專利名稱：：用于快速篩選微生物宿主以鑒定某些在表達(dá)異源蛋白質(zhì)方面具有改善的產(chǎn)量和/或質(zhì)量...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明在蛋白質(zhì)生產(chǎn)領(lǐng)域內(nèi)，具體涉及鑒定對于大規(guī)模生產(chǎn)正確加工的異源蛋白質(zhì)最佳的宿主細(xì)胞。
背景技術(shù)：
：超過150種重組生產(chǎn)的蛋白質(zhì)和多肽已經(jīng)獲得美國食品和藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)作為生物技術(shù)藥物和疫苗使用，另有370種處于臨床試驗中。與經(jīng)由化學(xué)合成所生產(chǎn)的小分子治療劑不同，蛋白質(zhì)和多肽是在活細(xì)胞中最有效生成的。然而，當(dāng)前在細(xì)菌中生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)的方法通常生成不正確折疊的、聚集的或沒有活性的蛋白質(zhì)，而且許多類型的蛋白質(zhì)要求使用已知方法時低效率實現(xiàn)的次級修飾。已經(jīng)開發(fā)了許多嘗試以提高正確折疊的蛋白質(zhì)在重組系統(tǒng)中的生成。例如，調(diào)查人員變更了發(fā)酵條件(Schein(1989)Bio/Technology,7:1141-1149),改變了啟動子強(qiáng)度，或者使用了過量表達(dá)的伴侶蛋白(Hockney(1994)TrendsBiotechnol.12:456-463)，其能有助于防止包含體的形成。已經(jīng)開發(fā)了多種策略來將蛋白質(zhì)從細(xì)胞分泌入上清液中。例如美國專利No.5,348,867;美國專利No.6,329,172;PCT公開文本號WO96/17943;PCT公開文本號WO02/40696;及美國申請公開文本2003/0013150。用于提高表達(dá)的其它策略致力于將蛋白質(zhì)靶向至周質(zhì)。一些調(diào)查聚焦于非Sec型分泌(參見例如PCT公開文本號WO03/07卯07;美國公開文本No.2003/0180937;美國公開文本No.2003/0064435;及PCT公開文本號WO00/59537)。然而，大多數(shù)研究聚焦于用Sec型分泌系統(tǒng)分泌外源蛋白質(zhì)。已經(jīng)記載了許多在表達(dá)重組多肽或蛋白質(zhì)中使用的分泌信號。參見例如美國專利No.5,914,254;美國專利No.4,963,495;歐洲專利No.0177343;美國專利No.5,082,783;PCT公開文本號WO89/10971;美國專利No.6,156,552;美國專利No.6,495,357;6,509,181;6,524,827;6,528,298;6,558,939;6,608,018;6,617,143;美國專利No.5,595,898;5，698，435;及6,204,023;美國專利No.6,258,560;PCT公開文本號WO01/21662,WO02/068660和美國申請公開文本2003/0044906;美國專利No.5,641,671;及歐洲專利No.EP0121352。異源蛋白質(zhì)生產(chǎn)通常導(dǎo)致不溶性或不正確折疊的蛋白質(zhì)的形成，它們難以恢復(fù)，而且可能是沒有活性的。此外，特定宿主細(xì)胞蛋白酶的存在可以降解感興趣的蛋白質(zhì)，如此降低最終的產(chǎn)量。沒有會改善所有異源蛋白質(zhì)生產(chǎn)的單因素。因此，本領(lǐng)域中需要能夠分泌和正確地加工重組多肽的改良大頭見模表達(dá)系統(tǒng)以生產(chǎn)正確加工形式的轉(zhuǎn)基因蛋白質(zhì)。發(fā)明概述本發(fā)明提供了用于快速鑒定能夠以改善的產(chǎn)量和/或質(zhì)量依照想要的規(guī)格(specification)生成至少一種異源多肽的宿主細(xì)胞群體的組合物和方法。該組合物包含兩個或更多個如下的宿主細(xì)胞群體，其已經(jīng)進(jìn)行過遺傳修飾以拔_高一種或多種牽涉蛋白質(zhì)生成的靶基因的表達(dá)、降低一種或多種牽涉蛋白質(zhì)降解的靶基因的表達(dá)、表達(dá)影響蛋白質(zhì)產(chǎn)物的異源基因、或組合。在多種經(jīng)修飾宿主細(xì)胞中表達(dá)感興趣多肽的能力提供了用于為感興趣多肽確定最佳宿主細(xì)胞的快速且高效的手段。想要的規(guī)格會隨感興趣的多肽而變化，但是包括產(chǎn)量、質(zhì)量、活性等。公認(rèn)的是，宿主細(xì)胞群體可以進(jìn)行修飾以表達(dá)如下核酸序列的許多組合，所述核酸序列影響促進(jìn)感興趣多肽表達(dá)的內(nèi)源序列和/或外源序列的表達(dá)以提高一種或多種牽涉感興趣異源蛋白質(zhì)的正確表達(dá)、加工、和/或轉(zhuǎn)運之一項或多項的靶基因的表達(dá)。在另一個實施方案中，所述靶基因是蛋白質(zhì)折疊調(diào)控物(modulator)。在另一個實施方案中，所述蛋白質(zhì)折疊調(diào)控物選自表l中的列表。在另一個實施方案中，一個或多個宿主細(xì)胞群體已經(jīng)進(jìn)行過遺傳修飾以降低一種或多種牽涉蛋白水解降解的靶基因的表達(dá)。在另一個實施方案中，所述靶基因是蛋白酶。在另一個實施方案中，所述蛋白酶選自表2中的列表。在一個實施方案中，編碼感興趣蛋白質(zhì)的核苷酸序列是與本文中所描述的焚光"(艮單月包菌(尸'sew(iomow(xy/7womycem1,/!//Momscem1)Sec系統(tǒng)分泌信號可操作連接的。陣列中的一個或多個菌抹可以在周質(zhì)區(qū)室(periplasmcompartment)中表達(dá)感興趣的異源蛋白質(zhì)。在某些實施方案中，一個或多個菌抹還可以穿過細(xì)胞外壁向胞外分泌異源蛋白質(zhì)。宿主細(xì)胞包括真核細(xì)胞(包括酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞、植物細(xì)胞等)和原核細(xì)胞(包括細(xì)菌細(xì)胞，諸如熒光假單胞菌、大腸桿菌CE.co//)如指明的那樣，可以對宿主細(xì)胞群體的文庫進(jìn)行快速篩選以鑒定異源表達(dá)的蛋白質(zhì)的產(chǎn)量和/或質(zhì)量得到改善的某些菌林。菌抹陣列對于篩選任何感興趣蛋白質(zhì)的表達(dá)改善是有用的，包括治療性蛋白質(zhì)、激素、生長因子、胞外受體或配體、蛋白酶、激酶、血液蛋白質(zhì)、趨化因子、細(xì)胞因子、抗體等。附圖簡述圖1A描繪了用于熒光假單胞菌中工程化基因組刪除的質(zhì)粒pDOW1261-2。圖1B是基因X刪除的構(gòu)建的示意圖。圖2是對zl,c/、/Weg尸2、z!La2和gr;^^"X/共表達(dá)菌抹中誘導(dǎo)后0小時和24小時時(分別為I0和I24)制備的可溶性細(xì)胞級分的Westem印跡分析(實施例6)。頂部箭頭指向共表達(dá)的菌抹中而不是對照(DC440)中的完全裝配的單克隆抗體。產(chǎn)重組體；n-r-非重組體。發(fā)明詳述現(xiàn)在會在下文中參照附圖更詳細(xì)地描述本發(fā)明，附圖中顯示了本發(fā)明的一些但不是所有實施方案。實際上，這些發(fā)明可以以許多不同形式體現(xiàn)，而且不應(yīng)當(dāng)解釋為限于本文中所提出的實施方案；而應(yīng)解釋為，提供這些實施方案以使本公開內(nèi)容會滿足適用的法定要求。這些發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員會想到本文中所提出的發(fā)明的許多改良和其它實施方案，它們具有上述說明及附圖中所呈現(xiàn)的教導(dǎo)的好處。因此，要理解的是，本發(fā)明不限于所公開的具體實施方案，并且意圖將改良和其它實施方案包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。雖然本文中采用特定的術(shù)語，但是它們僅以普通的且描述的意義使用，并且不是出于限制目的?？傉撎峁┝擞糜阼b定對于在宿主細(xì)胞中生成高水平的正確加工的異源多肽最佳的宿主菌林(例如熒光假單胞菌宿主菌抹)的組合物和方法。具體地，提供了宿主菌林的文庫(或"陣列")，其中該文庫中的每個菌抹(或"宿主細(xì)胞群體")已經(jīng)進(jìn)行過遺傳修飾以調(diào)控一種或多種靶基因在該宿主細(xì)胞中的表達(dá)?？梢愿鶕?jù)與該陣列中表型獨特的宿主細(xì)胞的其它群體相比所表達(dá)感興趣蛋白的數(shù)量、質(zhì)量、和/或位置來鑒定或選擇"最佳的宿主菌抹"。如此，最佳的宿主菌抹是依照想要的規(guī)格生成感興趣多肽的菌抹。雖然想要的規(guī)格會隨所生成的多肽而變化，但是所述規(guī)格包括蛋白質(zhì)的質(zhì)量和/或數(shù)量(無論該蛋白質(zhì)是隔離的還是分泌的)、蛋白質(zhì)折疊等。一般而言，"異源的"、"異源表達(dá)的"或"重組的"指如下基因或蛋白質(zhì)，所述基因或蛋白質(zhì)對宿主細(xì)胞而言不是內(nèi)源的或者對它在天然基因組中存在的位置而言不是內(nèi)源的，并且已經(jīng)通過注射、轉(zhuǎn)染、顯微注射、電穿孔、顯微噴射等添加至細(xì)胞。對陣列中的一個或多個宿主細(xì)胞群體進(jìn)行修飾以調(diào)控一種或多種靶基因在該宿主細(xì)胞中的表達(dá)。通過"耙基因，，意指影響宿主細(xì)胞中異源蛋白質(zhì)生成的基因。影響異源蛋白質(zhì)生成的靶基因包括編碼調(diào)控異源蛋白質(zhì)的表達(dá)、活性、溶解度、轉(zhuǎn)運、蛋白水解降解和/或切割的蛋白質(zhì)的基因。例如，把基因可以編碼至少一種宿主細(xì)胞蛋白酶、蛋白質(zhì)折疊調(diào)控物、轉(zhuǎn)錄因子、翻譯因子、分泌調(diào)控物、或任何其它牽涉感興趣異源蛋白質(zhì)的正確轉(zhuǎn)錄、翻譯、加工、和/或轉(zhuǎn)運的蛋白質(zhì)。"靶蛋白"指自靶基因表達(dá)得到的蛋白質(zhì)或多肽。提高或降低一種或多種靶基因的表達(dá)和/活性，這取決于所述靶基因或蛋白質(zhì)的功能。例如，可以降低一種或多種宿主細(xì)胞蛋白酶的表達(dá)，而可以提高一種或多種蛋白質(zhì)折疊調(diào)控物的表達(dá)。本文中所描述的陣列對于快速鑒定對感興趣異源蛋白質(zhì)或肽的生成最佳的宿主細(xì)胞是有用的。異源蛋白質(zhì)生成經(jīng)常導(dǎo)致不溶性或不正確折疊的蛋白質(zhì)的形成，它們難以恢復(fù)，而且可能是沒有活性的。此外，特定宿主細(xì)胞蛋白酶的存在可以降解感興趣的蛋白質(zhì)，如此降低最終的產(chǎn)量。沒有會最佳地生成所有感興趣多肽或蛋白質(zhì)的單一宿主細(xì)胞群體。如此，使用本發(fā)明的主細(xì)胞。然后可以使用最佳的宿主菌抹來生成足夠量的感興趣蛋白質(zhì)，或者用于商業(yè)生產(chǎn)。類似地，可以基于最佳的宿主菌抹來修飾宿主菌株以表達(dá)感興趣的蛋白質(zhì)。在一個實施方案中，該方法包括獲得至少包含熒光假單胞菌細(xì)胞的第一和第二群體的陣列，其中每個群體選自下組(i)如下熒光假單胞菌細(xì)胞的群體，其已經(jīng)進(jìn)行過遺傳修飾以降低至少一種牽涉蛋白質(zhì)降解的靶基因的表達(dá)；(ii)如下熒光假單胞菌細(xì)胞的群體，其已經(jīng)進(jìn)行過遺傳修飾以提高至少一種牽涉蛋白質(zhì)生成的耙基因的表達(dá)；和(iii)如下熒光假單胞菌細(xì)胞的群體，其已經(jīng)進(jìn)行過遺傳修飾以降低至少一種牽涉蛋白質(zhì)降解的靶基因的表達(dá)并提高至少一種牽涉蛋白質(zhì)生成的耙基因的表達(dá)；向每個群體的至少一個細(xì)胞中導(dǎo)入包含編碼至少一種感興趣異源蛋白質(zhì)的至少一種基因的表達(dá)構(gòu)建體；在足以在至少一個細(xì)胞群體中表達(dá)所述感興趣蛋白質(zhì)的條件下維持所述細(xì)胞；并選擇所述感興趣異源蛋白質(zhì)得以生成的最佳細(xì)胞群體；其中所述陣列中的每個群體是不相同的，且其中每個群體在物理上是;^皮此分開的；其中與該陣列中的其它群體相比，所述感興趣異源蛋白質(zhì)在所述最佳的細(xì)胞群體中展現(xiàn)出改善的表達(dá)、改善的活性、改善的溶解度、改善的移位、或降低的蛋白水解降解或切割之一項或多項。陣列可以進(jìn)一步包含如下宿主細(xì)胞(例如熒光假單胞菌宿主細(xì)胞)的群體，其沒有進(jìn)行過遺傳修飾以改變宿主細(xì)胞蛋白酶或蛋白質(zhì)折疊調(diào)控物的表達(dá)。此群體可以是野生型菌抹，或者可以是如下菌株，其進(jìn)行過遺傳修飾以改變一種或多種不牽涉蛋白質(zhì)生成、加工、或移位的基因的表達(dá)(例如可以進(jìn)行過遺傳修飾以表達(dá)例如選擇標(biāo)志基因)。在一個實施方案中，熒光假單胞菌宿主細(xì)胞的每個群體在表型方面是彼此獨特的(即"不相同的")。通過"表型獨特的"意指每個群體生成可測量程度上不同量的一種或多種靶蛋白質(zhì)。在此實施方案中，每個菌林進(jìn)行過遺傳修飾以改變一種或多種不同靶基因的表達(dá)。若在宿主細(xì)胞群體中調(diào)控超過包含多個表型獨特的依照本發(fā)明的宿主細(xì)胞群體的陣列是提供多個群體的陣列，從中選擇一種或多種對生成感興趣異源蛋白質(zhì)或多肽有用的菌抹。本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解的是，此類陣列還可以包含任何一種或多種宿主細(xì)胞群體的復(fù)制品(例如一式兩份、一式三份等)。陣列本文中提供了宿主細(xì)胞群體的陣列(即"菌抹陣列")，其能快速進(jìn)行篩選以鑒定某些具有改善的異源蛋白質(zhì)產(chǎn)量和/或質(zhì)量的菌抹。如本文中所使用的，術(shù)語"菌抹陣列"指多個尋址位置或可尋址位置(例如孔，諸如深孔或微孔)。該陣列中每個微孔或微孔組的位置通常是已知的，以便容許鑒定對于感興趣異源蛋白質(zhì)的表達(dá)最佳的宿主細(xì)胞。菌抹陣列包含多個表型獨特的宿主菌林。該陣列可以是低密度陣列或高密度陣列，并且可以含有約2個或更多個、約4個或更多個、約8個或更多個、約12個或更多個、約16個或更多個、約20個或更多個、約24個或更多個、約32個或更多個、約40個或更多個、約48個或更多個、約64個或更多個、約72個或更多個、約80個或更多個、約96個或更多個、約192個或更多個、約384個或更多個宿主細(xì)胞群體。本發(fā)明的宿主細(xì)胞群體可以在多孔或深孔器皿中維持和/或篩選。該器亞可以含有任何想要數(shù)目的孔，不過，微型化細(xì)胞培養(yǎng)微陣列平臺對于個別地和同時地使用最少的試劑和相對較少數(shù)目的細(xì)胞來篩選每個宿主細(xì)胞群體是有用的。在此測定法中有用的一種典型的多孔、微量滴定器皿是多孔板，包括但不限于10孔板、28孔板、96孔板、384孔板、和具有大于384孔的板?；蛘?，也可以使用管(tubes)、臺架(holders)、筒(cartridges)、微型管(minitubes)、微量離心管(microfugetubes)、冷凍管(cryovials)、方孑L4反管(squarewellplatestubes)、板(plates)、斜面(slants)、或培養(yǎng)瓶(cultureflasks)的陣列，這取決于想要的體積。器m可以由任何適合于培養(yǎng)和/或篩選感興趣宿主細(xì)胞(例如假單胞菌屬)的材料制成。例如，器i可以是可容易地進(jìn)行滅菌的材料，諸如塑料或其它人造聚合物材料，只要該材料是生物相容的?？梢允褂萌魏螖?shù)目的材料，包括但不限于聚苯乙烯；聚丙蹄；聚乙烯化合物(例如聚氯乙烯)；聚碳酸酯(PVC);聚四氟乙烯(PTFE);聚乙醇酸(PGA);纖維素；玻璃、含氟聚合物、氟化乙烯丙烯、聚偏乙烯、聚二曱基硅氧烷、硅等。自動化細(xì)胞轉(zhuǎn)化和自動化菌落揀選機(jī)會促進(jìn)想要的細(xì)胞的快速篩選。可以使用本領(lǐng)域中已知的測位儀裝置(例如自動化機(jī)器人裝置)來創(chuàng)建和/或篩選陣列。綠因本發(fā)明的菌抹陣列包含多個表型和基因型獨特的宿主細(xì)胞群體，其中陣列中的每個群體已經(jīng)進(jìn)行過遺傳修飾以調(diào)控一種或多種把基因在該宿主細(xì)胞中的表達(dá)。通過"靶基因"意指影響宿主細(xì)胞中異源蛋白質(zhì)生成的基因。靶基因可以編碼宿主細(xì)胞蛋白酶或內(nèi)源或外源蛋白質(zhì)折疊調(diào)控物、轉(zhuǎn)錄因子翻譯因子、分泌調(diào)控物、或任何其它牽涉感興趣異源蛋白質(zhì)的正確表達(dá)、加工、和/或轉(zhuǎn)運的基因。"靶蛋白"指自靶基因表達(dá)得到的蛋白質(zhì)或多肽。提高或降低一種或多種把基因的表達(dá)和/活性，這取決于所述耙基因或蛋白質(zhì)的功能。靶基因可以是宿主細(xì)胞內(nèi)源的，或者可以是陣列中的每個宿主細(xì)胞群體中異源表達(dá)的基因。在一個實施方案中，一種或多種靶基因是至少一種蛋白質(zhì)折疊調(diào)控物、推定的蛋白質(zhì)折疊調(diào)控物、或折疊調(diào)控物的輔因子或亞基。在一些實施方案中，一種或多種靶基因可以選自侶伴蛋白、折疊酶、肽基脯氨酰異構(gòu)酶和二硫鍵異構(gòu)酶。在一些實施方案中，一種或多種靶基因可以選自htpG、cbpA、dnaJ、dnaK和fkbP。來自焚光假單胞菌的例示性蛋白質(zhì)折疊調(diào)控物列于表l中。在其它實施方案中，靶基因包含至少一種推定的蛋白酶、蛋白酶樣蛋白、或蛋白酶的輔因子或亞基。例如，一種或多種靶基因可以是絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸或金屬肽酶。在一個實施方案中，一種或多種靶基因可以選自hslV、hsiU、clpA、clpB和clpX。靶基因還可以是蛋白酶的輔因子。來自熒光假單胞菌的例示性蛋白酶列于表2中。來自多種生物體的蛋白酶可以參見由WellcomeTrustSangerInstitute,Cambridge,UK維護(hù)的MEROPS肽酶凄欠-提,'牟(參網(wǎng)iihmerops.Sanger.acuk/)。蛋白質(zhì)折疊調(diào)控物在宿主細(xì)胞中生成異源蛋白質(zhì)的另一項主要障礙在于該細(xì)胞通常沒有足夠配備來生成可溶性或活性蛋白質(zhì)。雖然蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)由其氨基酸序列限定，但是二級結(jié)構(gòu)由a-螺旋或P-片層的存在限定，而三級結(jié)構(gòu)由相鄰蛋白質(zhì)段之間的共價鍵諸如二硫鍵限定。在表達(dá)異源蛋白質(zhì)時(特別在大規(guī)模生產(chǎn)中)，蛋白質(zhì)自身的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)是至關(guān)重要的。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的任何顯著變化可以產(chǎn)生沒有功能活性的分子，或具有顯著降低的生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)。在許多情況中，宿主細(xì)胞表達(dá)對于活性異源蛋白質(zhì)的正確生成而言必需的蛋白質(zhì)折疊調(diào)控物(PFM)。然而，在生成可用的、經(jīng)濟(jì)學(xué)上滿意的生物技術(shù)產(chǎn)品所一般要求的高水平表達(dá)，細(xì)胞通常不能生成足夠的一種或多種天然蛋白質(zhì)折疊調(diào)控物來加工異源表達(dá)的蛋白質(zhì)。在某些表達(dá)系統(tǒng)中，異源蛋白質(zhì)的過表達(dá)可以伴隨其錯誤折疊和隔離成不溶性聚集物。在細(xì)菌細(xì)胞中，這些聚集物稱為包含體。在大腸桿菌中，折疊調(diào)控物/伴侶蛋白的網(wǎng)絡(luò)包括Hsp70家族。主要的Hsp70伴估蛋白，即DnaK有效地阻止蛋白質(zhì)聚集，而且支持受損的蛋白質(zhì)重折疊。將熱休克蛋白摻入蛋白質(zhì)聚集物中可以促進(jìn)解聚。不過，在某些情況中，加工成包含體的蛋白質(zhì)可以經(jīng)由對不溶性級分的別的加工來恢復(fù)。包含體中找到的蛋白質(zhì)通常必須經(jīng)由多個步驟來純化，包括變性和復(fù)性。用于包含體耙向蛋白質(zhì)的典型復(fù)性方法牽涉如下嘗試，即將聚集物溶解于濃縮的變性劑中，隨后通過稀釋來除去變性劑。在此階段經(jīng)常再次形成聚集物。額外的加工增加成本，不能保證體外重折疊會產(chǎn)生有生物活性的產(chǎn)物，而且所恢復(fù)的蛋白質(zhì)可包括大量的片段雜質(zhì)。最近通過分子伴侶(其通過瞬時與折疊中間體相互作用來促進(jìn)對其它多肽的正確異構(gòu)化和細(xì)胞靶向)和折疊酶(其使限速步驟沿著折疊途徑加速)幫助體內(nèi)蛋白質(zhì)折疊的實現(xiàn)已經(jīng)提供了與包含體形成問題作斗爭的別的方法(參見例如ThomasJG等(1997)如/S/oc/ew腸fec/wo/66:197-238)。