專利名稱：：在核酸測(cè)序中用于自適應(yīng)試劑控制的系統(tǒng)和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域和一種或多種自適應(yīng)試劑控制方法和元件(adaptivereagentcontrolmethodandelement)。更具體地講，本發(fā)明涉及用于核酸測(cè)序過程的一種或多種酶試劑濃度的活性測(cè)定和動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)，以優(yōu)化性能并提高所述試劑和過程的效率。此外，本發(fā)明還涉及能自動(dòng)化檢測(cè)并調(diào)節(jié)試劑濃度的儀器裝置。
背景技術(shù)：
：已知本領(lǐng)域有許多“測(cè)序”技術(shù)可應(yīng)用于本文所描述的本發(fā)明，例如基于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的采用末端終止和大小分離技術(shù)的所謂Sanger測(cè)序法的技術(shù)。另一類高效的測(cè)序技術(shù)包括“合成測(cè)序(Sequencing-by-synthesis)”技術(shù)(SBS)。SBS技術(shù)通常用于測(cè)定核酸樣品中一種或多種分子的特征(identity)或核酸組成。比起先前所采用的測(cè)序技術(shù)而言，SBS技術(shù)具有許多想要的優(yōu)勢(shì)。例如，與現(xiàn)有技術(shù)相比，SBS的實(shí)施方案能夠進(jìn)行所謂的高通量測(cè)序，產(chǎn)生大容量高品質(zhì)的序列信息，而且費(fèi)用低廉。另一個(gè)優(yōu)勢(shì)包括以大規(guī)模平行方式從多個(gè)模板分子同時(shí)產(chǎn)生序列信息。換句話說，可在一個(gè)過程中對(duì)來自一種或多種樣品的多個(gè)核酸分子同時(shí)進(jìn)行測(cè)序。SBS方法的典型實(shí)施方案包括逐步合成與其核苷酸序列組成有待確定的模板核酸分子互補(bǔ)的單鏈多核苷酸分子。例如，SBS技術(shù)的操作通常是通過在相應(yīng)序列位置上將單個(gè)核酸(也稱為核苷酸)種類加到與模板分子的核酸種類互補(bǔ)的新生多核苷酸分子上而進(jìn)行的。通常采用本領(lǐng)域已知的各種方法來檢測(cè)新生分子上添加的核酸種類，這樣的方法包括但不限于焦磷酸測(cè)序法或熒光檢測(cè)法，例如使用可逆終止子或能量轉(zhuǎn)移標(biāo)記(包括熒光共振能量轉(zhuǎn)移染料(FRET))的方法。通常，循環(huán)進(jìn)行該過程，直到合成與模板互補(bǔ)的完全(即代表全部序列位置)或所需序列長(zhǎng)度。此外，如上所述的SBS的許多實(shí)施方案都能夠以大規(guī)模平行方式進(jìn)行測(cè)序操作。例如，可使用能自動(dòng)進(jìn)行制備和/或測(cè)序方法相關(guān)的一個(gè)或多個(gè)步驟或操作的儀器裝置，來完成SBS方法的一些實(shí)施方案。某些儀器采用例如具有孔的板或其它類型的微型反應(yīng)器配置的元件，這類元件能夠在各孔或各微型反應(yīng)器中同時(shí)進(jìn)行反應(yīng)。SBS技術(shù)以及用于大規(guī)模平行測(cè)序的系統(tǒng)和方法的其它實(shí)例可參見美國(guó)專利號(hào)6，274，320,6,258，568、6，210，891,7,211，390,7,244，559,7,264，929,7,335，762和7，323，305，其各自通過引用全部結(jié)合到本文中，用于所有目的；以及美國(guó)專利申請(qǐng)順序號(hào)11/195，254，其通過引用全部結(jié)合到本文中，用于所有目的。可以理解，SBS的典型實(shí)施方案對(duì)過程步驟或組成中所用的不同元件相關(guān)的參數(shù)差異是敏感的，這些差異例如酶促過程步驟中催化活性的不同水平。因此，通常在SBS的實(shí)施方案中最好采用提高一個(gè)或多個(gè)過程步驟或組成的效率的策略或方法。例如，通常可以理解，在下一循環(huán)利用不同核苷酸種類啟動(dòng)后續(xù)延伸反應(yīng)之前，前一延伸循環(huán)中所利用的特定核苷酸種類的所有分子都應(yīng)當(dāng)被除去和/或使之失活。如果前一循環(huán)的核苷酸種類仍殘留在用不同核苷酸種類的當(dāng)前循環(huán)中，則某些殘留核苷酸種類分子就有可能摻入到新生分子中。殘留核苷酸種類分子的摻入將會(huì)被錯(cuò)誤地翻譯成當(dāng)前循環(huán)中摻入的核苷酸種類。在本實(shí)例中，不想要的核苷酸種類分子的摻入可造成延后效應(yīng)(carryforwardeffect),這在下文有更詳細(xì)介紹。因此，最好是采用一種或多種方法來確保殘留核苷酸種類的分子以及其它不想要的反應(yīng)產(chǎn)物或試劑被完全除去或失活。特別有效并可用于SBS方法的一種方法就是用“腺苷三磷酸雙磷酸酶(apyrase)，，來洗滌反應(yīng)容器或底物區(qū)。相關(guān)領(lǐng)域普通技術(shù)人員都懂得腺苷三磷酸雙磷酸酶是一種具有多種特性的酶，包括降解核苷三磷酸、二磷酸、ATP和PPi(焦磷酸(pyrophosphate))。在SBS實(shí)施方案中使用腺苷三磷酸雙磷酸酶，僅僅簡(jiǎn)單地洗滌就能顯著地提高對(duì)過量和不想要的核苷酸種類、試劑和反應(yīng)產(chǎn)物的去除。例如，在每次反應(yīng)循環(huán)結(jié)束時(shí)，都可用腺苷三磷酸雙磷酸酶來“洗滌”或使之“流過”包含一個(gè)或多個(gè)反應(yīng)區(qū)的固體支持物表面，從而促進(jìn)對(duì)測(cè)序反應(yīng)混合物中的任何殘留的、未摻入的核苷酸種類分子的降解。腺苷三磷酸雙磷酸酶還可用于降解前一循環(huán)所產(chǎn)生的ATP，因此能“滅掉”前一循環(huán)反應(yīng)所產(chǎn)生的光。在一個(gè)除去殘留腺苷三磷酸雙磷酸酶和反應(yīng)產(chǎn)物的快速洗滌步驟之后，可以開始用不同核苷酸種類進(jìn)行下一反應(yīng)循環(huán)。在某些實(shí)施方案中，可將腺苷三磷酸雙磷酸酶結(jié)合在固體或可移動(dòng)的固體支持物上。腺苷三磷酸雙磷酸酶的使用和由此使用帶來的優(yōu)勢(shì)的其它實(shí)例可參見美國(guó)專利順序號(hào)7，323，305(名稱為“Methodsofamplifyingandsequencingnucleicacids(核酸的擴(kuò)增和測(cè)序方法)”)，其通過引用全部結(jié)合到本文中，用于所有目的。在典型的實(shí)施方案中，使用腺苷三磷酸雙磷酸酶的正確濃度以避免不良效應(yīng)是至關(guān)重要的。例如，如果腺苷三磷酸雙磷酸酶的濃度太高的話，結(jié)果可包括后續(xù)循環(huán)中想要的核苷酸種類也被降解。換句話說，因?yàn)闈舛忍?，未反?yīng)的腺苷三磷酸雙磷酸酶在反應(yīng)循環(huán)開始時(shí)仍然存在，而這反過來又會(huì)降解本輪所加入的核苷酸種類分子。這樣過量的腺苷三磷酸雙磷酸酶活性造成了“不完全延伸”效應(yīng)。另一方面，如果腺苷三磷酸雙磷酸酶的濃度或活性太低的話，結(jié)果可包括前一循環(huán)的某一部分核苷酸種類或某一百分比的核苷酸種類仍存在于當(dāng)前循環(huán)中。如上所述，腺苷三磷酸雙磷酸酶活性低下或缺失會(huì)造成“延后”效應(yīng)。因此，在本實(shí)例中，通常最好是測(cè)定腺苷三磷酸雙磷酸酶活性，以便能調(diào)節(jié)其濃度，在反應(yīng)中達(dá)到最佳活性水平。如上所述，延后效應(yīng)和不完全延伸效應(yīng)可能是非最佳腺苷三磷酸雙磷酸酶濃度或活性的結(jié)果，而且是要考慮的兩個(gè)重要的錯(cuò)誤來源。例如，在樣品的每一擴(kuò)增群體(即與自核酸分子模板擴(kuò)增的拷貝基本相同的群體)中的一小部分模板核酸分子失去或放棄與該群體中其余模板核酸分子的時(shí)相同步性(也就是說，這部分模板分子相關(guān)的反應(yīng)或超前或落后于在對(duì)該群體的測(cè)序反應(yīng)循環(huán)中其它模板分子所針對(duì)的序列位置)。在本實(shí)例中，反應(yīng)不能將一種或多種核苷酸種類適當(dāng)?shù)負(fù)饺氲揭粋€(gè)或多個(gè)新生分子中、以將序列延伸一位，這導(dǎo)致每個(gè)后續(xù)反應(yīng)都在時(shí)相上落后于其余群體序列位置的序列位置上或在其外面的序列位置上開始進(jìn)行。這樣的效應(yīng)在本文中就稱為“不完全延伸”(incompleteextension,IE)?；蛘?，通過在時(shí)相上超前于其余群體序列位置的序列位置上或在其外面的序列位置上摻入一種或多種核苷酸種類的新生分子的不完全延伸，在本文中就稱為“延后”(carryforward,CF)。CF和IE的合并效應(yīng)在本文中就稱為CAFIE。時(shí)相同步錯(cuò)誤及其校正方法的進(jìn)一步描述可參見PCT申請(qǐng)順序號(hào)US2007/004187(名稱為“SystemandMethodforCorrectingPrimerExtensionErrorsinNucleicAcidSequenceData(用于校正核酸序列數(shù)據(jù)中引物延伸錯(cuò)誤的系統(tǒng)和方法)”，申請(qǐng)日為2007年2月15日)，其通過引用全部結(jié)合到本文中，用于所有目的。因此，非常有利的是，使用測(cè)定和調(diào)節(jié)腺苷三磷酸雙磷酸酶濃度以及SBS方法和過程中其它重要試劑濃度的方法。尤其有用的是用不同儀器進(jìn)行自動(dòng)化實(shí)施方案，其中更希望能夠動(dòng)態(tài)測(cè)定酶或試劑的濃度或有效性，其中可以適應(yīng)性地調(diào)節(jié)所述酶或試劑的濃度，以滿足系統(tǒng)檢測(cè)的需要。發(fā)明概述本發(fā)明的實(shí)施方案涉及對(duì)核酸序列的測(cè)定。更具體地講，本發(fā)明的實(shí)施方案涉及對(duì)通過SBS進(jìn)行核酸測(cè)序時(shí)所獲取的數(shù)據(jù)進(jìn)行錯(cuò)誤校正的方法和系統(tǒng)。描述了用于自適應(yīng)試劑控制方法的一個(gè)實(shí)施方案，包括a)將第一濃度的酶試劑引入到含有反應(yīng)底物的反應(yīng)環(huán)境中，其中酶試劑和反應(yīng)底物是測(cè)序過程的組成部分；b)測(cè)定反應(yīng)環(huán)境中第一濃度酶試劑的活性水平，其中活性水平包括酶試劑與反應(yīng)底物之間反應(yīng)的可檢測(cè)產(chǎn)物；c)用所檢測(cè)到的第一濃度的活性水平來確定最佳濃度；和d)在反應(yīng)環(huán)境中使用酶試劑的最佳濃度實(shí)施測(cè)序過程，其中測(cè)序過程包括一系列重復(fù)的測(cè)序反應(yīng)。在某些實(shí)施過程中，該方法也包括在步驟d)之前，用最佳濃度作為第一濃度來重復(fù)步驟a)和b)；和用所檢測(cè)到的活性水平來證實(shí)酶試劑的最佳濃度。另外，該方法還可包括將第二濃度和第三濃度的酶試劑引入到含有反應(yīng)底物的反應(yīng)環(huán)境中；測(cè)定反應(yīng)環(huán)境中第二濃度和第三濃度的酶試劑的活性水平；和用所檢測(cè)到的第一、第二和第三濃度的活性水平來確定最佳濃度。也描述了核酸測(cè)序系統(tǒng)的一個(gè)實(shí)施方案，包括流動(dòng)槽(flowcell)、閥門和檢測(cè)器，其中流動(dòng)槽包括用于實(shí)施測(cè)序過程(包含一系列重復(fù)的測(cè)序反應(yīng))的反應(yīng)環(huán)境；閥門將第一濃度酶試劑引入到含有反應(yīng)底物的反應(yīng)環(huán)境中，其中酶試劑和反應(yīng)底物是測(cè)序過程的組成部分；檢測(cè)器檢測(cè)反應(yīng)環(huán)境中第一濃度的酶試劑的活性水平，其中活性水平包括酶試劑與反應(yīng)底物之間反應(yīng)的可檢測(cè)產(chǎn)物；其中閥門在響應(yīng)所檢測(cè)到的活性水平時(shí)，給反應(yīng)環(huán)境提供酶試劑的最佳濃度。在某些實(shí)施過程中，系統(tǒng)還包括儲(chǔ)存有可執(zhí)行代碼的計(jì)算機(jī)，其中可執(zhí)行代碼執(zhí)行以下步驟為閥門提供指令控制，以將第一濃度的酶試劑和反應(yīng)底物引入到反應(yīng)環(huán)境中；接收來自檢測(cè)器的所檢測(cè)到的第一濃度的活性水平；用所檢測(cè)到的第一濃度的活性水平來確定最佳濃度；和為閥門提供指令控制，以提供最佳濃度。以上實(shí)施方案和實(shí)施過程不一定是彼此包含或彼此排斥的，可以按任何不矛盾的方式和其它可能方式來組合，無論它們是否彼此相關(guān)地存在于相同或不同實(shí)施方案或?qū)嵤┻^程中。對(duì)一個(gè)實(shí)施方案或?qū)嵤┻^程的描述不得視為是對(duì)其它實(shí)施方案和/或?qū)嵤┻^程的限制。同樣，在本說明書其它地方所描述的任何一個(gè)或多個(gè)功能、步驟、操作或技術(shù)，在替代的實(shí)施過程中，可以與發(fā)明概述中所描述的任何一個(gè)或多個(gè)功能、步驟、操作或技術(shù)相結(jié)合。