmlDMSO中溶解0.Ig生物素來制備〃葡萄糖終濃度優(yōu)選地為1-4%w/v硫酸鹽微量元素儲備溶液的組分在表2中示出。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>在一個優(yōu)選的實施方案中，一種異源淀粉酶基因編碼α-淀粉酶(α-1，4_葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，EC3.2.1.1)。優(yōu)選地，所述淀粉酶基因源自地芽胞桿菌屬種，特別是嗜熱脂肪地芽胞桿菌(Geobacillusstearothermophilus)。α-淀粉酶的編碼序列已被闡明，并且能夠分離和擴(kuò)增該基因的技術(shù)在本領(lǐng)域中是公知的。為了使得本發(fā)明的微生物與野生型相比能夠表現(xiàn)出增加的淀粉酶表達(dá)，優(yōu)選將所述淀粉酶基因置于強啟動子的控制之下，所述強啟動子在有利于嗜熱微生物生產(chǎn)乙醇的低通氣條件或缺氧條件下起作用。所述啟動子優(yōu)選為Idh啟動子，其可以是自體同源的，但是優(yōu)選是異源的，最優(yōu)選來自與所述淀粉酶基因相同的物種。適合的啟動子的實例包括但不限于嗜熱脂肪地芽胞桿菌NCA1503的P_ldh、嗜熱脂肪地芽胞桿菌DSM13240的P_ferrA和賭質(zhì)芽孢桿菌(B.cereus)ATCC14579的P_pfl。在本發(fā)明的另一個實施方案中，將一系列不同的強啟動子置于所述淀粉酶基因的上游以進(jìn)一步增強表達(dá)。適合的強啟動子的實例包括但不限于嗜熱脂肪地芽胞桿菌NCA1503的甘油醛3-磷酸啟動子(P_GAPDH)和淀粉酶啟動子。P_ldh的核酸序列也是已知的，并且用于將啟動子序列克隆和組裝到所述淀粉酶基因上游的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的?？梢詫幼?淀粉酶序列克隆到均含有多個限制性酶切位點的適合質(zhì)粒或表達(dá)載體中。存在許多市售的適合表達(dá)載體，例如pGEM-TEasy載體(圖2)。可以使用限制性內(nèi)切酶將所述P_ldh/淀粉酶構(gòu)建體切割為特定的片段，所述片段可被連接至溫度敏感型質(zhì)粒如pUC19(NewEnglandBiolabs)的相應(yīng)限制性酶切位點中。優(yōu)選使用丙酮酸甲酸裂解酶敲除質(zhì)粒。然后將含有所述淀粉酶基因/Idh啟動子的質(zhì)粒構(gòu)建體電穿孔至本發(fā)明的微生物中，并且實現(xiàn)與基因組DNA的同源重組?？梢愿鶕?jù)染色體整合體對抗菌劑(如氨芐青霉素或卡那霉素)的抗性來對其進(jìn)行選擇。淀粉酶活性還可以例如在進(jìn)行板測定時被顯示為淀粉清亮區(qū)域。在一個優(yōu)選的實施方案中，還可通過使乳酸脫氫酶基因失活來對本發(fā)明的微生物進(jìn)行進(jìn)一步修飾。乳酸脫氫酶的核酸序列現(xiàn)在是已知的。技術(shù)人員通過使用該序列可以靶向乳酸脫氫酶基因以通過不同不同機制使該基因失活?？梢酝ㄟ^插入轉(zhuǎn)座子使乳酸脫氫酶基因失活。然而，優(yōu)選通過缺失乳酸脫氫酶基因序列或該基因序列的一部分來使其失活。優(yōu)選進(jìn)行缺失，因為這可避免該基因序列被再激活的問題，使用轉(zhuǎn)座子失活時經(jīng)常會遇到這個問題。在一個優(yōu)選的實施方案中，乳酸脫氫酶基因通過溫度敏感型質(zhì)粒(例如PCT/GB06/01586中所公開的質(zhì)粒pUB190_ldh)的整合來失活，這實現(xiàn)了所述質(zhì)粒與所述微生物染色體之間的天然同源重組或整合?？梢愿鶕?jù)染色體整合體對抗菌劑的抗性來對其進(jìn)行選擇。整合至乳酸脫氫酶基因可通過單次交叉重組事件或通過兩次(或多次)交叉重組事件來進(jìn)行。在另一個優(yōu)選的實施方案中，對所述微生物進(jìn)行進(jìn)一步修飾以上調(diào)PDH。