專利名稱:新型GPIIIa基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及新型GPIIIa基因,該基因是用于測定新生兒異體免疫性凝血細(xì)胞減 少性紫癜或其發(fā)病風(fēng)險的標(biāo)記,更具體地,本發(fā)明涉及用于檢測所述GPIIIa基因中的突變 的裝置(means),和用于該突變的檢測方法和檢測試劑盒。
背景技術(shù):
血小板粘附于血管疾病部位,然后彼此結(jié)合(凝集)形成血栓,并且這些功能由存在于血小板膜上的各種蛋白質(zhì)控制。已知的此類膜蛋白質(zhì)的實(shí)例包括GPI (糖蛋白I)、 GPIIb (糖蛋白lib)和GPIIIa(糖蛋白Ilia)。關(guān)于GPIIIa,從正常人的血小板分離出了編 碼GPIIIa蛋白質(zhì)的全長cDNA,并確定了其基因結(jié)構(gòu)(J. Biol. Chem. 262 (9) p. 3936-3939)。 進(jìn)一步地,已對存在于這些膜蛋白質(zhì)上的血小板抗原(HPA-1 7)進(jìn)行了研究(J.Clin. Invest 40 pl597(1961)、Prog. Hematol. 4 p222(1964)、Vox Sang 4pl61(1959)、Vox Sang 39 pll3(1980))。血小板抗原作為新生兒異體免疫性凝血細(xì)胞減少性紫癜(NAITP,neonatal alloimmune thrombocytopenic purpura)、輸血后紫癒(post—transfusion purpura)、血 小板輸注治療無效(refractoriness to platelettransfusion therapy)等的原因己為人 所知。在日本人中,據(jù)說抗HPA-2b抗體與血小板輸注治療無效有關(guān),且抗HPA-4b抗體與 NAITP有關(guān)。因此,血小板抗原的類型在臨床上日益變得重要。血小板抗原類型由于數(shù)種糖蛋白的多態(tài)性(polymorphism)而發(fā)生(表1),該 多態(tài)性在蛋白質(zhì)水平上通過單一氨基酸置換而產(chǎn)生,而在基因水平上通過單一堿基置 換而產(chǎn)生。因此,在基于基因的血小板抗原的分型中,該類單一堿基中的差異被評定
(JapaneseJournal of TransfusionMedicine. Vol. No. 139(1) :204_211,1993)。 然而,還存在未知的血小板抗原類型,目前尚未對其實(shí)現(xiàn)充分的闡明。關(guān)于HPA-7, 迄今僅報道的基因多態(tài)型是HPA-7a,其中GPIIIa基因的第1297位堿基是胞嘧啶(第407 位的氨基酸為脯氨酸);和HPA-7b,其中基因的第1297位的堿基是鳥嘌呤(第407位的氨 基酸是丙氨酸)(Blood 83 =70-76,1993)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人已在新生兒異體免疫性凝血細(xì)胞減少性紫癜(NAITP)的分析中發(fā)現(xiàn)了 新型的血小板特異性抗原。具體地,本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)存在于GPIIIa基因的外顯子9中的第 1297位的核苷酸殘基通常是胞嘧啶,但在患有新生兒異體免疫性凝血細(xì)胞減少性紫癜的患 者中,該胞嘧啶被置換成了胸腺嘧啶。進(jìn)一步地,本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)該置換與新生兒異體免疫 性凝血細(xì)胞減少性紫癜相關(guān)聯(lián)(實(shí)施例1)。本發(fā)明以該發(fā)現(xiàn)為基礎(chǔ)。本發(fā)明的目的在于提供新型的GPIIIa突變基因和蛋白質(zhì),用于檢測所述基因和 所述蛋白質(zhì)中的突變的裝置,用于所述突變的檢測方法和檢測試劑盒。根據(jù)本發(fā)明,提供包含GPIIIa基因的核苷酸序列的多核苷酸,其中該GPIIIa基因 的第1297位的核苷酸殘基是胸腺嘧啶殘基;或包含該胸腺嘧啶殘基的其片段(以下稱作 “本發(fā)明所述的多核苷酸”)。根據(jù)本發(fā)明,提供包含GPIIIa蛋白質(zhì)的氨基酸序列的蛋白質(zhì),其中GPIIIa蛋白質(zhì) 的第407位的氨基酸殘基是絲氨酸殘基,或包含該絲氨酸殘基的其片段(以下稱作“本發(fā)明 所述的蛋白質(zhì)”)。
根據(jù)本發(fā)明,提供可以與本發(fā)明所述的多核苷酸的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列雜交的引物,且該引物用于通過核酸擴(kuò)增法來擴(kuò)增包含GPIIIa基因的第1297位的核苷酸殘基 或與其配對的殘基的區(qū)域(以下稱作“本發(fā)明所述的引物”)。根據(jù)本發(fā)明,提供包含兩種以上的本發(fā)明所述的引物的引物組(primer set),其 用于通過核酸擴(kuò)增法來擴(kuò)增包含GPIIIa基因的第1297位的核苷酸殘基或與其配對的殘基 的區(qū)域(以下稱作“本發(fā)明所述的引物組”)。根據(jù)本發(fā)明,提供可以與本發(fā)明所述的多核苷酸的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列雜交 的探針,并且該探針用于GPIIIa基因的第1297位的胸腺嘧啶殘基的檢測(以下稱作“本發(fā) 明所述的探針”)。根據(jù)本發(fā)明,提供抗本發(fā)明所述的蛋白質(zhì)或其片段的抗體(以下稱作“本發(fā)明所 述的抗體”)。根據(jù)本發(fā)明,提供通過檢測GPIIIa基因的突變來判定新生兒異體免疫性凝血細(xì) 胞減少性紫癜或其發(fā)病風(fēng)險的方法,該方法包括使用本發(fā)明所述的引物、引物組或探針來 檢測GPIIIa基因的第1297位的胸腺嘧啶殘基的步驟。進(jìn)一步地,根據(jù)本發(fā)明,提供通過檢測GPIIIa基因的突變來判定新生兒異體免疫 性凝血細(xì)胞減少性紫癜或其發(fā)病風(fēng)險的方法,該方法包括使用本發(fā)明所述的抗體來檢測 GPIIIa蛋白質(zhì)的第407位的絲氨酸殘基的步驟(以下,上述兩種方法合并稱作“本發(fā)明的 第一實(shí)施方式的方法”)。根據(jù)本發(fā)明,提供通過檢測GPIIIa基因的突變來判定血小板輸注中血小板輸注 治療無效的發(fā)病可能性的方法,該方法包括使用本發(fā)明所述的引物、引物組或探針來檢測 GPIIIa基因的第1297位的胸腺嘧啶殘基的步驟。進(jìn)一步地,根據(jù)本發(fā)明,提供通過檢測GPIIIa基因的突變來判定血小板輸注中血 小板輸注治療無效的發(fā)病可能性的方法,該方法包括使用本發(fā)明所述的抗體來檢測GPIIIa 蛋白質(zhì)的第407位的絲氨酸殘基的步驟(以下,上述兩種方法合并稱作“本發(fā)明的第二實(shí)施 方式的方法”)。根據(jù)本發(fā)明,提供用于判定新生兒異體免疫性凝血細(xì)胞減少性紫癜或其發(fā)病風(fēng)險 的試劑盒,其至少包含本發(fā)明所述的引物、引物組、探針或抗體。根據(jù)本發(fā)明,提供用于判定血小板輸注中血小板輸注治療無效的發(fā)病可能性的試 劑盒,其至少包含本發(fā)明所述的引物、引物組、探針或抗體。本發(fā)明所述的探針、引物、引物組或抗體可以作為標(biāo)記用于判定新生兒異體免疫 性凝血細(xì)胞減少性紫癜或其發(fā)病風(fēng)險。因此,本發(fā)明對新生兒異體免疫性凝血細(xì)胞減少性 紫癜的基因診斷等有用。進(jìn)一步地,本發(fā)明所述的探針、引物、引物組或抗體可以作為標(biāo)記 用于判定血小板輸注中血小板輸注治療無效的發(fā)病可能性。因此,本發(fā)明對血小板輸注中 的輸注效果的預(yù)測等有用。
具體實(shí)施例方式[突變基因和突變蛋白質(zhì)]本發(fā)明所述的多核苷酸可以作為競爭雜交中的標(biāo)記 標(biāo)準(zhǔn)核酸用于檢測GPIIIa基因的第1297位的核苷酸殘基的突變,即置換為胸腺嘧啶殘基 (以下,稱作“GPIIIa基因的1297T多態(tài)性”(實(shí)施例1)。進(jìn)一步地,它還可以用作所述檢測中所用的寡核苷酸探針的核苷酸序列。在本說明書中,“GPIIIa基因的第1297位的核苷酸殘基”意指從下述起點(diǎn)計算的 位于第1297位的核苷酸殘基,所述起點(diǎn)即第一殘基,其是GPIIIa基因中編碼信號肽的區(qū)域 的起始密碼子的腺嘌呤殘基。GPIIIa基因的第1至78位構(gòu)成編碼信號肽的區(qū)域,GPIIIa基因的第79至2364 位構(gòu)成編碼成熟蛋白質(zhì)的區(qū)域。用于檢測GPIIIa基因的1297T多態(tài)性的標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)核酸可以是能夠檢測GPIIIa基 因中的第1297位的核苷酸殘基置換為胸腺嘧啶殘基的標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)核酸,并且也可以是本發(fā) 明所述的多核苷酸的片段。