因此，上述實(shí)施方案和實(shí)施過程是說明性的而非限制性的。附圖簡(jiǎn)述根據(jù)以下發(fā)明詳述并結(jié)合附圖，將會(huì)更清楚地理解上述特征和更多特征。在附圖中，同樣的參考數(shù)字表示同樣的結(jié)構(gòu)、元件或方法步驟，而參考數(shù)字最左邊的一位數(shù)字表示該參考元件首次出現(xiàn)時(shí)的圖號(hào)(例如，元件160首次出現(xiàn)在圖1)。然而，所有這些約定都視為是典型的或說明性的，而非限制性的。圖1是測(cè)序儀器的一個(gè)實(shí)施方案的功能性框圖，所述儀器包括在計(jì)算機(jī)控制下用于處理反應(yīng)底物的光控子系統(tǒng)和流控子系統(tǒng)；圖2是圖1用于處理反應(yīng)底物的光控子系統(tǒng)和流控子系統(tǒng)的一個(gè)實(shí)施方案的功能性框圖；圖3是簡(jiǎn)化圖，表示所測(cè)得的酶試劑的多個(gè)樣品活性水平的差異；圖4A和圖4B是簡(jiǎn)化圖，表示酶活性試驗(yàn)的一個(gè)實(shí)施方案，使用試驗(yàn)分子顯示沒有錯(cuò)誤的測(cè)序循環(huán)與具有引入錯(cuò)誤的測(cè)序循環(huán)之間的差異；和圖5是簡(jiǎn)化圖，表示被測(cè)信號(hào)與酶試劑濃度之間關(guān)系的一個(gè)實(shí)施方案。發(fā)明詳述正如下文將要更詳細(xì)描述的，本發(fā)明的實(shí)施方案包括用于測(cè)序反應(yīng)的試劑濃度的自適應(yīng)控制的系統(tǒng)和方法。此外，本發(fā)明還包括在測(cè)序過程之前和/或測(cè)序過程期間，對(duì)試劑濃度或活性進(jìn)行動(dòng)態(tài)地測(cè)定并對(duì)濃度進(jìn)行調(diào)節(jié)，致使試劑活性在測(cè)序過程的最佳范圍之內(nèi)。a.概要術(shù)語“流程圖(flowgram)”和“熱解圖(pyrogram)”在本文中可互換使用，通常是指通過SBS方法所得到的序列數(shù)據(jù)的圖表。此外，本文所用的術(shù)語“讀數(shù)(read)”或“序列讀數(shù)(sequenceread)”通常是指得自單一核酸模板分子或模板核酸分子的基本相同的多個(gè)拷貝的群體的完整序列數(shù)據(jù)。本文所用的術(shù)語“循環(huán)(rim)”或“測(cè)序循環(huán)(sequencingrun)”通常是指在一個(gè)或多個(gè)模板核酸分子的測(cè)序操作中進(jìn)行的一系列測(cè)序反應(yīng)。本文所用的術(shù)語“流動(dòng)(flow)”通常是指將溶液加入到含有模板核酸分子的環(huán)境中的一系列循環(huán)或重復(fù)循環(huán)，其中溶液可包含用于加到新生分子上的核苷酸種類或用于降低由上一輪循環(huán)核苷酸種類所引起的殘留或噪聲效應(yīng)的其它試劑(例如緩沖劑或酶)。本文所用的術(shù)語“流動(dòng)循環(huán)(flowcycle)”通常是指序貫系列的流動(dòng)，其中在循環(huán)期間核苷酸種類流動(dòng)一次(即流動(dòng)循環(huán)可包括按T、A、C、G核苷酸種類的順序序貫加入，盡管其它順序組合也可認(rèn)為是該定義的組成部分)。通常，流動(dòng)循環(huán)是重復(fù)循環(huán)，具有從循環(huán)到循環(huán)的相同流動(dòng)順序。本文所用的術(shù)語“讀長(zhǎng)(readlength)”通常是指能可靠測(cè)序的模板分子長(zhǎng)度的上限。有許多因素可以影響系統(tǒng)和/或過程的讀長(zhǎng)，包括但不限于模板核酸分子中GC含量的程度。本文所用的術(shù)語“試驗(yàn)片段”或“TF”通常是指可用于質(zhì)量控制、標(biāo)定或其它相關(guān)目的的已知序列組成的核酸元件?！靶律肿印蓖ǔＪ侵竿ㄟ^模板依賴性DNA聚合酶并摻入與模板分子中相應(yīng)核苷酸種類互補(bǔ)的核苷酸種類而延伸的DNA鏈。術(shù)語“模板核酸”、“模板分子”、“靶核酸”或“靶分子”通常是指作為測(cè)序反應(yīng)對(duì)象的核酸分子，從這樣的測(cè)序反應(yīng)中可獲取序列數(shù)據(jù)或信息。本文所用的術(shù)語“核苷酸種類(nucleotidespecie)”一般是指通常摻入到新生核酸分子中的包括嘌呤(腺嘌呤、鳥嘌呤)和嘧啶(胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶)在內(nèi)的核酸單體本身。本文所用的術(shù)語“單體重復(fù)序列”或“均聚物”通常是指包含相同核苷酸種類(即重復(fù)核苷酸種類)的兩個(gè)或更多個(gè)序列位置。本文所用的術(shù)語“均勻延伸”通常是指在反應(yīng)中基本相同的模板分子群體的各成員均勻地進(jìn)行同一延伸步驟的延伸反應(yīng)的關(guān)系或時(shí)相。本文所用的術(shù)語“完全效率(completionefficiency)”通常是指在給定流動(dòng)期間適當(dāng)延伸的新生分子的百分率。本文所用的術(shù)語“不完全延伸率”通常是指不能適當(dāng)延伸的新生分子數(shù)量與所有新生分子數(shù)量的比率。本文所用的術(shù)語“基因組文庫(kù)”或“鳥槍文庫(kù)(shotgunlibrary)”通常是指源自和/或代表一個(gè)生物體或個(gè)體的完整基因組(即基因組的所有區(qū)域)的分子集合。本文所用的術(shù)語“擴(kuò)增子”通常是指所選定的擴(kuò)增產(chǎn)物，例如由聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)或連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)產(chǎn)生的那些。本文所用的術(shù)語“密匙(keypass)”或“密匙作圖(keypassmapping)”通常是指在已知位置上與模板核酸分子相關(guān)的核酸“關(guān)鍵元件(keyelement)”(即通常包含在連接銜接子元件中)，其包含用作質(zhì)量控制參考的已知序列組成，用于從模板分子產(chǎn)生序列數(shù)據(jù)。如果它在正確位置上包含與關(guān)鍵元件相關(guān)的已知序列組成的話，這樣的序列數(shù)據(jù)就通過質(zhì)量控制。本文所用的術(shù)語“鈍端”或“鈍端的”通常是指末端以一對(duì)互補(bǔ)核苷酸堿基種類為端點(diǎn)的線狀雙鏈核酸分子，其中一對(duì)鈍端通常容許彼此連接。涉及樣品的制備和處理、序列數(shù)據(jù)的產(chǎn)生和序列數(shù)據(jù)的分析的系統(tǒng)和方法的某些示例性的實(shí)施方案，一般性地描述如下，其中部分或全部都適用于本發(fā)明的實(shí)施方案。特別描述了用于模板核酸分子的制備、模板分子的擴(kuò)增、靶特異性擴(kuò)增子和/或基因組文庫(kù)的產(chǎn)生、測(cè)序方法和儀器裝置的系統(tǒng)和方法以及計(jì)算機(jī)系統(tǒng)的示例性實(shí)施方案。在典型的實(shí)施方案中，來自實(shí)驗(yàn)或診斷樣品的核酸分子必須從其原始狀態(tài)制備和處理成為適用于高通量測(cè)序的模板分子。處理方法可因用途不同而異，產(chǎn)生具有不同特性的模板分子。例如，在高通量測(cè)序的某些實(shí)施方案中，優(yōu)選產(chǎn)生模板分子，其序列或讀長(zhǎng)至少是用特定測(cè)序方法可精確產(chǎn)生序列數(shù)據(jù)的長(zhǎng)度。在本實(shí)例中，長(zhǎng)度可包括的范圍約為25-30堿基對(duì)、約50-100堿基對(duì)、約200-300堿基對(duì)或約350-500堿基對(duì)，或適用于特定測(cè)序用途的其它長(zhǎng)度。在某些實(shí)施方案中，用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的各種方法，使來自樣品(例如基因組樣品)的核酸片段化。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，隨機(jī)打斷(即并非為具體序列或區(qū)域選擇)核酸的方法可包括噴霧法(nebulizationmethod)或超聲處理法。然而，可以理解，片段化的其它方法(例如用限制性核酸內(nèi)切酶進(jìn)行消化)也可用于片段化目的。同樣在本實(shí)例中，一些處理方法可采用本領(lǐng)域已知的大小選擇方法，以選擇性分離出所需長(zhǎng)度的核酸片段。同樣，在某些實(shí)施方案中，最好將額外功能性元件與每個(gè)模板核酸分子相關(guān)聯(lián)。這些元件可用于各種不同功能，包括但不限于用于擴(kuò)增和/或測(cè)序方法的引物序列、質(zhì)量控制元件、編碼不同關(guān)聯(lián)(例如與來源樣品或患者樣品相關(guān)聯(lián))的獨(dú)特標(biāo)識(shí)符、或者其它功能性元件。例如，某些實(shí)施方案可涉及引物序列元件或包含用于擴(kuò)增和/或測(cè)序的引物序列的互補(bǔ)序列組成的區(qū)域。此外，同樣的元件可用于所謂的“鏈選擇”和將核酸分子固定到固相基底上。在本實(shí)例中，兩組引物序列區(qū)(在下文中稱為引物序列A和引物序列B)可用于鏈選擇，其中僅選擇具有一拷貝引物序列A和一拷貝引物序列B的單鏈并且包含在所制備的樣品中。同樣的引物序列區(qū)可用于擴(kuò)增和固定化方法，其中，例如引物序列B可固定在固體基底上，而擴(kuò)增產(chǎn)物就在其上延伸。用于樣品處理片段化、鏈選擇和添加功能性元件和銜接子的其它實(shí)例可參見美國(guó)專利申請(qǐng)順序號(hào)10/767，894(名稱為“Methodforpreparingsingle-strandedDNAlibraries(單鏈DNA文庫(kù)的制備方法)”，申請(qǐng)日為2004年1月28日)；美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)Jliii^61/031,779("SystemandMethodforImprovedProcessingofNucleicAcidsforProductionofSequencableLibraries(改進(jìn)的用于產(chǎn)生可測(cè)序文庫(kù)的核酸處理系統(tǒng)和方法)”，申請(qǐng)日為2008年2月27日)；和代理公司卷號(hào)21465-529001US(名稱%"SystemandMethodforIdentificationofIndividualSamplesfromaMultiplexMixture(從多重混合物中識(shí)別個(gè)別樣品的系統(tǒng)和方法)”，申請(qǐng)日為2008年5月29日)，所述文獻(xiàn)各自通過弓I用全部結(jié)合到本文中，用于所有目的。描述了進(jìn)行模板核酸分子的擴(kuò)增以產(chǎn)生基本相同拷貝的群體的系統(tǒng)和方法的各種實(shí)例。對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員顯而易見的是，最好在SBS的某些實(shí)施方案中，產(chǎn)生每種核酸元件的許多拷貝，當(dāng)一種或多種核苷酸種類摻入到與模板分子拷貝相關(guān)的各新生分子中時(shí)就可產(chǎn)生更強(qiáng)的信號(hào)。本領(lǐng)域有許多已知技術(shù)用于產(chǎn)生核酸分子的拷貝，例如用細(xì)菌載體進(jìn)行擴(kuò)增、“滾環(huán)”復(fù)制(參見美國(guó)專利號(hào)6，274，320和7，211，390，通過引用結(jié)合到上文中)和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法，這些技術(shù)中的每一個(gè)都適用于本發(fā)明。一種特別適用于高通量應(yīng)用的PCR技術(shù)包括乳液PCR(emulsionPCR,emPCR)方法。乳液PCR方法的典型實(shí)施方案包括產(chǎn)生兩種不混溶物質(zhì)的穩(wěn)定乳液，產(chǎn)生水性微滴(aqueousdroplet)，而反應(yīng)可發(fā)生在其中。具體地講，可用于PCR方法的乳液的水性微滴可包含第一流體，例如懸浮于或分散于另一流體(例如油基流體)內(nèi)的所謂不連續(xù)相的水基流體。此外，一些乳液的實(shí)施方案可使用起到穩(wěn)定乳液作用的表面活性劑，這樣的乳液尤其可用于特定的處理方法，例如PCR。表面活性劑的某些實(shí)施方案包括非離子型表面活性劑，例如脫水山梨醇單油酸酯(也稱為Span80)、聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸酯(也稱為Tween80)，或者在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，二甲硅油共聚醇(也稱為AbilEM90)、聚硅氧烷、聚烷基聚醚共聚物、聚甘油酯、泊洛沙姆和PVP/十六烷共聚物(也稱為UnimerU-151)，或者在更優(yōu)選的實(shí)施方案中為高分子量硅酮聚醚/環(huán)戊硅氧烷(也稱為DC5225C，可得自DowCorning公司)。