PDH是一種大的酶復(fù)合體，包含三個單位——El:丙酮酸脫羧酶(EC1.2.4.1，非EC4.1.1.1)、E2二氫硫辛酰胺乙酰基轉(zhuǎn)移酶和E3二氫硫辛酰胺脫氫酶。該復(fù)合體需要幾種輔因子，其中包括NAD、FAD、輔酶A硫辛酸和硫胺素焦磷酸(TPP)。四個基因編碼該復(fù)合體，這是因為單位El是α和β亞基的異源二聚體，這四個基因一般被稱為pdhA、pdhB、pdhC和pdhD(分別對應(yīng)于Elα、Elβ、E2禾口Ε3)。PDH的單位El以與PDC(EC4.1.1.1)需要TPP的方式相同的方式需要TPP，并催化類似的脫羧反應(yīng)，不同之處是在存在輔酶A和硫辛酸時——由其他酶單位進(jìn)行——產(chǎn)物是乙酰輔酶A而不是乙醛。然而，在單位El未與PDH中其他單位復(fù)合的時候，已經(jīng)測定到了它的PDC活性(Lessard&Perham；TheJournalofBiologicalChemistry；1994，26914，10378—10383；Tomaretal；AppliedMicrobiologyandBiotechnology；2003,62,76-82；Franketal；Science；2004,306:0ct29,872-876,補充數(shù)據(jù))。因此，可通過上調(diào)PDH提高EC1.2.4.1的PDC活性，使得乙醛的產(chǎn)生超過及高于乙酰輔酶A。還尋求通過提高的PDH活性來消除出現(xiàn)于LDH失活株中的丙酮酸瓶頸，以使得產(chǎn)生更多的乙醇及更少的副產(chǎn)物乙酸和甲酸。為此，使用標(biāo)準(zhǔn)的“基因組行走(genomewalking)”技術(shù)分離了所述PDH基因和周圍序列。分離到了約8.Skb的DNA，對其進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)其包含圖3和表3中所示的以下基因。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>推定的啟動子區(qū)域顯示于圖3中(箭頭)——一個來自pdhA起始位點的上游區(qū)，以及PdhB前面可能的第二啟動子。以前已經(jīng)報道了枯草桿菌(Bacillussubtilis)的PDH簇中的第二啟動子的實例(GaoetalJournalofBacteriology,2002,18410,2780-2788)，但是大多數(shù)有記載的PDH基因簇僅具有一個位于簇上游的啟動子(Nevelingetal；BiochimicaActa;19981385，367-372)。可以使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)進(jìn)行所述上調(diào)。具體而言，上調(diào)可以通過在PDH復(fù)合體的上游引入合適的啟動子或增強子序列進(jìn)行。已知該酶復(fù)合體在有氧和缺氧兩種條件下都發(fā)揮功能(Carlssonetal；InfectionandImmunity；1985，49:3，674-678)，但一般認(rèn)為它是需氧酶(Ch15；PrinciplesofBiochemistry；Lehninger,Nelson&Cox；2ndEd,WorthPublishers,NewYork，1993，p447)，并以丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)為它的缺氧條件的對應(yīng)物。這兩種酶都將糖酵解中形成的丙酮酸轉(zhuǎn)化成乙酰輔酶A，以進(jìn)料至TCA循環(huán)，但TCA循環(huán)僅在有氧條件下完全工作。然而，由于需要使用無氧條件，因此本發(fā)明優(yōu)選使用在缺氧條件下起作用的啟動子。