具體地,作為本發(fā)明所述的多核苷酸的片段,是GPIIIa基因的 核苷酸序列中第1297位的核苷酸殘基為胸腺嘧啶殘基的多核苷酸的片段,其中所述片段 包含胸腺嘧啶殘基。本發(fā)明所述的多核苷酸包括選自以下的(i)、(ii)、(iii)和(iv)的多核苷酸(i) 包含SEQ ID NO :1的核苷酸序列的多核苷酸;(ii)下述多核苷酸,該多核苷酸由SEQ ID NO 1的核苷酸序列中插入、置換和/或缺失了一個或多個核苷酸和/或向其一端或兩端添 加了一個或多個核苷酸的核苷酸序列組成,并且該多核苷酸編碼與由SEQ IDNO 2的氨基 酸序列組成的蛋白質(zhì)具有同等功能的蛋白質(zhì)(前提是在所述多核苷酸中,SEQ ID N0:1的 核苷酸序列的第1297位的核苷酸殘基是胸腺嘧啶殘基);(iii)下述多核苷酸,該多核苷酸 在嚴(yán)格條件下與由SEQ ID NO :1的核苷酸序列的互補(bǔ)序列組成的多核苷酸雜交,且該多核 苷酸編碼與由SEQ ID NO :2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)具有同等功能的蛋白質(zhì)(前提是 在所述多核苷酸中,對應(yīng)于SEQ ID NO :1 核苷酸序列的第1297位的核苷酸殘基是胸腺嘧 啶殘基);和(iv)下述多核苷酸,該多核苷酸與由SEQ ID NO :1的核苷酸序列組成的多核 苷酸具有70%以上的同一性,且該多核苷酸編碼與由SEQ IDNO 2的氨基酸序列組成的蛋 白質(zhì)具有同等功能的蛋白質(zhì)(前提是在所述多核苷酸中,對應(yīng)于SEQ ID NO :1的核苷酸序 列的第1297位的核苷酸殘基是胸腺嘧啶殘基)。SEQ ID NO=I的核苷酸序列的第1至78位的序列是編碼信號肽的序列(GenBank 登錄號NM_000212)。在本發(fā)明中,編碼信號肽的序列并不局限于該序列,只要它可以編碼能 夠起信號肽功能的肽即可。本發(fā)明所述的多核苷酸優(yōu)選為編碼下述蛋白質(zhì)的多核苷酸,所述蛋白質(zhì)由SEQ ID NO :2的氨基酸序列組成或者由其一部分組成,該部分包含SEQ ID NO :2的氨基酸序列的第 407位的氨基酸殘基。在本發(fā)明中,當(dāng)SEQ ID NO :2的氨基酸序列給定時,編碼其的核苷酸序列可容易地 被確定,且可選擇各種編碼SEQ ID NO :2的氨基酸序列的核苷酸序列。因此,編碼由SEQ ID NO 2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的多核苷酸,除了 SEQ ID NO 1的DNA序列的部分或全部之外,還意指編碼同一氨基酸的DNA序列,其具有存在簡并 關(guān)系的密碼子作為DNA序列。本發(fā)明進(jìn)一步包括與這些序列對應(yīng)的RNA序列。編碼由SEQ ID NO 2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的多核苷酸的優(yōu)選實(shí)例包括由 SEQ ID NO 1的核苷酸序列組成的多核苷酸。在本說明書中,蛋白質(zhì)是否與 由SEQ ID NO 2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)具有同 等功能,可以通過評價與由SEQ ID NO :2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的表達(dá)相關(guān)的生物學(xué)現(xiàn)象或功能來確定。本發(fā)明所述的多核苷酸優(yōu)選為,由SEQ ID NO 1的核苷酸序列組成的多核苷酸或包含SEQ ID NO 1的第1297位的核苷酸殘基的其片段。本發(fā)明所述的多核苷酸更優(yōu)選為, 至少包含由SEQ ID NO 7的核苷酸序列(SEQ ID NO 1中的第1201至1391位的核苷酸序 列)組成的多核苷酸的多核苷酸。本發(fā)明所述的多核苷酸進(jìn)一步優(yōu)選為,至少包含由SEQ IDNO 3的核苷酸序列(SEQ ID NO=I中的第1281至1320位的核苷酸序列)組成的多核苷 酸的多核苷酸。本發(fā)明所述的蛋白質(zhì)可作為抗原用于制備下述抗體,該抗體能夠檢測GPIIIa蛋 白質(zhì)的第407位的氨基酸殘基的突變,即,置換為絲氨酸殘基(以下稱為“GPIIIa蛋白質(zhì)的 407S多態(tài)性”)。在本說明書中,“GPIIIa蛋白質(zhì)的第407位的氨基酸殘基”意指從起點(diǎn)計算位于第 407位的氨基酸殘基,所述起點(diǎn)即是第一殘基,其是構(gòu)成GPIIIa成熟型蛋白質(zhì)的氨基酸序 列中的N末端的甘氨酸殘基。“GPIIIa成熟型蛋白質(zhì)”是指,由GPIIIa基因的第79至2364位的核苷酸序列編 碼的蛋白質(zhì),其不包含信號肽。例如,它是由SEQ ID NO :6的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。本發(fā)明所述的蛋白質(zhì)包括選自以下(V)、(vi) , (vii)和(viii)的蛋白質(zhì)(ν)包 含SEQ ID NO :2的氨基酸序列的蛋白質(zhì);(vi)下述蛋白質(zhì),該蛋白質(zhì)由SEQ ID NO :2的氨 基酸序列中插入、置換和/或缺失了一個或多個氨基酸和/或向其一端或兩端添加了一個 或多個氨基酸的氨基酸序列組成,并且該蛋白質(zhì)與由SEQ ID NO :2的氨基酸序列組成的蛋 白質(zhì)具有同等功能(前提是SEQ ID NO 2的氨基酸序列的第407位的氨基酸殘基是絲氨 酸殘基);(vii)由下述多核苷酸編碼的蛋白質(zhì),該多核苷酸在嚴(yán)格條件下,與由編碼SEQ ID NO 2的氨基酸序列的多核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列組成的多核苷酸雜交,且所述 蛋白質(zhì)與由SEQ ID NO 2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)具有同等功能(前提是對應(yīng)于SEQ ID NO :2的氨基酸序列的第407位的氨基酸殘基的氨基酸殘基是絲氨酸殘基);和(viii) 下述蛋白質(zhì),該蛋白質(zhì)由與SEQ ID NO :2的氨基酸序列具有70%以上的同一性的氨基酸序 列組成,且該蛋白質(zhì)與由SEQ ID NO :2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)具有同等功能(前提是 對應(yīng)于SEQ ID NO :2的氨基酸序列的第407位的氨基酸殘基的氨基酸殘基是絲氨酸殘基)。本發(fā)明所述的蛋白質(zhì)優(yōu)選為,由SEQ ID NO 2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)或包含 SEQ ID NO :2的第407位的氨基酸殘基的其片段。本發(fā)明所述的蛋白質(zhì)更優(yōu)選為,至少包 含由SEQ ID NO 8的氨基酸序列(SEQ IDNO :2中的第381至450位的氨基酸序列)組成的 多肽的蛋白質(zhì)(多肽)。本發(fā)明所述的蛋白質(zhì)進(jìn)一步優(yōu)選為,至少包含由SEQ ID N0:4的 氨基酸序列(SEQ ID NO 2中的第395至420位的氨基酸序列)組成的多肽的蛋白質(zhì)(多 肽)。用于制備能夠檢測GPIIIa蛋白質(zhì)的407S多態(tài)性的抗體的抗原,可以是能夠檢測 GPIIIa蛋白質(zhì)中的第407位的氨基酸殘基向絲氨酸殘基的置換的抗原,并且也可以是本發(fā) 明所述蛋白質(zhì)的片段(肽)。具體地,本發(fā)明所述的蛋白質(zhì)的片段,是GPIIIa蛋白質(zhì)的氨基 酸序列中第407位的氨基酸殘基是絲氨酸殘基的蛋白質(zhì)的片段,其中所述片段包含絲氨酸殘基。本發(fā)明所述的蛋白質(zhì)的片段是具有至少6個氨基酸殘基的多肽(例如,8、10、12或15個氨基酸殘基以上)。在本發(fā)明中,“GPIIIa基因”已知為編碼血小板膜蛋白的基因,且已經(jīng)以GenBank 登錄號M35999(SEQ ID NO :5 (堿基序列),SEQ IDNO :6 (氨基酸序列))或登錄號NM_000212登記。