乳液微滴也可稱為區(qū)室(compartment)、微膠囊、微型反應(yīng)器、微環(huán)境或相關(guān)領(lǐng)域常用的其它名稱。水性微滴的大小范圍取決于乳液成分的構(gòu)成或組合、其中所含內(nèi)容物和所用的形成技術(shù)。所述乳液創(chuàng)建微環(huán)境，在其中可進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)，例如PCR。例如，模板核酸和進(jìn)行所需PCR反應(yīng)所需的所有試劑可包在膠囊中，并在乳液微滴中進(jìn)行化學(xué)分離。在某些實(shí)施方案中，可使用額外表面活性劑或其它穩(wěn)定劑，以提高上述微滴的額外的穩(wěn)定性?？捎梦⒌蝸韴?zhí)行PCR方法中典型的熱循環(huán)操作，以擴(kuò)增包入膠囊內(nèi)的核酸模板，從而產(chǎn)生含有許多基本相同拷貝的模板核酸的群體。在某些實(shí)施方案中，微滴內(nèi)的群體可稱為“克隆分離的”、“區(qū)室化的”、“隱蔽的”“膠囊化的”或“定域的”群體。同樣在本實(shí)例中，所述微滴的某些或全部都可將用于附著模板或其它類型核酸、試劑、標(biāo)記或其它目標(biāo)分子的固體基底(例如小珠)進(jìn)一步包入膠囊內(nèi)?？捎糜诒景l(fā)明的乳液的實(shí)施方案可包括能夠以大規(guī)模平行方式進(jìn)行所述化學(xué)反應(yīng)的非常高密度的微滴或微膠囊。用于擴(kuò)增的乳液及其在測(cè)序應(yīng)用中的用途的其它實(shí)例可參見美國(guó)專利申請(qǐng)順序號(hào)10/861,930；10/866，392；10/767，899；11/045，678，其各自通過引用全部結(jié)合到本文中，用于所有目的。同樣，描述了產(chǎn)生靶特異性擴(kuò)增子用于測(cè)序的示例性實(shí)施方案，包括使用一系列核酸引物，自含靶核酸樣品擴(kuò)增所選擇的一個(gè)或多個(gè)靶區(qū)域。此外，樣品可包含已知或懷疑含有序列變體的核酸分子群體，引物可用于擴(kuò)增并洞察有關(guān)樣品中序列變體的分布情況。例如，可以進(jìn)行這樣的方法即通過對(duì)核酸樣品中多個(gè)等位基因的特異性擴(kuò)增和測(cè)序來鑒定序列變體。首先用一對(duì)PCR引物擴(kuò)增核酸，該引物經(jīng)設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增目標(biāo)區(qū)域的周圍區(qū)域或核酸群體的常見區(qū)段。然后，在單獨(dú)的反應(yīng)容器(例如上述基于乳液的容器)中，分別進(jìn)一步擴(kuò)增各PCR反應(yīng)產(chǎn)物(擴(kuò)增子)。對(duì)所得擴(kuò)增子(在本文稱為第二擴(kuò)增子)(所得的每個(gè)擴(kuò)增子都來自第一擴(kuò)增子群體的一個(gè)成員)進(jìn)行測(cè)序，并用來自不同乳液PCR擴(kuò)增子的序列的集合來測(cè)定等位頻率(allelicfrequency)0所描述的靶特異性擴(kuò)增和測(cè)序方法的某些優(yōu)勢(shì)包括高于先前獲取的靈敏度水平。此外，用高通量測(cè)序儀器裝置的實(shí)施方案，例如使用454生命科學(xué)公司(454LifeSciencesCorporation)提供的PicoTiterPlate陣列的實(shí)施方案，所述方法可用于在每一輪或每次實(shí)驗(yàn)中對(duì)超過100，000個(gè)或超過300，000個(gè)不同拷貝的等位基因進(jìn)行測(cè)序。同樣，所述方法提供低冗余度等位基因的檢測(cè)靈敏度，這樣的等位基因可占等位基因變異體的以下。這些方法的另一優(yōu)勢(shì)包括產(chǎn)生包含所分析區(qū)域的序列的數(shù)據(jù)。重要的是，對(duì)于所分析基因座的序列，并不一定要預(yù)先有所了解。用于測(cè)序的靶特異性擴(kuò)增子的其它實(shí)例可參見美國(guó)專利申請(qǐng)順序號(hào)11/104，781(名禾爾為"Methodsfordeterminingsequencevariantsusingultra-deepsequencing(用ultra-de印測(cè)序法測(cè)定序列變體的方法)”，申請(qǐng)日為2005年4月12日)，其通過引用全部結(jié)合到本文中，用于所有目的。此外，測(cè)序的實(shí)施方案可包括Sanger型技術(shù)，通常稱為雜交測(cè)序(SBH)或摻入測(cè)序(SBI)的技術(shù)，其可包括所謂的polony測(cè)序技術(shù)；納米孔(nanopore)、波導(dǎo)和其它單分子檢測(cè)技術(shù)；或可逆終止子技術(shù)。如上所述，一項(xiàng)優(yōu)選的技術(shù)可包括合成測(cè)序法。例如，某些SBS實(shí)施方案對(duì)核酸模板的基本相同拷貝群體進(jìn)行測(cè)序，并且通常使用經(jīng)設(shè)計(jì)用于退火到樣品模板分子的預(yù)定互補(bǔ)位置上的一種或多種寡核苷酸引物、或者與模板分子連接的一種或多種銜接子(adaptor)。在核酸聚合酶存在下，引物/模板復(fù)合物與核苷酸種類同時(shí)存在。如果核苷酸種類與直接靠近寡核苷酸引物3’端的樣品模板分子相應(yīng)序列位置的核酸種類互補(bǔ)的話，則聚合酶將會(huì)用該核苷酸種類來延伸引物?；蛘?，在某些實(shí)施方案中，引物/模板復(fù)合物與多種目標(biāo)核苷酸種類(通常是A、G、C和T)同時(shí)存在，而與直接靠近寡核苷酸引物3’端的樣品模板分子的相應(yīng)序列位置互補(bǔ)的核苷酸種類就會(huì)摻入進(jìn)去。在每個(gè)所述實(shí)施方案中，核苷酸種類可經(jīng)化學(xué)封閉(例如在3’-0位)，以防進(jìn)一步延伸，而且在下一輪合成之前需要解除封閉。還可以理解，將核苷酸種類加到新生分子末端的過程與上述加到引物末端的過程基本相同。如上所述，可以用本領(lǐng)域已知的各種方法來檢測(cè)核苷酸種類的摻入，例如通過檢測(cè)焦磷酸(PPi)的釋放(實(shí)例參見美國(guó)專利號(hào)6，210，891、6，258，568和6，828，100，其各自通過引用全部結(jié)合到本文中，用于所有目的)或通過與核苷酸結(jié)合的可檢測(cè)標(biāo)記?？蓹z測(cè)標(biāo)記的一些實(shí)例包括但不限于質(zhì)量標(biāo)簽(masstag)和熒光標(biāo)記或化學(xué)發(fā)光標(biāo)記。在典型的實(shí)施方案中，未摻入核苷酸例如經(jīng)洗滌去除掉。此外，在某些實(shí)施方案中，未摻入核苷酸可經(jīng)酶促降解，例如用本文所述的腺苷三磷酸雙磷酸酶降解。在使用可檢測(cè)標(biāo)記的實(shí)施方案中，在下一合成循環(huán)之前，通常必須使其失活(例如通過化學(xué)裂解或光漂白)。如上所述，模板/聚合酶復(fù)合物的下一序列位置就可被另一核苷酸種類、或多個(gè)目標(biāo)核苷酸種類來查詢(query)。核苷酸添加、延伸、信號(hào)獲取和洗滌的重復(fù)循環(huán)，結(jié)果就能測(cè)定模板鏈的核苷酸序列。繼續(xù)本實(shí)例，通常在任一測(cè)序反應(yīng)中可以同時(shí)分析很多或大量的基本相同的模板分子(例如103、104、IO5UO6或IO7分子)，以便得到用于可靠檢測(cè)的足夠強(qiáng)的信號(hào)。另外，在某些實(shí)施方案中，最好通過使用所謂的“末端對(duì)讀(paired-end)”測(cè)序策略來提高讀長(zhǎng)容量和測(cè)序過程的質(zhì)量。例如，測(cè)序方法的某些實(shí)施方案對(duì)產(chǎn)生高質(zhì)量和可靠讀數(shù)的分子總長(zhǎng)度具有限制。換句話說，根據(jù)所用測(cè)序?qū)嵤┓桨傅牟煌?，可靠讀長(zhǎng)的序列位置總數(shù)不超過25個(gè)、50個(gè)、100個(gè)或150個(gè)堿基。末端對(duì)讀測(cè)序策略通過對(duì)分子兩端(有時(shí)稱為“標(biāo)簽(tag)”端)分別測(cè)序來提供可靠讀長(zhǎng)，所述分子包含在兩端通過接頭序列與中間連接的原始模板核酸分子片段。模板片段的原始位置關(guān)系是已知的，因此來自序列讀數(shù)的數(shù)據(jù)可重新組合為具有更長(zhǎng)的高質(zhì)量讀長(zhǎng)的單一讀數(shù)。末端對(duì)讀測(cè)序?qū)嵤┓桨傅母鄬?shí)例可參見美國(guó)專利申請(qǐng)順序號(hào)11/448，462(名稱為“Pairedendsequencing(末端對(duì)讀測(cè)序法)，，，申請(qǐng)日為2006年6月6日)和美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)順序號(hào)61/026，319(名稱為"Pairedendsequencing(末端對(duì)讀測(cè)序法)”，申請(qǐng)日為2008年2月5日)，其各自通過引用全部結(jié)合到本文中，用于所有目的?？赏瓿刹糠只蛩猩鲜龇椒ǖ腟BS儀器的一些實(shí)例可包括一種或多種檢測(cè)裝置例如電荷耦合裝置(即CXD照相機(jī))、微觀流體室(microfluidicschamber)或流動(dòng)槽、反應(yīng)基底和/或泵和流量閥門(flowvalve)。以基于焦磷酸的測(cè)序?yàn)槔?，儀器的實(shí)施方案可使用產(chǎn)生固有低水平背景噪聲的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)策略。在某些實(shí)施方案中，用于測(cè)序的反應(yīng)基底可包括經(jīng)酸蝕刻而得到成百上千個(gè)非常小的孔洞的纖維光學(xué)面板構(gòu)成的所謂PicoTiterPlate陣列(也稱為PTP板)，每個(gè)這樣的小孔可容納大量的基本相同的模板分子。在某些實(shí)施方案中，可將基本相同模板分子的各群體分配到固體基底(例如小珠)上，其各自可分配到一個(gè)這樣的孔中。例如，儀器可包括用于將流體試劑提供給PTP板固定器(holder)的試劑遞送元件，以及能夠收集從PTP板各孔中發(fā)出的光的光子的CCD型檢測(cè)裝置。進(jìn)行SBS型測(cè)序和焦磷酸測(cè)序的儀器和方法的更多實(shí)例可參見美國(guó)專利號(hào)7，323，305和美國(guó)專利申請(qǐng)順序號(hào)11/195，254，其通過引用結(jié)合到上文。另外，可采用自動(dòng)化進(jìn)行一種或多種樣品制備過程(例如上述emPCR過程)的系統(tǒng)和方法。例如，自動(dòng)化系統(tǒng)可用于提供產(chǎn)生emPCR過程所用乳液的有效溶液，進(jìn)行PCR熱循環(huán)操作并富集成功制備的核酸分子群體，用于測(cè)序。自動(dòng)化樣品制備系統(tǒng)的實(shí)例可參見美國(guó)專利申請(qǐng)順序號(hào)11/045，678(名稱為“Nucleicacidamplificationwithcontinuousflowemulsion(用連續(xù)流動(dòng)乳液的核酸擴(kuò)增法)”，申請(qǐng)日為2005年1月28日)，其通過引用全部結(jié)合到本文中，用于所有目的。同樣，本發(fā)明所述實(shí)施方案的系統(tǒng)和方法可包括使用計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)進(jìn)行一些設(shè)計(jì)、分析或其它操作，這樣的介質(zhì)存儲(chǔ)有用于在計(jì)算機(jī)系統(tǒng)上執(zhí)行的指令。例如，在下文中詳細(xì)描述了處理所檢測(cè)信號(hào)和/或分析用SBS系統(tǒng)和方法產(chǎn)生的數(shù)據(jù)的一些實(shí)施方案，其中處理和分析實(shí)施方案是在計(jì)算機(jī)系統(tǒng)上執(zhí)行的。用于本發(fā)明的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)的一個(gè)示例性實(shí)施方案可包括任何類型的計(jì)算機(jī)平臺(tái)，例如工作站、個(gè)人計(jì)算機(jī)、服務(wù)器或任何其它現(xiàn)有或未來的計(jì)算機(jī)。計(jì)算機(jī)通常包括已知部件，例如處理器、操作系統(tǒng)、系統(tǒng)存儲(chǔ)器、記憶存儲(chǔ)裝置(memorystoragedevice)、輸入-輸出控制器、輸入_輸出裝置和顯示器。相關(guān)領(lǐng)域普通技術(shù)人員將會(huì)理解，有許多可能的計(jì)算機(jī)配置和部件，并且還可包括高速存儲(chǔ)器、數(shù)據(jù)備份單元和許多其它裝置。顯示器可包括提供可視信息的顯示器，這樣的信息通常邏輯地和/或物理地組織成為像素陣列。也可包括界面控制器，其中可包括任何不同的已知或未來的軟件程序，用于提供輸入和輸出界面。例如，界面可包括所謂的“圖形用戶界面(GraphicalUserInterfaces，通常稱為⑶I)”，其可為用戶提供一種或多種圖像顯示。