因此，可以使用被認(rèn)為在缺氧條件下起作用的酶的啟動子——實例有LDH啟動子(來自嗜熱脂肪地芽胞桿菌NCA1503&P_ldh)、PFL啟動子(來自蠟質(zhì)芽孢桿菌ATCC14579和熱葡糖苷酶地芽孢桿菌NCIMBl1955的P_pf1)和鐵氧還蛋白啟動子(來自嗜熱脂肪芽胞桿菌DSM13240的P_ferrA)，如通過引用的方式納入本文的PCT/GB2007/03699中所述。在一個優(yōu)選的實施方案中，引入另一個修飾以增強PDC活性，從而促進(jìn)丙酮酸向乙醛的轉(zhuǎn)化。這可以通過激活E2；二氫硫辛酰胺乙?；D(zhuǎn)移酶(EC2.3.1.12)來實現(xiàn)?？梢砸灶愃朴谑筁DH失活的方式進(jìn)行失活，不同之處是E2基因作為破壞的靶位。在另一個實施方案中，本發(fā)明的微生物還包含另一個修飾以使丙酮酸甲酸裂解酶基因失活，從而防止/減少丙酮酸向乙酰輔酶A和甲酸的轉(zhuǎn)化。丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)是丙酮酸脫氫酶(PDH)的“缺氧條件的對應(yīng)物”，它將丙酮酸轉(zhuǎn)化成乙酰輔酶A和甲酸(見圖1)。雖然乙酰輔酶A可經(jīng)乙醛脫氫酶(AcHD)轉(zhuǎn)化成乙醇，但甲酸是一種可能會抑制產(chǎn)乙醇生物生長的不利的副產(chǎn)物。選擇PFL作為敲除的靶位，目的是為了促進(jìn)代謝流向乙醇產(chǎn)生方向，并且是為了改良其余乙醇合成途徑的氧化還原平衡。該工作的另一個優(yōu)點是消除甲酸的產(chǎn)生?？梢酝ㄟ^轉(zhuǎn)座子插入、基因缺失或部分基因缺失來使PFL失活，以產(chǎn)生一個不依賴于抗生素選擇來延續(xù)改變的表型的突變體。在該實施方案中，所述微生物優(yōu)選同時包含乳酸脫氫酶的失活及丙酮酸脫氫酶的上調(diào)，從而使得在缺氧條件下乙醇產(chǎn)生增加。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述微生物將還包含異源丙酮酸脫羧酶和醇脫氫酶基因。這些異源基因的表達(dá)會產(chǎn)生能夠重定向代謝方向以使得乙醇成為主要發(fā)酵產(chǎn)物的酶。這種基因可從通常進(jìn)行無氧發(fā)酵的微生物中獲得，所述微生物包含發(fā)酵單胞菌屬(zymomonas)禾中，包含運動發(fā)酵單胞菌(zymomonasmobilis)。制備這些基因并將其整合到微生物中的方法是已知的，例如見Ingrametal,Biotech&BioEng,1998；58(2+3):204_214和US5916787，上述每篇文獻(xiàn)的內(nèi)容均通過引用的方式納入本文。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)知曉，該基因可以被引入到質(zhì)粒中或者被整合到染色體中。可以通過使用可溶性淀粉作為原料的一部分來培養(yǎng)本發(fā)明微生物?？梢愿鶕?jù)已知的培養(yǎng)需求來選擇溫度、PH和其他生長條件?，F(xiàn)在將在下述實施例中參照附圖描述本發(fā)明的一個實施方案。用于在熱葡糖苷酶地芽孢桿菌NCIMB11955基因組中生成嗜熱脂肪地芽胞桿菌DSM22α-淀粉酶基因的整合體的兩種方法在下文中示出。通過這些方法舉例說明而非限制本發(fā)明。實施例淀粉酶基因的整合方法1使用源自現(xiàn)有克隆pGEM-LA的NotI片段的快速通道策略(Fast-trackstrategy)通過使用本領(lǐng)域中公知的技術(shù)，利用PCR生成α-淀粉酶序列(amyS)并且將其連接至源自11955的Idh啟動子(P_ldh)上。將該構(gòu)建體克隆到市售的pGEM-TEasy表達(dá)載體中，生成pGEM-LA。如圖2中所示，PGEM-TEasy載體中的連接位點側(cè)接有多個限制性酶切位點。