GPIIIa基因不僅包括以下(i')的多核苷酸,還包括選自以下(ii ‘ )、(iii') 和(iv')的同源多核苷酸(i')包含SEQ ID NO :5的核苷酸序列的多核苷酸;(ii ‘) 下述多核苷酸,該多核苷酸由SEQ ID NO :5的核苷酸序列中插入、置換和/或缺失了一個或 多個核苷酸和/或向其一端或兩端添加了一個或多個核苷酸的核苷酸序列組成,并且該多 核苷酸編碼與由SEQ IDNO :6的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)具有同等功能的蛋白質(zhì);(iii') 下述多核苷酸,該多核苷酸在嚴(yán)格條件下與由SEQ ID NO :5的核苷酸序列的互補(bǔ)序列組成 的多核苷酸雜交,且該多核苷酸編碼與由SEQ ID NO :6的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)具有同 等功能的蛋白質(zhì);和(iv')下述多核苷酸,該多核苷酸與由SEQ ID NO 5的核苷酸序列組 成的多核苷酸具有70%以上的同一性,且該多核苷酸編碼與由SEQ IDNO 6的氨基酸序列 組成的蛋白質(zhì)具有同等功能的蛋白質(zhì)。SEQ ID NO 5的核苷酸序列的第1至78位的序列是編碼信號肽的序列(GenBank 登錄號NM_000212)。在本發(fā)明中,編碼信號肽的序列并不局限于該序列,只要它可以編碼能 夠起信號肽功能的肽即可。GPIIIa基因優(yōu)選為包含SEQ ID NO 5的核苷酸序列的多核苷酸。進(jìn)一步地,GPIIIa基因優(yōu)選為編碼包含SEQ ID NO 6的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的多 核苷酸。作為GPIIIa蛋白質(zhì),除了以下(ν')的蛋白質(zhì)之外,還提供選自(vi ‘ )>(vii') 和(viii')的同源蛋白質(zhì)(多肽)(v')包含SEQ ID NO :6的氨基酸序列的蛋白質(zhì); (vi')下述蛋白質(zhì),該蛋白質(zhì)由SEQ ID NO :6的氨基酸序列中插入、置換和/或缺失了一個 或多個氨基酸和/或向其一端或兩端添加了一個或多個氨基酸的氨基酸序列組成,并且該 蛋白質(zhì)與由SEQ ID NO 6的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)具有同等功能;(vii')由下述多核 苷酸編碼的蛋白質(zhì),該多核苷酸在嚴(yán)格條件下與由編碼SEQ ID NO :6的氨基酸序列的多核 苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列組成的多核苷酸雜交,且所述蛋白質(zhì)與由SEQ ID N0:6的氨 基酸序列組成的蛋白質(zhì)具有同等功能;和(viii')下述蛋白質(zhì),該蛋白質(zhì)由與SEQ ID NO 6的氨基酸序列具有70%以上的同一性的氨基酸序列組成,且該蛋白質(zhì)與由SEQ ID NO 6 的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)具有同等功能。GPIIIa蛋白質(zhì)優(yōu)選為由SEQ ID NO 5的核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)。進(jìn)一步地,作為GPIIIa蛋白質(zhì),更優(yōu)選地提供包含SEQ ID NO 6的氨基酸序列的 蛋白質(zhì)。在本說明書中,“插入、置換和/或缺失了一個或多個核苷酸和/或向其一端或兩 端添加了一個或多個核苷酸”以及“插入、置換和/或缺失了一個或多個氨基酸和/或向其 一端或兩端添加了一個或多個氨基酸”意指,已經(jīng)通過位點(diǎn)定向誘變等公知的技術(shù)方法,或 者通過可以自然發(fā)生程度的多個核苷酸或氨基酸的置換等,進(jìn)行了改變。待改變的核苷酸 或氨基酸的數(shù)目可以是例如1至30個,優(yōu)選1至20個,更優(yōu)選1至10個,還更優(yōu)選1至4 個,尤其優(yōu)選1至2個的插入、置換或缺失,和/或向一端或兩端的添加。
本發(fā)明所述的多核苷酸的經(jīng)改變的核苷酸序列是,對GPIIIa基因的第1297位的核苷酸殘基不產(chǎn)生影響的經(jīng)改變的核苷酸序列,且可以優(yōu)選為具有一個或多個(例如,一 個或幾個,或1、2、3或4個)突變的本發(fā)明所述的多核苷酸的核苷酸序列,其中所述突變不 影響由SEQ IDNO 2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的功能。GPIIIa基因的經(jīng)改變的核苷酸序列可優(yōu)選為,具有一個或多個(例如,一個或幾 個、或1、2、3或4個)突變的GPIIIa基因的核苷酸序列,其中所述突變不影響由SEQ ID NO 6的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的功能。本發(fā)明所述的蛋白質(zhì)的經(jīng)改變的氨基酸序列是,對GPIIIa蛋白質(zhì)的第407位的氨 基酸殘基不產(chǎn)生影響的經(jīng)改變的氨基酸序列,且可以優(yōu)選為具有一個或多個(例如,一個 或幾個,或1、2、3或4個)保守置換的SEQ ID NO :2中所示的本發(fā)明所述的蛋白質(zhì)的氨基 酸序列。GPIIIa蛋白質(zhì)的經(jīng)改變的氨基酸序列可以優(yōu)選為,具有一個或多個(例如,一個 或幾個,或1、2、3或4個)保守置換的SEQ ID NO :6中所示的GPIIIa蛋白質(zhì)的氨基酸序 列。在本說明書中,“保守置換(一個或多個)”意指,一個或多個氨基酸殘基被其化學(xué) 相似的氨基酸殘基(一個或多個)置換以使蛋白質(zhì)的功能實(shí)質(zhì)上不被改變。其實(shí)例包括下 述情形某疏水性殘基被另一個疏水性殘基置換的情形;某極性殘基被另一個具有相同電 荷的極性殘基置換的情形。此類可被置換的功能相似的氨基酸(一個或多個),對每一氨 基酸而言是為本領(lǐng)域公知的。作為非極性(疏水性)氨基酸,其具體實(shí)例包括丙氨酸、纈氨 酸、異亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸和蛋氨酸。極性(中性)氨基酸的實(shí)例包 括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天門冬酰胺和半胱氨酸。具有正電荷的(堿 性)氨基酸的實(shí)例包括精氨酸、組氨酸和賴氨酸。具有負(fù)電荷的(酸性)氨基酸的實(shí)例包 括天門冬氨酸和谷氨酸。在本說明書中,“雜交”意指在嚴(yán)格條件下與目標(biāo)多核苷酸雜交,而不與該目標(biāo)核 苷酸之外的核苷酸雜交。所述“嚴(yán)格條件”可基于探針序列或引物序列及其互補(bǔ)鏈所形 成的雙鏈的熔解溫度(°c)、以及溶液的鹽濃度等來決定。在選擇探針序列或引物序列之 后設(shè)置合適的嚴(yán)格條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的技術(shù)(例如,Molecular Cloning 2nd edition, ColdSpring Harbor Laboratory(1989))。雜交可根據(jù)已知方法進(jìn)行。在使用市售文庫的情形中,其可根據(jù)附于其中的使用 說明書中記載的方法來進(jìn)行。在本說明書中,關(guān)于堿基序列或氨基酸序列的術(shù)語“同一性”意指,待比較的序列 之間、構(gòu)成各序列的堿基或氨基酸殘基的一致程度。在本說明書中所示的每一“同一性”的 數(shù)值,可以是通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的同源性檢索程序算出的數(shù)值,并且可通過FASTA、 BLAST等、使用默認(rèn)(初始設(shè)定)參數(shù)而容易地算出。與SEQ ID NO 2的氨基酸序列具有70%以上同一性的氨基酸序列可以是優(yōu)選與 其具有80 %以上,更優(yōu)選85 %以上,還更優(yōu)選90 %以上,還更優(yōu)選95 %以上,特別優(yōu)選98 % 以上,且最優(yōu)選99 %以上的同一性的氨基酸序列。與SEQ ID NO :6的氨基酸序列具有70%以上同一性的氨基酸序列可以是優(yōu)選與 其具有80 %以上,更優(yōu)選85 %以上,還更優(yōu)選90 %以上,還更優(yōu)選95 %以上,特別優(yōu)選98 %以上,且最優(yōu)選99%以上的同一性的氨基酸序列。在本發(fā)明中,當(dāng)SEQ ID NO :6的氨基酸序列給定時,編碼其的核苷酸序列可容易地 被確定,且可選擇各種編碼SEQ ID NO :6的氨基酸序列的核苷酸序列。因此,編碼包含SEQ ID NO 6的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的多核苷酸,除了 SEQ ID NO 5的DNA序列的部分或全部之外,還意指編碼同一氨基酸的DNA序列,其具有存在簡并關(guān)系 的密碼子作為DNA序列。本發(fā)明進(jìn)一步包括與這些序列對應(yīng)的RNA序列。 編碼包含SEQ ID NO 6的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的多核苷酸的優(yōu)選實(shí)例包括包含 SEQ ID NO :5的核苷酸序列的多核苷酸。在本說明書中,蛋白質(zhì)是否與由SEQ ID NO 6的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)具有同 等功能,可以通過評價與由SEQ ID NO :6的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的表達(dá)相關(guān)的生物學(xué) 現(xiàn)象或功能來確定。根據(jù)本發(fā)明,提供由包含GPIIIa基因的核苷酸序列的多核苷酸的核苷酸序列的 互補(bǔ)序列組成的多核苷酸,其中所述GPIIIa基因的第1297位的核苷酸殘基是胸腺嘧啶殘 基,或者提供包含與該胸腺嘧啶殘基配對的殘基的其片段。