在某些情況中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了伴侶蛋白的過表達(dá)增加聚集傾向的蛋白質(zhì)的可溶性產(chǎn)量(參見Baneyx，F(xiàn).(1999)CWr(9p/".fi/。阮/.10:41l-421及其中的參考文獻(xiàn))。與這些伴侶蛋白的胞內(nèi)濃度增加有關(guān)的有益效果表現(xiàn)出高度依賴于過度生成的蛋白質(zhì)的性質(zhì)，而且可以不需要為所有的異源蛋白質(zhì)過表達(dá)相同的蛋白質(zhì)折疊調(diào)控物。蛋白質(zhì)折疊調(diào)控物(包括伴侶蛋白、二碌"A異構(gòu)酶、和肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶(PPI酶))是一類存在于所有細(xì)胞中的蛋白質(zhì)，其有助于新生多肽的折疊、解折疊和降解。伴侶蛋白通過結(jié)合至新生多肽、使它們穩(wěn)定并讓它們正確地折疊來起作用。蛋白質(zhì)擁有疏水性和親水性兩種殘基，前者通常暴露于表面上，而后者埋藏在結(jié)構(gòu)內(nèi)，在那里它們與其它親水性殘基而不是該分子周圍的水相互作用。然而，在正在折疊的多肽鏈中，親水性殘基經(jīng)常暴露一定的時間段，因為蛋白質(zhì)以部分折疊或錯誤折疊的狀態(tài)存在。在此時間期間，正在形成的多肽可以變?yōu)橛谰缅e誤折疊的或者與其它錯誤折疊的蛋白質(zhì)相互作用并在細(xì)胞內(nèi)形成大聚集物或包含體。一般而言，伴侶蛋白通過結(jié)合至部分折疊鏈的疏水區(qū)域并防止它們完全錯誤折疊或與其它蛋白質(zhì)聚集來起作用。伴倡蛋白甚至可以結(jié)合至包含體中的蛋白質(zhì)，并讓它們解聚(Ranson等1998)。GroES/EL、DnaKJ、Clp、Hsp90和SecB折疊調(diào)控物家族都是具有伴侶蛋白樣活性的蛋白質(zhì)的例子。另一種重要類型的折疊調(diào)控物是二硫鍵異構(gòu)酶。這些蛋白質(zhì)催化非常特異性的一組反應(yīng)來幫助正在折疊的多肽形成正確的蛋白質(zhì)內(nèi)二硫鍵。任何具有超過兩個半胱氨酸的蛋白質(zhì)有在錯誤殘基之間形成二硫鍵的風(fēng)險。二硫鍵形成家族由催化二硫鍵在周質(zhì)的非還原性環(huán)境中形成的Dsb蛋白組成。在周質(zhì)多肽錯誤折疊時，二硫鍵異構(gòu)酶即DsbC能夠重新排列二硫鍵，并容許蛋白質(zhì)以正確的連接重新形成。脯氨酸殘基在氨基酸中的獨特之處在于其前面緊接的肽鍵可以采取順式或反式構(gòu)象。對于所有其它氨基酸，由于位阻，這不是有利的。肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶(PPI酶)催化此鍵從一種形式向另一種轉(zhuǎn)換。這種異構(gòu)化可以幫助蛋白質(zhì)折疊、重折疊、亞基裝配和細(xì)胞中的運輸(Dolinski等l"7)。在似乎以非特異性方式與蛋白質(zhì)相互作用的通用伴侶蛋白外，還有幫助特定靶物折疊的伴侶蛋白。這些蛋白質(zhì)特異性伴侶蛋白與其靶物形成復(fù)合物，阻止聚集和降解，并為它們裝配成多亞基結(jié)構(gòu)留出時間。P叩D伴侶蛋白是此類型的一個公知的例子(Lombardo等1997)。折疊調(diào)控物還包括例如HSP70蛋白、HSP110/SSE蛋白、HSP40(DNAJ相關(guān))蛋白、GRPE樣蛋白、HSP90蛋白、CPN60和CPN10蛋白、胞質(zhì)溶膠陪伴蛋白(cytosolicchaperoning)、HSP100蛋白、小HSP、鈣聯(lián)接蛋白和鈣網(wǎng)蛋白、PDI和硫氧還蛋白相關(guān)蛋白、肽基脯氨酰異構(gòu)酶、親環(huán)蛋白PPI酶、FK-506結(jié)合蛋白、纟田小蛋白PPI酶、個別的陪伴蛋白(individualchaperoning)、蛋白質(zhì)特異性伴侶蛋白、或分子內(nèi)伴侶蛋白。折疊調(diào)控物一般性記載于"GuidebooktoMolecularChaperonesandProtein-FoldingCatalysts"(1997)MGething編,MelbourneUniversity,Australia。大腸桿菌胞質(zhì)中表征最好的分子伴侶是ATP依賴性DnaK-DnaJ-GrpE和GroEL-GroES系統(tǒng)?；隗w外研究和同源性考慮，已經(jīng)提出了許多別的胞質(zhì)蛋白質(zhì)在大腸桿菌中起分子伴侶的作用。這些包括ClpB、HtpG和IbpA/B，像DnaK-DnaJ-GrpE和GroEL-GroES—樣，它們是屬于應(yīng)激調(diào)節(jié)子的熱休克蛋白(Hsp)。X-Pro鍵的反式構(gòu)象在新生蛋白質(zhì)鏈中是能量方面有利的；不過，在天然蛋白質(zhì)中找到占全部約5。/。的脯氨酰肽鍵為順式構(gòu)象。反式向順式的X-Pro鍵異構(gòu)化在許多多肽的折疊中是限速的，并且在體內(nèi)由肽基脯氨酰順/反異構(gòu)酶(PPI酶)催化。至今在大腸桿菌中已經(jīng)鑒定出3種胞質(zhì)PPI酶，即SlyD、SlpA和觸發(fā)因子(TF)。已經(jīng)假設(shè)了TF(—種與50S核糖體亞基結(jié)合的48kDa蛋白質(zhì))在大腸桿菌中與伴侶蛋白合作以保證新合成的蛋白質(zhì)的正確折疊。至少5種蛋白質(zhì)(硫氧還蛋白1和2及谷氧還蛋白1、2和3，分別為trxA、trxC、grxA、grxB和grxC基因的產(chǎn)物)牽涉胞質(zhì)酶中瞬時出現(xiàn)的二硫橋的還原。如此，靶基因可以是容許正確的二硫^:形成的二碌^t形成蛋白或伴侶蛋白。表l:熒光假單胞菌菌林MB214蛋白質(zhì)折疊調(diào)控物ORFID基因功能家族位置GroES/ELRXF02095.1groES伴侶蛋白HsplO胞質(zhì)的RXF06767.1:groEL伴侶蛋白Hsp60胞質(zhì)的:rxf02.090RXFO1748.1ibpA小熱休克蛋白(sHSP)IbpAHsp20胞質(zhì)的PA3126;起GroESL折疊支持物的作用RXF03385.1hscB伴倡蛋白hscBHsp20胞質(zhì)的Hsr70(DnaK/J)周質(zhì)的RXF05399.1dnaK伴侶蛋白Hsp70RXF06954.1dnaK伴侶蛋白Hsp70胞質(zhì)的RXF03376.1hscA伴侶蛋白Hsp70胞質(zhì)的RXF03987.2cbpA彎曲DNA結(jié)合蛋白，Hsp40胞質(zhì)的dnaJ樣活性RXF05406.2dnaJ伴侶蛋白dnaJHsp40胞質(zhì)的RXF03346.2dnaJ分子伴侶(DnaJ家族)Hsp40非分泌的RXF05413.1grpF二熱休克蛋白GrpEPA4762GrpE胞質(zhì)的HsplOO(Clp/Hsl)胞質(zhì)的RXF04587.1clpAATP依賴性clp蛋白酶HsplOOATP結(jié)合亞基clpARXF08347.1clpBClpB蛋白HsplOO胞質(zhì)的RXF04654.2clpXATP依賴性clp蛋白酶HsplOO胞質(zhì)的ATP結(jié)合亞基clpXRXF04663.1clpPATP依賴性clp蛋白酶MEROPS胞質(zhì)的蛋白水解亞基(EC3.4.21.92)肽酶家族S14RXFO1957.2hslUATP依賴性hsl蛋白酶HsplOO胞質(zhì)的ATP結(jié)合亞基hslURXF01961.2hslVATP依賴性hsl蛋白酶MEROPS胞質(zhì)的蛋白水解亞基肽酶亞家族T1B14Hsp33RXF04254.2yrfl33kDa陪伴蛋白(熱休克蛋白33同系物)(HSP33)htpG伴倡蛋白htpGHsp90RXF05455.2SecBRXF0223UsecB分泌特異性伴侶蛋白SecB二碌L鍵異構(gòu)酶RXF07017.2dsbARXF08657.2RXFO1002.1RXF03307.1dsbA/dsbC/dsbG/fernAdsbA/dsbCdsbC二^s克化物異構(gòu)酶二^?；锂悩?gòu)酶二;5克化物異構(gòu)酶二硫化物異構(gòu)酶RXF04890.2dsbG二硫化物異構(gòu)酶肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶RXF03768.1ppiARXF05345.2RXF06034.2RXF06591.1RXF05753.2RXFO1833.2RXF04655.2RXF05385.1RXF00271.1ppiBfklB細(xì)/臉fkbPslyDtigyaad肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶A(EC5.2.1.8)肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶B肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶FklBfk506結(jié)合蛋白肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶(EC5.2.1.8)肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶(EC5.2.1.8)肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶SlyD觸發(fā)因子，PPI酶(EC5.2丄8)可能是FKBP型16kDa肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶(EC5.2.1.8)(PPI酶)(旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶)肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶(EC5.2.1.8)Hsp33PPI酶:FKBP型胞質(zhì)的Hsp90胞質(zhì)的SecB非分泌的DSBA胞質(zhì)的氧化還原酶DSBA胞質(zhì)的氧化還原酶DSBA氧化還原酶/周質(zhì)的硫氧還蛋白谷氧還蛋白/周質(zhì)的硫氧還蛋白谷氧還蛋白/周質(zhì)的硫氧還蛋白PPI酶:親環(huán)蛋白型周質(zhì)的PPI酶:親環(huán)蛋白型胞質(zhì)的PPI酶:FKBP型外膜PPI酶:FKBP型周質(zhì)的PPI酶:FKBP型外膜PPI酶:FKBP型非分泌的PPI酶:FKBP型胞質(zhì)的PPI酶:FKBP型非分泌的非分泌的菌毛裝配伴侶蛋白(papD樣)RXF06068.1RXF05719.1RXF03406.2RXF04296.1c叩ecpDecpD;csuGespD',^半4呂蛋白cup伴侶蛋白ecpD伴侶蛋白ecpD14MS蛋白ecpD菌毛裝商己papD菌毛裝配papD菌毛裝配papD菌毛裝配papD周質(zhì)的質(zhì)號號周二一一口信15RXF04553.1cupespD;伴4呂蛋白ecpD菌毛裝配papD周質(zhì)的RXF04554.2cupespD;4半"f呂蛋白ecpD菌毛裝配papD周質(zhì)的RXF05310.2cupespD;4半"f呂蛋白ecpD菌毛裝配papD周質(zhì)的RXF05304.1cupespD;4半"f呂蛋白ecpD菌毛裝配papD周質(zhì)的RXF05073.1cupgltF革蘭氏陰性菌毛裝配伴侶蛋白周質(zhì)功能菌毛裝配papD信號肽蛋白酶對異源表達(dá)的蛋白質(zhì)的不想要的降解呈現(xiàn)有效使用某些表達(dá)系統(tǒng)的一項障礙。在細(xì)胞進(jìn)行修飾以生成大量靶蛋白時，細(xì)胞被放置在壓力下，并常常通過誘導(dǎo)或阻抑其它蛋白質(zhì)來做出反應(yīng)。宿主細(xì)胞在異源蛋白質(zhì)生成過程中經(jīng)歷的壓力可以提高例如特定蛋白質(zhì)或輔因子的表達(dá)以引起過表達(dá)的異源蛋白質(zhì)的降解。代償性蛋白質(zhì)的表達(dá)升高能對表達(dá)高水平的有活性的、全長的異源蛋白質(zhì)的目的起反作用。其它蛋白質(zhì)的表達(dá)降低或缺乏足夠表達(dá)可以導(dǎo)致異源表達(dá)的蛋白質(zhì)的錯誤折疊和聚集。雖然已知壓力下的細(xì)胞會改變其蛋白質(zhì)表達(dá)概況，但是并不是所有異源表達(dá)的蛋白質(zhì)都會調(diào)控相同蛋白質(zhì)在特定宿主細(xì)胞中的表達(dá)。如此，可以使用包含多個宿主細(xì)胞群體的陣列來鑒定最佳的宿主菌林(例如熒光假單胞菌宿主菌株)，所述宿主細(xì)胞群體已經(jīng)進(jìn)行過遺傳改造以降低一種或多種蛋白酶的表達(dá)。在一個實施方案中，通過降低至少一種來自基因組的蛋白酶的表達(dá)、抑制或除去至少一種來自基因組的蛋白酶來修飾一個或多個宿主細(xì)胞群體。該修飾還可以是對超過一種蛋白酶的。在一個相關(guān)的實施方案中，通過降低蛋白酶輔因子或蛋白酶蛋白的表達(dá)來修飾細(xì)胞。在另一個實施方案中，通過抑制蛋白酶或相關(guān)蛋白的啟動子(其可以是天然啟動子)來修飾宿主細(xì)胞。或者，基因修飾可以用于調(diào)控與靶基因同源的蛋白質(zhì)?？梢匀缦潞Y選包含經(jīng)修飾宿主菌抹的陣列，即表達(dá)感興趣的異源蛋白質(zhì)，并評估蛋白質(zhì)生成的質(zhì)量和/或數(shù)量，如下文所描述的。或者，可以獨立地將感興趣異源蛋白質(zhì)的分離物與自每個蛋白酶缺陷型宿主細(xì)胞群體收集的溶胞物一起溫育，并可以使用蛋白水解降解的水平來鑒定最佳的宿主細(xì)胞。在此實施方案中，最佳的宿主細(xì)胞群體是導(dǎo)致最少量異源蛋白質(zhì)降解的。如此，在一個實施方案中，來自最佳宿主細(xì)胞群體的溶胞物可以被降解了小于約50%的異源蛋白質(zhì)、小于約45%、小于約40%、小于約35%、小于約30%、小于約25%、小于約20%、小于約10%、小于約5%、小于約4%、約3%、約2%、約1%、或更少的所述蛋白質(zhì)。例示性的靶蛋白酶基因包括那些分類如下的蛋白酶氨肽酶；二肽酶；二肽基肽酶和三肽基肽酶；肽基二肽酶；絲氨酸型羧肽酶；金屬羧肽酶；半胱氨酸型羧肽酶；co肽酶；絲氨酸蛋白酶；半胱氨酸蛋白酶；天冬氨酸蛋白酶；金屬蛋白酶；或不明機(jī)制的蛋白質(zhì)。氨肽酶包括胞質(zhì)溶膠氨肽酶(亮氨酰氨肽酶)、膜丙氨酰氨肽酶、半胱氨酰氨肽酶、三肽氨肽酶、脯氨酰氨肽酶、精氨酰氨肽酶、谷氨酰氨肽酶、x-pro氨肽酶、細(xì)菌亮氨酰氨肽酶、嗜熱氨肽酶、梭菌氨肽酶、胞質(zhì)溶膠丙氨酰氨肽酶、賴氨酰氨肽酶、x-trp氨肽酶、色氨酰氨肽酶、曱硫氨酰氨肽酶、d—立體特異性氨肽酶、氨肽酶ey。二肽酶包括x-his二肽酶、x-arg二肽酶、x-曱基-his二肽酶、cys-gly二月太酶、glu-glu二月太酶、pro-x二月太酶、x-pro二月太酶、met-x二肽酶、非立體特異性二肽酶、胞質(zhì)溶膠非特異性二肽酶、膜二肽酶、卩-ala-his二肽酶。二肽基肽酶和三肽基肽酶包括二肽基肽酶i、二肽基肽酶ii、二肽基肽酶iii、二肽基肽酶iv、二肽基二肽酶、三肽基肽酶I、三肽基肽酶II。肽基二肽酶包括肽基二肽酶a和肽基二肽酶b。絲氨酸型羧肽酶包括溶酶體pro-x羧肽酶、絲氨酸型D-ala-D-ala羧肽酶、羧肽酶C、羧肽酶D。金屬羧肽酶包括羧肽酶a、羧肽酶B、賴氨酸(精氨酸)羧肽酶、gly-X羧肽酶、丙氨酸羧肽酶、胞壁酰五肽羧肽酶、羧肽酶h、谷氨酸羧肽酶、羧肽酶M、胞壁酰四肽羧肽酶、鋅d-ala-d-ala羧肽酶、羧肽酶A2、膜pro-x羧肽酶、微管蛋白基-tyr羧肽酶、羧肽酶t。w肽酶包括酰氨酰肽酶、肽基甘氨酰胺酶、焦谷氨酰肽酶I、(3-天冬氨酰肽酶、焦谷氨酰肽酶II、n-曱酰曱硫氨酰肽酶、蝶酰聚Y-谷氨酸羧肽酶、Y-glu-X羧肽酶、?；邗?ala肽酶。絲氨酸蛋白酶包括胰凝乳蛋白酶、胰凝乳蛋白酶c、metridin、胰蛋白酶、凝血酶、凝結(jié)因子Xa、纖溶酶、腸肽酶、頂體蛋白、a-溶解蛋白酶、谷氨酰內(nèi)肽酶、組織蛋白酶G、凝結(jié)因子viia、凝結(jié)因子ixa、cucumisi、脯氨酰寡肽酶、凝結(jié)因子xia、brachyurin、血漿激肽釋放酶、組織激肽釋放酶、胰彈性蛋白酶、白細(xì)胞彈性蛋白酶、凝結(jié)因子xiia、凝乳酶(chymase)、補(bǔ)體成分clr55、補(bǔ)體成分cls55、經(jīng)典補(bǔ)體途徑c3/c5轉(zhuǎn)化酶、補(bǔ)體因子I、補(bǔ)體因子D、旁路補(bǔ)體途徑c3/c5轉(zhuǎn)化酶、cerevisin、hypoderminC、賴泉醜內(nèi)狀酵、內(nèi)月太醉Ia、y-reni、venombinab、亮氨酰內(nèi)肽酶、類胰蛋白酶、scutelarin、kexin、枯草桿菌蛋白酶、水稻素、內(nèi)肽酶k、嗜熱霉菌素(thermomycolin)、thermitase、內(nèi)肽酶SO、T-纖溶酶原激活物、蛋白C、胰內(nèi)肽酶E、胰彈性蛋白酶ii、IGA特異性絲氨酸內(nèi)肽酶、U-纖溶酶原激活物、venombinA、弗林蛋白酶、成髓細(xì)胞蛋白酶、semenogelase、粒酶A或細(xì)胞毒性T-、淋巴細(xì)胞蛋白酶l、粒酶B或細(xì)胞毒性T-淋巴細(xì)月包蛋白酶2、streptogrisinA、treptogrisinB、谷氨酰內(nèi)肽酶II、寡肽酶B、鱟凝血因子c、鱟凝血因子、鱟凝固酶、omptin、阻抑物lexa、細(xì)菌前導(dǎo)肽酶I、togavirin、flavirin。半胱氨酸蛋白酶包括組織蛋白酶B、木瓜蛋白酶、無花果蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶、蘿摩蛋白酶、梭菌蛋白酶、streptopain、錒類(actinide)、組織蛋白酶l、組織蛋白酶H、鈣蛋白酶、組織蛋白酶t、甘氨酰內(nèi)月太酶、癌<足1是劑、纟且織蛋白酶S、picornain3C、picomain2A、caricain、ananain、莖干菠蘿蛋白酶、果實菠蘿蛋白酶、legumain、histolysain、白介素-卩轉(zhuǎn)化酶。天冬氨酸蛋白酶包括胃蛋白酶A、胃蛋白酶B、胃亞蛋白酶、凝乳酶(chymosin)、組織蛋白酶D、neopenthesin、腎素、retropepsin、阿黑皮素專爭4匕i酶(proopiomelanocortinconvertingenzyme)、曲霉胃蛋白酶I(aspergillopepsinI)、曲霉胃蛋白酶II(aspergillopepsinII)、青霉胃蛋白酶(penicillopepsin)、根霉胃蛋白酶(rhizopuspepsin)、內(nèi)座殼胃蛋白酶(cndodiiapepsh)、毛霉胃蛋白酶(mucorop印sin)、假絲酵母胃蛋白酶(candidapepsin)、糖胃蛋白酶(saccharopepsin)、紅酵母胃蛋白酶(rhodotomlapepsin)、絨泡菌胃蛋白酶(physaropepsin)、頂柱霉胃蛋白酶(acrocylindropepsin)、多孑L菌胃蛋白酶(polyporopepsin)、朱紅密孑L菌胃蛋白酶(pycnoporopepsin)、斗主霉胃蛋白酶a(scytalidopepsina)、斗主霉胃蛋白酶b(scytalidopepsinb)、黃色單胞菌胃蛋白酶(xanthomonapepsin)、組織蛋白酶e、屏障胃蛋白酶(barrierpepsin)、細(xì)菌前導(dǎo)肽酶I、假單胞菌胃蛋白酶(pseudomonapepsin)、plasmepsin。金屬蛋白酶包4舌衲脊蟲它〉容血素a(atrolysina)、微生物膠原酶、白細(xì)胞溶素、間質(zhì)膠原酶、中性溶酶、envelysin、iga特異性金屬內(nèi)肽酶、前膠原N-內(nèi)肽酶、甲拌磷寡肽酶、溶神經(jīng)素、溶基質(zhì)蛋白酶l、meprinA、前膠原C-內(nèi)肽酶、肽基-lys金屬內(nèi)肽酶、蝦紅素、溶基質(zhì)蛋白酉爭2、matrilysin明月交酶、氣單月包菌;容素(aeromonolysin)、pseudolysin、嗜熱菌蛋白酶、芽孢桿菌蛋白酶(bacillolysin)、金霉蛋白酶(aureolysin)、球菌蛋白酶(coccolysin)、真菌蛋白酶(mycolysin)、卩-溶解金屬內(nèi)肽酶、肽基-asp金屬內(nèi)肽酶、嗜中性粒細(xì)胞膠原酶、明膠酶B、利什曼原蟲蛋白酶(leishmanolysin)、saccharolysin、自〉容素、deuterolysin、沙雷氏菌蛋白酶(serralysin)、3內(nèi)脊蟲它;容血素B、衲脊蟲它溶血素C、atroxase、衲脊蟲它溶血素E、枘脊蛇溶血素F、adamalysin、horrilysin、mberlysin、bothropasin、bothrolysin、ophiolysin、trimerelysinI、trimerelysinII、mucrolysin、pitrilysin、insulysin、O-唾液酸糖蛋白內(nèi)肽酶(O-syaloglycoproteinendopeptidase)、russellysin、線粒體中間體肽酶、dactylysin、nardilysin、magnolysin、meprinB、纟戔4立體力口工月太酶、巨口苤細(xì)胞彈性蛋白酶、choriolysin、toxilysin。不明才幾制的蛋白酶包括thermopsin和多催化性內(nèi)肽酶復(fù)合物。