使用相關(guān)領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的選擇或輸入方式，界面通常能夠接受用戶輸入。在相同或替代實(shí)施方案中，在計(jì)算機(jī)上的應(yīng)用可使用包括所謂“命令行界面”(通常稱為CLI)在內(nèi)的界面。CLI通常提供基于應(yīng)用與用戶間相互作用的文本。通常，命令行界面通過顯示器以文本行形式顯示輸出并接收輸入。例如，某些執(zhí)行過程可包括所謂的“命令行解釋程序(shell)，，例如相關(guān)領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的Unix命令行解釋程序(UnixShell)，或使用面向?qū)ο笮统绦蝮w系結(jié)構(gòu)的MicrosoftWindowsPowershell，例如Microsoft.NET框架。相關(guān)領(lǐng)域普通技術(shù)人員將會(huì)知道，界面可包括一種或多種⑶I、CLI或其組合。處理器可包括市售處理器，例如Centrino、COTeTM2、Itanium或Pentium處理器(由IntelCorporation(因特爾公司)制造)、SPARC處理器(由SunMicrosystems公司制造)、Athalon或Opteron處理器(由AMD公司制造)，或者它可以是可用的或?qū)砜捎玫钠渌幚砥髦械囊环N。處理器的某些實(shí)施方案可包括所謂的多核處理器(Multi-coreprocessor)和/或能夠按照單核或多核配置來使用并行處理技術(shù)。例如，多核體系結(jié)構(gòu)通常包括兩個(gè)或更多個(gè)處理器“執(zhí)行核心”。在本實(shí)例中，每個(gè)執(zhí)行核心可作為獨(dú)立處理器，能夠?qū)Χ嗑€進(jìn)行并行處理。另外，相關(guān)領(lǐng)域普通技術(shù)人員將會(huì)知道，處理器通?？膳渲迷谒^的32或64比特的體系結(jié)構(gòu)或者目前已知的或未來將開發(fā)的其它體系結(jié)構(gòu)配置中。處理器通常執(zhí)行操作系統(tǒng)，例如微軟公司的Windows型操作系統(tǒng)(例如WindowsXP或WindowsVista)；蘋果計(jì)算機(jī)公司的MacOSX操作系統(tǒng)(例如MacOSXvlO.5“Leopard”或“SnowLeopard”操作系統(tǒng))；可得自眾多賣主或所謂的開放源碼(opensource)的Unix或Linux型操作系統(tǒng)；另一操作系統(tǒng)或未來的操作系統(tǒng)；或其某些組合。操作系統(tǒng)以眾所周知的方式連接固件和硬件，并有助于處理器協(xié)調(diào)和執(zhí)行用各種編程語言寫成的不同計(jì)算機(jī)程序的功能。操作系統(tǒng)，通常與處理器協(xié)同作用，能協(xié)調(diào)和執(zhí)行計(jì)算機(jī)其它部件的功能。操作系統(tǒng)也提供目錄的編制、輸入-輸出控制、文件和數(shù)據(jù)管理、存儲(chǔ)管理和通信控制及相關(guān)服務(wù)，所有這一切都根據(jù)已知技術(shù)來進(jìn)行。系統(tǒng)存儲(chǔ)器可包括各種已知或未來記憶存儲(chǔ)裝置的任何一種。實(shí)例包括任何通?？傻玫碾S機(jī)存取存儲(chǔ)器(RAM)、磁介質(zhì)(例如固定硬盤或磁帶)、光學(xué)介質(zhì)(例如讀寫光盤)或其它記憶存儲(chǔ)裝置。記憶存儲(chǔ)裝置可包括各種已知或未來裝置中的任一種，包括光盤驅(qū)動(dòng)器、磁帶驅(qū)動(dòng)器、移動(dòng)硬盤驅(qū)動(dòng)器、USB或閃存驅(qū)動(dòng)器(flashdrive)或軟盤驅(qū)動(dòng)器。這些類型的記憶存儲(chǔ)裝置通常從程序存儲(chǔ)介質(zhì)(未顯示)中讀出和/或?qū)懭?，這些介質(zhì)分別是例如光盤、磁帶、移動(dòng)硬盤、USB或閃存驅(qū)動(dòng)器或軟盤。任何這些程序存儲(chǔ)介質(zhì)或者目前使用的或今后開發(fā)的其它介質(zhì)，都可認(rèn)為是計(jì)算機(jī)程序產(chǎn)品。可以理解，這些程序存儲(chǔ)介質(zhì)通常存儲(chǔ)計(jì)算機(jī)軟件程序和/或數(shù)據(jù)。計(jì)算機(jī)軟件程序(也稱為計(jì)算機(jī)控制邏輯)通常存儲(chǔ)在系統(tǒng)存儲(chǔ)器和/或與記憶存儲(chǔ)裝置連接的程序存儲(chǔ)裝置中。在某些實(shí)施方案中，描述了計(jì)算機(jī)程序產(chǎn)品，包括其中存儲(chǔ)具有控制邏輯(計(jì)算機(jī)軟件程序，包括程序代碼)的計(jì)算機(jī)可用介質(zhì)?？刂七壿嫞?dāng)由處理器執(zhí)行時(shí)，使處理器行使本文所述的功能。在其它實(shí)施方案中，某些功能主要在硬件中執(zhí)行，使用例如硬件設(shè)備(hardwarestatemachine)。執(zhí)行并完成本文所述功能的硬件設(shè)備(hardwarestatemachine)是相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的。輸入-輸出控制器可包括用于接收和處理用戶(無論是人還是機(jī)器，無論是局域還是遠(yuǎn)程)信息的各種已知裝置中的任一種。這樣的裝置包括例如調(diào)制解調(diào)卡、無線卡、網(wǎng)絡(luò)接口卡、聲卡或用于各種已知輸入裝置的任一種的其它類型的控制器。輸出控制器可包括用于各種已知顯示器的任一種的控制器，這類顯示器用于給用戶(無論是人還是機(jī)器，無論是局域還是遠(yuǎn)程)提供信息。在本文所述的實(shí)施方案中，計(jì)算機(jī)的功能性元件通過系統(tǒng)總線進(jìn)行相互通信。計(jì)算機(jī)的某些實(shí)施方案可利用網(wǎng)絡(luò)或其它類型的遠(yuǎn)程通信而與某些功能性部件進(jìn)行通信。相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，儀器控制和/或數(shù)據(jù)處理上的應(yīng)用，如果在軟件中執(zhí)行的話，可加載(load)到系統(tǒng)存儲(chǔ)器和/或記憶存儲(chǔ)裝置中并由此來執(zhí)行。儀器控制和/或數(shù)據(jù)處理上的所有或部分應(yīng)用也可駐存于只讀存儲(chǔ)器或記憶存儲(chǔ)裝置的類似裝置，這些裝置無需通過輸入_輸出控制器來先加載儀器控制和/或數(shù)據(jù)處理上的應(yīng)用。相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)知道，儀器控制和/或數(shù)據(jù)處理上的應(yīng)用或其部分，可按已知方式，通過處理器加載到系統(tǒng)存儲(chǔ)器或高速緩沖存儲(chǔ)器或這兩者上，以便執(zhí)行。計(jì)算機(jī)也可包括保存在系統(tǒng)存儲(chǔ)器中一個(gè)或多個(gè)文庫(kù)文件、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)文件和互聯(lián)網(wǎng)用戶(internetclient)。例如，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可包括一個(gè)或多個(gè)實(shí)驗(yàn)或測(cè)定的相關(guān)數(shù)據(jù)，例如所檢測(cè)到的信號(hào)值，或一個(gè)或多個(gè)SBS實(shí)驗(yàn)或過程相關(guān)的其它數(shù)值。另外，互聯(lián)網(wǎng)用戶可包括能夠利用網(wǎng)絡(luò)而接入另一計(jì)算機(jī)上的遠(yuǎn)程服務(wù)的應(yīng)用并且包括例如所謂的“網(wǎng)絡(luò)瀏覽器(WebBrowser)”。在本實(shí)例中，一些常用的網(wǎng)絡(luò)瀏覽器包括MicrosoftInternetExplorer7(得自微軟公司)、MozillaFirefox2(得自MozillaCorporation),Safari1.2(得自蘋果計(jì)算機(jī)公司)或本領(lǐng)域目前已知的或未來即將開發(fā)的其它類型的網(wǎng)絡(luò)瀏覽器。同樣，在相同或其它實(shí)施方案中，互聯(lián)網(wǎng)用戶可包括專業(yè)化的軟件應(yīng)用，或者可以是這類專業(yè)化軟件應(yīng)用的一個(gè)組成部分，這類專業(yè)化軟件應(yīng)用能夠通過諸如針對(duì)SBS應(yīng)用的數(shù)據(jù)處理應(yīng)用的網(wǎng)絡(luò)接入遠(yuǎn)程信息。網(wǎng)絡(luò)可包括本領(lǐng)域普通技術(shù)人員眾所周知的許多不同類型的網(wǎng)絡(luò)的一種或多種。例如，網(wǎng)絡(luò)可包括局域網(wǎng)或廣域網(wǎng)，其采用通常稱為TCP/IP協(xié)議套件進(jìn)行通信。網(wǎng)絡(luò)可包括通常稱為互聯(lián)網(wǎng)的由相互連接的計(jì)算機(jī)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)成的全球網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，或包括各種內(nèi)部網(wǎng)架構(gòu)。相關(guān)領(lǐng)域普通技術(shù)人員也將理解，網(wǎng)絡(luò)環(huán)境中的某些用戶可能寧愿采用所謂的“防火墻”(有時(shí)也稱為信息包過濾器(PacketFilter)或邊界保護(hù)裝置(BorderProtectionDevice))來控制信息從硬件和/或軟件系統(tǒng)流入或流出。例如，防火墻可包括硬件或軟件元件組分或其某些組合，并且通?？稍O(shè)計(jì)為由用戶(例如網(wǎng)絡(luò)管理員等)設(shè)置安全規(guī)則。b.本發(fā)明的實(shí)施方案如上所述，本發(fā)明包括用于測(cè)定與一種或多種酶試劑相關(guān)的活性水平并動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)一種或多種所測(cè)酶試劑濃度以提供明顯優(yōu)化的試劑活性水平的方法。具體地講，本發(fā)明可用于減少因某些過程步驟中不想要的核苷酸種類水平所致的延后和不完全延伸效應(yīng)引起的序列數(shù)據(jù)中的引入錯(cuò)誤，并用于調(diào)整來自測(cè)序過程的可檢測(cè)信號(hào)輸出程度。本發(fā)明的某些實(shí)施方案可用作標(biāo)定多種測(cè)序儀器和/或不同測(cè)序循環(huán)之間的信號(hào)輸出的工具。同樣，可降低過高或過低信號(hào)變動(dòng)以及“信號(hào)釋放(signalbleed)”效應(yīng)(即來自一輪循環(huán)的信號(hào)如此之高，使得信號(hào)持續(xù)并釋放到下一輪循環(huán)，或者在某些情況下在同一輪或下一輪循環(huán)中釋放到鄰近孔或反應(yīng)位置)。在某些實(shí)施方案中，信號(hào)變動(dòng)和/或釋放的標(biāo)定和降低允許更短的一輪循環(huán)時(shí)間，通過流動(dòng)而導(dǎo)致更頻繁和有效循環(huán)(即更短的流動(dòng)循環(huán))。例如，通常最好是每次摻入事件的信號(hào)輸出都在可接受范圍內(nèi)，使得輸出在儀器之間和測(cè)序循環(huán)之間更容易作出比較，并能提高數(shù)據(jù)質(zhì)量和可靠性。通常，可使用能自動(dòng)進(jìn)行測(cè)定和調(diào)節(jié)的一個(gè)或多個(gè)過程步驟的一種或多種儀器元件。例如，可用自動(dòng)進(jìn)行和實(shí)現(xiàn)某些或全部過程步驟的儀器裝置來完成測(cè)序方法的實(shí)施方案。圖1提供了測(cè)序儀器100的說明性實(shí)例，該儀器包括光控子系統(tǒng)110和流控子系統(tǒng)120。用于進(jìn)行測(cè)序和自適應(yīng)控制過程的測(cè)序儀器100的實(shí)施方案可包括流控子系統(tǒng)120中的不同流控部件，光控子系統(tǒng)110中的不同光控部件，以及圖1或圖2未顯示的其它部件，包括用于某些功能的局部控制的微處理器和/或微控制器。此外，如圖1所示，測(cè)序儀器100可與一個(gè)或多個(gè)外部計(jì)算機(jī)部件(例如計(jì)算機(jī)130)操作性連接，其可例如執(zhí)行系統(tǒng)軟件或固件例如應(yīng)用程序135，為一個(gè)或多個(gè)部件和/或某些數(shù)據(jù)分析功能提供指令控制。在本實(shí)例中，測(cè)序儀器100和/或計(jì)算機(jī)130可包括以上概述的實(shí)施方案的部分或全部部件和特性。流控子系統(tǒng)120的實(shí)施方案可包括不同部件，例如流體貯存器(fluidreservoir)201、流體貯存器203、流體貯存器205、流體貯存器207和流體貯存器209，每個(gè)可容納一定體積的試劑或流體，用于測(cè)序反應(yīng)程序中發(fā)生的過程步驟。