[引物和引物組]本發(fā)明所述的引物可以與本發(fā)明所述的多核苷酸特異性地雜 交,以通過核酸擴(kuò)增法來擴(kuò)增包含GPIIIa基因的第1297位的核苷酸殘基或與其配對的殘 基的區(qū)域。因此,本發(fā)明所述的引物可被用作標(biāo)記用于判定新生兒異體免疫性凝血細(xì)胞減 少性紫癜或其發(fā)病的風(fēng)險。進(jìn)一步地,本發(fā)明所述的引物可用作標(biāo)記用于判定血小板輸注 中血小板輸注治療無效發(fā)病的可能性。本發(fā)明所述的引物意指,由脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)等構(gòu)成的引物, 且優(yōu)選由DNA構(gòu)成的引物。本發(fā)明所述的引物可以通過核酸擴(kuò)增法,來擴(kuò)增本發(fā)明所述的多核苷酸的核苷酸 序列或其互補(bǔ)序列中包含GPIIIa基因的第1297位的核苷酸殘基或與其配對的殘基的區(qū) 域。其實(shí)例包括由下述多核苷酸組成的那些,所述多核苷酸具有本發(fā)明所述的多核苷酸的 核苷酸序列或其互補(bǔ)序列中的至少10個,優(yōu)選至少15個,更優(yōu)選至少20個,進(jìn)一步優(yōu)選至 少21個連續(xù)核苷酸殘基。進(jìn)一步地,本發(fā)明所述的引物的實(shí)例包括由下述多核苷酸組成的 那些,該多核苷酸具有本發(fā)明所述的多核苷酸的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列中的10至30個, 12至30個,15至30個,20至30個,或21至30個連續(xù)核苷酸殘基。進(jìn)一步地,本發(fā)明所述的引物可以是能夠與本發(fā)明所述的多核苷酸的核苷酸序列 或其互補(bǔ)序列中包含GPIIIa基因的第1297位的核苷酸殘基或與其配對的殘基的區(qū)域進(jìn)行 雜交的引物。此處,包含本發(fā)明所述的多核苷酸的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列中的連續(xù)核苷酸的 多核苷酸,可以起本發(fā)明所述的引物的作用,并且其實(shí)例也包括下述經(jīng)改變的多核苷酸,該 經(jīng)改變的多核苷酸包含本發(fā)明所述的多核苷酸的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列中的連續(xù)核苷 酸中導(dǎo)入了一個或多個(例如1、2、3或4個)對GPIIIa基因的第1297位的核苷酸殘基不 產(chǎn)生影響的突變(其可選自例如插入、置換、缺失和添加)的核苷酸。經(jīng)改變的多核苷酸的 實(shí)例包括包含SEQ ID NO 1的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列中的至少12至30個連續(xù)核苷酸 中導(dǎo)入了一個或多個突變的核苷酸、且作為本發(fā)明所述的引物起作用的多核苷酸。本發(fā)明所述的引物的長度可以是至少10個堿基,且優(yōu)選至少15個堿基,更優(yōu)選至少20個堿基,還更優(yōu)選至少21個堿基。進(jìn)一步地,本發(fā)明所述的引物長度為12至30個堿 基,20至30個堿基,或21至30個堿基。根據(jù)本發(fā)明所述的引物的優(yōu)選實(shí)施方式,提供具有12至30個堿基長度的引物,其 由具有至少10個(更優(yōu)選至少15個,更優(yōu)選至少20個,還更優(yōu)選至少21個)本發(fā)明所述 的多核苷酸的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列中的連續(xù)核苷酸的多核苷酸組成;該引物可通過核 酸擴(kuò)增法來擴(kuò)增包含GPIIIa基因的核苷酸序列中的第1297位的核苷酸殘基的區(qū)域,并且 該引物被用于GPIIIa基因的1297T多態(tài)性的檢測。本發(fā)明所述的引物也可以用作引物組,該引物組包含兩種或更多種本發(fā)明所述的 引物的組合。本發(fā)明所述的引物組能以下述方式選擇,以便本發(fā)明所述的多核苷酸的核苷酸序 列或其互補(bǔ)序列中,包含GPIIIa基因的第1297位的核苷酸殘基或與其配對的殘基的區(qū)域 可以通過核酸擴(kuò)增法來擴(kuò)增。核酸擴(kuò)增法是已知的,且本領(lǐng)域技術(shù)人員可選擇適用于核酸 擴(kuò)增的引物對。例如,在PCR方法中,可以按下述方式選擇引物,以便兩個引物中的一個與 GPIIIa突變基因的正鏈配對,另一個引物與GPIIIa突變基因的負(fù)鏈配對,且由一個引物延 伸的延伸鏈為另一個引物所配對。進(jìn)一步地,在LAMP方法(W0 00/28082)中,相對于目的 基因,分別定義了自3'端起的三 個區(qū)域,即F3c、F2c和Flc;以及自5'端起的三個區(qū)域, 即Bi、B2和B3,這六個區(qū)域可用于設(shè)計四種引物。本發(fā)明所述的引物和引物組,可根據(jù)常規(guī)方法,用作已知核酸擴(kuò)增法比如PCR 方法(Saiki,R. K.,Bugawan, T. L.,etal. (1986)Nature,324,163-166)、NASBA 方法 (Comptom, J. (1991)Nature,650,91-92)、TMA 方法(Kacian, D. L.,和 Fultz, T. J. (1995) US. Patent5, 399,491)、SDA 方法(Walker, G. Τ.,Little, Μ. C.,et al (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA,89,392-396)或 PCR-SSCP 方法(Orita,Μ.,Iwahara, H.,eal. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA,86,2776-2770)中的引物和引物組。本發(fā)明所述的引物可以以本說明書中所公開的核苷酸序列為基礎(chǔ)而化學(xué)合成。引 物的制備是公知的,且可根據(jù)常規(guī)方法進(jìn)行。[探針]本發(fā)明所述的探針與本發(fā)明所述的多核苷酸特異性地雜交,且可以檢測 GPIIIa基因的1297T多態(tài)性。因此,本發(fā)明所述的探針可以用作標(biāo)記用于判定新生兒異體 免疫性凝血細(xì)胞減少性紫癜和/或其發(fā)病風(fēng)險。進(jìn)一步地,本發(fā)明所述的探針可用作標(biāo)記 用于判定血小板輸注中血小板輸注治療無效的發(fā)病可能性。本發(fā)明所述的探針意指由脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)等構(gòu)成的探針,且 優(yōu)選為由DNA構(gòu)成的探針。本發(fā)明所述的探針的實(shí)例包括能夠與本發(fā)明所述的多核苷酸的核苷酸序列或其 互補(bǔ)序列中包含GPIIIa基因的第1297位的核苷酸殘基或與其配對的殘基的區(qū)域進(jìn)行雜交 的探針。本發(fā)明所述的探針的實(shí)例包括由包含本發(fā)明所述的多核苷酸的核苷酸序列或其 互補(bǔ)序列中的至少10個、優(yōu)選至少14個、更優(yōu)選至少15個、還更優(yōu)選至少16個連續(xù)核苷 酸殘基的多核苷酸構(gòu)成的探針。進(jìn)一步地,本發(fā)明所述的探針的實(shí)例包括由包含本發(fā)明所 述的多核苷酸的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列中的10至20個、12至20個、14至20個、15至 20個、16至20個、10至30個、12至30個、14至30個、15至30個、或16至30個連續(xù)核苷酸殘基的多核苷酸構(gòu)成的探針。此處,包含本發(fā)明所述的多核苷酸的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列中的連續(xù)核苷酸的 多核苷酸,可以作為本發(fā)明所述的探針起作用,并且其實(shí)例也包括下述經(jīng)改變的多核苷酸, 該經(jīng)改變的多核苷酸包含本發(fā)明所述的多核苷酸的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列中的連續(xù)核 苷酸中導(dǎo)入了一個或多個(例如1、2、3或4個)對GPIIIa基因的第1297位的核苷酸殘基 不產(chǎn)生影響的突變(其可選自例如插入、置換、缺失和添加)的核苷酸。經(jīng)改變的多核苷酸 的實(shí)例包括下述多核苷酸,該多核苷酸包含SEQ IDNO=I的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列中的 至少12至30個連續(xù)核苷酸中導(dǎo)入了一個或多個突變的核苷酸,且所述多核苷酸作為本發(fā) 明所述的探針起作用。本發(fā)明所述的探針的長度為至少10個堿基。進(jìn)一步地,本發(fā)明所述的探針的長度 為12至30個堿基。