因此可以切割Notl/NotI片段上插入的P_ldh/淀粉酶序列。將源自pGEM-LA的NotI片段連接到所述pf1敲除質(zhì)粒構(gòu)建體pTMOl11的NotI位點中，以生成兩種同胞質(zhì)粒構(gòu)建體PTM0139和pTM0140。和經(jīng)由電穿孔將這些質(zhì)粒導(dǎo)入到穩(wěn)定的PFL陰性11955菌株TM242中。在68°C下選擇推定的整合體。通過以下方式測試原代轉(zhuǎn)化體(自體同源質(zhì)粒)和原代整合體的淀粉酶生產(chǎn)，即將其以補片(patch)形式于60°C下在TGP+0.4%可溶性淀粉平板上生長3天，然后用革蘭氏碘溶液進(jìn)行液泛。與DSM22對照相比，在這些菌株周圍見到大的清亮區(qū)域(淀粉水解)。在該測試中TM242顯示出遠(yuǎn)低于DSM22的微弱活性，表明存在某些背景活性。將原代整合體在不含卡那霉素的液體培養(yǎng)中傳代培養(yǎng)，然后讓菌落在TGP卡那霉素上復(fù)制，以鑒別潛在的雙交叉突變體(DCO)。在TGP+0.4%可溶性淀粉上測試了總計32個卡那霉素敏感性菌落的淀粉酶活性(12孔Costar板，每孔中3ml，在60°C下培養(yǎng)3天)。除陽性對照DSM22夕卜，沒有大的清亮區(qū)域。大多數(shù)菌株顯示出與TM242類似的微量清亮，但是5種顯示出不大但仍然明顯的清亮區(qū)域。對這些菌株中的兩種——TM319和TM320的基因組制品進(jìn)行診斷PCR,使用簡并引物bamr66a和bamr72，所述引物是基于已知的芽胞桿菌PFL序列之間的序列同源性設(shè)計的。對于這兩種菌株，均獲得了一種約3.Ikb的單PCR產(chǎn)物，將其用NotI消化會產(chǎn)生約0.6kb的雙帶和一條約2.Okb的帶。這與預(yù)計的基因置換/插入一致。對照顯示出預(yù)計的結(jié)果，由11955(野生型)獲得未用NotI切割的約1.7kb的產(chǎn)物，以及由TM242獲得約1.3kb的產(chǎn)物，所述1.3kb的產(chǎn)物用NotI消化時可產(chǎn)生約0.6kb的雙帶。因此，這些菌株(TM319和TM320)表明所述淀粉酶構(gòu)建體整合到pfl基因座上。方法2生成帶有P_ldh(NCA)啟動子的淀粉酶構(gòu)建體用于將源自DSM22的淀粉酶編碼序列置于P_ldh(NCA)控制之下的策略在圖4中示出。pTM031為一種含有插入至pUC19(NEB)多克隆位點(mcs)中的ECORl/SnaBlpUBllO片段的質(zhì)粒載體。使用pGEM-LA構(gòu)建體為模板，經(jīng)由PCR將所述淀粉酶編碼序列擴(kuò)增為一條NdeI/NotI片段。使用pTM049(通過將P_ldh(NCA1503)克隆到pTM023中產(chǎn)生)為模板將P_Idh(NCA)擴(kuò)增為一條Ndel/NotI片段，并且將產(chǎn)物克隆和組裝到pTM023(移除NdeI位點的PUC19)中以生成插入(基因置換)構(gòu)建體PTM0146和pTM0147(同胞質(zhì)粒)。表4詳述了用于生成用于插入到11955中的P_ldh(NCA)/amyS構(gòu)建體的PCR組分。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>淀粉酶克隆的測序?qū)⑹褂胋amr87和bamr88寡核苷酸(參見表4)生成的淀粉酶編碼序列的克隆PCR產(chǎn)物測序以檢查完整性。對兩個獨立的克隆進(jìn)行測序。每個均顯示出不同的單堿基對突變，其大概是通過PCR引入的。選擇使用的克隆為pTM0135(將PCR產(chǎn)物平端連接到pTM023的SmaI位點中得到)。如利用公開的嗜熱地芽胞桿菌(G.kaustophilus)的密碼子選擇所判斷的，該克隆中的PCR誘導(dǎo)突變代表一種沉默突變，顯示出相同的氨基酸和類似的密碼子選擇。