例如，貯存器201-209可包括瓶(bottle)、燒瓶(flask)、管、杯或其它流體密封容器，均可容納一定體積的試劑，例如各核苷酸種類(即A、C、G、T或U)；特定的酶，例如腺苷三磷酸雙磷酸酶、硫酸化酶、螢光素酶、焦磷酸酶或其它酶；可包括ATP或焦磷酸在內(nèi)的試驗(yàn)液或標(biāo)定液；底物；酶的增強(qiáng)劑或抑制劑；緩沖液或洗滌液，其可包括含抗衡離子(即Ca2+或Mg2+)的那些和/或優(yōu)選的PH、水和/或者漂白液、碘液或其它消毒液的稀釋液；或測(cè)序過程或其制備中要用的其它流體。流控子系統(tǒng)120的實(shí)施方案也可包括一個(gè)或多個(gè)廢液貯存器240，用于收集和貯存那些用過而不能再利用的流體?？梢岳斫?，貯存器240的多個(gè)實(shí)施方案可用于不相容的或混合起來有危險(xiǎn)的流體，或者用于通常優(yōu)選分別存放的流體。而且，各貯存器201-209的流體與多通閥200都是連通的。多通閥是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的并可得自各供應(yīng)商,例如SMCCorporationofIndianapolis,Indiana。在圖2的實(shí)例中，多通閥200能打開和關(guān)閉，以選擇性地允許指定體積的流體從貯存器201-209流向流動(dòng)槽250。開關(guān)周期稱為“脈沖寬度”，通常以打開閥門所花費(fèi)的時(shí)間單位來度量(即可以按毫秒計(jì)或按其它類似測(cè)定來計(jì))。在某些情況下，引入一種流體相關(guān)的脈沖寬度可以與引入另一流體同時(shí)發(fā)生，其中這兩種流體可混合在一起。此外，多通閥200能夠同時(shí)調(diào)節(jié)貯存器201-209中的一個(gè)或多個(gè)的流速。在本實(shí)例中，可調(diào)節(jié)的流速或脈沖寬度時(shí)限允許精確控制試劑的濃度和稀釋度。例如，用于控制試劑的10倍稀釋度的一個(gè)可能方法就可完成如下即通過打開貯存器201-209中的一個(gè)而使其流出，其脈沖寬度等于過程步驟中允許流過流動(dòng)槽250的所有試劑總時(shí)間的1/10。在某些實(shí)施方案中，閥門200可按間隔進(jìn)行“脈沖調(diào)制”(即較短脈沖寬度的開關(guān)間隔)，以提供更好的稀釋均勻度。一些替代實(shí)施方案也可包括通過閥門200控制流速，即通過調(diào)節(jié)閥門200開啟程度。換句話說，閥門200開啟范圍可以自打開一小部分至完全打開，其中流速取決于開啟程度?？梢岳斫猓詈檬且褱?zhǔn)確知道貯存器201-209內(nèi)一種或多種試劑的濃度。還最好是貯存器201-209內(nèi)的試劑濃度高于測(cè)序過程所需的濃度(在某些情況下明顯更高)，因此允許稀釋并容易控制最終濃度。相關(guān)領(lǐng)域普通技術(shù)人員也將會(huì)理解，流控子系統(tǒng)120是示例性的，而且其它部件可包括在典型的流控子系統(tǒng)中。例如，某些實(shí)施方案可包括能測(cè)量貯存器內(nèi)流體體積的傳感器，和/或正確或預(yù)期的流體存在于貯存器201-209中或流過閥門200。傳感器可包括一種或多種傳感器的組合，例如電導(dǎo)率傳感器、光傳感器(即光密度)、聲傳感器(即超聲密度)或PH傳感器。子系統(tǒng)實(shí)施方案中的一些典型的流控部件也可包括閥門、管道、泵(即蠕動(dòng)泵)、加熱/冷卻元件(即加熱槽)或本領(lǐng)域常用的其它元件。圖2還顯示了光控子系統(tǒng)110相關(guān)部件，包括流動(dòng)槽250、反應(yīng)基底105和檢測(cè)器260。例如，流動(dòng)槽250的流體與反應(yīng)環(huán)境基底105的第一表面是連通的，該反應(yīng)環(huán)境基底105在某些實(shí)施方案中包括裝有基本相同的模板核酸分子的許多群體的PTP板的孔。因此引入到流動(dòng)槽250的流體與基底105和模板核酸分子接觸。同樣，在某些實(shí)施方案中，在流動(dòng)槽250內(nèi)可建立所謂的“對(duì)流性”流動(dòng)，用于有效引入和從基底105中去除試劑。測(cè)序?qū)嵤┓桨钢袑?duì)流性流動(dòng)的實(shí)例及其優(yōu)勢(shì)可參見美國(guó)專利申請(qǐng)順序號(hào)10/191，438、11/016，942、11/217，194，其通過引用全部結(jié)合到本文中，用于所有目的。另外，如上所述，檢測(cè)器260可包括CCD照相機(jī)、光電倍增管(PMT)或本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的其它光學(xué)檢測(cè)裝置的實(shí)施方案。優(yōu)選的是檢測(cè)器260與反應(yīng)基底105表面具有光通信，使得測(cè)序反應(yīng)產(chǎn)生的光發(fā)送到檢測(cè)器260。也可以理解，在某些實(shí)施方案中，流動(dòng)槽250和反應(yīng)環(huán)境基底105是同一元件，其中流動(dòng)槽250可包括一個(gè)或多個(gè)內(nèi)表面，起到基底105的作用。如上所述，本發(fā)明的實(shí)施方案動(dòng)態(tài)地控制遞送給反應(yīng)環(huán)境的一種或多種酶試劑的濃度，其可包括例如通過多通閥200控制濃度并遞送到反應(yīng)環(huán)境基底105。例如，計(jì)算機(jī)130可包括存儲(chǔ)在系統(tǒng)存儲(chǔ)器中用于執(zhí)行的應(yīng)用程序135，其為動(dòng)態(tài)濃度調(diào)節(jié)提供指令控制。在某些實(shí)施方案中，應(yīng)用程序135也接收輸入，用于計(jì)算濃度調(diào)節(jié)，確定所需調(diào)節(jié)來執(zhí)行，并為測(cè)序儀器100的一個(gè)或多個(gè)元件(例如用于定時(shí)控制閥門200的微控制器元件)提供指令控制。在本實(shí)例中，應(yīng)用程序135可用一種或多種酶試劑的起始濃度值來啟動(dòng)測(cè)序過程并按照預(yù)定時(shí)間間隔來調(diào)整濃度(即可使用開環(huán)型機(jī)制，用于預(yù)定稀釋概況)或響應(yīng)所測(cè)變化，其中在測(cè)序循環(huán)期間可連續(xù)或周期性檢測(cè)試劑濃度(即可使用閉環(huán)型反饋控制機(jī)制，用于所測(cè)試劑活性)。相關(guān)領(lǐng)域普通技術(shù)人員將會(huì)知道，酶試劑不同實(shí)施方案的有效性或活性因不同原因而異，例如批與批之間的差異、制造商之間的差異、隨時(shí)間而降解(即貨架壽命)、環(huán)境效應(yīng)(即溫度、濕度等)和其它已知或未知效應(yīng)。因此，通常最好是根據(jù)(至少部分根據(jù))其活性水平來調(diào)節(jié)反應(yīng)中的酶試劑濃度。相關(guān)領(lǐng)域普通技術(shù)人員將會(huì)知道，通常酶活性按酶單位(U)計(jì)，其中一個(gè)單位(IU)等于在1分鐘內(nèi)催化1微摩爾底物轉(zhuǎn)化的酶量。有時(shí)用于酶活性的另一計(jì)量單位稱為開特(katal)。也應(yīng)當(dāng)知道，某些環(huán)境條件(例如溫度和PH)會(huì)影響酶的催化速率，當(dāng)在測(cè)序過程中測(cè)定和使用酶試劑時(shí)，通常最好量化和/或控制這些條件。重要的是，本文所用的術(shù)語酶試劑的“濃度”是指每單位體積酶試劑的活性水平(通常計(jì)量單位可包括U/ml)。如上概述，某些酶的催化活性水平隨時(shí)間而下降，在某些情況下導(dǎo)致基本喪失催化活性。這樣的活性損失率取決于各種因素，包括貯存條件和酶的種類，其中特別困難的是在不直接測(cè)定的情況下，預(yù)測(cè)改變率。此外，某些測(cè)序過程可能需要延長(zhǎng)時(shí)間來執(zhí)行完整的一輪循環(huán)，而其中某些試劑(例如腺苷三磷酸雙磷酸酶)可能對(duì)某些環(huán)境條件尤其敏感，這樣再加上要延長(zhǎng)時(shí)間，就會(huì)特別麻煩。在某些實(shí)施方案中，用戶101可能不知道催化活性損失，而本文所述的自適應(yīng)控制則可避免包括整個(gè)實(shí)驗(yàn)的災(zāi)難性損失在內(nèi)的后果。圖3提供在所有樣品設(shè)定濃度相同時(shí)，不同樣品的腺苷三磷酸雙磷酸酶活性的所測(cè)差異的說明性實(shí)例。每份所測(cè)樣品的脈沖寬度(即體積)相同，但各自卻測(cè)得具有實(shí)測(cè)相對(duì)信號(hào)水平明顯不同，因而活性水平也明顯不同。在本實(shí)例中，用下述振幅測(cè)量方法，測(cè)定酶樣品305A、305B和305C各自的“實(shí)測(cè)相對(duì)信號(hào)”，并找到與各份樣品酶活性水平的關(guān)系。重要的是，顯然，所測(cè)13份不同樣品的活性水平明顯不同，因此各份酶樣品對(duì)測(cè)序過程的影響部分地取決于活性水平。普通技術(shù)人員也可以理解，所測(cè)酶試劑活性取決于(至少部分取決于)與所述酶試劑相互作用的一種或多種其它試劑的濃度，所述其它試劑例如包括底物、增強(qiáng)劑或抑制齊U。例如，用于鈍化核苷酸種類的腺苷三磷酸雙磷酸酶的所需濃度部分地取決于流動(dòng)槽250和/或反應(yīng)基底105的反應(yīng)環(huán)境中所述核苷酸種類的濃度。換句話說，如果核苷酸種類的濃度偏高或偏低，腺苷三磷酸雙磷酸酶所需活性的濃度也應(yīng)當(dāng)同樣偏高或偏低。同樣，在某些實(shí)施方案中，反應(yīng)環(huán)境可包括減少擴(kuò)散或流動(dòng)性的復(fù)雜情況。在這類情況下，最好調(diào)節(jié)腺苷三磷酸雙磷酸酶濃度以解決這類復(fù)雜情況。如上所述，本發(fā)明的實(shí)施方案包括測(cè)定作為測(cè)序過程組成部分的一種或多種酶試劑的活性。例如，本發(fā)明的某些實(shí)施方案測(cè)定用于測(cè)序過程的一種或多種酶試劑的活性，即通過使用酶試劑，進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)試驗(yàn)反應(yīng)并測(cè)定反應(yīng)結(jié)果，以測(cè)定酶活性水平并因此而調(diào)節(jié)酶濃度。相關(guān)領(lǐng)域普通技術(shù)人員將會(huì)知道，酶活性的測(cè)定方法至少部分取決于酶的種類以及其它因素。同樣，對(duì)于不同酶試劑，測(cè)定可不同，而且在某些情況下，在與酶試劑相互作用的大量試劑存在時(shí)，測(cè)定方法可提供對(duì)酶試劑活性的指示。在某些實(shí)施方案中，優(yōu)選控制酶試劑活性，即通過調(diào)節(jié)各種互作試劑中的一種或多種的濃度或環(huán)境條件。例如，可用PH調(diào)節(jié)腺苷三磷酸雙磷酸酶的活性水平，其中對(duì)于最佳腺苷三磷酸雙磷酸酶活性而言，優(yōu)選PH約6.5。因此，通過使用更高或更低PH可降低腺苷三磷酸雙磷酸酶活性，其中差異程度涉及活性降低的程度。也可理解，在測(cè)序過程中最好使用對(duì)其它酶或步驟而言的最佳PH水平。在本實(shí)例中，在測(cè)序過程中可采用PH約7.8，這對(duì)聚合酶的表現(xiàn)而言是最好的。在這種情況下，通常優(yōu)選用測(cè)序過程的優(yōu)選PH，測(cè)定并調(diào)節(jié)腺苷三磷酸雙磷酸酶活性?；蛘撸谑褂脺y(cè)序系統(tǒng)100實(shí)施測(cè)序過程的某些實(shí)施方案中，可改變環(huán)境條件以＝適應(yīng)不同酶的最佳范圍。例如，當(dāng)洗滌步驟中包含腺苷三磷酸雙磷酸酶以去除過量核苷酸種類和ATP時(shí)，因?yàn)樘幚聿襟E的連續(xù)性，緩沖液可與腺苷三磷酸雙磷酸酶一起使用，其PH能使腺苷三磷酸雙磷酸酶活性水平最佳化。然后，在下一個(gè)核苷酸摻入步驟中使用聚合酶，可使用具有對(duì)聚合酶而言的最佳PH條件的不同緩沖液，以便使聚合酶活性最佳化。另外，每種最佳緩沖液可包括對(duì)于每種酶而言的優(yōu)選抗衡離子，例如對(duì)于腺苷三磷酸雙磷酸酶緩沖液而言的Ca2+和對(duì)于聚合酶緩沖液而言的Mg2+。腺苷三磷酸雙磷酸酶測(cè)定技術(shù)的一個(gè)實(shí)施方案可稱為“時(shí)相測(cè)定(PhaseMeasurement)”，其采用經(jīng)設(shè)計(jì)用于通過亞適量腺苷三磷酸雙磷酸酶濃度來放大弓I入錯(cuò)誤的特別的試驗(yàn)分子。具體地講，通過測(cè)序儀器100容易測(cè)定上述低腺苷三磷酸雙磷酸酶濃度的延后效應(yīng)，而且也容易找到與酶的相對(duì)催化活性之間的關(guān)系。例如，試驗(yàn)分子可包括核苷酸種類的序列組成，其包括GCGCCCCCCCC(SEQIDNO1)。重要的是，試驗(yàn)分子包括在最少量流動(dòng)循環(huán)中產(chǎn)生可檢測(cè)錯(cuò)誤的序列組成。在本實(shí)例中，因?yàn)樵囼?yàn)分子的準(zhǔn)確序列是已知的并且僅含C和G核苷酸種類，可采用特定測(cè)序方案，僅加入C和G核苷酸種類。僅用2種核苷酸種類，節(jié)約使用試劑，并避免與反應(yīng)環(huán)境中存在的以A或T核苷酸種類為開頭的樣品分子發(fā)生反應(yīng)。例如，與各基本相同模板分子連接的銜接子元件在第一序列位置上、或在某些實(shí)施方案中的若干第一序列位置(即可包括范圍為2-10的序列位置)上可包含A或T核苷酸種類。