根據(jù)本發(fā)明所述的探針的優(yōu)選實(shí)施方式,提供具有12至30個堿基長度的探針和 引物,其由包含至少10個(更優(yōu)選為至少15個)本發(fā)明所述的多核苷酸的核苷酸序列或 其互補(bǔ)序列中的連續(xù)核苷酸的多核苷酸構(gòu)成,且其可以與包含GPIIIa基因的核苷酸序列 中的第1297位的核苷酸殘基的區(qū)域雜交,并且所述探針和引物用于GPIIIa基因的1297T 多態(tài)性的檢測。本發(fā)明所述的探針可以按照常規(guī)方法,作為探針用于Northern印跡方法、 Southern印跡方法或原位雜交方法等已知的方法中。本發(fā)明所述的探針可以以本說明書中所公開的核苷酸序列為基礎(chǔ)而化學(xué)合成。引 物的制備是公知的,且可根據(jù)常規(guī)方法進(jìn)行。[抗體]本發(fā)明所述的抗體可以特異性地識別本發(fā)明所述的蛋白質(zhì),且可以檢測 GPIIIa蛋白質(zhì)的407S多態(tài)性。因此,本發(fā)明所述的抗體可以用作標(biāo)記用于判定新生兒異體 免疫性凝血細(xì)胞減少性紫癜或其發(fā)病風(fēng)險。進(jìn)一步地,本發(fā)明所述的抗體可用作標(biāo)記用于 判定血小板輸注中血小板輸注治療無效的發(fā)病可能性。根據(jù)本發(fā)明所述的抗體的優(yōu)選實(shí)施方式,提供識別下述區(qū)域的抗體,該區(qū)域包含 本發(fā)明所述的蛋白質(zhì)的氨基酸序列中的GPIIIa蛋白質(zhì)的第407位的氨基酸殘基。通過使 用這種抗體,可以檢測GPIIIa蛋白質(zhì)的407S多態(tài)性。這種抗體的實(shí)例包括對抗下述蛋白 質(zhì)的抗體,所述蛋白質(zhì)包含具有SEQ ID NO :2的氨基酸序列中的第407位的氨基酸殘基的 至少6個氨基酸殘基。對抗本發(fā)明所述的蛋白質(zhì)的抗體的實(shí)例包括對抗具有SEQ IDNO 2的氨基酸序 列或其一部分的蛋白質(zhì)的抗體。本發(fā)明所述的抗體的實(shí)例包括多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、單鏈抗體 (scFv)、人源化抗體、多特異性抗體、和抗體片段比如Fab、Fab'、F(ab' )2、Fc和Fv。本發(fā)明所述的抗體可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法獲得。[檢測方法]GPIIIa基因的核苷酸序列中,第1297位的核苷酸殘基向胸腺嘧啶殘 基的置換,可以為新生兒異體免疫性凝血細(xì)胞減少性紫癜或其發(fā)病風(fēng)險的指標(biāo)。因此,根據(jù) 本發(fā)明,新生兒異體免疫性凝血細(xì)胞減少性紫癜或其發(fā)病風(fēng)險可以通過檢測GPIIIa基因 的1297T多態(tài)性來判定。存在下述可能性,即 GPIIIa基因中第1297位的核苷酸殘基被置換為胸腺嘧啶殘基的血小板抗原(HPA-7抗原)會由于抗原的差異而在血小板輸注時引起血小板輸注治療無效。因此,該置換可以是血小板輸注中是否發(fā)生血小板輸注治療無效的指標(biāo),即血小板輸 注中輸注效果的指標(biāo)。因此,根據(jù)本發(fā)明,血小板輸注中血小板輸注治療無效的發(fā)病可能性 可以通過檢測GPIIIa基因的1297T多態(tài)性而判定。本發(fā)明所述的檢測方法沒有特別限定,只要它能檢測試驗(yàn)樣品中的GPIIIa基因 的1297T多態(tài)性或GPIIIa蛋白質(zhì)的407S多態(tài)性即可,并且其實(shí)例包括雜交方法、核酸擴(kuò)增 法和抗原-抗體反應(yīng)法。此處,“試驗(yàn)樣品”可以包含下述區(qū)域,該區(qū)域含有GPIIIa基因的第1297位的核 苷酸殘基或者GPIIIa蛋白質(zhì)的第407位的氨基酸殘基,并且該樣品可通過從待試驗(yàn)人(對 象)提取基因、mRNA或蛋白質(zhì)而獲得。mRNA可以在使用前根據(jù)需要轉(zhuǎn)換為cDNA。在本說 明書中,“基因”同樣包括這種cDNA。此處,“對象”除了新生兒,還可以是該新生兒的血親親屬。本發(fā)明的有利方面在于 可在出生以前判定新生兒異體免疫性凝血細(xì)胞減少性紫癜的發(fā)病風(fēng)險。對象的基因、mRNA或蛋白質(zhì)可以從人體中的任何細(xì)胞提取,且所述細(xì)胞優(yōu)選為白 細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明,提取的基因或mRNA可以直接用于限制性片段長度多態(tài)性方法(RFLP 方法)(Southerns,Ε. Μ. (1975) J. Mol. Biol. 98,503)、等位基因特異的寡核苷酸探針法 (AS0 方法)(Wallace,R. B.,Schaffer,N. J.,etal. (1979) Nucleic Acid Res.,6,3543)或 寡核苷酸連接分析法,以檢測所述GPIIIa基因的1297T多態(tài)性。根據(jù)本發(fā)明所述的檢測方法,試驗(yàn)樣品中的GPIIIa基因的1297T多態(tài)性可以通 過下述方式來檢測使用本發(fā)明所述的引物或引物組,利用核酸擴(kuò)增法來擴(kuò)增核酸樣品 (mRNA或其逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物),并分析該擴(kuò)增產(chǎn)物。利用核酸擴(kuò)增法檢測GPIIIa基因的1297T多態(tài)性,例如可以通過以下步驟來進(jìn) 行(c)將來源于試驗(yàn)樣品的多核苷酸作為模板,使用本發(fā)明所述的引物或引物組來施行 核酸擴(kuò)增法;和(d)分析所形成的擴(kuò)增產(chǎn)物。在步驟(c)中,可以使用由試驗(yàn)樣品制備的mRNA或由該mRNA逆轉(zhuǎn)錄的互補(bǔ)DNA 作為模板。基因擴(kuò)增可以使用核酸擴(kuò)增法進(jìn)行,比如PCR方法(Saiki,R. K.,Bugawan, T. L., et al. (1986) Nature,324,163-166)、NASBA 方法(Comptom, J. (1991) Nature,650,91-92)、 TMA 方法(Kacian,D. L.,and Fultz, Τ. J. (1995)US. Patent 5,399, 491)或 SDA 方法 (Walker, G. Τ.,Little, Μ. C.,et al (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89,392-396)。通過這些方法擴(kuò)增的基因,根據(jù)其擴(kuò)增產(chǎn)物的特征可以用來檢測GPIIIa基因的 1297T多態(tài)性。例如,對于用PCR方法擴(kuò)增的片段,通過堿基序列確定方法可以容易地確定 核苷酸序列,并且由此可以確定GPIIIa基因的第1297位的核苷酸殘基是否是胸腺嘧啶。通過PCR的基因擴(kuò)增也可使用識別一個堿基差異的PCR-SSCP方法(Orita,Μ., Iwahara,H. , et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 2776-2770)來進(jìn)行。PCR-SSCP 方 法是下述方法,該方法中通過PCR擴(kuò)增的核酸片段被熱變性為單鏈后,在恒定溫度下使用 非變性聚丙烯酰胺凝膠分離。所述方法可以通過將核苷酸片段的差異所致的高級結(jié)構(gòu)的形 成中的差異作為電泳遷移率中的差異來評價而檢測一個堿基的差異。
通過其它PCR方法擴(kuò)增的片段,可以通過限制性片段長度多態(tài)性方法(RFLP方法) (Southerns, Ε. Μ. (1975) J. Mol. Biol. 98,503)、等位基因特異的寡核苷酸探針法(AS0方 法)(Saiki,R. K,Bugawan,T. L.,et al, (1986)Nature,324,163-166)、寡核苷酸連接分析法 (Landegren, U, Kaiser, R. , etal. (1990)PCR Protocols, Academic Press, Inc. p92_98)、 PCR-PHFA 方法(Oka, Τ. , Matsunaga, H, et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22,1541-1547)、 PCR-rSSO 方法(Kawai,S. , et al, (1994)Hum Immunol, 41 (2), 121-126)等來分析。在同時 處理多個樣品時,優(yōu)選PCR-PHFA方法或PCR-rSSO方法。根據(jù)本發(fā)明所述的檢測方法,可以通過使用能夠與本發(fā)明所述的多核苷酸的核苷 酸序列或其互補(bǔ)序列中包含GPIIIa基因的第1297位的核苷酸殘基或與其配對的殘基的區(qū) 域雜交的本發(fā)明的引物或引物組,通過核酸擴(kuò)增法擴(kuò)增核酸樣品(mRNA或其逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物), 并檢測該擴(kuò)增產(chǎn)物,從而檢測試驗(yàn)樣品中的GPIIIa基因的1297T多態(tài)性。根據(jù)本發(fā)明所述的第一實(shí)施方式,第1297位的核苷酸殘基被確定為胸腺嘧啶的 對象,由于被評價為檢測到了 GPIIIa基因的1297T多態(tài)性,因此可以被診斷或判定為患有 新生兒異體免疫性凝血細(xì)胞減少性紫癜的患者或具有其發(fā)病風(fēng)險。