源自PTM0135的淀粉酶編碼序列(刪除起始密碼子)在圖5中示出。對應(yīng)于該序列與所述公開的DSM22amyS序列(登錄號M57457)之間差異的核苷酸用下劃線標(biāo)出。在所述PTM0135序列(覆蓋15bp)和所公開的DSM22amyS序列(M57457)之間存在9個差異。在位置1449處的錯配代表pTM0135中的PCR誘導(dǎo)的突變。對pTM0139(其具有源自pGEM-LA的NotI片段)中的淀粉酶插入片段的測序結(jié)果顯示與pTM0135完全一致(除所述第1449bp處突變外)。然后利用PCR直接從嗜熱脂肪地芽胞桿菌DSM22基因組DNA(該菌株獲取自DSMZ收藏中心(DSMZcollection))中擴(kuò)增所述淀粉酶編碼序列。將所獲得的PCR產(chǎn)物(使用上文所述的bamr87和88寡核苷酸)克隆至pTM023中(以產(chǎn)生pTM0145)并且將其測序。除第904bp之外，該序列與pTM0135(除第1449bp突變之外)和pTM0139相同。在pTM0135和pTM0139中，第904bp為“A”，而在PTM0145中為“G”。這樣在該位置會引入一個從天冬氨酸向天冬酰胺的突變。已證明該密碼子(天冬氨酸的GAC)在所有檢測的地芽孢桿菌淀粉酶序列中都是保守的，因此這可能是在從DSM22通過PCR克隆淀粉酶序列過程中引入的一個突變。所述序列中的其他差異不得不認(rèn)為是所述公開序列中的錯誤；與其他地芽孢桿菌淀粉酶序列的比對表明該序列(即在PTM0135和pTM0145中)遠(yuǎn)比所述公開序列(M57457)更接近共有序列。盡管存在所述904突變，仍然使用pTM0145和pTM0146構(gòu)建體繼續(xù)進(jìn)行實驗研究，因為很顯然源自pGEM-LA的所述克隆NotI片段確實在淀粉平板上顯示出了明顯的淀粉酶活性。pTM0145和pTM0146(P_ldh(NCA)/amyS)的DCO的生成和表征通過電穿孔將pTM0145和pTM0146導(dǎo)入TM242中，并且如上文所示步驟選擇推定的雙交叉(DCO)突變體。用平板測定法測試了總計48個推定DCO(卡那霉素敏感的)的淀粉酶活性。18個給出非常強的淀粉酶活性(其他看上去與對照TM242類似)。當(dāng)被貼到較大的扇形板上時，其顯示出至少與DSM22對照一樣大的清亮區(qū)域。選擇這些菌株中的四種——TM304、TM305、TM311和TM315，用于進(jìn)一步的研究。制備基因組DNA，用于診斷PCR。所有四種菌株的結(jié)果均表明amyS基因插入到pfl基因座上。首先以葡萄糖作為碳源，然后以可溶性淀粉作為碳源，在ASYE(0.5%)中測試了兩種淀粉酶突變體菌株——TM304和TM305的乙醇產(chǎn)生。測試分別在低充氣條件和高充氣條件下進(jìn)行。結(jié)果在表5中示出。在高和低充氣模型中，TM304和TM305從可溶性淀粉產(chǎn)生的乙醇量都與從葡萄糖產(chǎn)生的乙醇量相當(dāng)。TM242使用淀粉產(chǎn)生的乙醇水平明顯低于使用葡萄糖，但是該效應(yīng)在較高充氣條件下非常不明顯。但使用葡萄糖進(jìn)行培養(yǎng)時，TM304和TM305產(chǎn)生的乙醇量與TM242類似，而當(dāng)用淀粉培養(yǎng)這三種菌株時，顯而易見的是，TM304和TM305的超強的淀粉酶功能使得這些微生物可以將基本上全部的淀粉轉(zhuǎn)化為乙醇。在低充氣條件下，使用淀粉產(chǎn)生乙醇的水平與使用葡萄糖產(chǎn)生乙醇的水平幾乎相同，而TM242由淀粉產(chǎn)生乙醇的能力約為其將葡萄糖轉(zhuǎn)化為乙醇的能力的三分之一。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>*對殘余淀粉進(jìn)行測試；0.5ml培養(yǎng)物+0.2ml革蘭氏碘。除那些標(biāo)記的之外均為陰性。