因此，使用具有G和C核苷酸種類組成的試驗(yàn)分子，可用于在模板分子存在時(shí)不破壞序列數(shù)據(jù)。此外，在試驗(yàn)方案中可改變腺苷三磷酸雙磷酸酶的濃度以產(chǎn)生放大效應(yīng)，提供基線，以按需要逐漸增加或降低濃度。例如，所用的腺苷三磷酸雙磷酸酶濃度采用的脈沖寬度是測(cè)序過程常用的“正常”或最佳濃度的1/10，從而在所得序列數(shù)據(jù)中產(chǎn)生引入的延后錯(cuò)誤。重要的是，即使腺苷三磷酸雙磷酸酶濃度比標(biāo)準(zhǔn)濃度低，也很容易測(cè)定系統(tǒng)中腺苷三磷酸雙磷酸酶的催化活性并計(jì)算腺苷三磷酸雙磷酸酶的稀釋度，以達(dá)到用于測(cè)序循環(huán)的所需濃度。沒有任何預(yù)計(jì)自本實(shí)例的試驗(yàn)分子產(chǎn)生的引入延后錯(cuò)誤的示例性流程圖參見圖4A，其中信號(hào)水平407與種類流動(dòng)(specieflow)405中的試驗(yàn)分子的序列組成密切相關(guān)。換句話說，信號(hào)水平407的數(shù)值為1.0代表包括試驗(yàn)分子中的一個(gè)核苷酸種類的頭3個(gè)序列位置的序列組成。數(shù)值8.0代表試驗(yàn)分子中隨后序列位置的一組8個(gè)均聚物。繼續(xù)上述實(shí)例，使用低腺苷三磷酸雙磷酸酶濃度并假定對(duì)反應(yīng)底物的簡(jiǎn)單洗滌不足以除去上一輪的所有核苷酸種類，由試驗(yàn)分子得到的序列數(shù)據(jù)產(chǎn)生可檢測(cè)的延后錯(cuò)誤。圖4B顯示對(duì)于種類流動(dòng)(SpeCieSflOW)405，試驗(yàn)分子的可能的延后錯(cuò)誤效應(yīng)的實(shí)例。加粗的虛線表示對(duì)于每個(gè)種類流動(dòng)405而言，具有延后錯(cuò)誤的信號(hào)水平407。例如，在低腺苷三磷酸雙磷酸酶濃度時(shí)，在第2輪加入C核苷酸種類期間，反應(yīng)環(huán)境中還存有第1輪加入的殘留G核苷酸種類，導(dǎo)致這兩種核苷酸種類都摻入(即在試驗(yàn)分子的第2位C和第3位G序列位置上摻入，以及可能在第4-8位C位置上摻入)，從而產(chǎn)生來自這兩種摻入的光以及被測(cè)信號(hào)水平的可檢測(cè)的增加?？蓹z測(cè)的增加可表示第2輪加入中存在的殘留G核苷酸種類的數(shù)量，并且與腺苷三磷酸雙磷酸酶的活性水平有關(guān)(即低濃度不能降解所有G核苷酸分子)。在第3輪加時(shí)效應(yīng)進(jìn)一步放大，其中在第3輪期間，反應(yīng)環(huán)境中有來自第2輪加入的殘留C核苷酸種類并導(dǎo)致類似的可檢測(cè)的延后效應(yīng)結(jié)果。最終，必要時(shí)可使用第4輪加入的C種類并顯示出來自延后效應(yīng)的信號(hào)可檢測(cè)性地減少，這表明來自上一輪的C核苷酸種類的預(yù)延伸。換句話說，因?yàn)樯弦惠喲h(huán)的延后延伸，在第4輪期間，有更少的試驗(yàn)分子處于加入的C核苷酸種類的時(shí)相(或時(shí)相同步)，因此更少的摻入事件導(dǎo)致檢測(cè)信號(hào)比起延后錯(cuò)誤不存在時(shí)預(yù)期的要低?？梢岳斫?，在本實(shí)例中，所測(cè)信號(hào)值仍然比上一輪更亮，這可用于鑒定含試驗(yàn)分子的孔。用于測(cè)定腺苷三磷酸雙磷酸酶活性的另一技術(shù)在本文中稱為“振幅測(cè)定(AmplitudeMeasurement)，，。振幅測(cè)定與時(shí)相測(cè)定(phasemeasurement)方法相比具有某些優(yōu)勢(shì)，因?yàn)椴恍枰貏e的試驗(yàn)分子，振幅測(cè)量可用ATP作為反應(yīng)底物，這樣就不會(huì)影響到測(cè)序過程的其它步驟。此外，振幅測(cè)量技術(shù)采用單一流動(dòng)(simpleflow)算法和信號(hào)處理方法(無需應(yīng)用程序135來執(zhí)行孔尋找算法(wellfindingalgorithm))。另外，振幅測(cè)量更適用于頻繁測(cè)定，而不會(huì)帶來時(shí)相錯(cuò)誤的風(fēng)險(xiǎn)(即通過在測(cè)量期間添加dNTP種類，其可摻入到與模板核酸分子相連的新生鏈中)，而且對(duì)其它來源的背景錯(cuò)誤較不敏感。如上所述，振幅測(cè)量的某些實(shí)施方案使用腺苷三磷酸雙磷酸酶將腺苷三磷酸底物(通常稱為ATP)轉(zhuǎn)化為腺苷二磷酸(通常稱為ADP)的特性，在焦磷酸測(cè)序過程中使其功能性失活。通常認(rèn)為ATP在細(xì)胞代謝中對(duì)能量轉(zhuǎn)移是至關(guān)重要的，而且是基礎(chǔ)反應(yīng)底物，用于由螢光素酶催化螢光素而產(chǎn)生光作為一種反應(yīng)產(chǎn)物。也可理解，螢光素和螢光素酶通常用于焦磷酸測(cè)序方法，當(dāng)核苷酸種類摻入時(shí)，最終導(dǎo)致光的產(chǎn)生。因此，在螢光素和螢光素酶存在下，容易測(cè)定腺苷三磷酸雙磷酸酶能夠水解/降解ATP的效率，即通過使用系統(tǒng)100的光檢測(cè)能力來測(cè)定光輸出。在某些實(shí)施方案中，其它反應(yīng)底物也可用于替代ATP，包括其它核苷三磷酸(即CTP、GTP或TTP)、核糖核苷酸或脫氧核苷酸(例如脫氧核苷三磷酸，dNTP)。然而可以理解，對(duì)于時(shí)相測(cè)定技術(shù)而言，通過聚合酶向上述新生鏈摻入dNTP是有風(fēng)險(xiǎn)的，因而對(duì)于某些應(yīng)用而言并不理想。在采用振幅測(cè)量的測(cè)序過程的某些實(shí)施方案中，最好對(duì)測(cè)序反應(yīng)所用的每種dNTP種類都測(cè)定腺苷三磷酸雙磷酸酶活性。如本發(fā)明說明書中其它地方所提及的，腺苷三磷酸雙磷酸酶在洗滌過程中可用于降解ATP和dNTP種類，其中腺苷三磷酸雙磷酸酶活性因不同dNTP種類而異。例如，可使用測(cè)定技術(shù)，分別測(cè)試過量濃度的每種dNTP種類與有限濃度的ATP。因此，dNTP作為ATP的競(jìng)爭(zhēng)物，與ATP競(jìng)爭(zhēng)腺苷三磷酸雙磷酸酶，并且可以測(cè)定腺苷三磷酸雙磷酸酶降解每種核苷酸種類的效率。然后，在用相應(yīng)核苷酸種類進(jìn)行的每一輪之后，可使用針對(duì)每種核苷酸種類的最佳腺苷三磷酸雙磷酸酶的濃度。振幅測(cè)量的第一實(shí)施方案包括將一定濃度的腺苷三磷酸雙磷酸酶和一定濃度的ATP反應(yīng)底物同時(shí)引入到反應(yīng)環(huán)境中，測(cè)定作為反應(yīng)產(chǎn)物的光輸出，找到所測(cè)輸出與酶活性水平的關(guān)系。在所述實(shí)施方案中，腺苷三磷酸雙磷酸酶活性并不依賴于反應(yīng)環(huán)境中的ATP底物濃度，其中對(duì)于ATP，反應(yīng)處于“第一順序”。然而，通常最好還是使用已知ATP濃度。在儀器100的某些實(shí)施方案中，反應(yīng)環(huán)境中螢光素、螢光素酶和硫酸化酶的濃度與測(cè)序過程所需濃度相比是過量的，其中過量濃度對(duì)其它相互作用或過程沒有有害效應(yīng)。事實(shí)上，過量濃度的螢光素、螢光素酶和硫酸化酶可用于抵消螢光素酶或硫酸化酶可能的低催化活性效應(yīng)(本發(fā)明的方法也用來測(cè)定螢光素酶和/或硫酸化酶活性，正如下文將要詳述的那樣)。因此，在抑制效應(yīng)不存在時(shí)，當(dāng)將ATP反應(yīng)底物引入到反應(yīng)環(huán)境中時(shí)，其將會(huì)與螢光素和螢光素酶反應(yīng)并導(dǎo)致光的產(chǎn)生。在此同時(shí)，腺苷三磷酸雙磷酸酶通過將ATP轉(zhuǎn)化為ADP，而起到抑制光產(chǎn)生效應(yīng)。因此，加入ATP而產(chǎn)生光的量反映了腺苷三磷酸雙磷酸酶的活性和ATP向ADP轉(zhuǎn)化的效率。例如，多通閥200可測(cè)定并向流動(dòng)槽250中引入所需濃度的腺苷三磷酸雙磷酸酶和ATP。在本實(shí)例中，可將腺苷三磷酸雙磷酸酶和ATP試劑作為混合流體或系列稀釋流體，平行引入到流動(dòng)槽250中(即按照先加入腺苷三磷酸雙磷酸酶、再加入ATP的順序或反之亦然)。繼續(xù)本實(shí)例，一旦將腺苷三磷酸雙磷酸酶引入到流動(dòng)槽250中時(shí)，立即起到將ATP轉(zhuǎn)化為ADP的作用，由ATP與螢光素酶接觸時(shí)產(chǎn)生的光，可得到可檢測(cè)的活性率。圖5提供將不同腺苷三磷酸雙磷酸酶濃度與ATP反應(yīng)底物輸入到反應(yīng)環(huán)境后所檢測(cè)到的相對(duì)信號(hào)之間的關(guān)系的說明性實(shí)例。圖5也顯示設(shè)置點(diǎn)(setpoint)信號(hào)水平505和酶濃度515，表明用于測(cè)序過程的所需水平。重要的是，被測(cè)相對(duì)信號(hào)與腺苷三磷酸雙磷酸酶濃度之間的關(guān)系是線性關(guān)系，因此能夠容易地測(cè)定出對(duì)腺苷三磷酸雙磷酸酶儲(chǔ)液的調(diào)節(jié)，以達(dá)到所需活性水平的濃度。例如，可通過被測(cè)數(shù)據(jù)點(diǎn)510來繪制回歸線，顯示線性關(guān)系。同樣，在本實(shí)例中，酶濃度515的最佳濃度包括0.95U/ml的數(shù)值。振幅測(cè)量的第二實(shí)施方案可包括將一定濃度的腺苷三磷酸雙磷酸酶和一定濃度的焦磷酸反應(yīng)底物同時(shí)或序貫引入到反應(yīng)環(huán)境中。硫酸化酶催化焦磷酸產(chǎn)生ATP作為反應(yīng)產(chǎn)物，因此可如上所述地測(cè)定腺苷三磷酸雙磷酸酶的活性。用焦磷酸作為試驗(yàn)底物或反應(yīng)底物的一個(gè)可能的障礙在儀器100和用焦磷酸酶降解過量焦磷酸的方法的實(shí)施方案中可能會(huì)經(jīng)歷(即在反應(yīng)環(huán)境中可用于流動(dòng)的和/或固定在固相珠子基底上)。因此，焦磷酸酶活性可破壞對(duì)腺苷三磷酸雙磷酸酶活性的測(cè)定。然而，可用本文所述的實(shí)施方案來進(jìn)行焦磷酸酶活性的測(cè)定(即通過在腺苷三磷酸雙磷酸酶不存在時(shí)，用焦磷酸酶作為競(jìng)爭(zhēng)物流過焦磷酸一段時(shí)間，以建立評(píng)價(jià)焦磷酸和焦磷酸酶活性的基線)。此外，由焦磷酸流動(dòng)產(chǎn)生的ATP可以是區(qū)域特異性的，因?yàn)楫?dāng)通過閥門200引入時(shí)，它存在于產(chǎn)生部位而不是廣泛分布。在測(cè)序過程中使用焦磷酸酶的實(shí)施方案的實(shí)例可參見美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)順序號(hào)61/026，547(名稱"SystemandMethodforImprovedSignalDetectioninNucleicAcidSequencing(核酸測(cè)序中用于信號(hào)檢測(cè)改進(jìn)的系統(tǒng)和方法)”，申請(qǐng)日為2008年2月6日)，其通過引用全部結(jié)合到本文中，用于所有目的。也可理解，使用競(jìng)爭(zhēng)性反應(yīng)底物也可進(jìn)行其它酶試劑(例如螢光素酶和硫酸化酶)濃度的測(cè)定和自適應(yīng)控制的實(shí)施方案。例如，信號(hào)輸出的差異可能是因?yàn)?至少部分因?yàn)?螢光素、螢光素酶或硫酸化酶的活性或濃度水平的不同(也可包括空間效應(yīng)，其中局部區(qū)域可具有較高或較低濃度)以及模板分子的濃度和分布的不同。在本實(shí)例中，測(cè)序儀器100的某些實(shí)施方案可使用置入反應(yīng)孔內(nèi)的珠子上結(jié)合的螢光素酶和硫酸化酶，以及基本相同的模板分子群體，其也可分配在一個(gè)或多個(gè)珠子上。珠子的排列可產(chǎn)生所謂的“分層效應(yīng)(layeringeffect)”。本文所用的術(shù)語分層效應(yīng)通常是指底物、試劑、靶標(biāo)等在局部分布上的差異，這樣的差異可能是在反應(yīng)環(huán)境中分布這些材料所用的工藝所導(dǎo)致的結(jié)果。結(jié)果可包括一種或多種酶濃度的彼此局部差異或模板分子群體的局部差異或其某些組合。除了調(diào)節(jié)特定酶試劑的脈沖寬度之外，控制系統(tǒng)增益和標(biāo)定的一個(gè)實(shí)施方案包括使用調(diào)節(jié)酶活性水平的所謂“抑制劑”。本文所用的術(shù)語“抑制劑”通常是指互作分子之間的關(guān)系，其中一種分子即抑制劑對(duì)另一種分子的活性產(chǎn)生負(fù)面影響。在本發(fā)明中，最好調(diào)節(jié)硫酸化酶和螢光素酶的活性，這對(duì)反應(yīng)級(jí)聯(lián)而言是至關(guān)重要的，其在響應(yīng)核苷酸種類的摻入和焦磷酸的釋放時(shí)導(dǎo)致產(chǎn)生光。例如，可通過多通閥200，將螢光素酶的一種抑制劑(例如CAPMBT)引入到流動(dòng)槽250和反應(yīng)基底105的反應(yīng)環(huán)境中。在某些實(shí)施方案中，在應(yīng)用程序135的控制之下，在響應(yīng)所測(cè)的來自一個(gè)或多個(gè)摻入事件的光輸出時(shí)加入抑制劑?？