表2:焚光假單胞菌菌株MB214蛋白酶類別家族RXF基因安排的功能天冬氨酸肽酶A8(信號肽酶1I家族)RXF05383.2脂蛋白信號肽酶(EC3.4.23.36)A24(IV型前菌毛蛋白肽酶家族)RXF05379.14型前菌毛蛋白肽酶pild(EC3.4.99,)半胱氨酸肽酶C15(焦谷氨酰肽酶I家族)RXF02161.1C40RXF01968.1RXF04920.1RXF04923.1C56(Pfpl內(nèi)肽酶家族)RXF01816.1金屬蛋白酶MlRXF08773.1M3RXF00561.2prlC吡咯烷酮羧酸肽酶(EC3.4.19.3)侵入相關(guān)蛋白，P60侵入相關(guān)蛋白，P60磷酸酶相關(guān)蛋白papq肽酶I(EC3.4,,)膜丙氨酸氨肽酶(EC3.4.11.2)寡肽酶A(EC3.4.24.70)位置細(xì)胞質(zhì)膜細(xì)胞質(zhì)膜胞質(zhì)的信號肽胞質(zhì)的信號肽非分泌的非分泌的胞質(zhì)的RXF04631.2Zn依賴性寡肽酶胞質(zhì)的M4(嗜熱菌蛋白酶家族)RXF05113.2胞外金屬蛋白酶前體(EC3.4.24.-)胞外的M41(FtsH內(nèi)肽酶家族)RXF05400.2細(xì)胞分裂蛋白ftsH(EC3.4.24,)細(xì)胞質(zhì)膜M10RXF04304.1沙雷氏菌蛋白酶(EC3.4.24,40)胞外的RXF04500.1沙雷氏菌蛋白酶(EC3.4.24.40)胞外的RXF01590.2沙雷氏菌蛋白酶(EC3.4.24.40)胞外的RXF04495.2沙雷氏菌蛋白酶(EC3.4.24.40)胞外的RXF02796.1沙雷氏菌蛋白酶(EC3.4.24.40)胞外的M14(羧肽酶A家族)RXF09091.1鋅羧肽酶前體(EC3.4.17.-)胞質(zhì)的M16(pitrilysin家族)RXF03441.1輔酶pqq合成蛋白F(EC3.4.99,)非分泌的RXF01918.1鋅蛋白酶(EC3.4.99,)信號肽RXF01919.1鋅蛋白酶(EC3.4.99,)周質(zhì)的RXF03699.2加工肽酶(EC3.4.24.64)信號肽M17(亮氨酰氨肽酶家族)RXF00285.2胞質(zhì)溶膠氨肽酶(EC3.4.11.1)非分泌的M18RXF07879.1天冬氨酰氨肽酶(EC3.4.11.21)胞質(zhì)的M20RXF00811.1dapE琥珀?；被狨グ|(zhì)的脫琥珀酰酶(EC3.5.1.18)RXF04052.2Xaa-His二肽酶(EC3.4.13.3)信號肽RXF01822.2羧肽酶G2前體(EC3.4.17.11)信號肽RXF09831.2::N-?；?L-氨基酸氨基信號肽RXF04892.1水解酶(EC3.5.1.14)M28(氨肽酶Y家族)RXF03488.2^4性磷酸酶同工酶轉(zhuǎn)化外膜20M42M22M23(谷氨酰氨肽酶家族)RXF05615.1RXF05817.1RXRB065.2RXF01291.2RXF03916.1RXF09147.2M24RXF04693.1RXF03364.1RXF02980.1RXF06564.1M48(Ste24內(nèi)狀酶家族)RXF05137.1RXF05081.1M50(S2P蛋白酶家族)RXF04692.1絲氨酸肽酶Sl(胰凝乳蛋白酶家族)RXF01250.2RXF07210.1S8(枯草桿菌蛋白酶家族)RXF06755.2RXF08517.1RXF08627.2RXF0628URXF08978.1RXF0645U蛋白前體(EC3.4.11,)去封閉氨肽酶(EC3.4.11,)細(xì)胞壁內(nèi)肽酶家族M23/M37與金屬內(nèi)肽酶相關(guān)的膜蛋白細(xì)胞壁內(nèi)肽酶家族M23/M37甲硫氨酸氨肽酶(EC3.4.11.18)曱石泉氨酸氨肽酶(EC3.4.11.18)Xaa-Pro氨肽酶(EC3.4.11.9)Xaa-Pro氨肽酶(EC3.4.1.9)熱休克蛋白HtpX鋅金屬蛋白酶(EC3.4.24,)膜金屬蛋白酶蛋白酶do(EC3.4.21,)蛋白酶do(EC3.4.21,)絲氨酸蛋白酶(EC3.4.21,)絲氨酸y菱白酶(EC3.4.21,)胞外絲氨酸蛋白酶(EC3.4.21,)胞外絲氨酸蛋白酶前體(EC3.4.21.-)胞外絲氨酸蛋白酶(EC3.4.21.-)絲氨酸蛋白酶(EC_非分泌的O-唾液酸糖蛋白內(nèi)肽酶(EC3.4.24.57)胞外的糖蛋白酶蛋白質(zhì)家族非分泌的信號肽信號肽信號肽胞質(zhì)的非分泌的胞質(zhì)的胞質(zhì)的細(xì)胞質(zhì)膜信號肽細(xì)胞質(zhì)膜周質(zhì)的周質(zhì)的非分泌的胞外的信號肽非分泌的外膜信號肽S9(脯氨酰寡肽酶家族)RXF02003.2蛋白酶ii(EC3.4.21.83)RXF00458.2水解酶Sll(D-Ala-D-Ala羧肽酶A家族)RXF04657.2D-丙氨酰-D-丙氨酸內(nèi)肽酶(EC3.4.99,)RXF00670.1D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶(EC3.4.16.4)S13(D-Ala-D-Ala肽酶C家族)RXF00133.1RXF04960.2S14(ClpP內(nèi)肽酶家族)RXF04567.1clpPRXF04663.1clpPS16(lon蛋白酶家族)RXF04653.2RXF08653.1RXF05943.1S24(LexA家族)RXF00449.1RXF03397.1S26(信號肽酶I家族)RXF01181.1S33RXF05236.1RXF04802.1RXF04808.2pip3piplPiP2D-丙氨酰內(nèi)消旋二氨基庚二酸酯內(nèi)肽酶(EC3.4,,)D-丙氨酰內(nèi)消^走二氨基庚二酸酯內(nèi)肽酶(EC3.4,,)ATP依賴性Clp蛋白酶蛋白水解亞基(EC3.4.21.92)ATP依賴性Clp蛋白酶蛋白水解亞基(EC3.4.21.92)ATP依賴性蛋白酶La(EC3.4.21.53)ATP依賴性蛋白酶La(EC3.4.21.53)ATP依賴性蛋白酶La(EC3.4.21.53)LexA阻抑物(EC3.4.21.88)LexA阻抑物(EC3.4.21.88)信號肽酶I(EC3.4.21.89)脯氨酸亞氨基肽酶(EC3.4.11.5)脯氨酸亞氨基肽酶(EC3.4.11.5)脯氨酸亞氨基肽酶(EC3.4.11.5)周質(zhì)的非分泌的周質(zhì)的細(xì)胞質(zhì)膜外膜外膜非分泌的胞質(zhì)的胞質(zhì)的胞質(zhì)的胞質(zhì)的非分泌的胞質(zhì)的細(xì)胞質(zhì)膜非分泌的非分泌的胞質(zhì)的S41(C端加工肽酶家族)RXH)6586.1尾部特異性蛋白酶(EC3.4.21,)信號肽RXF01037.1尾部特異性蛋白酶(EC3.4.21,)信號肽S45RXF07170.1pacB2青霉素?；?EC3.5丄11)信號肽RXF06399.2pacBl青霉素?；竔i(EC3.5丄11)信號肽S49(蛋白酶IV家族)RXF06993.2RXF01418.1S58(DmpA氨肽酶家族)RXF06308.2蘇氨酸肽#Tl(蛋白酶體家族)RXF01961.2hslVT3(Y-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶家族)RXF02342.1ggtlRXF04424.2ggt2未分類的肽酶U32RXF00428.1RXF02151.2U61RXF04715.2U62RXF04971.2pmbAPmbA蛋白胞質(zhì)的RXF04968.2TldD蛋白胞質(zhì)的非MEROP蛋白酶RXF00325.1阻抑物蛋白C2非分泌的RXF02689.2微粒體二肽酶(EC3.4.13.19)胞質(zhì)的RXF02739.1膜二肽酶(EC3.4.13.〗9)_信號肽可能的蛋白酶sohb(EC3.4,.-)非分泌的蛋白酶iv(EC3.4.-,)非分泌的D-氨肽酶(EC.3.4.11.19)細(xì)胞質(zhì)膜ATP依賴性蛋白酶hslV胞質(zhì)的(EC3.4.25,)1谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶家族(EC2.3.2.2)周質(zhì)的7-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶家族(EC2.3.2.2)周質(zhì)的蛋白酶(EC3.4.-,)胞質(zhì)的蛋白酶(EC3.4,.-)胞質(zhì)的胞壁酰四肽羧肽酶(EC3.4.17.13)非分泌的RXF03329.2假設(shè)的胞質(zhì)溶膠蛋白質(zhì)胞質(zhì)的RXF02492.1Xaa-Pro二肽酶(EC3.4.13.9)胞質(zhì)的RXF04047.2caax氨基端蛋白酶家族細(xì)胞質(zhì)膜RXF08136.2蛋白酶(轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶樣蛋白質(zhì))胞質(zhì)的RXF09487.1鋅金屬蛋白酶(EC3.4.24.-)非分泌的別的蛋白質(zhì)修飾酶在另一個實施方案中，靶基因包含牽涉正確的蛋白質(zhì)加工和/或修飾的基因。常見的修飾包括二硫鍵形成、糖基化、乙?；?、?；?、磷酸化、和，羧基化，它們都能調(diào)控蛋白質(zhì)折疊和生物學(xué)活性。數(shù)類牽涉蛋白質(zhì)加工的酶的非窮盡性列表參見表3。本領(lǐng)域技術(shù)人員會認(rèn)識到如何從表3中所列出的各類蛋白質(zhì)修飾酶中鑒定出在為陣列所選定的宿主細(xì)胞中有用的靶基因，或?qū)Ω信d趣異源蛋白質(zhì)有用的靶基因。靶基因可以是所利用宿主細(xì)胞內(nèi)源的，可以是衍生感興趣異源蛋白質(zhì)的生物體內(nèi)源的，或者可以是已知促進(jìn)異源表達(dá)的感興趣蛋白質(zhì)正確加工的。還認(rèn)識到，可以依照感興趣異源蛋白質(zhì)想要的規(guī)格來靶向任何牽涉蛋白質(zhì)生成的基因。_表3:牽涉蛋白質(zhì)加工的酶的類別__類別例子糖基轉(zhuǎn)移酶(EC2.4.1.18)ot-葡聚糖-分支糖基轉(zhuǎn)移酶酶促分支因子分支糖基轉(zhuǎn)移酶酶Q葡聚糖轉(zhuǎn)糖基酶糖原分支酶直鏈淀粉異構(gòu)酶植物分支酶a-1，4-葡聚糖a-1,4-葡聚糖-6-糖基轉(zhuǎn)移酶淀粉分支酶UDP-N-乙酰-D-半乳糖胺:多肽N-乙酰氨基半乳糖基轉(zhuǎn)移酶GDP-巖藻糖蛋白O-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶2<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>PPT-確酸酶PTP酶蛋白質(zhì)磷酸酶PTP磷酸酶用于調(diào)控耙基因表達(dá)的方法可以通過本領(lǐng)域中已知的任何技術(shù)來^f務(wù)飾陣列中的一個或多個宿主細(xì)胞群體，例如通過其中在基因組中敲除至少一種靶基因的技術(shù)，或者通過突變至少一種靶基因來降低該基因的表達(dá)，通過改變至少一種靶基因的至少一種啟動子來降低該靶基因的表達(dá)，或者通過在宿主基因組中(與感興趣的異源蛋白質(zhì)或多肽一起)共表達(dá)靶基因或靶基因的抑制物來實現(xiàn)。如上文所討論的，靶基因可以是陣列中的宿主細(xì)胞群體內(nèi)源的，或者可以是在每個宿主細(xì)胞群體中異源表達(dá)的?？梢酝ㄟ^例如向宿主群體的至少一個細(xì)胞中導(dǎo)入包含牽涉蛋白質(zhì)生成的一種或多種耙基因的表達(dá)栽體來提高靶基因的表達(dá)。還可以通過例如突變耙基因的啟動子來提高耙基因表達(dá)。表達(dá)異源蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞或生物體還可以進(jìn)行遺傳修飾以提高至少一種牽涉蛋白質(zhì)生成的靶基因的表達(dá)，和降低至少一種牽涉蛋白質(zhì)降解的靶基因的表達(dá)。基因組可以進(jìn)行修飾以調(diào)控一種或多種靶基因的表達(dá)，其通過在基因組中或在具有表達(dá)載體的宿主中包括外源基因或啟動子元件，通過增強(qiáng)特定靶基因產(chǎn)生mRNA或蛋白質(zhì)的能力，通過刪除或破壞靶基因或啟動子元件，或者通過降低靶基因產(chǎn)生mRNA或蛋白質(zhì)的能力來實現(xiàn)?？梢越?jīng)由例如替代、刪除("敲除")、共表達(dá)、或插入("敲入'，)技術(shù)來改變遺傳密碼，由此影響靶基因的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。還可以插入想要的蛋白質(zhì)或調(diào)節(jié)序列的別的基因，其調(diào)控現(xiàn)有靶序列的轉(zhuǎn)錄。基因組修飾宿主細(xì)胞的基因組可以經(jīng)由遺傳靶向事件來修飾，所述遺傳靶向事件可以通過插入或重組，例如同源重組來實現(xiàn)。同源重組指基于序列同源性的DNA重組過程。同源重組容許內(nèi)源基因中的位點特異性修飾，如此可以將新的變化工程化改造入基因組中(參見例如Radding(1982)Ann.Rev.Genet.16:405;美國專利號4，888,274)。可以為把基因座處的同源重組制備多種構(gòu)建體。通常，構(gòu)建體可以包括與所鑒定的基因座同源的至少10bp、20bp、30bp、40bp、50bp、70bp、100bp、500bp、lkbp、2kbp、4kbp、5kbp、10kbp、15kbp、20kbp、或50kbp的序列。確定靶基因序列的同源性程度可以牽涉多項考慮因素，諸如例如耙基因座的大小、序列的可得性、雙交換事件在靶基因座處的相對效率及耙序列與其它序列的相似性。經(jīng)修飾的基因可以包括如下序列，其中基本上同基因的DNA位于要修飾的基因組中相應(yīng)靶序列的想要的修列修飾側(cè)翼。"經(jīng)修飾的基因"是導(dǎo)入基因組中以改變蛋白酶或蛋白質(zhì)折疊調(diào)控物在宿主細(xì)胞中的表達(dá)的序列。"靶基因"是被經(jīng)修飾的基因替換的序列?；旧贤虻男蛄锌梢耘c相應(yīng)的靶序列(除想要的序列修飾外)至少約95%、97-98%、99.0-99.5%、99.6-99.9%、或100%相同。經(jīng)修飾的基因和被靶定的基因可以共享100%相同的至少約10、20、30、50、75、150或500個堿基對的DNA段?？梢栽O(shè)計核香酸構(gòu)建體來修飾內(nèi)源的靶基因產(chǎn)物。經(jīng)修飾的基因序列可以具有設(shè)計用于破壞所得基因產(chǎn)物的功能的一處或多處刪除、插入、替代或其組合。在一個實施方案中，改變可以是與靶基因的上游序列以符合閱讀框的方式融合的選擇標(biāo)志基因的插入。還可以使用插入失活來修飾基因組。在此實施方案中，通過在基因中重組抑制基因產(chǎn)物形成的序列來修飾基因組。此插入可以或是通過插入不同的元件來破壞基因，或是除去該基因的必需部分。在一個實施方案中，插入刪除還包括編碼對特定應(yīng)激物諸如抗生素的抗性或用于在特定培養(yǎng)基中生長(例如用于生成必需氨基酸)的基因的插入。還可以通過使用轉(zhuǎn)座子來修飾基因組，轉(zhuǎn)座子是能夠通過與同源重組無關(guān)的機(jī)制來在原核基因組中的位點處插入的遺傳元件。轉(zhuǎn)座子可以包括例如大腸桿菌中的Tn7、Tn5、或丁n10,金黃色葡萄球菌CS.awwM力中的Tn554，畐'j結(jié)核分枝桿菌(Mparam^rcw/o^)中的IS900,來自大西洋假單胞菌(尸化^fomomw必/a""c力的IS492,來自鏈霉菌(5^印to^yce》的ISl16及來自副結(jié)核分枝桿菌的IS900。認(rèn)為牽涉轉(zhuǎn)座的步驟包括切割轉(zhuǎn)座子末端以產(chǎn)生3，OH;鏈轉(zhuǎn)移，其中轉(zhuǎn)座酶集合轉(zhuǎn)座子3，OH暴露的末端和所鑒定的序列；及單步酯交換反應(yīng)以產(chǎn)生轉(zhuǎn)座子與所鑒定DNA的共價連接。一般而言，認(rèn)為由轉(zhuǎn)座酶所實施的關(guān)鍵反應(yīng)是產(chǎn)生切口或鏈交換，其余的過程由宿主酶完成。200880022208.6在一個實施方案中，如下提高靶基因或蛋白質(zhì)的表達(dá)或活性，即通過重組來將編碼靶蛋白的遺傳序列或其同系物摻入基因組中。在另一個實施方案中，將啟動子插入基因組中以增強(qiáng)靶基因或同系物的表達(dá)。在另一個實施方案中，通過用無活性的基因重組來降低靶基因或其同系物的表達(dá)或活性。在另一個實施方案中，可以經(jīng)由重組來將編碼不同基因的序列插入基因組中，所述不同基因在細(xì)胞中可以具有不同的功能，或者可以是報告基因諸如抗性標(biāo)志或其它方面可檢測的標(biāo)志基因。在又一個實施方案中，經(jīng)由重組來將靶基因的至少一部分的一個拷貝插入基因組中，所述靶基因的至少一部分在一個或多各位置進(jìn)行過突變。突變型靶基因可能不編碼蛋白質(zhì)，或者由該突變型基因編碼的蛋白質(zhì)可能變得無活性，活性可以進(jìn)行調(diào)控(升高或降低)，或者突變型蛋白質(zhì)在與天然蛋白質(zhì)比較時可以具有不同活性。存在有敲除細(xì)菌中的基因的策略，它們一般已經(jīng)在大腸桿菌中例示。一種路徑是將基因內(nèi)部DNA片段克隆入含有抗生素抗性基因(例如氨芐青霉素)的載體中。在經(jīng)由接合轉(zhuǎn)移、化學(xué)轉(zhuǎn)化或電穿孔來轉(zhuǎn)化細(xì)胞前(Puehler等(1984)AdvancedMolecularGeneticsNewYork,Heidelberg,Berlin,Tokyo,SpringerVerlag)，切除復(fù)制起點諸如無性繁殖質(zhì)粒復(fù)制起點(oriV基因座)，再連接剩余的DNA片段，并純化(Sambrook等(2000)Molecularcloning:Alaboratorymanual,第3版ColdSpringHarbor,N.Y"ColdSpringHarborLaboratoryPress)?；蛘撸梢允褂镁哂蠨NA復(fù)制起點的抗生素抗性質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化后，將細(xì)胞鋪板至例如含有合適的抗生素(例如200ug/mL氨芐青霉素)的LB瓊脂板上。在含有抗生素的板上生長的菌落假定經(jīng)歷了單一重組事件(Snyder,L.，W.Champness等(1997)MolecularGeneticsofBacteriaWashingtonDC，ASMPress),其導(dǎo)致整個DNA片段在同源基因座處整合入基因組中。通過例如診斷性PCR來對抗生素抗性細(xì)胞進(jìn)一步分析以證實已經(jīng)在想要的基因座處發(fā)生了想要的基因敲除(McPherson,M.J.，P.Quirke等(1991)PCR:APracticalApproachNewYork,OxfordUniversityPress)。這里，設(shè)計至少2種PCR引物一種在用于基因敲除構(gòu)建的DNA區(qū)以外雜交；而一種在剩余的質(zhì)粒主鏈內(nèi)雜交。具有正確大小的DNA片段的成功PCR擴(kuò)增繼而進(jìn)行DNA序列分析會證實在細(xì)菌染色體中的正確位置處已經(jīng)發(fā)生了基因敲除。然后可以通過例如SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳來分析新構(gòu)建的突變抹的表型(Simpson,R.J.(2003)ProteinsandProteomics-ALaboratoryManual.ColdSpringHarbor,N.Y"ColdSpringHarborLaboratoryPress)。產(chǎn)生基因敲除的一種備選路徑是通過使用溫度敏感性復(fù)制子，諸如pSC101復(fù)制子來促進(jìn)基因替換(Hamilton等(1989)JournalofBacteriology171(9):4617-22)。該方法通過染色體上的基因與DNA復(fù)制對溫度敏感的質(zhì)粒上攜帶的同源序列之間的同源重組來進(jìn)行。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入合適的宿主中后，有可能在44'C選擇質(zhì)粒進(jìn)入染色體中的整合。這些共整合物在3(TC的隨后生長導(dǎo)致第二次重組事件，導(dǎo)致它們的拆分。取決于第二次重組事件發(fā)生的位置，染色體會經(jīng)歷基因替換或保留基因的初始拷貝。已經(jīng)開發(fā)了其它策略來抑制特定基因產(chǎn)物的表達(dá)。例如，已經(jīng)廣泛地開發(fā)RNA干擾(RNAi)(特別是使用小干擾RNA(siRNA)的)來降低或者甚至消除特定基因產(chǎn)物的表達(dá)。siRNA是短的、雙鏈RNA分子，其可以靶向互補(bǔ)mRNA以進(jìn)行降解。RNAi是如下現(xiàn)象，其中雙鏈RNA的導(dǎo)入抑制同源基因的表達(dá)。dsRNA分子在體內(nèi)被減小至21-23ntsiRNA,其是RNAi效應(yīng)的介導(dǎo)物。導(dǎo)入后，雙鏈RNA被稱作Dicer的RNA酶III樣酶加工成20-25個核苷酸的siRNA(起始步驟)。然后，siRNA裝配成稱為RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC)的含有內(nèi)切核糖核酸酶的復(fù)合物，其在該方法中解旋。隨后，siRNA鏈引導(dǎo)RISC至互補(bǔ)的RNA分子，在那里它們切割并破壞關(guān)聯(lián)RNA(效應(yīng)器步驟)。對關(guān)聯(lián)RNA的切割在由siRNA鏈結(jié)合的區(qū)域的中部附近發(fā)生。