接種物；100μ1冷凍儲液接種；50ml錐形管中的IOml2TY，52°C0/N,250rpm,Iml轉(zhuǎn)移緩沖液(10%)生產(chǎn)；15或20mlfalcon管中的IOmlASYE(0.5%)+C源，60°C，250rpm，24小時在5%w/v可溶性淀粉中培養(yǎng)的菌株TM304的分批發(fā)酵結(jié)果在圖6中示出。使用革蘭氏碘進(jìn)行的簡單測試表明，DCO與TM242不同，它水解了所有的淀粉。這些結(jié)果清楚地支持了處于P_ldh(NCA)啟動子控制之下的插入異源淀粉酶對于低充氣條件下淀粉利用的實用性。pTM0150和pTM0151(P_ldh(NCA)/amyS-無突變)的DCO的生成和表征將源自DSM22基因組DNA的新amySPCR產(chǎn)物用于生成“空白"DC0構(gòu)建體，命名為PTM0150和pTM0151。這兩種質(zhì)粒含有以反方向插入至pfl基因中的P_ldh(NCA)。pTM0150中的與Pfl轉(zhuǎn)錄方向相同。PTM0151中的與pfl方向相反，如pTM0146和pTM0147中的P_Idh(NCA)那樣。從兩種質(zhì)粒形成DC0，并通過PCR驗證源自每種質(zhì)粒的兩個突變體(源自PTM0150的TM328和329，源自pTM0151的TM333和335)。對兩種淀粉酶突變體-TM304和TM305進(jìn)行了測試。首先以2%w/v葡萄糖作為碳源，然后以2%w/v可溶性淀粉作為碳源，最后以3%w/v可溶性淀粉作為碳源，在ASYE(0.5%)中在低充氣條件下測試所有四種突變體菌株以及TM304、TM305和TM242的乙醇產(chǎn)生。表6中所示的結(jié)果表明，所有突變體菌株在2%w/v可溶性淀粉中表現(xiàn)得基本同樣好，產(chǎn)生的乙醇量為親株TM242的兩倍多。在3%w/v淀粉中，TM333產(chǎn)生了比其他突變體更多的乙醇以及在淀粉板上更大的清亮區(qū)域，表明TM333可能是優(yōu)于TM304的乙醇生產(chǎn)菌株。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>這些結(jié)果被ΤΜ333分批發(fā)酵(在與菌株ΤΜ304發(fā)酵相同的條件下進(jìn)行(圖6))的結(jié)果支持，在圖7中示出，并且這些結(jié)果表明ΤΜ333能夠利用從淀粉釋放的全部葡萄糖。進(jìn)行比較測試以確保突變體菌株ΤΜ304和ΤΜ333以與親株ΤΜ242類似的方式進(jìn)行，并且沒有形成任何不需要的突變。結(jié)果在表7Α和7Β中示出。表7Α<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>表7Β<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>權(quán)利要求一種嗜熱微生物，包括一種與野生型相比增加淀粉酶基因表達(dá)的修飾。2.權(quán)利要求1的微生物，其中所述修飾為將一種異源淀粉酶基因插入至所述嗜熱微生物的基因組中，該基因處于一個適合的啟動子的控制之下。3.權(quán)利要求2的微生物，其中所述啟動子在缺氧條件下起作用。4.權(quán)利要求3的微生物，其中所述啟動子為Idh啟動子。5.權(quán)利要求4的微生物，其中所述Idh啟動子為自體同源的。6.權(quán)利要求4的微生物，其中所述Idh啟動子為異源的。7.權(quán)利要求6的微生物，其中所述Idh啟動子來源自嗜熱脂肪地芽胞桿菌(Geobacillusstearothermophilus)08.權(quán)利要求2的微生物，其中所述淀粉酶處于一系列強啟動子的控制之下。9.權(quán)利要求8的微生物，其中所述強啟動子為異源的。10.權(quán)利要求9的微生物，其中所述強啟動子包括3-磷酸甘油醛脫氫酶啟動子。11.權(quán)利要求9的微生物，其中所述強啟動子包括淀粉酶啟動子。