根據(jù)本發(fā)明所述的方法的第二實(shí)施方式,第1297位的核苷酸殘基被確定為胸腺 嘧啶的對象,由于被評價為檢測到了 GPIIIa基因的1297T多態(tài)性,因此可被診斷或判定為 具有血小板輸注中血小板輸注治療無效發(fā)病可能性。 根據(jù)本發(fā)明所述的檢測方法,可以通過將本發(fā)明所述的探針與核酸樣品(mRNA或 其逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物)雜交,并檢測雜交復(fù)合物即雙鏈核苷酸,來檢測試驗(yàn)樣品中的GPIIIa基因 的1297T多態(tài)性。對于雜交方法的詳細(xì)步驟,可以參照Nucleic Acid hybridization BiosScientific Publishers(1999)。利用雜交方法檢測GPIIIa基因的1297T多態(tài)性,例如可以通過以下步驟來進(jìn)行 (a)使來自試驗(yàn)樣品的多核苷酸與本發(fā)明所述的探針接觸;和(b)檢測雜交復(fù)合物。在步驟(a)中,可以將從試驗(yàn)樣品制備的mRNA或從該mRNA逆轉(zhuǎn)錄得到的互補(bǔ) DNA(cDNA)作為來自待試驗(yàn)細(xì)胞樣品的多核苷酸,與所述探針接觸。在使用探針的檢測方法中,探針可以被標(biāo)記。標(biāo)記的實(shí)例包括使用放射性物質(zhì)、酶 和熒光物質(zhì)的標(biāo)記。雜交產(chǎn)物的檢測可以利用熟知的方法比如Northern雜交、Southern雜交或菌落 雜交來進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明所述的第一實(shí)施方式,第1297位的核苷酸殘基被確定為胸腺嘧啶的 對象,由于被評價為檢測到了 GPIIIa基因的1297T多態(tài)性,因此可以被診斷或判定為患有 新生兒異體免疫性凝血細(xì)胞減少性紫癜的患者或具有其發(fā)病風(fēng)險。根據(jù)本發(fā)明所述的方法的第二實(shí)施方式,第1297位的核苷酸殘基被確定為胸腺 嘧啶的對象,由于被評價為檢測到了 GPIIIa基因的1297T多態(tài)性的評價,因此可被診斷或 判定為具有血小板輸注中血小板輸注治療無效發(fā)病可能性。根據(jù)本發(fā)明所述的檢測方法,可以通過使本發(fā)明所述的抗體與試驗(yàn)樣品接觸,并 檢測抗原_抗體反應(yīng),來檢測該試驗(yàn)樣品中的GPIIIa蛋白質(zhì)的407S多態(tài)性。使用抗原-抗體反應(yīng)的GPIIIa蛋白質(zhì)的407S多態(tài)性的檢測,例如可以通過以下步驟來進(jìn)行(e)使來自試驗(yàn)樣品的蛋白質(zhì)與本發(fā)明所述的抗體接觸;和(f)檢測抗原-抗 體復(fù)合物。檢測抗原-抗體反應(yīng)的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的,例如,被認(rèn)為包含多巴 胺分泌(dopamine-producing)神經(jīng)細(xì)胞增殖前體細(xì)胞的待試驗(yàn)細(xì)胞樣品中的GPIIIa蛋白 質(zhì),可以通過免疫學(xué)方法檢測。對于所述免疫學(xué)方法,可以對已經(jīng)根據(jù)需要進(jìn)行了適當(dāng)處理 (比如細(xì)胞的分離和提取操作)的細(xì)胞樣品施用以前已知的方法比如免疫組織染色方法、 酶免疫測定法、Western印跡方法、凝集法、競爭法或夾心法。免疫組織染色法例如可以通 過使用標(biāo)記抗體的直接法、或使用對抗該抗體的標(biāo)記抗體的間接法來進(jìn)行。作為標(biāo)記試劑, 可以使用已知的標(biāo)記物質(zhì)比如熒光物質(zhì)、放射性物質(zhì)、酶、金屬和染料。 根據(jù)本發(fā)明所述方法的第一實(shí)施方式,檢測到抗原-抗體復(fù)合物的對象,由于被 評價為檢測到了 GPIIIa蛋白質(zhì)的407S多態(tài)性,因此可被診斷或判定為患有新生兒異體免 疫性凝血細(xì)胞減少性紫癜的患者或具有其發(fā)病風(fēng)險。根據(jù)本發(fā)明方法所述的第二實(shí)施方式,檢測到抗原-抗體絡(luò)合物的對象,由于被 評價為檢測到了 GPIIIa蛋白質(zhì)的407S多態(tài)性,因此可以被診斷或判定為具有血小板輸注 中血小板輸注治療無效的發(fā)病可能性。[檢測試劑盒]根據(jù)本發(fā)明,提供用于進(jìn)行本發(fā)明所述的檢測方法的試劑盒。用于進(jìn)行本發(fā)明所述的檢測方法的檢測試劑盒的實(shí)例包括,用于檢測GPIIIa基 因的1297T多態(tài)性的試劑盒,其至少包含本發(fā)明所述的探針、引物或引物組。進(jìn)一步地,用 于進(jìn)行本發(fā)明所述的檢測方法的檢測試劑盒的實(shí)例包括,用于檢測GPIIIa蛋白質(zhì)的407S 多態(tài)性的試劑盒,其至少包含本發(fā)明所述的抗體。本發(fā)明所述的探針、引物、引物組和抗體可以是經(jīng)標(biāo)記的那些。至少包含本發(fā)明所述的探針的本發(fā)明所述的檢測試劑盒,通過雜交方法來檢測 GPIIIa基因的1297T多態(tài)性。根據(jù)需要,本發(fā)明所述的試劑盒可以進(jìn)一步地包含用于進(jìn)行雜交方法的各種試 齊U,比如用于檢測標(biāo)記的底物;雜交緩沖液;說明書;和/或儀器。至少包含本發(fā)明所述的引物或本發(fā)明所述的引物組的本發(fā)明所述的檢測試劑盒, 通過核酸擴(kuò)增法來檢測GPIIIa基因的表達(dá)。根據(jù)需要,本發(fā)明所述的試劑盒可以進(jìn)一步地包含用于進(jìn)行核酸擴(kuò)增法的各種試 齊U,比如緩沖液;指示PCR可正常進(jìn)行的內(nèi)標(biāo);說明書;和/或儀器。至少包含本發(fā)明所述的抗體的本發(fā)明所述的檢測試劑盒,通過檢測抗原-抗體反 應(yīng)來檢測GPIIIa蛋白質(zhì)的407S多態(tài)性。根據(jù)檢測方法的第三實(shí)施方式,本發(fā)明所述的試劑盒可以進(jìn)一步地包含用于進(jìn)行 抗原-抗體反應(yīng)的各種試劑,比如用于ELISA法等的第二抗體;染色劑;緩沖液;說明書;和 /或儀器。
實(shí)施例現(xiàn)在本發(fā)明將借助于實(shí)施例具體地描述,但本發(fā)明例如引物序列、探針序列等并 不受其限定。實(shí)施例1 :GPIIIa(HPA-7)基因中的多態(tài)性和新生兒異體免疫性凝血細(xì)胞減少性^M^Mffi^關(guān)于被診斷為新生兒異體免疫性凝血細(xì)胞減少性紫癜(NAITP)的患兒,預(yù) 測包含在母親血清中的抗體將與患兒的血小板反應(yīng)。因?yàn)樵摶純菏堑诙€孩子,故認(rèn)為在 第一個孩子的妊娠期間對來源于父親的血小板特異性抗原產(chǎn)生敏化的母親,獲得了對抗該 抗原的抗體產(chǎn)生能力,并且患兒的血小板受到在第二個孩子的妊娠期間產(chǎn)生的抗體的侵 襲。因?yàn)榛純旱难“逄禺愋钥乖醋杂诟赣H,故通過MPHA方法證實(shí)了患兒和其母親的 血清對父親的血小板的反應(yīng)性(Japanese Journal of Transfusionand Cell Therapy, Vol. 52. No. 652(6)678-683,2006)。首先,將父親的血小板固定于微孔板的孔上,然后使該血小板與患兒和母親的血 清,以及其稀釋液反應(yīng)。將反應(yīng)物與涂覆有人IgG抗體的羊紅細(xì)胞反應(yīng),并觀測生成的凝集 圖像。結(jié)果,分別為至多1024倍和16倍稀釋的母親血清和患兒血清顯示了對父親血小 板的陽性反應(yīng)。然后,使用PCR-PHFA方法分析了血小板抗原基因的類型(W098/02574)。結(jié)果,觀測到了不相容性,因?yàn)檠“蹇乖校瑢τ贖PA-2,母親具有(a-b+), 父親具有(a+b_)且患兒具有(a+b+);而對于HPA-3,母親具有(a+b_),父親和患兒具有 (a+b+)。然而,對于HPA-1、4、5和6的血小板抗原類型,觀測到了相容性,因?yàn)楦改负突純?均具有(a+b_)。另一方面,對于HPA-7,與之前報道的用于HPA-7a和HPA_7b的標(biāo)準(zhǔn)DNAs 通過PHFA方法比較,結(jié)果顯示所用個體中均存 在HPA-7a基因,而不存在HPA_7b基因。來源于父親的血小板特異性抗原被認(rèn)為存在于患兒中。因此,檢查了父親的血小 板對已知抗體的反應(yīng)性,雖然該血小板對HPA-I至HPA-6抗體為陰性,但是對HPA-7b抗體 卻顯示反應(yīng)性。此處,因?yàn)楦赣H的血小板與HPA-7b抗體反應(yīng),故預(yù)測到GPIIIa基因之中對 應(yīng)于HPA-7的區(qū)域中的某堿基的置換?;谠摽紤],使用以下引物擴(kuò)增了父親染色體DNA 中的GPIIIa基因的外顯子9,并且使用Wizard Plus SV Gel與PCRClean系統(tǒng)純化了擴(kuò) 增產(chǎn)物,然后將其連接到pT7Blue-T載體(由Novagen制造)中并導(dǎo)入E. coli JM109株 (由 TAKARA 制造)中。WHPA7-A :5,-TCCAGAGCTGGAGTGTTAACTG(SEQ ID NO :9)WHPA7_B 5,-CTGGCAGGCACAGTCACAATC (SEQ ID N0:10)培養(yǎng)獲得的白色菌落然后純化質(zhì)粒,隨后使用M13-R18引物(由TAKAEA制造)進(jìn) 行測序,以確認(rèn)克隆區(qū)域的堿基序列。測序使用BigDyeterminator ver. 1. 1 (由Applied Biosystems制造)來進(jìn)行。測序結(jié)果如表2所示。HPA_7a表示HPA_7a基因,HPA_7b表示