已經(jīng)成功使用RNAi來降低多種生物體中的基因表達(dá)，包括斑馬魚、線蟲(秀麗隱桿線蟲(C.e/ega似))、昆蟲(黑腹果蟲黽(DraTO//w7awe/awogaWer))、、;咼蟲(planaria)、刺月包動物(cnidaria)、4,蟲(trypanosome)、小鼠和哺乳動物纟田月包。還可以通過突變編碼靶基因的可讀框中的一個或多個核苷酸來修飾基因組。用于遺傳突變的技術(shù)(例如定點誘變)是本領(lǐng)域中公知的。一些辦法聚焦于在染色體DNA中產(chǎn)生隨機(jī)突變，諸如那些由X射線和化學(xué)品誘導(dǎo)的。共表達(dá)在一個實施方案中，可以通過包括一種或多種編碼靶基因的載體來修飾宿主細(xì)胞中的一種或多種靶基因以促進(jìn)靶基因與異源蛋白質(zhì)或肽的共表達(dá)。在另一個實施方案中，通過為靶基因增強(qiáng)啟動子，包括通過向宿主細(xì)胞基因組添加外源啟動子來#"飾宿主細(xì)胞。在另一個實施方案中，通過包括一種或多種編碼靶基因抑制劑(諸如蛋白酶抑制劑)的載體來修飾宿主細(xì)胞中的一種或多種靶基因以抑制靶蛋白酶的活性。此類抑制劑可以是限制耙基因表達(dá)的反義分子、耙基因的輔因子或靶基因的同系物。一般而言，反義用于指具有與靶基因的至少一部分互補(bǔ)的序列的核酸分子。另外，抑制劑可以是干擾RNA或編碼干擾RNA的基因。在真核生物體中，此類干擾RNA可以是小干擾RNA或核酶，如記載于例如Fire，A.等(1998)Nature391:806-11,Elbashir等(2001)Genes&Development15(2):188-200,Elbashir等(2001)Nature411(6836):494-8，CarnegieInstitute的美國專利號6,506，559，Benitec的6,573,099,WhiteheadInst.的美國專利申請?zhí)?003/0108923，和2003/0114409,PCT開文本號WO03/006477,WO03/012052,WO03/023015,WO03/056022,WO03/064621和WO03/070966的。抑制劑還可以是另一種蛋白質(zhì)或肽。抑制劑可以是例如具有靶蛋白質(zhì)共有序列的肽。抑制劑還可以是能在宿主中生成靶蛋白質(zhì)的直接或間接抑制分子的蛋白質(zhì)或肽。例如，蛋白酶抑制劑可以包括阿嗎他定(Amastatin)、E-64、抗痛素(Antipain)、彈性蛋白酶抑制劑(Elastatinal)、APMSF、亮抑酶肽(Le叩eptin)、笨丁抑制素(Bestatin)、胃蛋白酶抑制劑(Pepstatin)、芐脒(Benzamidine)、1,10-菲咯啉(Phe廳throline)、糜凝乳蛋白酶抑制劑(Chymostatin)、磷酸阿米酮(Phosphoramidon)、3,4-二氯異香豆素(dichloroisocoumarin)、TLCK、DFP、TPCK。迄今為止已經(jīng)鑒定出超過IOO種天然存在的蛋白質(zhì)蛋白酶抑制劑。它們已經(jīng)在從細(xì)菌至動物和植物的多種生物體中分離。它們表現(xiàn)為蛋白酶的緊密結(jié)合的、可逆的或假不可逆的抑制劑，經(jīng)由位阻來阻止底物接近活性位點。它們的大小也是極端易變的，從50個殘基(例如BPTI:牛胰腺胰蛋白酶抑制劑)至多達(dá)400個殘基(例如a-lPI:a-l蛋白酶抑制劑)。除經(jīng)由分子阱機(jī)制結(jié)合和抑制大多數(shù)蛋白酶的a-巨球蛋白家族的蛋白質(zhì)(例如ot-2巨球蛋白)外，它們是嚴(yán)格類別特異性的。可以將外源載體或DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞中。用于用外源核酸分別轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)化真核細(xì)胞和原核細(xì)胞的技術(shù)是本領(lǐng)域中公知的。這些可以包括脂嚢泡介導(dǎo)的攝取、磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(磷酸鈣/DNA共沉淀)、病毒感染(特別是使用經(jīng)修飾的病毒諸如例如經(jīng)修飾的腺病毒的)、顯微注射和電穿孔。對于原核轉(zhuǎn)化，技術(shù)可以包括熱休克介導(dǎo)的攝取、與完整細(xì)胞的細(xì)菌原生質(zhì)體融合、顯微注射和電穿孔。用于植物轉(zhuǎn)化的技術(shù)包括土壤桿菌(Agrobacterium)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移(諸如通過根瘤土i裏桿菌(A^me/ac^ra)實現(xiàn)的)、被快速推進(jìn)的鴒或金微粒、電穿孔、顯微注射和聚乙二醇介導(dǎo)的攝取。DNA可以是單鏈的或雙鏈的、線性的或環(huán)狀的、；松弛的或超螺旋的DNA。對于用于轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞的多種技術(shù)，參見例如Keown等(1990)ProcessesinEnzymology第185巻，第527頁-第537頁?？梢詷?gòu)建編碼靶基因或其增強(qiáng)劑或抑制劑的表達(dá)構(gòu)建體，如下文關(guān)于包含感興趣的異源蛋白質(zhì)或多肽的表達(dá)構(gòu)建體所描述的。例如，構(gòu)建體可以含有一個或超過一個內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(IRES)。構(gòu)建體還可以含有與如下核酸序列可操作連接的啟動子，所述核酸序列編碼靶基因的至少一部分、或靶基因的輔因子、靶基因的至少一部分的突變型式、或(在一些實施方案中)耙基因的抑制劑?；蛘撸瑯?gòu)建體可以是無啟動子的。在構(gòu)建體不被設(shè)計成摻入細(xì)胞DNA/基因組中的情況中，載體通常含有至少一種啟動子元件。在核酸序列外，表達(dá)載體還可以含有選擇標(biāo)志序列。表達(dá)構(gòu)建體可以進(jìn)一步含有轉(zhuǎn)錄起始、終止的位點和/或核糖體結(jié)合位點?？梢詫⒔?jīng)鑒定的構(gòu)建體插入任何原核或真核細(xì)胞中，并可以在其中進(jìn)行表達(dá)，包括但不限于細(xì)菌細(xì)胞(諸如熒光假單胞菌或大腸桿菌)、酵母細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞(諸如CHO細(xì)胞)、或植物細(xì)胞?？梢砸勒毡绢I(lǐng)域中已知的方法來制備構(gòu)建體。可以裝配多種片段，導(dǎo)入合適的載體中，克隆，分析，然后進(jìn)一步操作，直至已經(jīng)實現(xiàn)了想要的構(gòu)建體?？梢詫π蛄羞M(jìn)行多種修飾，以便容許限制性分析、切割、探針鑒定等。根據(jù)需要，可以導(dǎo)入沉默突變。在各個階段，可以采用限制性分析、測序、用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進(jìn)行的擴(kuò)增、引物修復(fù)、體外誘變等。用于摻入抗生素抗性基因和負(fù)選擇因子的方法對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會是熟悉的(參見例如WO99/15650;美國專利號6,080,576;美國專利號6,136,566;Niwa等，J.Biochem.113:343-349(1993);及Yoshida等，TransgenicResearch,4:277-287(1995))?？梢允褂眉?xì)菌載體來制備構(gòu)建體，包括原核復(fù)制系統(tǒng)，例如可被原核細(xì)胞諸如焚光假單胞菌或大腸桿菌識別的起點?？梢圆捎门c要用于插入的標(biāo)志物相同或不同的標(biāo)志物，其可以在導(dǎo)入宿主細(xì)胞中前除去。一旦完成了含有該構(gòu)建體的載體，便可以對它進(jìn)一步操作，諸如通過某些序列的刪除、線性化、或者通過將突變、刪除或其它序列導(dǎo)入同源序列中來進(jìn)行。在一個實施方案中，靶基因構(gòu)建體和異源蛋白質(zhì)構(gòu)建體是同一表達(dá)載體的部分，并且可以是或者不是在同一啟動子元件的控制下的。在另一個實施方案中，它們在分開的表達(dá)載體上。最終的操作后，可以將構(gòu)建體導(dǎo)入細(xì)胞中。細(xì)胞生長條件本文中所描述的宿主細(xì)胞的細(xì)胞生長條件包括促進(jìn)感興趣的蛋白質(zhì)在陣列中的至少一種菌林(或其至少一定比例的細(xì)胞)中的表達(dá)的、和/或促進(jìn)所表達(dá)的感興趣蛋白質(zhì)的發(fā)酵的。如本文中所使用的，術(shù)語"發(fā)酵"包括采用字面上的發(fā)酵的實施方案和釆用其它非發(fā)酵培養(yǎng)模式的實施方案兩者?？梢砸匀魏我?guī)模實施陣列中的宿主細(xì)胞群體的生長、維持、和/或發(fā)酵。然而，若同時篩選多個宿主細(xì)胞群體，則所述規(guī)模會由不同群體的數(shù)目和培養(yǎng)和測試多個宿主細(xì)胞群體的能力所限制。在一個實施方案中，發(fā)酵培養(yǎng)基可以自豐富培養(yǎng)基、基本培養(yǎng)基、和礦物鹽培養(yǎng)基中選擇。在另一個實施方案中，選擇基本培養(yǎng)基或礦物鹽培養(yǎng)基。在又一個實施方案中，選4奪基本培養(yǎng)基。在又一個實施方案中，選擇礦物鹽培養(yǎng)基。礦物鹽培養(yǎng)基由礦物鹽和碳源(諸如例如葡萄糖、哀糖、或甘油)組成。礦物鹽培養(yǎng)基的例子包括例如M9培養(yǎng)基、假單胞菌培養(yǎng)基(ATCC179)、Davis和Mingioli培養(yǎng)基(參見BDDavis和ESMingioli(1950)J.Bact.60:17-28)。用于構(gòu)成礦物鹽培養(yǎng)基的礦物鹽包括那些自例如磷酸鉀、硫酸銨或氯化銨、硫酸鎂或氯化鎂、和痕量礦物(諸如氯化4丐，硼酸鹽，及鐵、銅、錳和鋅的硫酸鹽)之中選擇的。礦物鹽培養(yǎng)基中不包括有機(jī)氮源，諸如蛋白胨、胰蛋白胨、氨基酸、或酵母提取物。使用無機(jī)氮源代替，并且這可以自例如銨鹽、氨水、和氨氣中選擇。一種優(yōu)選的礦物鹽培養(yǎng)基會含有作為碳源的葡萄糖。與礦物鹽培養(yǎng)基相比，基本培養(yǎng)基也可以含有礦物鹽和碳源，但是可以補(bǔ)充有例如低水平的氨基酸、維生素、蛋白胨、或其它成分，雖然這些以極低水平添力口。在一個實施方案中，可以使用下文表4中所列出的成分來制備培養(yǎng)基?？梢砸匀缦马樞蛱砑痈鞒煞质紫瓤蓪?NH4)HP04、KH2P04和檸檬酸溶解于約30L蒸餾水中；然后可添加痕量元素的溶液，接著添加消泡劑，諸如UcolubN115。然后，熱滅菌(諸如于約121。C)后，可以添加葡萄糖、MgS04和鹽酸硫胺素的無菌溶液。可以使用氨水來將pH控制在約6.8。然后可添加無菌蒸餾水來將起始體積調(diào)至371減去甘油原液(123mL)?；瘜W(xué)品可以購自多個供應(yīng)商，諸如Merck。表4:培養(yǎng)基組成成分起始濃度KH2P04(NH4)2HP044.ogr1檸檬酸i.7grMgS04-7H20i.2gr1痕量金屬溶液10mlr1鹽酸;克胺素4.5mg1"葡萄糖-H2027.3gr1消泡劑UcolubN1150.1mlr1補(bǔ)料溶液MgS04-7H20i9.7gr1葡萄糖-H20770gr1NH323g痕量金屬溶液6g1"檸檬酸鐵(III)1.5gr1MnCl2-4H200.8gI-1ZmCH2COOI2-2H200.3gr1H3B030.25gl扁1Na2Mo04-2H200.25g廠1CoCl26H200.15gl—1CuCl22H200.84gl—1乙4掌二次氮基四乙酸Na2鹽2H20(TritriplexIII，Merck)在本發(fā)明中，在容許宿主細(xì)胞生存的溫度范圍內(nèi)，優(yōu)選于約4。C-約55。C的范圍內(nèi)(包括端點)的溫度實施經(jīng)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的生長、培養(yǎng)和/或發(fā)酵。如此，例如如本文中關(guān)于本發(fā)明宿主細(xì)胞所使用的，術(shù)語"生長"、"培養(yǎng)"和"發(fā)酵"內(nèi)在地指約4。C-約55。C的溫度范圍內(nèi)(包括端點)的"生長"、"培養(yǎng)"和"發(fā)酵"。另外，"生長"用于指明活躍的細(xì)胞分裂和/或擴(kuò)大的生物學(xué)狀態(tài)以及非分裂和/或非擴(kuò)大的細(xì)胞在新陳代謝方面得到維持的生物學(xué)狀態(tài)兩者，術(shù)語"生長"的后一種應(yīng)用與術(shù)語"維持"同義。維持?？梢愿鶕?jù)選定宿主細(xì)胞的已知生長要求，容易地選擇此類正常生長溫度。優(yōu)選地，培養(yǎng)物建立期間，及特別是篩選過程期間，在用感興趣的異源蛋白質(zhì)或多肽轉(zhuǎn)化之前和之后，將細(xì)胞培養(yǎng)物在適合于選定細(xì)胞生長的受控C(VN2濕度中溫育?？刂茰赜臐穸纫允箒碜耘囵B(yǎng)器皿的蒸發(fā)最小化，并容許較小體積的使用。作為控制濕度的替代/在控制濕度之外，可以用蓋子覆蓋器皿，以便使蒸發(fā)最小化。溫育溫度的選擇主要取決于所利用宿主細(xì)胞的身份?？刂普舭l(fā)的百分比濕度的選擇基于選定的器皿體積和器皿中細(xì)胞培養(yǎng)物的濃度和體積，以及溫育溫度。如此，濕度可以自約10%變化至約80%。應(yīng)當(dāng)理解，合適條件的選擇完全在本領(lǐng)域的技術(shù)范圍內(nèi)。篩選可以對本文中所描述的菌抹陣列篩選其中要表達(dá)感興趣的異源蛋白質(zhì)的最佳宿主細(xì)胞群體。可以根據(jù)所表達(dá)的感興趣蛋白質(zhì)的數(shù)量、質(zhì)量、和/或位置來鑒定或選擇最佳的宿主細(xì)胞群體。在一個實施方案中，最佳的宿主細(xì)胞群體是如下的，其與陣列中表型獨特的宿主細(xì)胞的其它群體相比導(dǎo)致宿主細(xì)胞內(nèi)感興趣蛋白質(zhì)或多肽的產(chǎn)量升高。或者，升高的生成可以是每克所生成蛋白質(zhì)或每克宿主蛋白質(zhì)中正確加工的蛋白質(zhì)或多肽的水平升高。升高的生成還可以是每克異源蛋白質(zhì)或每克宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)中所產(chǎn)生的可回收蛋白質(zhì)或多肽的水平升高。升高的生成還可以是下列各項的任意組合總蛋白質(zhì)的水平升高、正確加工或正確折疊的蛋白質(zhì)的水平升高、或者有活性的或可溶性的蛋白質(zhì)的水平升高。在此實施方案中，術(shù)語"升高的"或"改善的"是相對于在陣列中一個或多個其它宿主細(xì)胞群體中表達(dá)感興趣蛋白質(zhì)或多肽時生成的、正確加工的、可溶性的、和/或可回收的蛋白質(zhì)或多肽的水平而言的。升高的生成可以通過例如降低能量消耗、提高可用資源的使用、或降低對生長培養(yǎng)基中生長補(bǔ)充物的要求而優(yōu)化細(xì)胞或生物體的效率。升高的生成還可以是對所表達(dá)蛋白質(zhì)的蛋白水解降解降低的結(jié)果。在一個實施方案中，陣列中的至少一種菌抹生成至少0.1mg/ml正確加工的蛋白質(zhì)。正確加工的蛋白質(zhì)具有天然蛋白質(zhì)的氨基端。在另一個實施方案中，至少一種菌抹在細(xì)胞中生成0.1-10mg/ml正確加工的蛋白質(zhì)，包括至少約0.2、約0.3、約0.4、約0.5、約0.6、約0.7、約0.8、約0.9或至少約1.0mg/ml正確加工的蛋白質(zhì)。在另一個實施方案中，由陣列中的至少一種菌抹所生成的總的正確加工的感興趣蛋白質(zhì)或多肽是至少1.0mg/ml、至少約2mg/ml、至少約3mg/ml、約4mg/ml、約5mg/ml、約6mg/ml、約7mg/ml、約8mg/ml、約1Omg/ml、約15mg/ml、約20mg/ml、約25mg/ml、約30mg/ml、約35mg/ml、約40mg/ml、約45mg/ml、至少約50mg/ml、或更大。在一些實施方案中，所生成的正確加工的蛋白質(zhì)的量是正確加工形式的總的異源蛋白質(zhì)的至少約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、至少約99%、或更多。感興趣蛋白質(zhì)或多肽的改善的表達(dá)還可以指蛋白質(zhì)的溶解度升高。可以生成感興趣的蛋白質(zhì)或多肽，并自宿主細(xì)胞的胞質(zhì)、周質(zhì)或胞外培養(yǎng)液回收。蛋白質(zhì)或多肽可以是可溶性的或不溶性的。蛋白質(zhì)或多肽可以包括一種或多種靶向(例如信號或前導(dǎo))序列或幫助純化的序列，如上文所討論的。如本文中所使用的，術(shù)語"可溶性的"指在生理學(xué)條件下的緩沖液中旋轉(zhuǎn)10-30分鐘時不被約5,000和20,000x重力之間的離心沉淀的蛋白質(zhì)?？扇苄缘鞍踪|(zhì)不是包含體或其它沉淀塊的一部分。類似地，"不溶性的"指在生理學(xué)條件下的緩沖液中旋轉(zhuǎn)10-30分鐘時能被5，000和20,000x重力之間的離心沉淀的蛋白質(zhì)或多肽。不溶性蛋白質(zhì)或多肽可以是包含體或其它沉淀塊的一部分。術(shù)語"包含體"意圖包括細(xì)胞內(nèi)含有的任何胞內(nèi)體，其中已經(jīng)隔離蛋白質(zhì)或多肽的聚集體。在另一個實施方案中，最佳的宿主細(xì)胞群體生成增加量的感興趣蛋白質(zhì)，其被轉(zhuǎn)運至宿主細(xì)胞的周質(zhì)或者被分泌入胞外間隙中。在一個實施方案中，陣列中的至少一種菌抹在周質(zhì)區(qū)室中生成至少0.1mg/ml蛋白質(zhì)。在另一個實施方案中，至少一種菌抹在細(xì)胞中生成0.1-10mg/ml周質(zhì)蛋白質(zhì)，或至少約0.2、約0.3、約0.4、約0.5、約0.6、約0.7、約0.8、約0.9或至少約1.0mg/ml周質(zhì)蛋白質(zhì)。在一個實施方案中，由陣列中的至少一種菌株所生成的總的感興趣蛋白質(zhì)或多肽是至少1.0mg/ml、至少約2mg/ml、至少約3mg/ml、約4mg/ml、約5mg/ml、約6mg/ml、約7mg/ml、約8mg/ml、約10mg/ml、約15mg/ml、約20mg/ml、至少約25mg/ml、或更大。在一些實施方案中，所生成的周質(zhì)蛋白質(zhì)的量是所生成的總的感興趣蛋白質(zhì)或多肽的至少約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、或更多。本發(fā)明陣列中的至少一種菌株還可以導(dǎo)致感興趣蛋白質(zhì)或多肽的產(chǎn)率升高。在一個實施方案中，至少一種菌抹生成占總的細(xì)胞蛋白質(zhì)(tcp)至少約5%、至少約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、或更大的感興趣蛋白質(zhì)或多肽。"百分比總的細(xì)胞蛋白質(zhì)"是宿主細(xì)胞中蛋白質(zhì)或多肽的量占聚集細(xì)胞蛋白質(zhì)的百分比。用于測定百分比總的細(xì)胞蛋白質(zhì)的方法在本領(lǐng)域中是公知的。在一個具體的實施方案中，在礦物鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)(即于約4。C-約55。C的溫度范圍內(nèi)，包括約10。C、約15。C、約20。C、約25。C、約30。C、約35。C、約40。C、約45。C、和約50。C)時，陣列中的至少一個宿主細(xì)胞群體可以具有至少1%tcp的異源蛋白質(zhì)生成水平和至少40mg/ml的細(xì)胞密度。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，在礦物鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)(即于約4。C-約55。C的溫度范圍內(nèi)，包括端點)時，表達(dá)系統(tǒng)會具有至少5。/。tcp的蛋白質(zhì)或多肽表達(dá)水平和至少40g/L的細(xì)胞密度。實踐中，通常在培養(yǎng)基中找到靶向至周質(zhì)的異源蛋白質(zhì)(參見歐洲專利號EP0288451)，這可能是由于對細(xì)胞外膜的破壞或細(xì)胞外膜流動性的增加。這種"被動"分泌的速率可以通過使用透化細(xì)胞外膜的多種機(jī)制來提高，包括大腸桿菌素(Miksch等(1997)Arch.Microbiol.167:143-150);生長速率(Shokri等(2002)AppMiocrobiolBiotechnol58:386-392);TolIII過表達(dá)(Wan和Baneyx(1998)ProteinExpressionPurif.14:13-22);纟田菌素釋放蛋白(Hsiung等(1989)Bio/Technology7:267-71);大腸桿菌素A溶解蛋白(Lloubes等(1993)Biochimie75:451-8)突變體，其泄露周質(zhì)蛋白質(zhì)(Furlong和Sundstrom(1989)DevelopmentsinIndus.Microbio.30:141-8);禹蟲合酉己4禺(Jeong禾口Lee(2002)Appl.Environ.Microbio.68:4979-4985);或通過滲壓震擾進(jìn)行的回收(Taguchi等(1990)BiochimicaBiophysicaActa1049:278-85)。