12.權(quán)利要求10或11的微生物，其中所述啟動子來源自嗜熱脂肪地芽胞桿菌。13.前述權(quán)利要求任一項的微生物，還包含一種使天然乳酸脫氫酶基因失活的修飾。14.權(quán)利要求13的微生物，其中所述乳酸脫氫酶基因或其一部分已被缺失。15.權(quán)利要求13或其從屬權(quán)利要求的微生物，其中所述微生物的乳酸脫氫酶基因中不含整合元件。16.前述權(quán)利要求任一項的微生物，還包含一種使天然丙酮酸甲酸裂解酶基因失活的修飾。17.權(quán)利要求16的微生物，其中所述丙酮酸甲酸裂解酶基因或其一部分已被缺失。18.前述權(quán)利要求任一項的微生物，還包括一種上調(diào)丙酮酸脫氫酶基因的修飾。19.權(quán)利要求18的微生物，其中將一個基因啟動子插入至所述丙酮酸脫氫酶基因的上游，并且其中所述啟動子在缺氧條件下起作用。20.前述權(quán)利要求任一項的微生物，還包含一種上調(diào)丙酮酸脫羧酶活性的修飾。21.權(quán)利要求20的微生物，其中所述修飾使天然二氫硫辛酰胺乙?；D(zhuǎn)移酶基因(EC2.3.1.12)失活。22.權(quán)利要求20或21的微生物，其中所述二氫硫辛酰胺乙?；D(zhuǎn)移酶基因或其一部分已被缺失。23.前述權(quán)利要求任一項的微生物，其中所述淀粉酶基因來源自地芽胞桿菌屬(Geobacillus)禾中。24.前述權(quán)利要求任一項的微生物，其中所述淀粉酶基因來源自嗜熱脂肪地芽胞桿菌。25.前述權(quán)利要求任一項的微生物，其中所述淀粉酶基因編碼α淀粉酶(EC3.2.1.1)。26.前述權(quán)利要求任一項的微生物，其中所述微生物為地芽胞桿菌屬種。27.前述權(quán)利要求任一項的微生物，其中所述微生物為熱葡糖苷酶地芽孢桿菌(Geobacillusthermoglucosidasius)028.前述權(quán)利要求任一項的微生物，其中所述微生物含有異源丙酮酸脫羧酶基因。29.前述權(quán)利要求任一項的微生物，其中所述微生物含有異源乙醇脫氫酶基因。30.前述權(quán)利要求任一項的微生物，其中所述微生物不含有限制系統(tǒng)。31.前述權(quán)利要求任一項的微生物，其中所述微生物在含有最高達(dá)10%w/v乙醇的培養(yǎng)基中是穩(wěn)定的。32.前述權(quán)利要求任一項的微生物，其中所述微生物可以被高頻率轉(zhuǎn)化。33.前述權(quán)利要求任一項的微生物，其中所述微生物在40°C至85°C，優(yōu)選50°C至70°C的溫度下生長。34.一種用于乙醇生產(chǎn)的方法，包括在存在淀粉的情況下在適合條件下培養(yǎng)前述權(quán)利要求任一項的微生物。35.權(quán)利要求34的方法，其中所述培養(yǎng)基含有至少w/v的淀粉。36.權(quán)利要求34或35的方法，其中所述培養(yǎng)基含有至少10%w/v的淀粉。37.權(quán)利要求34至36任一項的方法，其中所述培養(yǎng)基含有至少20%w/v的淀粉。38.權(quán)利要求34至37任一項的方法，其中所述方法在40°C至70°C的溫度下實施。39.權(quán)利要求38的方法，其中所述溫度為52°C至65°C。40.權(quán)利要求34至39任一項的方法，其中所述微生物被保持于pH為4至7.5的培養(yǎng)物中。41.一種動物飼料，含權(quán)利要求1至33任一項的微生物。全文摘要一種嗜熱微生物，包含一種與野生型相比增加了淀粉酶表達(dá)和淀粉水解的修飾，其中所述修飾為插入一種異源淀粉酶基因。文檔編號C12N5/10GK101802178SQ200880106938公開日2010年8月11日申請日期2008年8月12日優(yōu)先權(quán)日2007年8月13日發(fā)明者A·阿特金森,B·拉德,K·埃利,M·托德,R·克里普斯申請人:Tmo可再生能源有限公司