HPA-7b基因,且HPA-7新表示不同于HPA_7a基因和HPA_7b基因的新型基因。如表2和表3中所示,確認(rèn)了GPII工a基因的第1297位的堿基是胸腺嘧啶,且由該基因產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的第407位的氨基酸是絲氨酸的基因(HPA一7新)(SEQ工D N。7(堿基序列),SEQ ID N0:8(氨基酸序列))。關(guān)于HPA-7基因,作為基因多態(tài)性,迄今已經(jīng)報道了 GPIIIa基因的第1297位的堿基是胞嘧啶、第407位的氨基酸是脯氨酸的HPA-7a基因;和 GPIIIa基因的第1297位的堿基是鳥嘌呤、第407位的氨基酸是丙氨酸的HPA_7b基因,但此 次確認(rèn)的基因被證實(shí)具有不同于它們的新序列。實(shí)施例2 通過PCR-PHFA方法構(gòu)津HPA-7的新型等位基因檢測系統(tǒng)現(xiàn)在將描沭通 過PCR-PHFA方法構(gòu)建HPA-7的新型等位基因檢測系統(tǒng)。在PHFA方法中,將用非標(biāo)記引物 擴(kuò)增樣品所得的產(chǎn)物(樣品DNA)和用標(biāo)記引物擴(kuò)增相同區(qū)域所得的產(chǎn)物(標(biāo)準(zhǔn)DNA) —起 混合,并熱變性,然后基于在溫度梯度下退火時產(chǎn)生的鏈置換的程度來檢測樣品DNA和標(biāo) 準(zhǔn)DNA的序列是否相同。(1)標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)DNA的制備使用以下引物,擴(kuò)增分別整合了 HPA_7a基因、HPA_7b基 因和實(shí)施例1中所確認(rèn)的新型等位基因(HPA-7新)的質(zhì)粒,以制備一端標(biāo)記有DNP(二硝基 苯基)而另一端標(biāo)記有生物素的PCR產(chǎn)物,將該產(chǎn)物分別用作HPA-7a、HPA-7b和HPA-7新的 標(biāo)準(zhǔn) DNA。DNP-WHPA7-A 5' -TCCAGAGCTGGAGTGTTAACTG (SEQ ID NO 11)生物素-WHPA7-B 5’ -CTGGCAGGCACAGTCACAATC(SEQ ID NO 12)(2)樣品DNA的制備使用以下非標(biāo)記引物通過PCR擴(kuò)增分別整合了 HPA_7a、 HPA-7b和HPA-7新的質(zhì)粒,以獲得樣品DNA。進(jìn)一步地,使用相同引物擴(kuò)增事先已知基因 型的染色體 DNA 以獲得樣品 DNA。WHPA7-A :5,-TCCAGAGCTGGAGTGTTAACTG (SEQ ID NO 9) WHPA7-B :5’ -CTGGCAGGCACAGTCACAATC(SEQ ID NO 10)(3)競爭雜交使用30 μ 1的3XSSC(終濃度),將兩端具有標(biāo)記的1 μ 1標(biāo)準(zhǔn)DNA和 20 μ 1的樣品DNA混合,并將所得混合物在98°C下加熱10分鐘,以將DNA變性為單鏈。將 混合物按l°c /10分鐘的速度漸漸冷卻至70°C以退火。此時,具有完全匹配序列的互補(bǔ)鏈, 相較于具有誤配(一個或多個)的那些優(yōu)先地重新構(gòu)建。即,在具有完全相同于標(biāo)準(zhǔn)DNA 的序列的樣品DNA的情形中,標(biāo)準(zhǔn)DNA兩端的標(biāo)記被數(shù)學(xué)地稀釋,使得可預(yù)測具有兩標(biāo)記的 分子的比例約為總數(shù)的1/21。相反,樣品DNA中不存在相同于標(biāo)準(zhǔn)DNA的序列時,在兩端具 有標(biāo)記的原始標(biāo)準(zhǔn)DNA優(yōu)先被重新構(gòu)建。(4)重新構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)DNA的檢測向預(yù)先涂覆有鏈霉親和素的微型板的孔中添加在 兩端均具有標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)DNA,將該DNA通過末端的生物素維持在孔中。通過對其添加標(biāo)記有 抗-DNP抗體的堿性磷酸酶,預(yù)計該堿性磷酸酶將通過標(biāo)準(zhǔn)DNA被捕獲于孔中。對其添加作 為該酶底物的PNPP (對硝基酚),則引起出現(xiàn)黃色。該顏色通過測定405nm處的吸光度來定 量和檢測。在樣品DNA中存在相同于標(biāo)準(zhǔn)DNA的序列的情形中,所述吸光度低,而在不存在 相同序列時,則該吸光度高。關(guān)于指標(biāo)值,將混合有水的各標(biāo)準(zhǔn)DNA所測得的吸光度定義為 100,并顯示了與各樣品混合、熱變性和溫度梯度后所測得的吸光度的比例。該數(shù)值為20以 下時,判定樣品對標(biāo)準(zhǔn)DNA為陽性,而該數(shù)值為20以上時,判定該樣品為陰性。對于由HPA_7a、HPA_7b和 HPA-7新基因制備的標(biāo)準(zhǔn)DNA,測量了各樣品DNA所顯示
的指標(biāo)值。結(jié)果示于表4。 由克隆了各基因的質(zhì)粒制備的樣品相對于它們各自的標(biāo)準(zhǔn)DNA顯示了低指標(biāo)值。此處,樣品No. 1、No. 3至No. 7的指標(biāo)值相對于HPA_7a為20以下,而它們相對于 HPA-7b和HPA-7新卻均顯示超過50的數(shù)值,故推測它們具有HPA_7a的同源基因型。另一 方面,樣品No. 2相對于HPA-7a和HPA-7新的標(biāo)準(zhǔn)DNA顯示20以下的指標(biāo)值,故推測其具 有HPA-7a/新的雜合基因型。由以上結(jié)果,顯示GPIIIa基因的1297T多態(tài)性可以通過PCR-PHFA方法來檢測。實(shí)施例3 通過熒光珠法構(gòu)建檢測新型等位基因的方法現(xiàn)在將描述通過熒光珠法 構(gòu)建檢測新型等位基因的方法。在所述熒光珠法(Clin Chem. 43 (9)pl799-801 (1997))中, 可以通過用2種熒光染料來染色珠子(beads)以便各染料實(shí)現(xiàn)10個梯度,從而來識別100 種珠子。通過將不同的探針固定在各珠子上,并與樣品DNA進(jìn)行雜交,從而在測定中同時檢 測到對多個DNA探針的反應(yīng)性。(1)基因擴(kuò)增使用以下引物根據(jù)常規(guī)方法對人染色體DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。 生物素-P6/7FC :5,-CCATCCAGGTGAGCTTCAGC(SEQ ID NO: 13)生物素-P6/7RC-2 5’ -AGTGGTTGCAGGTATATGAGGG(SEQ IDNO 14)(2)Luminex珠子的預(yù)備作為探針序列,將具有以下核苷酸序列的低聚核苷酸根 據(jù)常規(guī)方法固定在Luminex珠子(由Luminex制造)上。珠子No. 1 (用于檢測HPA_7a 的珠子)5,-GCTGTCCCCAGGAG-3' (SEQ ID NO 15)珠子 No. 2 (用于檢測 HPA_7b 的珠 子)5' -GAGGCTGTGCCCAGGA-3' (SEQ ID NO 16)珠子 No. 3 [用于檢測 HPA-7 新的珠子) 5,-GAGGCTGTTCCCAGG-3' (SEQ ID NO 17)珠子 No. 4 (用于檢測 HPA-7 的共通珠子) 5’-TGAACCTAATAGCCATCGC-3’ (SEQ ID NO 18)(3)雜交和檢測作為樣品,使用以下物質(zhì)樣品No. 1 具有HPA_7a基因的質(zhì)粒樣 品No. 2 具有HPA-7b基因的質(zhì)粒樣品No. 3 具有HPA-7新基因的質(zhì)粒樣品樣品No. 4 染色 體 DNA No. 001 樣品 No. 5 染色體 DNA No. 019 樣品 No. 6 染色體 DNA No. 193通過利用這些作為樣品,進(jìn)行了 PCR擴(kuò)增和與探針的雜交,測量通過結(jié)合至珠子 的探針捕獲到的PCR產(chǎn)物的熒光值。