工程化蛋白質(zhì)向周質(zhì)間隙的轉(zhuǎn)運(隨后定位于培養(yǎng)基中)已經(jīng)用于在大腸桿菌中生成正確折疊的且有活性的蛋白質(zhì)(Wan和Baneyx(1998)ProteinExpressionPurif.14:13-22;Simmons等(2002)J.Immun.Meth.263:133-147;Lundell等(1990)J.Indust.Microbio.5:215-27)。該方法還可以包括自周質(zhì)或自胞外培養(yǎng)液純化感興趣蛋白質(zhì)或多肽的步驟。異源蛋白質(zhì)或多肽可以以如下方式表達(dá)，其中它被連接至標(biāo)簽蛋白，而且可以自細(xì)胞或胞外培養(yǎng)液純化"帶有標(biāo)簽的"蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，感興趣蛋白質(zhì)或多肽也可以由陣列中的至少一種菌抹以活性形式生成。術(shù)語"有活性的，，指生物學(xué)活性的存在，其中所述生物學(xué)活性與相應(yīng)的天然蛋白質(zhì)或多肽的生物學(xué)活性相當(dāng)或基本上對應(yīng)。在蛋白質(zhì)的背景中，這通常意味著多核苷酸或多肽包含在使用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)衡量時與相應(yīng)的天然蛋白質(zhì)或多肽相比具有至少約20%、約50%、優(yōu)選至少約60-80%、最優(yōu)選至少約90-95%活性的生物學(xué)功能或效應(yīng)。然而，在一些實施方案中，可能希望生成具有與天然蛋白質(zhì)相比改變的或改善的活性的多肽(例如具有改變的或改善的免疫反應(yīng)性、底物特異性等的)。改變的或改善的多肽可以源自由陣列的一個或多個宿主細(xì)胞群體所產(chǎn)生的特定構(gòu)象?？梢岳锰囟ǖ鞍踪|(zhì)或多肽相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)靶向比較生物學(xué)測定法來實施蛋白質(zhì)或多肽活性測定，所述測定法可以用于評估生物學(xué)活性。與本發(fā)明陣列中的一種或多種其它菌林相比，最佳的宿主菌抹中還可改善有活性的感興趣蛋白質(zhì)或多肽的回收?；钚缘鞍踪|(zhì)可具有衍生該序列的天然蛋白質(zhì)或多肽的比活的至少約20。/。、至少約30%、至少約40%、約50%、約60%、至少約70%、約80%、約90%、或至少約95%的比活。此外，任選地，底物特異性(k^/Km)基本上類似于天然蛋白質(zhì)或多肽。通常，k^/Km會是至少約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、至少約90%、至少約95%、或更大。測定和量化蛋白質(zhì)和多肽活性和底物特異性(k^/Km)的度量的方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的。蛋白質(zhì)活性的測量異源表達(dá)的感興趣蛋白質(zhì)或多肽的活性可以與先前建立的天然蛋白質(zhì)或多肽標(biāo)準(zhǔn)活性進(jìn)行比較?；蛘?，感興趣蛋白質(zhì)或多肽的活性可以在同時的、或基本上同時的比較測定法中與天然蛋白質(zhì)或多肽一起測定。例如，可以使用體外測定法來測定感興趣蛋白質(zhì)或多肽與靶物之間(例如所表達(dá)的酶與底物之間，所表達(dá)的激素與激素受體之間，所表達(dá)的抗體與抗原之間等)的任何可檢測的相互作用。此檢測可包括量熱變化、增殖變化、細(xì)胞死亡、細(xì)胞排斥、放射性變化、溶解度變化、通過凝膠電泳和/或凝膠排阻方法所測量的分子量變化、磷酸化能力、抗體特異性測定法(諸如ELISA測定法)等的測量。另外，體內(nèi)測定法包括但不限于用于檢測與天然蛋白質(zhì)或多肽的生理學(xué)效應(yīng)相比異源表達(dá)的蛋白質(zhì)或多肽的生理學(xué)效應(yīng)(例如重量增加、電解質(zhì)平衡的變化、血液凝固時間的變化、凝塊溶解的變化和抗原應(yīng)答的誘導(dǎo))的測定法。一般而言，可以使用任何體外或體內(nèi)測定法來測定容許與天然蛋白質(zhì)或多肽進(jìn)行比較分析的感興趣蛋白質(zhì)或多肽的活性本質(zhì)，只要此類活性是可測定的。或者，可以對本發(fā)明陣列的至少一種菌抹中所生成的蛋白質(zhì)或多肽測定刺激或抑制蛋白質(zhì)或多肽和通常與所述蛋白質(zhì)或多肽相互作用的分子(例如信號途徑中通常與天然蛋白質(zhì)相互作用的成分或底物)之間的相互作用的能力。此類測定法通?？梢园ㄈ缦虏襟E，即在容許感興趣蛋白質(zhì)或多肽與靶分子相互作用的條件下組合蛋白質(zhì)與底物分子，并檢測蛋白質(zhì)與靶分子相互作用的生化后果?？捎糜跍y定蛋白質(zhì)或多肽活性的測定法記載于例如Ralph，P.J.等(1984)J.Immunol.132:1858或Saiki等(1981)J.Immunol.127:1044;Steward,W.E.II(1980)TheInterferonSystems.Springer-Verlag,Vienna和NewYork;Broxmeyer,H.E.等(1982)Blood60:595;MolecularCloning:ALaboratoryManua",第2版:ColdSpringHarborLaboratoryPress,Sambrook,J.，E.RFritsch和T.Maniatis編，1989;及MethodsinEnzymology:GuidetoMolecularCloningTechniques,AcademicPress,Berger,S.L.和A.R.Kimmel編,1987;AKPatra等，ProteinExprPurif，18(2):p/182-92(2000);Kodama等，J.Biochem.99:1465-1472(1986);Stewart等,Proc.Nat，lAcad.Sci.USA90:5209-5213(1993);Lombillo等，丄CellBiol.128:107-115(1995);Vale等，Cell42:39-50(1985)。活性可以在自陣列中的一個或多個其它宿主細(xì)胞群體衍生的異源表達(dá)的蛋白質(zhì)的樣品之間比較，和/或可以與天然蛋白質(zhì)的活性比較?？梢詫Ψ蛛x的蛋白質(zhì)實施活性測量，或者可以在宿主細(xì)胞中在體外實施活性測量。在另一個實施方案中，可以通過在例如常規(guī)的顯微鏡、光度計、或讀板儀上的熒光或分光術(shù)測量來在培養(yǎng)物中直接監(jiān)測蛋白質(zhì)生成和/或活性。若感興趣的蛋白質(zhì)是其底物已知的酶，則將該底物添加至培養(yǎng)基，其中在底物被酶轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物時發(fā)出焚光信號。在一個實施方案中，編碼感興趣異源蛋白質(zhì)或多肽的表達(dá)構(gòu)建體進(jìn)一步編碼報告蛋白。通過"報告蛋白"指如下蛋白質(zhì)，即通過其在細(xì)胞中或在細(xì)胞上的存在或在培養(yǎng)液中分泌時容許區(qū)分該細(xì)胞與不含報告蛋白的細(xì)胞。感興趣異源蛋白質(zhì)的生成導(dǎo)致宿主細(xì)胞群體可檢測的變化。報告分子可以是螢火蟲螢光素酶和GFP或任何其它焚光分子，以及(3-半乳糖苷酶基因((3.gal)及氯霉素和乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(CAT)。用于連同這些報告基因元件之每一種所產(chǎn)生的表達(dá)的測定法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。報告基因可以編碼可檢測的蛋白質(zhì)或可間接檢測的蛋白質(zhì)，或者報告基因可以是存活基因。在一個優(yōu)選的實施方案中，報告蛋白是可檢測的蛋白質(zhì)。"可檢測的蛋白質(zhì)"或"檢測蛋白"(由可檢測的基因或檢測基因編碼的)是能作為直接標(biāo)記物使用的蛋白質(zhì)；即該蛋白質(zhì)在不進(jìn)行進(jìn)一步操作的情況中就是可檢測的(且優(yōu)選地，包含可檢測蛋白質(zhì)的細(xì)胞是可檢測的)。如此，在此實施方案中，報告基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物自身可以用來區(qū)分表達(dá)可檢測基因的細(xì)胞。在此實施方案中，合適的可檢測基因包括那些編碼自發(fā)焚光蛋白的。如本領(lǐng)域中所知曉的，有多種已知的自發(fā)焚光蛋白；一般而言，這些是基于來自多管水母(Aequorea)的綠色熒光蛋白(GFP)及其變體；包括但不限于GFP(Chalfie等(1994)Science263(5148):802-805);增強(qiáng)型GFP(EGFP;Clontech-Genbank登錄號U55762)、藍(lán)色熒光蛋白(BFP;QuantumBiotechnologies,Inc.,Montreal,Canada;Stauber(1998)Biotechniques24(3):462-471;Heim和Tsien(1996)Curr.Biol.6:178-182)、增強(qiáng)型黃色熒光蛋白(EYFP;ClontechLaboratories,Inc.,PaloAlto,CA)和紅色熒光蛋白。另外，最近有來自海腎(Renilla)和海筆(Ptilosarcus)物種的自發(fā)熒光蛋白的報告。參見WO92/15673;WO95/07463;WO98/14605;WO98/26277;WO99/49019;美國專利號5,292,658;美國專利號5,418,155;美國專利號5,683,888;美國專利號5,741,668;美國專利號5,777,079;美國專利號5,804,387;美國專利號5,874,304;美國專利號5,876,995;及美國專利號5，925,558;本文通過提及而明確收錄其全部內(nèi)容。感興趣蛋白質(zhì)或多肽的分離為了測量感興趣蛋白質(zhì)的產(chǎn)量、溶解度、構(gòu)象、和/或活性，可能希望自陣列中的一種或多種菌林分離蛋白質(zhì)。分離可以是粗略的、半粗略的、或純凈的分離，這取決于用于進(jìn)行合適的測量的測定法的要求。蛋白質(zhì)可以在細(xì)胞質(zhì)中生成，靶向至周質(zhì)，或可以分泌入培養(yǎng)物或發(fā)酵培養(yǎng)基中。為了釋放靶向至周質(zhì)的蛋白質(zhì)，使用了牽涉如下化學(xué)品的處理，諸如氯仿(Ames等(1984)J.Bacteriol.,160:1181-1183)、鹽酸胍、和TritonX陽100(Naglak和Wang(19卯)EnzymeMicrob.Technol.,12:603-611)。然而，這些化學(xué)品不是惰性的，并且可能對許多異源蛋白質(zhì)產(chǎn)物或隨后的純化規(guī)程具有有害的影響。也有報告，對大腸桿菌細(xì)胞的甘氨酸處理(引起外膜的透化)釋放周質(zhì)內(nèi)容物(Ariga等(1989)J.Ferm.Bioeng.,68:243-246)。異源蛋白質(zhì)的周質(zhì)釋放的最廣泛使用的方法是滲壓震擾(Nosal和Heppel(1966)J.Biol.Chem.，241:3055-3062;Neu和Heppel(1965)J.Biol.Chem.,240:3685-3692)、雞蛋清(HEW)溶菌酶/乙二胺四乙酸(EDTA)處理(Neu和Heppel(1964)J.Biol.Chem.，239:3893-3900;Witholt等(1976)Biochim.Biophys.Acta,443:534-544;Pierce等(1995)IChemeResearch.Event,2:995-997)、和HEW溶菌酶/滲壓震擾組合處理(French等(1996)EnzymeandMicrob.Tech.，19:332-338)。弗氏法牽涉細(xì)胞在分級緩沖液中的重懸，接著是周質(zhì)級分的回收，其中滲壓震擾就在溶菌酶處理后。通常，這些規(guī)程包括滲壓穩(wěn)定化培養(yǎng)基中的起始破壞，接著是非穩(wěn)定化培養(yǎng)基中的選擇性釋放。這些培養(yǎng)基的組成(pH、保護(hù)劑)和所使用的破壞方法(氯仿、HEW溶菌酶、EDTA、超聲處理)在所報告的具體規(guī)程中有所不同。使用雙極性離子型去垢劑替換EDTA的一種HEW溶菌酶/EDTA處理變化形式記載于Stabel等(1994)VeterinaryMicrobiol.,38:307-314。關(guān)于使用胞內(nèi)溶胞酶系統(tǒng)來破壞大腸桿菌的一般性綜述，參見Dabora和Cooney(1990)于AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology,巻43,A.Fiechter，編(Springer-Verlag:Berlin),頁11-30。用于自細(xì)胞質(zhì)作為可溶性蛋白質(zhì)或折射顆?；厥崭信d趣蛋白質(zhì)或多肽的常規(guī)方法牽涉通過機(jī)械破壞來碎裂細(xì)菌細(xì)胞。機(jī)械破壞通常牽涉在液體懸浮液中產(chǎn)生局部空化、用剛性珠進(jìn)行的快速攪動、超聲處理、或細(xì)胞懸液的研磨(BacterialCellSurfaceTechniques,Hancock和Poxton(JohnWiley&SonsLtd,1988),章3，頁55)。HEW溶菌酶以生化方式起水解細(xì)胞壁肽聚糖骨架的作用。該方法最初由Zinder和Arndt(1956)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，42:586-590開發(fā)，他們用卵清蛋白(其含有HEW溶菌酶)處理大腸桿菌以產(chǎn)生后來稱為原生質(zhì)球的圓形細(xì)胞球。這些結(jié)構(gòu)保留了一些細(xì)胞壁成分但是具有大的表面積，其中細(xì)胞質(zhì)膜是暴露的。美國專利No.5,169,772披露了用于自細(xì)菌純化肝素酶的方法，包括使用例如EDTA、溶菌酶、或有機(jī)化合物在滲壓穩(wěn)定化培養(yǎng)基(例如20%蔗糖溶液)中破壞細(xì)菌的包膜，通過將細(xì)菌暴露于低離子強(qiáng)度緩沖液來自被破壞細(xì)菌的周質(zhì)間隙釋放非肝素酶樣蛋白質(zhì)，和通過將經(jīng)低離子強(qiáng)度清洗的細(xì)菌暴露于緩沖鹽溶液來釋放肝素酶樣蛋白質(zhì)。已經(jīng)對廣泛的表達(dá)系統(tǒng)使用了這些方法的許多不同改良，獲得了不同程度的成功(Joseph-Liazun等(1990)Gene,86:291-295;Carter等(1992)Bio/Technology,10:163-167)。誘導(dǎo)重組細(xì)胞培養(yǎng)物生成溶菌酶的努力已經(jīng)有報告。EP0,155,189披露了用于誘導(dǎo)重組細(xì)胞培養(yǎng)物生成溶菌酶的手段，通常預(yù)期所述手段會通過破壞或溶解細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的手段來殺死此類宿主細(xì)胞。美國專利No.4,595，658披露了用于促進(jìn)轉(zhuǎn)運至細(xì)菌周質(zhì)間隙的蛋白質(zhì)外化(extemalization)的方法。這種方法容許在不需要對細(xì)胞進(jìn)行溶菌酶處理、機(jī)械研磨、或滲壓震擾處理的情況中選擇性分離位于周質(zhì)中的蛋白質(zhì)。美國專利No.4，637,980披露了如下生成細(xì)菌產(chǎn)物，即用編碼(直接地或間接地)產(chǎn)物的DNA分子轉(zhuǎn)化溫度敏感性溶原性細(xì)菌，在允許性條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體以在胞內(nèi)表達(dá)基因產(chǎn)物，并通過提高溫度來誘導(dǎo)噬菌體編碼的功能而使產(chǎn)物外化。Asami等(1997)J.Ferment,andBioeng.,83:511-516披露了通過T4噬菌體感染來同步破壞大腸桿菌細(xì)胞，而Tanji等(1998)J.Ferment,andBioeng.，85:74-78披露了T4噬菌體中所編碼溶解基因的受控表達(dá)，用以溫和破壞大腸桿菌細(xì)胞。細(xì)胞溶解后，基因組DNA泄露出細(xì)胞質(zhì)而進(jìn)入培養(yǎng)基中，并導(dǎo)致流體粘度的顯著升高，這可阻止固體在離心場中的沉降。在沒有剪切力(諸如那些在機(jī)械破壞過程中所施加的用以打碎DNA聚合物的)的情況中，固體穿過粘性流體的較慢沉降速率導(dǎo)致離心期間固體與流體的分開不足。除機(jī)械剪切力之外，還存在有降解DNA聚合物的核酸降解酶。在大腸桿菌中，內(nèi)源基因endA編碼內(nèi)切核酸酶(成熟蛋白質(zhì)的分子量為約24.5kD)，其通常分泌至周質(zhì)，并以內(nèi)切核酸降解方式將DNA切割成寡脫氧核糖核苷酸。已經(jīng)提出，endA由大腸桿菌相對較弱地表達(dá)(Wackemagel等(1995)Gene154:55-59)。若想要的話，可以通過本領(lǐng)域中公知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來分離并純化使用本發(fā)明陣列中的一種或多種菌抹生成的蛋白質(zhì)至基本上純凈，包括但不限于硫酸銨或乙醇沉淀、酸提取、陰離子或陽離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水相互作用層析、親和層析、鎳層析、羥磷灰石層析、反相層析、凝集素層析、制備電泳、去污劑增溶、用諸如柱層析的物質(zhì)進(jìn)行的選擇性沉淀、免疫純化法等。例如，可以將具有已確立的分子粘附特性的蛋白質(zhì)與配體可逆地融合。憑借合適的配體，可以將蛋白質(zhì)選擇性吸附至純化柱，然后以相對純凈的形式從柱中釋放。然后通過酶活性切出所融合的蛋白質(zhì)。另外，可以使用免疫親和柱或Ni-NTA柱來純化蛋白質(zhì)。一^:性技術(shù)進(jìn)一步記載于例如R.Scopes,ProteinPurification:PrinciplesandPractice,Springer-Verlag:N.Y.(1982);Deutscher，GuidetoProteinPurification,AcademicPress(1990);美國專利No.4,511,503;S.Roe,ProteinPurificationTechniques:APracticalApproach(PracticalApproachSeries),OxfordPress(2001);D.Bollag等,ProteinMethods,Wiley-Lisa，Inc.(1996);AKPatra等，ProteinExprPurif,18(2):p/182-92(2000);及R.Mukhija等，Gene165(2):頁303-6(1995)。還可參見例如Ausubel等(1987和定期補(bǔ)充);Deutscher(1990)"GuidetoProteinPurification",MethodsinEnzymology巻182,及此叢書中的其它巻；Coligan等(1996和定期補(bǔ)充)CurrentProtocolsinProteinScienceWiley/Greene,NY;及制造商關(guān)于蛋白質(zhì)純產(chǎn)品的文南大，例^口Pharmacia,Piscataway,N丄或Bio-Rad,Richmond,Calif。與重組技術(shù)的組合容許與合適的區(qū)段融合，例如與FLAG序列或等同物，它們可經(jīng)由蛋白酶可切除的序列來融合。還可參見例如Hochuli(1989)ChemischeIndustrie12:69-70;Hochuli(1990)"PurificationofRecombinantProteinswithMetalChelateAbsorbent"于Setlow(編)GeneticEngineering,PrincipleandMethods12:87-98,PlenumPress,NY;及Crowe等(1992)QIAexpress:TheHighLevelExpression&ProteinPurificationSystemQUIAGEN,Inc.,Chatsworth,Calif。通過本領(lǐng)域中已知的方法來實現(xiàn)所表達(dá)蛋白質(zhì)的檢測，包括例如放射性免疫測定法、Western印跡纟支術(shù)或免疫沉淀。由本發(fā)明陣列中的菌抹所表達(dá)的某些蛋白質(zhì)可以形成不溶性聚集體("包含體")。數(shù)種方案適于自包含體純化蛋白質(zhì)。例如，包含體的純化通常牽涉通過破壞宿主細(xì)胞(例如通過在50mMTRIS/HCLpH7.5、50mMNaCl、5mMMgCl2、lmMDTT、O.lmMATP、和lmMPMSF的緩沖液中溫育)對包含體的提取、分離和/或純化。通常通過2-3次通過French壓碎器來裂解細(xì)胞懸浮液。細(xì)胞懸浮液也可以使用Polytron(BrinkmanInstruments)進(jìn)行勻漿或在冰上進(jìn)行超聲處理。