砂炊喾N方式來測(cè)量光輸出，例如測(cè)量來自包括關(guān)鍵序列在內(nèi)的具有已知組成的序列或上述試驗(yàn)分子的輸出。此外，可如上所述地測(cè)定來自ATP的流動(dòng)或焦磷酸的流動(dòng)的光輸出，其也可用于測(cè)定測(cè)序循環(huán)期間可能發(fā)生的所謂的“信號(hào)衰減”或“信號(hào)下降”。處于應(yīng)用程序135控制之下的多通閥200可加入合適濃度的抑制劑，達(dá)到所需的酶活性水平。在某些實(shí)施方案中，該過程也可重復(fù)進(jìn)行，其中可進(jìn)行后續(xù)幾輪檢測(cè)和標(biāo)定，直至達(dá)到所需結(jié)果。控制系統(tǒng)增益和標(biāo)定的另一實(shí)施方案包括調(diào)節(jié)一種或多種“底物”試劑，其中可用底物數(shù)量或濃度的增加會(huì)導(dǎo)致信號(hào)輸出的增加。例如，來自如上所述ATP的流動(dòng)或焦磷酸的流動(dòng)的光輸出可用于調(diào)節(jié)包括D-螢光素和/或APS在內(nèi)的底物相關(guān)活性。如上所述對(duì)于系統(tǒng)增益控制，使用抑制劑，處于應(yīng)用程序135控制之下的多通閥200可加入合適濃度的底物，以達(dá)到所需活性水平。又一實(shí)施方案可包括調(diào)節(jié)某些組合中的部分或所有如上所述的酶、抑制劑或底物。再一實(shí)施方案可包括用環(huán)境條件例如PH來調(diào)節(jié)酶的活性水平。對(duì)于各種酶而言，與酶活性的最佳PH水平相比，酶活性水平可取決于(至少部分取決于)反應(yīng)環(huán)境中PH水平的關(guān)系。重要的是要注意，對(duì)于其最佳條件而言，不同酶的活性水平通常各不相同，最好可以在亞適量條件下使用一種或多種酶，但是可用更高濃度或體積來補(bǔ)償。例如，腺苷三磷酸雙磷酸酶活性的最佳PH可包括PH值6.5，而聚合酶的最佳PH可包括PH值為7.8。如上所述，本發(fā)明的元件涉及在核酸測(cè)序過程中對(duì)一種或多種酶試劑的自適應(yīng)控制。通常，本發(fā)明的實(shí)施方案包括在測(cè)序循環(huán)開始之前或在測(cè)序循環(huán)的同時(shí)(在測(cè)序循環(huán)期間按照正常間隔)來測(cè)定一種或多種酶試劑的活性，在測(cè)序循環(huán)期間一直進(jìn)行監(jiān)測(cè)，或其某些組合。在某些實(shí)施方案中，最好進(jìn)行多種測(cè)定，以確保測(cè)定的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義并控制測(cè)定和/或標(biāo)定過程中以及暫時(shí)改變系統(tǒng)條件時(shí)的錯(cuò)誤。進(jìn)行多種測(cè)定，可用于確定具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的測(cè)定，以達(dá)到更準(zhǔn)確地調(diào)節(jié)酶試劑最終濃度的目的。例如，測(cè)定過程可包括以3種不同的腺苷三磷酸雙磷酸酶體積(通過脈沖寬度來測(cè)定)的一系列腺苷三磷酸雙磷酸酶以及ATP反應(yīng)底物的流動(dòng)，并對(duì)每一次流動(dòng)測(cè)定的光的信號(hào)輸出。ATP的濃度不必準(zhǔn)確，但可包括的濃度約為0.875μΜ。在本實(shí)例中，該系列包括腺苷三磷酸雙磷酸酶的3次流動(dòng)，各次以3種脈沖寬度，包括83ms(預(yù)期濃度約為0.0079U/ml)、138ms(預(yù)期濃度約為0.0131U/ml)和201ms(預(yù)期濃度為約0.019U/ml)。將各次流動(dòng)的每種脈沖寬度的被測(cè)相對(duì)信號(hào)進(jìn)行平均，并通過求出的平均點(diǎn)來繪制回歸線，用于求出校正系數(shù)。調(diào)節(jié)腺苷三磷酸雙磷酸酶濃度之后，可用調(diào)節(jié)后的濃度來重復(fù)該過程，以證實(shí)調(diào)節(jié)是準(zhǔn)確的。如上所述，在測(cè)定步驟之后，用試劑、或增強(qiáng)劑、抑制劑或與所述試劑相互作用的底物的濃度或稀釋度來調(diào)節(jié)一種或多種酶試劑活性?？捎谩伴_環(huán)”或“閉環(huán)”策略進(jìn)行調(diào)節(jié)，調(diào)節(jié)反應(yīng)環(huán)境中的酶試劑濃度或者通過操縱反應(yīng)環(huán)境(即溫度、流速、PH等)中的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)或條件。本文所用的術(shù)語“開環(huán)”通常是指不響應(yīng)反饋的固定的預(yù)定設(shè)置。本文所用的術(shù)語“閉環(huán)”通常是指反饋控制系統(tǒng)，其中響應(yīng)所測(cè)參數(shù)來修改調(diào)節(jié)量。開環(huán)和閉環(huán)調(diào)節(jié)策略在不同實(shí)施方案中各有各的優(yōu)勢(shì)。例如，兩種常見類型的實(shí)施方案包括所謂的信號(hào)衰減補(bǔ)償和腺苷三磷酸雙磷酸酶補(bǔ)償。例如，在用信號(hào)衰減的校正或補(bǔ)償?shù)膶?shí)施方案中，使用開環(huán)調(diào)節(jié)策略的優(yōu)勢(shì)包括通過降低抑制劑濃度和/或提高上述底物的濃度而增加光的產(chǎn)生，來增加信號(hào)輸出量。此夕卜，在用腺苷三磷酸雙磷酸酶活性的校正或補(bǔ)償?shù)膶?shí)施方案中，使用開環(huán)調(diào)節(jié)策略的優(yōu)勢(shì)包括提高濃度以抵消催化活性的降解，或積累時(shí)相同步錯(cuò)誤。同樣，優(yōu)勢(shì)還包括降低濃度以抵消聚合酶的損失或聚合酶的活性。在本實(shí)例中，開環(huán)策略是有利的，因?yàn)檫@兩種實(shí)施方案包括穩(wěn)定性和/或預(yù)測(cè)性水平，其中在測(cè)序循環(huán)期間可能發(fā)生明顯的或不可預(yù)測(cè)的變化。此外，所述優(yōu)勢(shì)提高了數(shù)據(jù)質(zhì)量和可比性，其中最好的是在測(cè)序循環(huán)期間數(shù)據(jù)的一致性。繼續(xù)本實(shí)例，在使用信號(hào)衰減和腺苷三磷酸雙磷酸酶的校正或補(bǔ)償?shù)膶?shí)施方案中，使用閉環(huán)調(diào)節(jié)策略的優(yōu)勢(shì)包括更精細(xì)的調(diào)節(jié)，以產(chǎn)生更高質(zhì)量和更可靠的數(shù)據(jù)。同樣，在預(yù)測(cè)性和/或穩(wěn)定性的水平比所需閾值更低的實(shí)施方案中，優(yōu)選閉環(huán)調(diào)節(jié)策略。同樣如上所述，一種或多種酶催化活性水平可取決于(至少部分取決于)反應(yīng)環(huán)境中的條件。例如，腺苷三磷酸雙磷酸酶的降解速率可以是溫度依賴型的，當(dāng)溫度升高時(shí)降解速率也隨之提高。結(jié)果可包括腺苷三磷酸雙磷酸酶濃度不可預(yù)測(cè)地下降，導(dǎo)致延后錯(cuò)誤的增加。或者，更低的溫度可使降解速率放慢并允許過量濃度的腺苷三磷酸雙磷酸酶增加，導(dǎo)致不完全延伸錯(cuò)誤的增加。在本實(shí)例中，溫度可在儀器100內(nèi)進(jìn)行測(cè)定并在應(yīng)用程序135控制之下進(jìn)行調(diào)節(jié)，以將表現(xiàn)維持在所需參數(shù)內(nèi)。溫度也可用于調(diào)節(jié)腺苷三磷酸雙磷酸酶活性，以解決如上所述的其它活性效應(yīng)。實(shí)施例1-對(duì)自適應(yīng)腺苷三磷酸雙磷酸酶過程的驗(yàn)證用于測(cè)定腺苷三磷酸雙磷酸酶活性、確定脈沖寬度校正系數(shù)的過程驗(yàn)證需要達(dá)到預(yù)定腺苷三磷酸雙磷酸酶活性，并通過校正系數(shù)來調(diào)節(jié)腺苷三磷酸雙磷酸酶脈沖。腺苷三磷酸雙磷酸酶活性方法腺苷三磷酸雙磷酸酶可降解的ATP量可通過孔內(nèi)酶活性來測(cè)定；校正系數(shù)方法需要脈沖寬度的倍增因子，以得到預(yù)定腺苷三磷酸雙磷酸酶活性；相對(duì)信號(hào)方法腺苷三磷酸雙磷酸酶活性的檢測(cè)。將由ATP和腺苷三磷酸雙磷酸酶濃度的脈沖產(chǎn)生的信號(hào)與僅由ATP產(chǎn)生的信號(hào)進(jìn)行校正；和設(shè)定值方法所需預(yù)定相對(duì)信號(hào)。這是相對(duì)信號(hào)，校正系數(shù)應(yīng)當(dāng)校正所測(cè)量的腺苷三磷酸雙磷酸酶的脈沖寬度。編寫進(jìn)行腺苷三磷酸雙磷酸酶活性測(cè)定流程的腳本(script)。進(jìn)行校正系數(shù)的計(jì)算，然后用于標(biāo)稱腺苷三磷酸雙磷酸酶活性測(cè)定流程，以測(cè)定校正系數(shù)的準(zhǔn)確度。在標(biāo)準(zhǔn)腳本中，校正系數(shù)在洗滌核心程序(washingkernel)中用于腺苷三磷酸雙磷酸酶脈沖。該腳本稱為“測(cè)定_調(diào)節(jié)_再測(cè)定”腳本。它進(jìn)行腺苷三磷酸雙磷酸酶測(cè)定流程，調(diào)節(jié)腺苷三磷<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>注意，從腺苷三磷酸雙磷酸酶脈沖向相對(duì)信號(hào)的典型轉(zhuǎn)化為0.002Cnt/mS。使用138ms測(cè)定脈沖作為我們的標(biāo)稱濃度，從重測(cè)值中相對(duì)錯(cuò)誤向相對(duì)腺苷三磷酸雙磷酸酶濃度錯(cuò)誤的轉(zhuǎn)化是(x/100*0.79)/(.002*138)，設(shè)定值為0.79。例如，相對(duì)信號(hào)為1.48%的相對(duì)錯(cuò)誤(試驗(yàn)1)表明腺苷三磷酸雙磷酸酶濃度錯(cuò)誤為4.24%。試驗(yàn)1的結(jié)果顯示如下。過程驗(yàn)證了測(cè)定僅來自ATP圖像的目標(biāo)區(qū)的算法能力，其是用于計(jì)算腺苷三磷酸雙磷酸酶測(cè)定和校正系數(shù)的區(qū)域。算法測(cè)定每一加載道(loadedlane)的中心和寬度并選擇內(nèi)部目標(biāo)區(qū)?！皽y(cè)定-調(diào)節(jié)_再測(cè)定”循環(huán)進(jìn)行6次，6次重測(cè)核心程序的每次都包括3次重復(fù)。這3次重測(cè)步驟的平均值作為目標(biāo)度量。aaLog.txt是儀器產(chǎn)生的自適應(yīng)腺苷三磷酸雙磷酸酶結(jié)果的匯總表并且包括在運(yùn)行目錄(rimdirectory)內(nèi)。該日志歸納了上述信息和第一次“測(cè)定-調(diào)節(jié)-再測(cè)定”循環(huán)的數(shù)據(jù)，并且加以注釋以便更清楚。nPixelsUnderDCOffset=3988(0.023770%)確定圖像是否需要DC補(bǔ)償adjustingdcoffsetfound2regionsregion0:center=1511,width=798region1:center=2548，width=820目標(biāo)區(qū)發(fā)珊,結(jié)果range0start=1245,end=1777range1start=2282，end=2814processimageblock...found1calpoints3samplesat172.755524,average=0.836458在講行任何改動(dòng)之前取3次測(cè)量結(jié)果notenoughcalpoints(1)processimageblock...found3calpoints4samplesat82.644630,average=0.915227第一循環(huán)腺苷三磷酸雙磷酸酶的測(cè)量4samplesat137.931030,average=0.786803結(jié)果4samplesat200.000000，average=0.688323found3calpoints4samplesat82.644630，average=0.9152274samplesat137.931030，average=0.7868034samplesat200.000000，average=0.6883230:x=82.644630,y=0.9369561:x=137.931030,y=0.8043542:x=200.000000,y=0.6907723:x=82.644630,y=0.9424564:x=137.931030,y=0.8078855:x=200.000000,y=0.7012686:x=82.644630,y=0.9156747:x=137.931030,y=0.7727978:x=200.000000,y=0.6757899:x=82.644630,y=0.86582410:x=137.931030，y=0.76217611:x=200.000000，y=0.685462y=-0.001926431*x+l.066854(raw)found3calpoints4samplesat82.644630，average=0.9152274samplesat137.931030，average=0.7868034samplesat200.000000，average=0.688323calPoint82.644630has48pointsinitialcv=0.035133cvtrimmed48originalvaluesto48柜絕離群數(shù)據(jù)。