首先,將5μ1的PCR反應(yīng)液與5μ 1的堿溶液混合,以將DNA變性為單鏈。將所得混合 物與25 μ 1的含有上述4種珠子和熒光標(biāo)記鏈霉親和素[由BD Biosciences制造)的雜交 溶液混合,從而中和。將所得混合物在55°C下孵育30分鐘,以使探針與PCR產(chǎn)物雜交,同時 進(jìn)行PCR產(chǎn)物的熒光標(biāo)記。然后,在添加洗滌液并混合所得混合物后,通過離心除去上清, 以除去未結(jié)合至探針的PCR產(chǎn)物和過量的熒光標(biāo)記鏈霉親和素。將珠子混懸于洗滌液,并 使用Luminex設(shè)備,進(jìn)行與珠子上的探針雜交的熒光標(biāo)記PCR產(chǎn)物,和四種珠子的識別。檢 關(guān)于熒光值,通過設(shè)定截斷值為2000,染色的細(xì)胞變?yōu)殛栃浴R驗(yàn)闃悠種o. 1、樣品 No. 2和樣品No. 3分別是具有HPA-7a、HPA_7b和HPA-7新的序列的質(zhì)粒,故它們分別與它 們各自的探針特異性地反應(yīng),而給出比截斷值高的熒光值。進(jìn)一步地,它們均與具有共通序 列(commonsequence)作為探針的珠子No. 4反應(yīng)而給出高熒光值。另一方面,因?yàn)槿旧w DNA即樣品No. 4和No. 5對結(jié)合有ΗΡΑ-la和共通序列的珠子給出高熒光值,故可看出它們 具有同型接合的HPA-7a。因?yàn)闃悠種o. 6相對于結(jié)合有HPA_7a、HPA-7新和共通序列的珠 子給出高熒光值,故可看出它具有雜合的HPA-7a和HPA-7新。由以上結(jié)果,顯示GPIIIa基因的1297T多態(tài)性可以通過使用熒光珠法來檢測。
權(quán)利要求
包含GPIIIa基因的核苷酸序列的多核苷酸,其中所述GPIIIa基因的第1297位的核苷酸殘基是胸腺嘧啶殘基,或包含所述胸腺嘧啶殘基的其片段。
2.權(quán)利要求1所述的多核苷酸或其片段,選自以下(i)、(ii)、(iii)和(iv)(i)包含SEQ ID NO 1的核苷酸序列的多核苷酸;( )下述多核苷酸,該多核苷酸由SEQ ID NO :1的核苷酸序列中插入、置換和/或缺 失了一個或多個核苷酸和/或向其一端或兩端添加了一個或多個核苷酸的核苷酸序列組 成,并且該多核苷酸編碼與由SEQ IDNO 2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)具有同等功能的蛋 白質(zhì);(iii)下述多核苷酸,該多核苷酸在嚴(yán)格條件下與由SEQID NO :1的核苷酸序列的互 補(bǔ)序列組成的多核苷酸雜交,且該多核苷酸編碼與由SEQ ID NO :2的氨基酸序列組成的蛋 白質(zhì)具有同等功能的蛋白質(zhì);和(iv)下述多核苷酸,該多核苷酸與由SEQID NO 1的核苷酸序列組成的多核苷酸具有 70%以上的同一性,且該多核苷酸編碼與由SEQ IDNO 2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)具有 同等功能的蛋白質(zhì)。
3.權(quán)利要求1所述的多核苷酸或其片段,編碼由SEQID NO :2的氨基酸序列或其一部 分組成的蛋白質(zhì)。
4.權(quán)利要求1所述的多核苷酸或其片段,由SEQID NO 1的核苷酸序列或其一部分組成。
5.包含GPIIIa蛋白質(zhì)的氨基酸序列的蛋白質(zhì),其中所述GPIIIa蛋白質(zhì)的第407位的 氨基酸殘基是絲氨酸殘基,或者包含所述絲氨酸殘基的其片段。
6.權(quán)利要求5所述的蛋白質(zhì)或其片段,選自以下(ν)、(vi)、(vii)和(viii) (ν)包含SEQ ID NO 2的氨基酸序列的蛋白質(zhì);(vi)下述蛋白質(zhì),該蛋白質(zhì)由SEQID NO :2的氨基酸序列中插入、置換和/或缺失了 一個或多個氨基酸和/或向其一端或兩端添加了一個或多個氨基酸的氨基酸序列組成,并 且該蛋白質(zhì)與由SEQ ID NO :2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)具有同等功能;(vii)由下述多核苷酸編碼的蛋白質(zhì),該多核苷酸在嚴(yán)格條件下,與由編碼SEQID NO 2的氨基酸序列的多核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列組成的多核苷酸雜交,且所述蛋白質(zhì) 與由SEQ ID NO 2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)具有同等功能;和(viii)下述蛋白質(zhì),該蛋白質(zhì)由與SEQID NO :2的氨基酸序列具有70%以上的同一性 的氨基酸序列組成,且該蛋白質(zhì)與由SEQ ID NO :2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)具有同等功 能。
7.權(quán)利要求5所述的蛋白質(zhì)或其片段,由SEQID NO :2的氨基酸序列或其一部分組成。
8.引物,其可以與權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的多核苷酸的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列 雜交,且其用于通過核酸擴(kuò)增法來擴(kuò)增包含GPIIIa基因的第1297位的核苷酸殘基或與其 配對的殘基的區(qū)域。
9.權(quán)利要求8所述的引物,由下述多核苷酸組成,所述多核苷酸包含權(quán)利要求1-4中任 一項(xiàng)所述的多核苷酸的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列的至少10個連續(xù)核苷酸。
10.權(quán)利要求8或9所述的引物,具有至少12至30個堿基的長度。
11.引物組,其由權(quán)利要求8-10中任一項(xiàng)所述的兩種或更多種引物組成,且其用于通過核酸擴(kuò)增法來擴(kuò)增包含GPIIIa基因的第1297位的核苷酸殘基或與其配對的殘基的區(qū) 域。
12.權(quán)利要求8-10中任一項(xiàng)所述的引物或權(quán)利要求11所述的引物組,用于測定新生兒 異體免疫性凝血細(xì)胞減少性紫癜或其發(fā)病風(fēng)險,或血小板輸注中血小板輸注治療無效的發(fā) 病可能性。
13.探針,其可以與權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的多核苷酸的核苷酸序列或其互補(bǔ)序 列雜交,且其用于GPIIIa基因的第1297位的胸腺嘧啶殘基的檢測。
14.權(quán)利要求13所述的探針,包含與下述區(qū)域雜交的多核苷酸,所述區(qū)域包含權(quán)利要 求1-4中任一項(xiàng)所述的多核苷酸的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列中的、GPIIIa基因的第1297位 的核苷酸殘基或與其配對的殘基。
15.權(quán)利要求13或14所述的探針,由下述多核苷酸組成,該多核苷酸包含權(quán)利要求 1-4中任一項(xiàng)所述的多核苷酸的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列的至少10個連續(xù)核苷酸。
16.權(quán)利要求13-15中任一項(xiàng)所述的探針,具有至少12至30個堿基的長度。
17.權(quán)利要求13-16中任一項(xiàng)所述的探針,用于測定新生兒異體免疫性凝血細(xì)胞減少 性紫癜或其發(fā)病風(fēng)險,或血小板輸注中血小板輸注治療無效的發(fā)病可能性。
18.抗體,該抗體抗權(quán)利要求5-7中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)或其片段。
19.用于通過檢測GPIIIa基因中的突變來判定新生兒異體免疫性凝血細(xì)胞減少性紫 癜或其發(fā)病風(fēng)險、或血小板輸注中血小板輸注治療無效的發(fā)病可能性的方法,其包括使用 權(quán)利要求8-10中任一項(xiàng)所述的引物、權(quán)利要求11所述的引物組或權(quán)利要求13-16中任一 項(xiàng)所述的探針,來檢測GPIIIa基因的第1297位的胸腺嘧啶殘基的步驟。
20.用于通過檢測GPIIIa基因中的突變來判定新生兒異體免疫性凝血細(xì)胞減少性紫 癜或其發(fā)病風(fēng)險、或血小板輸注中血小板輸注治療無效的發(fā)病可能性的方法,其包括使用 權(quán)利要求18所述的抗體來檢測GPIIIa蛋白質(zhì)的第407位的絲氨酸殘基的步驟。
21.用于判定新生兒異體免疫性凝血細(xì)胞減少性紫癜或其發(fā)病風(fēng)險、或血小板輸注中 血小板輸注治療無效的發(fā)病可能性的試劑盒,至少包含權(quán)利要求8-10中任一項(xiàng)所述的引 物、權(quán)利要求11所述的引物組、權(quán)利要求13-16中任一項(xiàng)所述的探針或權(quán)利要求18所述的 抗體。
全文摘要
本發(fā)明的目的是提供用于測定新生兒異體免疫性凝血細(xì)胞減少性紫癜或其發(fā)病風(fēng)險的探針、引物、引物組和抗體。根據(jù)本發(fā)明,提供探針、引物、引物組和抗體,以用于GPIIIa基因的第1297位的胸腺嘧啶殘基的檢測。
文檔編號C12P21/08GK101849003SQ20088002506
公開日2010年9月29日 申請日期2008年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月25日
發(fā)明者岡孝紀(jì), 前川尻真司, 永田希美, 石井博之, 谷上純子 申請人:日本赤十字社;湧永制藥株式會社