裂解細(xì)菌的備選方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的(參見例如Sambrook等，見上文；Ausubel等，見上文)。在必要時，可以溶解包含體，并且通?？梢詫α呀獾募?xì)胞懸浮液離心，以便除去不想要的不溶性物質(zhì)?？梢酝ㄟ^用相容的緩沖液進(jìn)行的稀釋或透析來使形成包含體的蛋白質(zhì)復(fù)性。合適的溶劑包括但不限于尿素(約4M-約8M)、曱酰胺(至少約80%，體積/體積計)、和鹽酸胍(約4M-約8M)。雖然鹽酸胍和類似的試劑是變性劑，但是這種變性不是不可逆的，并且復(fù)性可以在除去(例如通過透析)或稀釋變性劑后發(fā)生，這容許免疫學(xué)和/或生物學(xué)活性蛋白質(zhì)的重新形成。其它合適的緩沖液對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的標(biāo)準(zhǔn)分離技術(shù)能將上清液中存在的異源表達(dá)的蛋白質(zhì)與宿主蛋白質(zhì)分開。例如，起始的鹽分級可將許多不想要的宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)(或自細(xì)胞培養(yǎng)基衍生的蛋白質(zhì))與感興趣蛋白質(zhì)或多肽分開。一個這樣的例子可以是硫酸銨。硫酸銨通過有效地降低蛋白質(zhì)混合物中的水量而使蛋白質(zhì)沉淀。然后蛋白質(zhì)根據(jù)它們的溶解度而沉淀。蛋白質(zhì)越疏水，其越有可能在較低的硫酸銨濃度沉淀。一個典型方案包括將飽和硫酸銨添加至蛋白質(zhì)溶液，使得所得硫酸銨濃度在20-30%之間。此濃度會沉淀大多數(shù)疏水性蛋白質(zhì)。然后棄去沉淀物(除非感興趣蛋白質(zhì)是疏水的)，并將硫酸銨添加至上清液至已知使感興趣蛋白質(zhì)沉淀的濃度。然后將沉淀物溶解于緩沖液中，并在必要時除去過量的鹽，其經(jīng)由透析或滲濾實現(xiàn)。依賴于蛋白質(zhì)溶解度的其它方法(諸如冷乙醇沉淀)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的，并可用于對復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物進(jìn)行分級。可以利用感興趣蛋白質(zhì)或多肽的分子量來將其與較大和較小尺寸的蛋白質(zhì)分離，其使用穿過不同孔徑的膜(例如Amicon或Millipore膜)的超濾來實現(xiàn)。作為第一步，蛋白質(zhì)混合物可以穿過孔徑的分子量截留比感興趣蛋白質(zhì)的分子量低的膜而進(jìn)行超濾。然后超濾的保留物可以針對分子截留比感興趣蛋白質(zhì)的分子量大的膜進(jìn)行超濾。感興趣蛋白質(zhì)或多肽會穿過膜而進(jìn)入濾液中。然后可以對濾液進(jìn)行層析，如下文所述的。所表達(dá)的感興趣蛋白質(zhì)或多肽也可以根據(jù)其大小、表面凈電荷、疏水性、和對配體的親和力而與其它蛋白質(zhì)分開。另外，可以將針對蛋白質(zhì)所產(chǎn)生的抗體偶聯(lián)至柱基質(zhì)，并對蛋白質(zhì)免疫純化。所有的這些方法在本領(lǐng)域中是公知的。對于技術(shù)人員會顯而易見的是，可以以任何規(guī)模和使用來自許多不同制造商(例如PharmaciaBiotech)的儀器實施層析技術(shù)。復(fù)性和重折疊若異源表達(dá)的蛋白質(zhì)以變性形式生成，則不溶性蛋白質(zhì)可以復(fù)性或重折疊以產(chǎn)生二級和三級蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)構(gòu)象。必要時，可以在完成異源產(chǎn)物的構(gòu)造中使用蛋白質(zhì)重折疊步驟。可以使用本領(lǐng)域中已知的用于促進(jìn)蛋白質(zhì)解離/結(jié)合的試劑來實現(xiàn)重折疊和復(fù)性。例如，可將蛋白質(zhì)與二硫蘇糖醇一起溫育，接著與氧化型谷胱甘肽二鈉鹽一起溫育，接著與含有重折疊試劑(諸如尿素)的緩沖液一起溫育。也可以例如通過使其針對磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)或50mM醋酸鈉，pH6緩沖液加200mMNaCl透析來4吏感興趣蛋白質(zhì)或多肽復(fù)性?；蛘撸梢栽诠潭ɑ谥?諸如NiNTA柱)上時，通過使用500mMNaCl、20%甘油、20mMTris/HClpH7.4(含有蛋白酶抑制劑)中的6M-1M尿素線性梯度來使蛋白質(zhì)重折疊?？梢栽?.5小時或更長的一段時間里實施復(fù)性。復(fù)性后，可以通過添加250mM咪哇來洗脫蛋白質(zhì)?？梢酝ㄟ^針對PBS或50mM醋酸鈉pH6緩沖液加200mMNaCl的最終透析步驟來除去咪唑。純化的蛋白質(zhì)可以于4。C貯存或于-80。C冷凍。其它方法包括例如那些可記載于MHLee等，ProteinExpr.Purif.，25(1):頁166-73(2002);W.K.Cho等，J.Biotechnology,77(2-3):頁169-78(2000);Ausubel等(1987和定期補(bǔ)充)；Deutscher(1990)"GuidetoProteinPurification,"MethodsinEnzymology巻182，及此叢書中的其它巻；Coligan等(1996和定期補(bǔ)充)CurrentProtocolsinProteinScienceWiley/Greene,NY;S.Roe，ProteinPurificationTechniques:APracticalApproach(PracticalApproachSeries),OxfordPress(2001);D.Bollag等，ProteinMethods,Wiley-Lisa,Inc.(1996)。表達(dá)載體可以通過向每種菌林中導(dǎo)入編碼感興趣異源蛋白質(zhì)的表達(dá)載體來在一種或多種本文中所公開的宿主細(xì)胞中生成感興趣異源蛋白質(zhì)。在一個實施方案中，載體包含與能夠在選定的宿主細(xì)胞中運行的啟動子以及所有其它所需要的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控元件可搡作連接的編碼感興趣蛋白質(zhì)的多核苷酸序列。術(shù)語"可操作連接的"指任何如下的構(gòu)造，其中轉(zhuǎn)錄和任何翻譯調(diào)控元件以相對于編碼序列的這樣一種或多種布置共價附著于編碼序列以使得在宿主細(xì)胞中和通過宿主細(xì)胞的作用，調(diào)控元件可指導(dǎo)編碼序列的表達(dá)?？梢宰匀缦露嗪丝嗨岜磉_(dá)感興趣異源蛋白質(zhì)，在所述多核芬酸中異源多肽編碼序列可操作連接至轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控元件以形成功能基因，宿主細(xì)胞能44自該功能基因表達(dá)蛋白質(zhì)或多肽。編碼序列可以是異源多肽的天然編碼序列，或者可以是已經(jīng)為了在選定的表達(dá)宿主細(xì)胞中的應(yīng)用進(jìn)行選擇、改善、或優(yōu)化的編碼序列例如，通過合成基因來反映宿主物種的密碼子使用偏愛。在本發(fā)明的一個實施方案中，宿主物種是熒光假單胞菌，并在設(shè)計多肽編碼序列時考慮熒光假單胞菌的密碼子偏愛。在一種或多種載體內(nèi)構(gòu)建一種或多種基因或者將一種或多種基因插入一種或多種載體中，然后可將所述載體轉(zhuǎn)化入表達(dá)宿主細(xì)胞中。其它調(diào)控元件可包括在載體(也稱為"表達(dá)構(gòu)建體")中。載體通常會包含一種或多種表型選擇標(biāo)志和復(fù)制起點以確保載體的維持，并在想要時提供宿主內(nèi)的擴(kuò)增。別的元件包括但不限于例如轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子序列、翻譯增強(qiáng)子序列、其它啟動子、激活子、翻譯起始和終止信號、轉(zhuǎn)錄終止子、順反子調(diào)節(jié)物、多順反子調(diào)節(jié)物、或標(biāo)簽序列(諸如核苷酸序列"標(biāo)簽"和"標(biāo)簽"多肽編碼序列)，其促進(jìn)所表達(dá)的多肽的鑒定、分開、純化、和/或分離。在另一個實施方案中，表達(dá)載體進(jìn)一步包含與感興趣蛋白質(zhì)或多肽的編碼序列鄰近的標(biāo)簽序列。在一個實施方案中，此標(biāo)簽序列容許純化蛋白質(zhì)。標(biāo)簽序列可以是親和標(biāo)簽，諸如六組氨酸親和標(biāo)簽。在另一個實施方案中，親和標(biāo)簽可以是谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶分子。標(biāo)簽還可以是熒光分子，諸如YFP或GFP，或此類熒光蛋白的類似物。標(biāo)簽還可以是對純化有用的已知結(jié)合配偶的配體或已知抗原、或抗體分子的一部分。在蛋白質(zhì)編碼序列之外，依照本發(fā)明的蛋白質(zhì)編碼基因還可包括與其可操作連接的下列調(diào)控元件啟動子、核糖體結(jié)合位點(RBS)、轉(zhuǎn)錄終止子、翻譯起始和終止信號。有用的RBS可自在依照本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)中可用作宿主細(xì)胞的任何物種獲得，優(yōu)選自選定的宿主細(xì)胞獲得。許多特有的和多種共有的RBS是已知的，例如那些記載于D.Frishman等，Gene234(2):257-65(1999年7月8日);及B.E.Suzek等，Bioinfo腿tics17(12):1123-30(2001年12月)的和由它們提及的。另外，可使用天然的或合成的RBS，例如那些記載于EP0207459(合成的RBS);0.Ikehata等,Eur.J.Biochem.181(3):563-70(1989)的(天然RBS序列AAGGAAG)。本發(fā)明中有用的方法、載體、及翻譯和轉(zhuǎn)錄元件及其它元件的進(jìn)一步的例子記載于例如Gilroy的美國專利No.5，055,294和Gilroy等的美國專利No.5,128,130;Rammler等的美國專利No.5,281,532;Barnes等的美國專利No.4,695,455和4,861,595;Gray等的美國專利No.4,755,465;及Wilcox的美國專利No.5,169,760。通過將增強(qiáng)子序列插入載體或質(zhì)粒中來增加編碼感興趣異源蛋白質(zhì)的DNA的轉(zhuǎn)錄。典型的增強(qiáng)子是大小通常約10-300bp的DNA順式作用元件，其作用于啟動子以增加其轉(zhuǎn)錄。例子包括多種假單胞菌增強(qiáng)子。一般而言，異源表達(dá)載體會包括復(fù)制起點和容許宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化的選擇標(biāo)志和自高度表達(dá)的基因衍生以指導(dǎo)下游結(jié)構(gòu)序列轉(zhuǎn)錄的啟動子。此類啟動子可以自編碼酶(諸如3-磷酸甘油酸激酶(PGK)、酸性磷酸酶或熱休克蛋白等)的操縱子衍生。若使用信號序列，則異源編碼序列以合適的狀態(tài)與翻譯起始和終止序列和能夠指導(dǎo)所翻譯蛋白質(zhì)區(qū)室積累或分泌的信號序列裝配在一起。任選地，異源序列可編碼包含賦予想要的特性(例如所表達(dá)異源產(chǎn)物的穩(wěn)定化或簡化的純化)的N端鑒定多肽的融合酶。融合多肽還可以包含一種或多種靶蛋白質(zhì)或其抑制劑或增強(qiáng)劑，如上文所討論的。用于在宿主細(xì)胞中表達(dá)異源蛋白質(zhì)的載體在本領(lǐng)域中是已知的，并且可使用這些中的任一種來表達(dá)依照本發(fā)明的基因。此類載體包括例如質(zhì)粒、粘pBBRlMCS、pDSK519、pKT240、pML122、pPS10、RK2、RK6、pRO1600、和RSF1010。此類有用的載體的其它例子包括那些記載于例如N.Hayase，于Appl.Envir.Microbiol.60(9):3336-42(1994年9月);A.A.Lushnikov等,于BasicLifeSci.30:657-62(1985);S.Graupner和W.Wackemagel,于Biomolec.Eng.17(1):11-16.(2000年10月)；H.P,Schweizer,于Curr.Opin.Biotech.12(5):439-45(2001年10月);M.Bagdasarian和K.N.Timmis,于Curr.TopicsMicrobiol.Immunol.96:47-67(1982);T.Ishii等,于FEMSMicrobiol.Lett.116(3):307-13(1994年3月1曰);I.N.Olekhnovich和Y.K.Fomichev,于Gene140(1):63-65(1994年3月11日)；M.Tsuda和T.Nakazawa,于Gene136(l-2):257-62(1993年12月22日);C.Nieto等，于Gene87(1):145-49(1990年3月1日)；J.D.Jones和N.Gutterson，于Gene61(3):299-306(1987);M.Bagdasarian等，于Gene16(l-3):237-47(1981年12月);H.P.Schweizer等,于Genet.Eng.(NY)23:69-81(2001);P.Mukhopadhyay等，于J.Bact.172(0:477-80(1990年1月);D.O.Wood等,于J.Bact.145(3):1448-51(1981年3月);及R.Holtwick等，于Microbiology147(Pt2):337-44(2001年2月)的?？捎糜诒景l(fā)明宿主細(xì)胞的表達(dá)載體的進(jìn)一步例子包括那些列于表5中46的、自指示的復(fù)制子衍生的。表5:有用的表達(dá)載體的例子<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>表達(dá)質(zhì)粒RSF1010記載于例如F.Heffron等，于Proc.Nat，lAcad.Sci.USA72(9):3623-27(1975年9月)及K.Nagahari和K.Sakaguchi，于J.Bact.133(3):1527-29(1978年3月)。質(zhì)粒RSF1010及其衍生物是本發(fā)明中特別有用的載體。例示性的、有用的RSF1010衍生物(其在本領(lǐng)域中是已知的)包括例如pKT212、pKT214、pKT231及相關(guān)質(zhì)粒，和pMYC1050及相關(guān)質(zhì)粒(參見例如Thompson等的美國專利No.5，527,883和5，840，554)，諸如例如的美國專利No.5,169,760)，其攜帶來自RSF1010質(zhì)粒的可調(diào)型四環(huán)素抗性標(biāo)志及復(fù)制和轉(zhuǎn)移基因座(replicationandmobilizationloci)。其它例示性的有用的載體包括那些記載于Puhler等的美國專利No.4，680,264的。在一個實施方案中，表達(dá)質(zhì)粒作為表達(dá)載體使用。在另一個實施方案中，RSF1010或其衍生物作為表達(dá)載體使用。在又一個實施方案中，pMYC1050或其衍生物，或pMYC4803或其衍生物作為表達(dá)載體使用?？赏ㄟ^在質(zhì)粒中包含選^4示志基因來在宿主細(xì)胞中維持質(zhì)粒。這可以是抗生素抗性基因(其中將相應(yīng)的抗生素添加至發(fā)酵培養(yǎng)基)，或本領(lǐng)域中已知的任何其它類型的選擇標(biāo)志基因，例如原養(yǎng)型恢復(fù)基因，其中在相應(yīng)的性狀(例如生物催化性狀，諸如氨基酸生物合成或核苷酸生物合成性狀，或碳源利用性狀)營養(yǎng)缺陷的宿主細(xì)胞中使用所述質(zhì)粒。可調(diào)型啟動子的常見例子包括那些自lac啟動子(即lacZ啟動子)衍生的家族的，特別是記載于DeBoer的美國專利No.4,551,433的toc和^r啟動子，以及Ptacl6、Ptacl7、PtacII、PlacUY5、和T71ac啟動子。在一個實施方案中，啟動子不是自宿主細(xì)胞生物體衍生的。在某些實施方案中，啟動子是自大腸桿菌生物體衍生的。在依照本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)中有用的非lac型啟動子的常見例子包括例如那些列于表6的。表6:非/ac啟動子的例子啟動子誘導(dǎo)物Pr古，、曰向/皿Pl兩溫Pm烴基或卣代苯曱酸鹽Pu烴基或卣代曱苯Psal水楊酸鹽參見例^口J.Sanchez-MicrobiologyandBiotechnology(A.Demain禾口J.Davies纟扁)頁460-74(ASMPress,Washington,D,C.);H.Schweizer(2001)CurrentOpinioninBiotechnology,12:439-445;及R.Slater和R.Williams(2000MolecularBiologyandBiotechnology(J.Walker和R.Rapley編)頁125-54(TheRoyalSocietyofChemistry,Cambridge,UK))。還可使用具有對于選定的細(xì)菌宿主細(xì)胞而言天然的啟動子的核苦酸序列的啟動子來控制編碼靶多肽的轉(zhuǎn)基因的表達(dá)，例如假單胞菌鄰氨基苯曱酸鹽或苯曱酸鹽操縱子啟動子(Pant,Pben)。還可使用串聯(lián)啟動子，其中一個以上的啟動子共價附接至另一個啟動子，無論序列是相同的還是不同的(例如Pant-Pben串聯(lián)啟動子(啟動子間的雜合物)或P/ac-P/ac串聯(lián)啟動子)，或者無論是自相同的還是不同的生物體衍生的。可調(diào)型啟動子利用啟動子調(diào)控蛋白以控制啟動子是其一部分的基因的轉(zhuǎn)錄。若在本文中使用可調(diào)型啟動子，則相應(yīng)的啟動子調(diào)控蛋白也會是依照本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)的一部分。啟動子調(diào)控蛋白的例子包括激活蛋白，例如大腸桿菌分解代謝物激活蛋白，MalT蛋白；AraC家族轉(zhuǎn)錄激活物；阻抑蛋白，例如大腸桿菌LacI蛋白；和雙功能調(diào)控蛋白，例如大腸桿菌NagC蛋白。48許多可調(diào)型啟動子/啟動子調(diào)控蛋白對在本領(lǐng)域中是已知的。在一個實施方案中，靶蛋白質(zhì)和感興趣異源蛋白質(zhì)的表達(dá)構(gòu)建體在同一調(diào)控元件的控制下。啟動子調(diào)控蛋白與效應(yīng)器化合物相互作用，所述效應(yīng)器化合物即如下化合物，其可逆地或不可逆地與調(diào)控蛋白相結(jié)合以使得所述蛋白質(zhì)能夠釋放或結(jié)合啟動子控制下的基因中的至少一個DNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)，由此容許或阻斷轉(zhuǎn)錄酶在啟動基因轉(zhuǎn)錄中的作用。效應(yīng)器化合物分類為誘導(dǎo)物或協(xié)阻抑物，并且這些化合物包括天然效應(yīng)器化合物和義務(wù)誘導(dǎo)物化合物。許多可調(diào)型啟動子/啟動子調(diào)控蛋白/效應(yīng)器化合物三元組合在本領(lǐng)域中是已知的。雖然效應(yīng)器化合物可貫穿細(xì)胞培養(yǎng)或發(fā)酵使用，但是在使用可調(diào)型啟動子的一個優(yōu)選的實施方案中，在宿主細(xì)胞生物量生長到想要的數(shù)量或密度后，將合適的效應(yīng)器化合物添加至培養(yǎng)物以直接地或間接地導(dǎo)致編碼所述感興趣蛋白質(zhì)或多肽的想要基因的表達(dá)。舉例而言，在利用/ac家族啟動子的情況中，lacl基因也可存在于系統(tǒng)中。lacl基因(其(通常)是組成型表達(dá)的基因)編碼Zw阻抑蛋白(LacD蛋白)，其結(jié)合這些啟動子的/ac操縱基因。如此，在利用/ac家族啟動子的情況中，lacl基因也可包括在表達(dá)系統(tǒng)中，并在表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)。在/ac啟動子家族成員(例如tac啟動子)的情況中，效應(yīng)器化合物是誘導(dǎo)物，優(yōu)選義務(wù)誘導(dǎo)物，諸如IPTG(異丙基-D-1-硫代吡喃半乳糖苷，也稱作"異丙基硫代半乳糖苷")。對于感興趣蛋白質(zhì)或多肽的表達(dá)，也可使用任何植物啟動子。啟動子可以是植物RNA聚合酶II啟動子。植物啟動子中包括的元件可以是通常位于轉(zhuǎn)錄起始位點上游(5，)約25-35個堿基對的TATA框或Goldberg-Hogness框，和位于上游70和100個堿基對之間的CCAAT框。在植物中，CCAAT框可具有不同于哺乳動物啟動子功能類似序列的共有序列(Messing等(l983)于GeneticEngineeringofPlants,Kosuge等編，頁211-227)。另外，幾乎所有啟動子都包括自轉(zhuǎn)錄起始位點上游約-100bp至-l，000bp或更多延伸的別的上游激活序列或增強(qiáng)子(Benoist和Chambon(1981)Nature290:304-310;Gruss等(1981)Proc.Nat.Acad.Sci.78:943-947;及Khoury和Gruss(1983)Cell27:313-314)。