這可歸于流動(dòng)異sdtrimmed48originalvaluesto47常、氣泡等calPoint137.931030has48pointsinitialcv=0.037847cvtrimmed48originalvaluesto48sdtrimmed48originalvaluesto45calPoint200.000000has48pointsinitialcv=0.020899cvtrimmed48originalvaluesto48sdtrimmed48originalvaluesto46y=-0.001951383*x+l.071890(trimmed)根據(jù)腺苷三磷酸雙磷酸酶測(cè)定來found3calpoints計(jì)算回歸線47samplesat82.644630，average=0.916581，IineFit=0.91061945samplesat137.931030，average=0.790962，IineFit=0.80273446samplesat200.000000，average=0.687038，IineFit=0.681614calSetPoint=0.790000pulseffidthAtSetpoint=144.456635adjust=1.046787計(jì)算校lH系數(shù)maximumPulseffidth=151nominalPulseffidth=116.119minimumPulseffidth=60e2motf=-22.000000newApyraseffashPulseffidth=122.581計(jì)算新的重測(cè)脈沖寬度adjustedpulsewidthis123changingmicro'spulsewidthto123脈沖寬度由微秒改變成毫秒(ms)MsgType=108，Index=21，Pulse=123SCRIPT_PULSE_WIDTH_NOTIFYmsgreceivedMsgType=204，Index=21，Pulse=123processimageblock...found1calpoints3samplesat172.755524,average=0.8299983次重測(cè)流動(dòng)的平均倌在4次試驗(yàn)(24個(gè)總“重測(cè)”值)中，在90%置信度時(shí)，算法校正了脈沖寬度，產(chǎn)生相對(duì)信號(hào)在設(shè)定值的5%之內(nèi)，至少78%的時(shí)間(22次成功)。如果去掉兩個(gè)異常值，將會(huì)在5%之內(nèi)，至少89%的時(shí)間(24次成功)。也證實(shí)了微控制器可控制腺苷三磷酸雙磷酸酶脈沖寬度至O.5ms的計(jì)算脈沖寬度之內(nèi)。因?yàn)橛兴龈鞣N實(shí)施方案和實(shí)施過程，相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，前述內(nèi)容僅僅是說明性的而非限制性的，僅以實(shí)施例的方式給出。所述實(shí)施方案所用的各種功能性元件中分配功能的許多其它方案是可行的。任何元件的功能都可在替代實(shí)施方案中以不同方式實(shí)現(xiàn)。權(quán)利要求一種用于自適應(yīng)試劑控制的方法，所述方法包括a)將第一濃度的酶試劑引入到含有反應(yīng)底物的反應(yīng)環(huán)境中，其中所述酶試劑和反應(yīng)底物是測(cè)序過程的組成部分；b)測(cè)定所述反應(yīng)環(huán)境中第一濃度酶試劑的活性水平，其中所述活性水平包括所述酶試劑與所述反應(yīng)底物之間反應(yīng)的可檢測(cè)產(chǎn)物；c)用所檢測(cè)到的第一濃度的活性水平來確定最佳濃度；和d)在所述反應(yīng)環(huán)境中使用所述酶試劑的最佳濃度實(shí)施測(cè)序過程，其中所述測(cè)序過程包括一系列重復(fù)的測(cè)序反應(yīng)。2.權(quán)利要求1的方法，所述方法還包括在步驟d)之前，用所述最佳濃度作為第一濃度，重復(fù)步驟a)和b)；和用所檢測(cè)到的活性水平來證實(shí)所述酶試劑的最佳濃度。3.權(quán)利要求1的方法，所述方法還包括將第二濃度和第三濃度的所述酶試劑引入到含有所述反應(yīng)底物的所述反應(yīng)環(huán)境中；測(cè)定所述反應(yīng)環(huán)境中第二濃度和第三濃度的所述酶試劑的活性水平；和用所檢測(cè)到的第一、第二和第三濃度的活性水平來確定最佳濃度。4.權(quán)利要求3的方法，其中分別測(cè)定第一、第二和第三濃度的活性水平，重復(fù)兩次或更多次，其中用分別測(cè)定的第一、第二和第三濃度的活性水平的兩次或更多次測(cè)定的平均值來確定最佳濃度。5.權(quán)利要求1的方法，所述方法還包括e)在所述測(cè)序過程期間一次或多次重復(fù)步驟a)_c)。6.權(quán)利要求1的方法，其中所述酶試劑包括腺苷三磷酸雙磷酸酶，所述反應(yīng)底物包括ATP，其中將ATP引入到含有腺苷三磷酸雙磷酸酶的反應(yīng)環(huán)境中。7.權(quán)利要求6的方法，其中用模板核酸進(jìn)行系列重復(fù)的測(cè)序反應(yīng)，在測(cè)序反應(yīng)后續(xù)循環(huán)之前，將最佳濃度的腺苷三磷酸雙磷酸酶引入到所述反應(yīng)環(huán)境中，以減少后續(xù)循環(huán)中產(chǎn)生的模板核酸序列組成中的引入錯(cuò)誤。8.權(quán)利要求7的方法，其中所述引入錯(cuò)誤包括在所述反應(yīng)環(huán)境中腺苷三磷酸雙磷酸酶濃度低于最佳濃度時(shí)的延后錯(cuò)誤。9.權(quán)利要求7的方法，其中所述引入錯(cuò)誤包括在所述反應(yīng)環(huán)境中腺苷三磷酸雙磷酸酶濃度高于最佳濃度時(shí)的不完全延伸錯(cuò)誤。10.權(quán)利要求7的方法，其中所述引入錯(cuò)誤包括在所述反應(yīng)環(huán)境中腺苷三磷酸雙磷酸酶濃度高于最佳濃度時(shí)來自測(cè)序反應(yīng)的低反應(yīng)產(chǎn)物。11.權(quán)利要求1的方法，其中所述酶試劑包括焦磷酸酶，所述反應(yīng)底物包括焦磷酸，其中將焦磷酸引入到含有焦磷酸酶的所述反應(yīng)環(huán)境中。12.權(quán)利要求1的方法，其中所述酶試劑包括腺苷三磷酸雙磷酸酶，所述反應(yīng)底物包括焦磷酸，其中將焦磷酸引入到含有腺苷三磷酸雙磷酸酶的所述反應(yīng)環(huán)境中。13.權(quán)利要求1的方法，其中所述酶試劑對(duì)環(huán)境條件敏感，其中所述環(huán)境條件改變所述酶試劑的活性水平。14.權(quán)利要求13的方法，其中所述環(huán)境條件包括PH或溫度。15.權(quán)利要求1的方法，其中所述可檢測(cè)產(chǎn)物包括從所述反應(yīng)中發(fā)出的光。16.權(quán)利要求1的方法，其中所述測(cè)序反應(yīng)產(chǎn)生多種反應(yīng)產(chǎn)物，其中包括反應(yīng)底物。17.權(quán)利要求1的方法，其中所述酶試劑降解所述反應(yīng)底物。18.權(quán)利要求1的方法，其中所述反應(yīng)環(huán)境包括流動(dòng)槽。19.權(quán)利要求1的方法，其中所述反應(yīng)環(huán)境包括板的孔。20.權(quán)利要求19的方法，其中所述板包括含有所述孔陣列的纖維光學(xué)面板。21.一種核酸測(cè)序系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括流動(dòng)槽，所述流動(dòng)槽具有進(jìn)行包括一系列重復(fù)的測(cè)序反應(yīng)在內(nèi)的測(cè)序過程的反應(yīng)環(huán)境；閥門，所述閥門將第一濃度的酶試劑引入到含有反應(yīng)底物的反應(yīng)環(huán)境中，其中所述酶試劑和反應(yīng)底物是所述測(cè)序過程的組成部分；檢測(cè)器，所述檢測(cè)器檢測(cè)所述反應(yīng)環(huán)境中第一濃度的所述酶試劑活性水平，其中所述活性水平包括所述酶試劑與所述反應(yīng)底物之間反應(yīng)的可檢測(cè)產(chǎn)物；其中所述閥門響應(yīng)所檢測(cè)到的活性水平，給所述反應(yīng)環(huán)境提供所述酶試劑的最佳濃度。22.權(quán)利要求21的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)還包括儲(chǔ)存有可執(zhí)行代碼的計(jì)算機(jī)，其中所述可執(zhí)行代碼執(zhí)行以下步驟為所述閥門提供指令控制，以將第一濃度的所述酶試劑和所述反應(yīng)底物引入到所述反應(yīng)環(huán)境中；接收來自所述檢測(cè)器的所檢測(cè)到的第一濃度的活性水平；用所檢測(cè)到的第一濃度的活性水平來確定最佳濃度；和為所述閥門提供指令控制，以提供最佳濃度。23.權(quán)利要求22的系統(tǒng)，其中將所述指令控制提供給控制所述閥門的定時(shí)功能的微控制器。24.權(quán)利要求23的系統(tǒng)，其中所述閥門的定時(shí)功能包括控制脈沖寬度。25.權(quán)利要求21的系統(tǒng)，其中所述閥門是多通閥。26.權(quán)利要求21的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)還包括裝有所述酶試劑貯液的第一流體貯存器和裝有所述反應(yīng)底物貯液的第二流體貯存器，其中所述閥門通過第一和第二流體貯存器將第一濃度的所述酶試劑和所述反應(yīng)底物引入到所述反應(yīng)環(huán)境中。27.權(quán)利要求26的系統(tǒng)，其中所述閥門通過第一流體貯存器引進(jìn)最佳濃度。28.權(quán)利要求21的系統(tǒng)，其中所述檢測(cè)器是CCD檢測(cè)器。29.權(quán)利要求21的系統(tǒng)，其中所述酶試劑包括腺苷三磷酸雙磷酸酶，所述反應(yīng)底物包括ATP，其中將ATP引入到含有腺苷三磷酸雙磷酸酶的反應(yīng)環(huán)境中。30.權(quán)利要求29的系統(tǒng)，其中在第一重復(fù)后的測(cè)序反應(yīng)的每次后續(xù)重復(fù)中，所述閥門提供腺苷三磷酸雙磷酸酶的最佳濃度，以減少后續(xù)重復(fù)中產(chǎn)生的序列組成中的引入錯(cuò)誤。31.權(quán)利要求30的系統(tǒng)，其中所述引入錯(cuò)誤包括在反應(yīng)環(huán)境中腺苷三磷酸雙磷酸酶濃度低于最佳濃度時(shí)的延后錯(cuò)誤。32.權(quán)利要求30的系統(tǒng)，其中所述引入錯(cuò)誤包括在反應(yīng)環(huán)境中腺苷三磷酸雙磷酸酶濃度高于最佳濃度時(shí)的不完全延伸錯(cuò)誤。33.權(quán)利要求30的系統(tǒng)，其中所述引入錯(cuò)誤包括在反應(yīng)環(huán)境中腺苷三磷酸雙磷酸酶濃度高于最佳濃度時(shí)來自測(cè)序反應(yīng)的低反應(yīng)產(chǎn)物。34.權(quán)利要求21的系統(tǒng)，其中所述酶試劑對(duì)環(huán)境條件敏感，其中所述環(huán)境條件改變所述酶試劑的活性水平。35.權(quán)利要求34的系統(tǒng)，其中所述環(huán)境條件包括PH或溫度。36.權(quán)利要求21的系統(tǒng)，其中所述可檢測(cè)產(chǎn)物包括從所述反應(yīng)中發(fā)出的光。37.權(quán)利要求21的系統(tǒng)，其中所述測(cè)序反應(yīng)產(chǎn)生多種反應(yīng)產(chǎn)物，其中包括反應(yīng)底物。38.權(quán)利要求21的系統(tǒng)，其中所述酶試劑降解所述反應(yīng)底物。39.權(quán)利要求21的系統(tǒng)，其中所述反應(yīng)環(huán)境包括板的孔。40.權(quán)利要求39的系統(tǒng)，其中所述板包括含有所述孔陣列的纖維光學(xué)面板。全文摘要本發(fā)明描述了用于自適應(yīng)試劑控制方法的實(shí)施方案，所述方法包括a)將第一濃度的酶試劑引入到含有反應(yīng)底物的反應(yīng)環(huán)境中，其中所述酶試劑和反應(yīng)底物是測(cè)序過程的組成部分；b)測(cè)定所述反應(yīng)環(huán)境中第一濃度酶試劑的活性水平，其中所述活性水平包括所述酶試劑與反應(yīng)底物之間反應(yīng)的可檢測(cè)產(chǎn)物；c)用所檢測(cè)到的第一濃度的活性水平來確定最佳濃度；和d)在所述反應(yīng)環(huán)境中使用所述酶試劑的最佳濃度實(shí)施測(cè)序過程，其中所述測(cè)序過程包括一系列重復(fù)的測(cè)序反應(yīng)。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101802218SQ200880022571公開日2010年8月11日申請(qǐng)日期2008年6月27日優(yōu)先權(quán)日2007年6月28日發(fā)明者G·T·羅思,J·M·尼利斯,J·R·諾比爾,M·斯里尼瓦桑,X·V·戈姆斯,Z·陳申請(qǐng)人:454生命科學(xué)公司