表達(dá)系統(tǒng)可能希望將感興趣蛋白質(zhì)或多肽靶向至陣列中的一個或多個宿主細(xì)胞群體的周質(zhì)，或者靶向入胞外間隙中。在一個實施方案中，表達(dá)載體進(jìn)一步49包含編碼分泌信號序列多肽的核苷酸序列，其可操作連接至編碼感興趣蛋白質(zhì)或多肽的核苷酸序列。在一些實施方案中，在信號序列和感興趣蛋白質(zhì)或多肽之間沒有進(jìn)行修飾。然而，在某些實施方案中，摻入額外的切割信號以促進(jìn)對多肽氨基端的正確加工。載體可以具有上文所描述的任何特征。在一個實施方案中，包含感興趣蛋白質(zhì)或多肽的編碼序列的載體進(jìn)一步包含信號序列，例如分泌信號序列。因此，在一個實施方案中，此分離的多肽是分泌信號與感興趣蛋白質(zhì)或多肽的融合蛋白。然而，在將蛋白質(zhì)耙向至周質(zhì)后，也可自蛋白質(zhì)切除分泌信號。在一個實施方案中，對Sec系統(tǒng)分泌信號和蛋白質(zhì)或多肽之間的連接進(jìn)行修飾以提高對分泌信號的切割。CHAMPIONpET表達(dá)系統(tǒng)提供了高水平的蛋白質(zhì)生產(chǎn)。自T71ac強(qiáng)啟動子誘導(dǎo)表達(dá)。此系統(tǒng)利用噬菌體T7RNA聚合酶的高活性和特異性來高水平地轉(zhuǎn)錄感興趣基因。位于啟動子區(qū)中的lac操縱基因提供了比傳統(tǒng)的基于T7的載體更緊密的調(diào)控，這改善了質(zhì)粒穩(wěn)定性和細(xì)胞生存力(Studier和Moffatt(1986)JMolecularBiology189(1):113-30;Rosenberg等(1987)Gene56(1):125-35)。T7表達(dá)系統(tǒng)使用T7啟動子和T7RNA聚合酶(T7RNAP)來高水平地轉(zhuǎn)錄感興趣基因。在T7表達(dá)系統(tǒng)中實現(xiàn)高水平表達(dá)，因為T7RNAP比天然的大腸桿菌RNAP更易前行(processive)，而且致力于轉(zhuǎn)錄感興趣基因。通過在宿主細(xì)胞中提供T7RNAP的來源來誘導(dǎo)所鑒定基因的表達(dá)。這通過使用含有T7RNAP基因染色體拷貝的BL21大腸桿菌宿主來實現(xiàn)。T7RNAP基因在可由IPTG誘導(dǎo)的lacUV5啟動子的控制下。T7RNAP在誘導(dǎo)后進(jìn)行表達(dá)，并轉(zhuǎn)錄感興趣基因。pBAD表達(dá)系統(tǒng)經(jīng)由特定碳源(諸如葡萄糖、甘油和阿拉伯糖)的存在而容許感興趣蛋白質(zhì)或多肽的緊密控制的、可滴定的表達(dá)(Guzman等(1995)JBacteriology177(14):4121-30)。獨特地設(shè)計pBAD載體以對表達(dá)水平給予精確的控制。在araBAD啟動子處啟動來自pBAD載體的異源基因表達(dá)。啟動子受到araC基因產(chǎn)物的正向和負(fù)向調(diào)控。AraC是與L-阿拉伯糖形成復(fù)合物的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物。在沒有L-阿拉伯糖的情況中，AraC二聚體阻斷轉(zhuǎn)錄。為了最大限度的轉(zhuǎn)錄激活，需要兩種事件(i)L-阿拉伯糖結(jié)合至AraC,這容許轉(zhuǎn)錄開始；和(ii)cAMP激活蛋白(CAP)-cAMP復(fù)合物結(jié)合至DNA,并刺激AraC結(jié)合至啟動子區(qū)的正確位置。50加表達(dá)系統(tǒng)容許大腸桿菌中自加啟動子的高水平、可調(diào)型表達(dá)。加表達(dá)載體已經(jīng)得到了優(yōu)化以在大腸桿菌中表達(dá)真核基因。^r啟動子是自色氨酸(化p)和乳糖(/ac)啟動子衍生的雜合強(qiáng)啟動子。它受到lacO操縱基因和lacIQ基因產(chǎn)物的調(diào)控(Brosius,J.(1984)Gene27(2):161-72)?？墒褂帽绢I(lǐng)域中已知的任何轉(zhuǎn)化方法來實施本文中所公開的載體對宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，而且可以作為完整細(xì)胞或作為原生質(zhì)體(即包括細(xì)胞質(zhì))來轉(zhuǎn)化細(xì)菌宿主細(xì)胞。例示性的轉(zhuǎn)化方法包括穿孔法例如電穿孔、原生質(zhì)體融合、細(xì)菌接合、和二價陽離子處理例如氯化鈣處理或CaCl/Mg"處理、或本領(lǐng)域中其它公知方法。參見例如Morrison，J.Bact.,132:349-351(1977);Clark-Curtiss和Curtiss，MethodsinEnzymology,101:347-362(Wu等編，1983);Sambrook等,MolecularCloning,ALaboratoryManual(第2版，1989);Kriegler，GeneTransferandExpression:ALaboratoryManual(1990);及CurrentProtocolsinMolecularBiology(Ausubel等編，1994)。感興趣蛋白質(zhì)本發(fā)明的方法和組合物對于鑒定如下熒光假單胞菌菌林是有用的，所述焚光假單胞菌菌抹對于生成高水平的正確加工的感興趣蛋白質(zhì)或多肽是最佳的。陣列對于篩選任何物種的和任何大小的感興趣蛋白質(zhì)或多肽的生產(chǎn)是有用的。然而，在某些實施方案中，感興趣蛋白質(zhì)或多肽是在治療方面有用的蛋白質(zhì)或多肽。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)可以是哺乳動物蛋白質(zhì)，例如人蛋白質(zhì)，而且可以是例如生長因子、細(xì)胞因子、趨化因子或血液蛋白質(zhì)。感興趣蛋白質(zhì)或多肽可以以與天然蛋白質(zhì)或多肽類似的方式加工。在某些實施方案中，感興趣蛋白質(zhì)或多肽是小于100kD、小于50kD、或小于30kD大小的。在某些實施方案中，感興趣蛋白質(zhì)或多肽是具有至少約5個、10個、15個、20個、30個、40個、50個或100個或更多個氨基酸的多肽。感興趣蛋白質(zhì)或多肽的編碼序列可以是多肽的天然編碼序列(若可獲得的話)，但是會更優(yōu)選的是如下編碼序列，其已經(jīng)經(jīng)過選擇、改良或優(yōu)化以在陣列的菌抹中以可表達(dá)形式使用例如，通過優(yōu)化基因來反映假單胞菌物種(諸如焚光假單胞菌)或其它合適的生物體的密碼子使用偏愛。為了基因優(yōu)化，可以除去一種或多種罕見的密碼子以避免核糖體停轉(zhuǎn)，并使氨基酸錯參最小化。還可以消除一種或多種基因內(nèi)部核糖體結(jié)合位點來避免截短的蛋51白質(zhì)產(chǎn)物?？梢猿ラL段的C和G核苷酸以避免RNA聚合酶滑動，其可以導(dǎo)致移碼。還可以消除強(qiáng)基因內(nèi)部莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，特別是覆蓋核糖體結(jié)合位點的。在其它實施方案中，蛋白質(zhì)在生成時還包括別的靶向序列，例如將蛋白質(zhì)靶向周質(zhì)或胞外培養(yǎng)基的序列。在一個實施方案中，所述別的靶向序列是可操作連接至蛋白質(zhì)羧基末端的。在另一個實施方案中，蛋白質(zhì)包括自運輸物(autotransporter)、只又酉己寸禺分泌系統(tǒng)(twopartnersecretionsystem)、主端分4支系統(tǒng)(mainterminalbranchsystem)或菌毛引座孔蛋白(fimbrialusherporin)的分泌信號。在一種或多種載體中構(gòu)建所得基因或者將所得基因插入一種或多種載體中，然后將該載體轉(zhuǎn)化入陣列中的每一個宿主細(xì)胞群體中。要以"可表達(dá)形式"提供的核酸或多核苷酸意指含有至少一種能由一種或多種本發(fā)明宿主細(xì)胞群體表達(dá)的基因的核酸或多核苷酸。分子遺傳學(xué)和遺傳工程技術(shù)所要求的大量序列信息是可廣泛地公開荻得的?？勺訥enBank于網(wǎng)站www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez獲4尋哺乳動物以及人的基因、cDNA序列、氨基酸序列和基因組的完整核苷酸序列的訪問(access)。別的信息也可自GeneCards(來自魏茨曼科學(xué)基因組和生物信息學(xué)研究所(WeizmannInstituteofScienceGenomeandBioinformatics)的整合關(guān)于基因及其產(chǎn)物和生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的信息的電子百科全書(bioinformatics.weizmann.ac.il/cards))獲得，核苦酸序歹'〗信息也可自EMBL核苷酸序歹'J數(shù)據(jù)庫(www.ebi.ac.uk/embl/)或日本DNA數(shù)據(jù)庫(DDBJ,www.ddbi.nig.ac.ii)獲得；關(guān)于氨基酸序列的信息的別的站點包括Georgetown的蛋白質(zhì)信息資源網(wǎng)站(www-nbrf.Reorgetown.edu/pirl)和Swiss-Prot(au.expasy.org/sprot/sprot-top.html)。可以在本發(fā)明中表達(dá)的蛋白質(zhì)的例子包括如下分子，諸如例如，腎素、生長激素，包括人生長激素；牛生長激素；生長激素釋放因子；曱狀旁腺激素；促曱狀腺激素；脂蛋白；a-l-抗胰蛋白酶；胰島素A鏈；胰島素B鏈；胰島素原；血小板生成素；促卵泡激素；降鈣素；黃體生成素；胰高血糖素；凝血因子，諸如因子VIIIC、因子IX、組織因子、和vonWillebrands因子；抗凝血因子，諸如蛋白C;心房鈉尿肽；肺表面活性劑；纖溶酶原激活物，諸如尿激酶或人尿或組織型纖溶酶原激活物(t-PA);鈴蟾肽；凝血酶；造血生長因子；肺瘤壞死因子-a和-P;腦啡肽酶；血清清蛋白，諸如人血清清蛋白；繆勒抑制物質(zhì)(mullerian-inhibitingsubstance);;^弛素A《連；水〉弛素B鏈；水〉弛素原；小鼠促性腺激素相關(guān)多肽；微生物蛋白質(zhì)，諸如p-內(nèi)酰胺酶；DNA酶；抑制素；活化素(activin);血管內(nèi)皮生長因子(VEGF);激素的或生長因子的受體；整聯(lián)蛋白；蛋白A或D;類風(fēng)濕因子；神經(jīng)營養(yǎng)因子，諸如腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-3、-4、-5、或-6(NT-3、NT-4、NT-5、或NT-6)、或神經(jīng)生長因子，諸如NGF-(3;心肌營養(yǎng)蛋白(心臟肥大因子)，諸如心肌營養(yǎng)蛋白-1(CT-1);血小板衍生生長因子(PDGF);成纖維細(xì)胞生長因子，諸如aFGF和bFGF;表皮生長因子(EGF);轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)，諸如TGF-a和TGF-卩，包括TGF-(31、TGF隱卩2、TGF-卩3、TGF-(34、或TGF畫(35;胰島素樣生長因子-I和-II(IGF-I和IGF-II);des(l-3)-IGF-I(腦IGF-I)、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白；CD蛋白，諸如CD-3、CD-4、CD-8、和CD-19;紅細(xì)胞生成素；骨誘導(dǎo)因子；免疫毒素；骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP);干擾素，諸如干擾素-a、-(3、和-r,集落刺激因子(CSF)，例如M-CSF、GM-CSF、和G-CSF;白介素(IL),例如IL-1至IL-10;抗HER-2抗體；超氧化物歧化酶；T纟田月包受體；表面膜蛋白；衰變加速因子；病毒抗原，諸如例如AIDS包膜的一部分；轉(zhuǎn)運蛋白；歸巢受體；地址素；調(diào)控蛋白；抗體；及上文所列多肽中任一種的片段。在某些實施方案中，蛋白質(zhì)或多肽可選自IL-1、IL-la、IL-lb、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL陽IO、IL-11、IL-12、IL-12dasti、IL-13、IL-15、IL陽16、IL-18、IL-18BPa、IL-23、IL-24、VIP、紅細(xì)胞生成素、GM-CSF、G-CSF、M-CSF、血小板衍生生長因子(PDGF)、MSF、FLT-3配體、EGF、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF;例如a-FGF(FGF-l)、卩-FGF(FGF-2)、FGF-3、FGF-4、FGF-5、FGF-6、或FGF-7)、胰島素樣生長因子(例如IGF-1、IGF-2);腫瘤壞死因子(例如TNF、淋巴毒素)、神經(jīng)生長因子(例如NGF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF);干擾素(例如IFN-ouIFN-卩、IFN-y);白血病抑制因子(LIF);睫狀節(jié)神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF);制瘤素M;干細(xì)胞因子(SCF);轉(zhuǎn)化生長因子(例如TGF-a、TGF-卩1、TGF-|32、TGF-(33);TNF超家族(例如LIGHT/TNFSF14、STALL-1/TNFSF13B(BLy5、BAFF、THANK)、TNFa/TNFSF2和TWEAK/TNFSF12);或趨化因子(BCA-1/BLC-1、BRAK/Kec、CXCL16、CXCR3、ENA-78/LIX、Eotaxin-l、Eotaxin陽2/MPIF-2、Exodus-2/SLC、Fractalkine/Neurotactin、GROa/MGSA、HCC-1、I-TAC、淋53巴細(xì)胞趨化蛋白/ATAC/SCM、MCP-1/MCAF、MCP-3、MCP-4、MDC/STCP-1/ABCD-1、MIP-1.quadrature.、MIP-1.quadrature.、MIP-2.quadrature./GRO.quadrature.、MIP-3.quadrature./Exodus/LARC、MIP陽3/Exodus-3/ELC、MIP-4/PARC/DC-CK1、PF-4、RANTES、SDF1、TARC、或TECK、微生物毒素、ADP核糖基化毒素、微生物或病毒抗原)。在本發(fā)明的一個實施方案中，感興趣蛋白質(zhì)可以是多亞基蛋白質(zhì)或多肽?？梢员磉_(dá)的多亞基蛋白質(zhì)包括同聚體和異聚體蛋白質(zhì)。多亞基蛋白質(zhì)可以包括兩個或更多個亞基，它們可以是相同的或不同的。例如，蛋白質(zhì)可以是包含2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、ll個、12個或更多個亞基的同聚體蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)也可以是包含2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、ll個、12個、或更多個亞基的異聚體蛋白質(zhì)。例示性的多亞基蛋白質(zhì)包括受體，包括離子通道受體；胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)，包括軟骨素；膠原；免疫調(diào)節(jié)劑，包括MHC蛋白、全鏈抗體、和抗體片,殳；酶，包括RNA聚合酶、和DNA聚合酶；及膜蛋白。在另一個實施方案中，感興趣蛋白質(zhì)可以是血液蛋白質(zhì)。在此實施方案中所表達(dá)的血液蛋白質(zhì)包括但不限于載體蛋白，諸如清蛋白(包括人的和牛的清蛋白)、運鐵蛋白、重組運鐵蛋白半分子、觸珠蛋白、血纖蛋白原和其它凝結(jié)因子、補(bǔ)體成分、免疫球蛋白、酶抑制劑、物質(zhì)(諸如血管緊張素和緩激肽)的前體、胰島素、內(nèi)皮縮血管肽、和球蛋白(包括a、(3、y-球蛋白)，及主要在哺乳動物的血液中找到的其它類型的蛋白質(zhì)、多肽及其片段。已經(jīng)報告了許多血液蛋白質(zhì)的氨基酸序列(參見S.S.Baldwin(1993)Comp.BiochemPhysiol.106b:203-218),包括人血清清蛋白的(Lawn，L.M.等(1981)NucleicAcidsResearch,9:6103-6114)和人血清運鐵蛋白的(Yang,F.等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci,USA81:2752-2756)氨基酸序列。在另一個實施方案中，感興趣蛋白質(zhì)可以是酶或輔因子。在此實施方案中所表達(dá)的酶和輔因子包括但不限于醛縮酶、胺氧化酶、氨基酸氧化酶、天冬氨酸酶、B12依賴性酶、羧肽酶、羧酸酯酶(carboxyesterase)、羧酸分解酶(carboxylyase)、4匕學(xué)月夷蛋白酶(chemotrypsin)、需要CoA的酶(CoArequiringenzyme)、羥腈合成酶、月先石克醚合酶(cystathionesynthase)、脫羧酶、脫氫酶、醇脫氫酶、脫水酶、心肌黃酶(diaphorase)、加雙氧酶、烯酸還原酶(enoatereductase),環(huán)氧4b物7jM匕酶(epoxidehydrase)、延胡索酸酶(fumerase)、半乳糖氧化酶、葡萄糖異構(gòu)酶、葡萄糖氧化酶、糖基轉(zhuǎn)移酶、甲基轉(zhuǎn)移酶、腈水化酶(nitrilehydrase)、核苦磷酸化酶、氧化還原酶、氧腈酶(oxynitilase)、肽酶、糖基轉(zhuǎn)移酶、過氧化物酶、與治療活性多肽融合的酶、組織纖溶酶原激活物；尿激酶、reptilase、鏈激酶；過氧化氫酶、超氧化物歧化酶；DNA酶、氨基酸水解酶(例如天冬酰胺酶、酰胺水解酶)；羧肽酶；蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、膠原酶；神經(jīng)氨酸酶；乳糖酶、麥芽糖酶、蔗糖酶、和阿拉伯呋喃糖苷酶。在另一個實施方案中，感興趣蛋白質(zhì)可以是單鏈、Fab片段和/或全鏈抗體或其片段或部分。單鏈抗體可以包括在穩(wěn)定折疊的多肽單鏈上的、抗體的抗原結(jié)合區(qū)。Fab片段可以是特定抗體中的一段。Fab片段可以含有抗原結(jié)合位點。Fab片段可以含有2條鏈輕鏈和重鏈片段。這些片段可經(jīng)由接頭或二硫鍵連接。在其它實施方案中，感興趣蛋白質(zhì)是在約20至約42。C的溫度有活性的蛋白質(zhì)。在一個實施方案中，蛋白質(zhì)在生理溫度是有活性的，而在加熱至高的或極端的溫度(諸如超過65。C的溫度)時凈皮滅活。在一個實施方案中，感興趣蛋白質(zhì)是如下蛋白質(zhì)，其在約20至約42。C的溫度是有活性的，和/或在加熱至高的或極端的溫度(諸如超過65。C的溫度)時被滅活；是天然蛋白質(zhì)(諸如天然哺乳動物或人蛋白質(zhì))或與其基本上同源，并且不是自多聯(lián)體形式的核酸表達(dá)的；其中啟動子不是陣列中所使用的宿主細(xì)胞中的天然啟動子，而是衍生自另一種生物體，諸如大腸桿菌。宿主細(xì)胞在一個實施方案中，本發(fā)明提供了熒光假單胞菌宿主細(xì)胞的陣列，自此以最佳地生成感興趣的異源蛋白質(zhì)或肽。熒光假單胞菌已經(jīng)證明是用于生產(chǎn)多種蛋白質(zhì)的改良平臺，并且已經(jīng)自此生物體鑒定出數(shù)種有效的分泌信號(參見美國申請公開文本號2GG6/()()G8877，通過提及而完整收入本文)。與其它細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)相比，假單胞菌系統(tǒng)為多肽和酶的商業(yè)性表達(dá)提供優(yōu)勢。具體地，熒光假單胞菌已經(jīng)鑒定為有利的表達(dá)系統(tǒng)。熒光假單胞菌涵蓋一組常見的、非病原性腐生生物，其拓殖土壤、水和植物表面環(huán)境。自熒光假單胞菌衍生的商品化酶已經(jīng)用于降低環(huán)境污染，用作去污添加劑，及用于立體選"^性水解。焚光假單胞菌還在農(nóng)業(yè)上用于控制病原體。美國專利號554，695,462記載了重組細(xì)菌蛋白質(zhì)在焚光假單胞菌中的表達(dá)。然而，可以使用備用的宿主細(xì)胞，或者甚至多種不同宿主細(xì)胞來產(chǎn)生包含多個表型獨特的宿主細(xì)胞的陣列，所述表型獨特的宿主細(xì)胞已經(jīng)進(jìn)行過遺傳修飾以調(diào)控一種或多種耙基因的表達(dá)，如上文所討論的。宿主細(xì)胞可以是任何可以在其中改變耙基因的生物體。鑒定與那些在表1和表2中所列出的靶基因同源的靶基因的方法是本領(lǐng)域已知的。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解如何鑒定對于感興趣的宿主細(xì)胞而言是天然的或者在感興趣的宿主細(xì)胞中有用的耙基因。這些蛋白質(zhì)中許多是本領(lǐng)域中公知的。參見例如美國專利申請7>開文本號2006/0110747。宿主細(xì)胞可以選自"革蘭氏陰性變形菌門(Proteobacteria)亞組18"。"革蘭氏陰性變形菌門亞組18"定義為物種熒光假單胞菌的所有亞種、變種、菌抹和其它亞物種單位的組，包括那些屬于例如下列各項的(圓括號中顯示了例示性菌株的ATCC或其它保藏號)焚光假單胞菌生物型A,也稱為生物變型1或生物變型I(ATCC13525);焚光^^單胞菌生物型B,也稱為生物變型2或生物變型II(ATCC17816);熒光^(艮單胞菌生物型C，也稱為生物變型3或生物變型III(ATCC17400);焚光假單胞菌生物型F，也稱為生物變型4或生物變型IV(ATCC12983);熒光假單胞菌生物型G，也稱為生物變型5或生物變型V(ATCC17518);焚光假單胞菌生物變型VI;熒光假單胞菌Pf0-l;熒光假單胞菌Pf-5(ATCCBAA-477);熒光假單胞菌SBW25;及熒光假單胞菌纖維素亞種(NCIMB10462)。宿主細(xì)胞可以選自"革蘭氏陰性變形菌門亞組19"。"革蘭氏陰性變形菌門亞組19"定義為焚光假單胞菌生物型A的所有菌林的組。此生物型的一種特別優(yōu)選的菌林是焚光假單胞菌菌林MBIOI(參見Wilcox的美國專利No.5,169,760)及其衍生物。它優(yōu)選的衍生物的例子是熒光假單胞菌菌抹MB214,它是通過將天然大腸桿菌PlacI-lacI-lacZYA構(gòu)建體(即其中刪除了PlacZ)插入MB101染色體aW(天冬氨酸脫氫酶基因)基因座中而構(gòu)建的?？梢栽诒景l(fā)明中使用的別的熒光假單胞菌菌林包括熒光假單胞菌Migula和熒光假單胞菌Loitokitok,其具有下列ATCC名稱[NCIB8286];NRRLB-1244;NCIB8865菌抹C01;NCIB8866菌抹(302;1291[ATCC17458;IFO15837;NCIB8917;LA;NRRLB-1864;吡咯烷；PW2[ICMP3966;NCPPB967;NRRLB-899];13475;NCTC10038;NRRLB-1603[6;IFO15840];52-1C;CCEB488-A[BU140];CCEB553[EM15/47];IAM1008[AHH-27];IAM1055[AHH-23];1[IFO15842];12[ATCC25323;NIH11;denDoorendeJong216];18[IFO15833;WRRLP陽7];93[TR畫10];108[52-22;IFO15832];143[IFO15836;PL];149[2-40畫40;IFO15838];182[IFO3081;PJ73];184[IFO15830];185[W2L-l];186[IFO15829;PJ79];187[NCPPB263];188[NCPPB316];189[PJ227;1208];191[IFO15834;PJ236;22/1];194[KlingeR-60;PJ253];196[PJ288];197[PJ290];198[PJ302];201[PJ368];202[PJ372];203[PJ376];204[IFO15835;PJ682];205[PJ686];206[PJ692];207[PJ693];208[PJ722];212.[PJ832];215[PJ849];216[PJ885];267[B-9];271[B-1612];401[C71A;IFO15831;PJ187];NRRLB-3178[4;IFO.15841];KY8521;3081;30-21;[IFO3081];N;PYR;PW;D946-B83[BU2183;FE固-P3328];P-2563[FERM畫P2894;IFO13658];IAM-1126[43F];M-l;A506[A5-06];A505[A5-05匿l];A526[A5-26];B69;72;NRRLB-4290;PMW6[NCIB11615];SC12936;Al[IFO15839];F1847[CDC-EB];1，1848[CDC93];NCIB10586;P17;F-12;AmMS257;PRA25;6133D02;6519E01;Ni;SC]5208;BNL-WVC;NCTC2583[NCIB8194];H13;1013[ATCC11251;CCEB295];IFO3903;1062;或Pf-5。在一個實施方案中，宿主細(xì)胞可以是能夠生成感興趣蛋白質(zhì)或多肽的任何細(xì)胞，包括上文所描述的熒光假單胞菌細(xì)胞。由于它們在大型分批培養(yǎng)中相對便宜的生長要求和生產(chǎn)蛋白質(zhì)的潛在能力，用于生成感興趣蛋白質(zhì)或多肽的最常用系統(tǒng)包括某些細(xì)菌細(xì)胞，特別是大腸桿菌。酵母也用于表達(dá)生物學(xué)有關(guān)蛋白質(zhì)和多肽，特別是用于研究目的的。系統(tǒng)包括釀酒酵母(5bcc/flramyce51cerev/w'ae)或巴斯德畢赤氏酵母CP/c/z/a/cwtor/》。這些系統(tǒng)是充分表征的，提供一般可接受水平的總蛋白質(zhì)生成，而且是比較快速且便宜的。昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)也已經(jīng)顯現(xiàn)為用于表達(dá)生物學(xué)活性形式的重組蛋白的備選。在一些情況中，可生成經(jīng)翻譯后修飾的正確折疊的蛋白質(zhì)。哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)(諸如中國倉鼠卵巢細(xì)胞)也已經(jīng)用于表達(dá)感興趣蛋白質(zhì)或多肽。這些表達(dá)系統(tǒng)在小規(guī)模上通常是有效的。某些生物制品可自蛋白質(zhì)衍生，特別是在動物或人保健應(yīng)用中。在另一個實施方案中，宿主細(xì)胞是植物細(xì)胞，包括但不限于煙草細(xì)胞、玉米、來自擬南芥(Arabidopsis)物種的細(xì)胞、馬鈴薯或稻細(xì)胞。57在另一個實施方案中，宿主細(xì)胞可以是原核生物，諸如細(xì)菌細(xì)胞，包括但不限于埃希氏菌屬(Escherichia)或假單胞菌屬(Pseudomonas)物種。典型的細(xì)菌纟田胞記載于例如"BiologicalDiversity:BacteriaandArchaeans，，，即由MJFarabee十專士(EstrellaMountainCommunityCollege,Arizona,USA)在網(wǎng)鄉(xiāng)占www.emc.maricotpa.edu/faculty/farabee/BIOBK/BioBookDiversity才是供的在線生物學(xué)書籍的一章。在某些實施方案中，宿主細(xì)胞可以是假單胞菌細(xì)胞，而且通?？梢允菬晒饧賳伟?xì)胞。在其它實施方案中，宿主細(xì)胞也可以是大腸桿菌細(xì)胞。在另一個實施方案中，宿主細(xì)胞可以是真核細(xì)胞，例如昆蟲細(xì)胞，包括但不限于來自灰翅夜蛾屬(Spodoptera)、粉紋夜蛾屬(Trichoplusia)、果蠅屬(Drosophila)或頂燈蛾屬(Estigmene)物種的細(xì)胞，或哺乳動物細(xì)胞，包括但不限于鼠細(xì)胞、倉鼠細(xì)胞、猴、靈長類或人細(xì)胞。在一個實施方案中，宿主細(xì)胞可以是任何細(xì)菌分類單位的成員。例如，細(xì)胞可以是真細(xì)菌的任何物種的成員。宿主可以是下列分類單位之任一的成員酸桿菌門(Addobacteria)、放線桿菌門(Actinobacteira)、產(chǎn)液菌門(Aquificae)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、綠菌門(Chlorobi)、衣原體門(Chlamydiae)、綠屈撓菌門(Choroflexi)、金礦菌門(Chrysiogenetes)、藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacteria)、脫纟失桿菌門(Deferribacteres)、異常j求菌(Deinococcus)、網(wǎng)團(tuán)菌門(Dictyoglomi)、絲狀桿菌門(Fibrobacteres)、厚壁菌門(Firmicutes)、梭桿菌門(Fusobacteria)、芽單月包菌門(Gemmatimonadetes)、黏膠球形菌門(Lentisphaerae)、；肖4匕蟲系s走菌門(Nitrospirae)、)'孚霉^犬菌門(Planctomycetes)、變形菌門(Proteobacteria)、螺旋體門(Spirochaetes)、熱脫硫桿菌門(Thermodesulfobacteria)、熱孩史菌門(Thermomicrobia)、才西熱對包菌門(The誦togae)、棲熱菌屬(The匪s)(棲熱菌目(The謹(jǐn)les))、或疣微菌門(Vermcomicrobia)。在真細(xì)菌宿主細(xì)胞的一個實施方案中，細(xì)胞可以是真細(xì)菌(除藍(lán)細(xì)菌門之夕卜)的任何物種的成員。細(xì)菌宿主還可以是變形菌門的任何物種的成員。變形菌門宿主細(xì)胞可以是分類單位a-變形菌綱、(3-變形菌綱、Y-變形菌綱、5-變形菌綱或s-變形菌綱中任一種的成員。另夕卜，宿主可以是分類單位a-變形菌綱、(3-變形菌綱或丫-變形菌綱中任一種的成員，和y-變形菌綱的任何物種的成員。在Y-變形菌綱宿主的一個實施方案中，宿主會是分類單位氣單胞菌目(Aeromonadales)、交替單月包菌目(Alteromonadales)、腸4干菌目(Enterobacteriales)、々I單月包菌目(Pseudomonadales)、或黃單月包菌目(Xanthomonadales)中任一種的成員；或腸桿菌目或假單胞菌目的任何物種的成員。在一個實施方案中，宿主細(xì)胞可以是腸桿菌目的，宿主細(xì)胞會是腸桿菌牙牛的成員，或可以是歐文氏菌屬(Erwinia)、埃希氏菌屬(Escherichia)、或沙雷氏菌屬(Serratia)中任一種的成員；或埃希氏菌屬的成員。若宿主細(xì)胞是4i單胞菌目的，則宿主細(xì)胞可以是假單胞菌科的成員，包括假單胞菌屬。y-變形菌綱宿主包括物種大腸桿菌的成員和物種熒光假單胞菌的成員。其它假單胞菌生物體也可能是有用的。假單胞菌和緊密相關(guān)的物種包括革蘭氏陰性變形菌門亞組l,其包括屬于由R.E.Buchanan和N.E.Gibbons(編):Bergey，sManualofDeterminativeBacteriology,頁217-289(第8版，1974)(TheWilliams&WilkinsCo"Baltimore,Md.,USA)(下文中的"Bergey(1974)，，)以"革蘭氏陰性好氧桿菌和球菌"描述的科和/或?qū)俚淖冃尉T組。表7呈現(xiàn)了這些科和屬的生物體。表7:"革蘭氏陰性好氧桿菌和球菌"部分(Bergey(1974))中所列的科和屬牙牛I,j叚單月包菌牙斗(Pseudomomonaceae)葡糖桿菌屬(Gluconobacter)寸艮單月包菌屬(Pseudomonas)黃單胞菌屬(Xanthomonas)動膠菌屬(Zoogloea)科II.固氮菌科(Azotobacteraceae)氮單月包菌屬(Azomonas)固氮菌屬(Azotobacter)拜p十一木克氏菌屬(Beijerinckia)德克斯氏菌屬(Derxia)科III.根瘤菌科(Rhizobiaceae)土》裏^干菌屬(Agrobacterium)才艮瘤菌屬(Rhizobium)科IV.曱基單胞菌科(Methylomonadaceae)曱基球菌屬(Methylococcus)曱基單胞菌屬(Methylomonas)科V.鹽桿菌科(Halobacteriaceae)鹽桿菌屬(Halobacterium)鹽球菌屬(Halococcus)其它屬醋桿菌屬(Acetobacter)產(chǎn)威菌屬(Alcaligenes)博德特氏菌屬(Bordetella)59<table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table>"革蘭氏陰性變形菌門亞組l"還包括依照分類中所使用的標(biāo)準(zhǔn)會分類在此標(biāo)題中的變形菌門。該標(biāo)題還包括先前分類在此部分中但不再在此部分中的組，諸如食酸菌屬(Acidovorax)、短波單胞菌屬(Brevundimonas)、伯克霍爾德氏菌屬(Burkholderia)、氫噬胞菌屬(Hydrogenophaga)、海洋單胞菌屬(Oceanimonas)、羅爾斯通氏菌屬(Ralstonia)、和寡養(yǎng)單月包菌屬(Stenotrophomonas)，鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)(及自其衍生的屬芽單胞菌屬(Blastomonas))(其通過對屬于黃單胞菌屬(且先前稱為黃單胞菌屬的種)的生物體重新分組而創(chuàng)建)、酸單胞菌屬(Acidomonas)(其通過對屬于Bergey(1974)中定義的醋桿菌屬(Acetobacter)的生物體重新分組而創(chuàng)建)。另外，宿主可包括來自下組的細(xì)胞假單胞菌屬、海洋假單胞菌(尸化M^wo"os(ATCC14393)、生黑假單胞菌(尸化M^mo"wm'g〃/"c^;w')(ATCC19375)、和腐敗假單胞菌(尸化w^wo"^/wfre/ac/em)(ATCC8071),它們已經(jīng)分別被重新分類為河豚毒素交替單胞菌04"eramo朋skj/，/a獻(xiàn)to)、產(chǎn)黑交替單月包菌(yl/z^ra附owaww'gn力c/e朋)、和腐敗交3齊單月包菌(yl/eramtwas/zz/re/flc,'era)。類似、i4，例^口后來食酉交4艮單月包菌(尸化wciowcwas1flc/(iovora似)(ATCC15668)和睪丸酮假單胞菌(尸化w^wo"OT(ATCC11996)已經(jīng)被分別重新分類為食酸叢毛單胞菌(Cb,www"asac/Jovorara)和睪丸酮叢毛單胞菌(Cbwawo"asfe^oWeram');而生黑假單胞菌(ATCC19375)和殺魚假單胞菌(尸化^owo"^;^c/c/Ja)(ATCC15057)已經(jīng)被分別重新分類為生黑假交替單月包菌CP化Mcfoa/terawo"a5"w'g/^y^c/e似)牙口殺魚1支交替單月包菌(尸化^fofl/teramo腦5p&c/cWa)。"革蘭氏陰性變形菌門亞組1，，還包括變形菌門中分類為屬于任何如下科的假單胞菌科、固氮菌科(現(xiàn)在通常以同義詞即假單胞菌科的"固氮菌組"稱呼)、根瘤菌科、和甲基單胞菌科(現(xiàn)在通常以同義詞即"曱基球菌科，，稱呼)。因此，在那些于本文中其它部分所述的屬之外，變形菌門中落入"革蘭氏陰性變形菌門亞組r內(nèi)的其它屬包括l)嗜氮根瘤菌屬(Azorhizophilus)的固氮菌組細(xì)菌；2)纖維弧菌屬(Cellvibrio)、寡源桿菌屬(Oligella)、和Teredinibacter的假單胞菌科細(xì)菌；3)螯合桿菌屬(Chelatobacter)、嚙'J菌屬(Ensifer)、Liberibacter(也-爾為"CandidatusLiberibacter")、和中華才艮瘤菌屬(Sinorhizobium)的才艮瘤菌牙牛細(xì)菌；及4)甲基細(xì)菌屬(Methylobacter)、曱基暖菌屬(Methylocaldum)、曱基農(nóng)i菌屬(Methylomicrobium)、曱基八疊球菌屬(Methylosarcina)、和甲基3求形菌屬(Methylosphaera)的曱基球菌科細(xì)菌。在另一個實施方案中，宿主細(xì)胞選自"革蘭氏陰性變形菌門亞組2"。"革蘭氏陰性變形菌門亞組2"定義為下列屬的變形菌門組(在圓括號中指明產(chǎn)品目錄列出的、公眾可獲得的、已保藏的其菌林的總數(shù)，均保藏于ATCC,除非另有指明)酸單胞菌屬(2);酸桿菌屬(93);葡糖桿菌屬(37);短波單胞菌屬(23);拜葉林克氏菌屬(Beyerinckia)(13);德克斯氏菌屬(2);布魯氏菌屬(4);土壤桿菌屬(79);螯合桿菌屬(2);劍菌屬(3);才艮瘤菌屬(144);中華根瘤菌屬(24);芽單胞菌屬(l);鞘氨醇單胞菌屬(27);產(chǎn)石咸菌屬(88);博德特氏菌屬(43);伯克霍爾德氏菌屬(73);羅爾斯通氏菌屬(33);食酸菌屬(20);氫噬胞菌屬(9);動膠菌屬(9);曱基細(xì)菌屬(2);曱基暖菌屬(在NCIMB的l種)；曱基球菌屬(2);曱基微菌屬(2);甲基單胞菌屬(9);曱基八疊球菌屬(l);曱基球形菌屬；氮單胞菌屬(9);嗜氮根瘤菌屬(5);固氮菌屬(64);纖維弧菌屬(3);寡源桿菌屬(5);假單胞菌屬(1139);弗朗西絲氏菌屬(4);黃單胞菌屬(229);寡養(yǎng)單胞菌屬(50);和海洋單胞菌屬(4)。"革蘭氏陰性變形菌門亞組2"的例示性宿主細(xì)胞物種包括但不限于下列細(xì)菌(在圓括號中顯示其例示性菌抹的ATCC或其它保藏號)曱醇酸單胞菌(」c/(io歸顧膨A(3"o//—(ATCC43581);醋化醋桿菌(Jceto/a"erac幼〕(ATCC15973);氧化葡糖桿菌(G7"co"o6acferox少&m)(ATCC19357);缺陷短波單胞菌(^^v,Amo腦sA脂'冊to)(ATCC11568);印度拜葉林克氏菌C8e,)'en'"ch'a/"&ca)(ATCC9039和ATCC19361);膠德克斯氏菌gwmwow)(ATCC15994);馬耳他布魯氏菌CSrace〃a(ATCC23456);流產(chǎn)布魯氏菌(&wce//aWoW^)(ATCC23448);根癌土壤桿菌(Xgro6a"en'wmfwme/ac/em1)(ATCC23308)、》文射形土i裏沖干菌(v4gro6a"en'wmrad/o6acfer)(ATCC19358)、發(fā)才艮土壤桿菌(^grakcten'wwr/z/zogewe力(ATCC11325);何氏螯合桿菌(C7ze/atoZ^"er/^'"te")(ATCC29600);粘著劍菌(五m77^"a(i/2aerem1)(ATCC33212);豆死豆才艮瘤菌(//z/zo6z'Mm/egM/w'/msan/w)(ATCC10004);費氏中華根瘤菌(S/"oA/zoZ)/m/w(ATCC35423);5/osto附o"(zs1"atoton'a(ATCC35951);少動鞘氨醇單月包菌(5^/7/"gomowas61p做c/wo&fo)(ATCC29837);糞產(chǎn)i咸菌(^/c""gew^/aecato)(ATCC8750);百曰咳博德特氏菌(5orafe&〃apeWw^/力(ATCC9797);洋蔥伯克霍爾德氏菌CSwr狄o/(ien.acepac/a)(ATCC25416);皮氏羅爾斯通氏菌屬(ia&tom.ap/cfem7)(ATCC27511);敏捷食酸菌04cWovorax/a"7&)(ATCC11228);黃色氬噬胞菌(/fy(iragewci/7/z(3g"_/7avo)(ATCC33667);生枝動膠菌(Zoog7oear函/gera)(ATCC19544);藤黃曱基細(xì)菌(Mw/^/oZ^cter/w&w力(ATCC49878);Ma/7>Voca/<iMmgrac,/e(NCIMB11912);莢膜甲基J求菌0W^/2y/ococcwsca/ww/af附)(ATCC19069);活潑曱基微菌(Me/;^/om/craWwmap7e)(ATCC35068);曱烷曱基單胞菌(Me^y/omo"osweAam.ca)(ATCC35067);她f/2少/osa/r細(xì),Zrato(ATCC700909);Me~/，/z<aeraA(ms細(xì)7(ACAM549);敏捷氮單胞菌(j加wo"oy(ATCC7494);雀稗嗜氮根瘤菌(/^0^&0;/7^p^;a//)(ATCC23833);褐球固氮菌0^oto6acferc/zraococcww)(ATCC9043);混合纖維弧菌(Ce〃vAn'om"/M力(UQM2601);尿道寡源桿菌((9//ge〃ai^Ara//》(ATCC17960);銅綠假單胞菌CPseMcfomo"waen/g/wasa)(ATCC0145)，熒光假單胞菌(尸化wcfowo腦sy/womce"s)(ATCC35858);土拉熱弗朗西絲氏菌(Fra/'化〃a似/fl"m/力(ATCC6223);嗜麥芽糖寡養(yǎng)單月包菌(5Vewo"'o//zowow(3w附a/to//H7/a)(ATCC13637);罷予油菜黃單月包菌(義aW/7owowflst'"附/e邊刮(ATCC33913);和(9caaw/ww7ascfowdora^/(ATCC27123)。在另一個實施方案中，宿主細(xì)胞選自"革蘭氏陰性變形菌門亞組3"。"革蘭氏陰性變形菌門亞組3"定義為下列屬的變形菌門組短波單胞菌屬；土壤桿菌屬；根瘤菌屬；中華根瘤菌屬；芽單胞菌屬；鞘氨醇單胞菌屬；產(chǎn)堿菌屬；伯克霍爾德氏菌屬；羅爾斯通氏菌屬；食酸菌屬；氫噬胞菌屬；曱基細(xì)菌屬；曱基暖菌屬；曱基球菌屬；曱基微菌屬；曱基單胞菌屬；曱基八疊球菌屬；曱基球形菌屬；氮單胞菌屬；嗜氮根瘤菌屬；固氮菌屬；纖維弧菌屬；寡源桿菌屬；假單胞菌屬；Teredinibacter;弗朗西絲氏菌屬；寡養(yǎng)單胞菌屬；黃單胞菌屬；和海洋單胞菌屬。在另一個實施方案中，宿主細(xì)胞選自"革蘭氏陰性變形菌門亞組4"。"革蘭氏陰性變形菌門亞組4"定義為下列屬的變形菌門組短波單胞菌屬；芽單胞菌屬；鞘氨醇單胞菌屬；伯克霍爾德氏菌屬；羅爾斯通氏菌屬；食酸菌屬；氫噬胞菌屬；曱基細(xì)菌屬；曱基暖菌屬；曱基球菌屬；曱基微菌屬；曱基單胞菌屬；曱基八疊球菌屬；曱基球形菌屬；氮單胞菌屬；嗜氮根瘤菌屬；62固氮菌屬；纖維弧菌屬；寡源桿菌屬；假單胞菌屬；Teredinibacter;弗朗西絲氏菌屬；寡養(yǎng)單胞菌屬；黃單胞菌屬；和海洋單胞菌屬。在另一個實施方案中，宿主細(xì)胞選自"革蘭氏陰性變形菌門亞組5"。"革蘭氏陰性變形菌門亞組5"定義為下列屬的變形菌門組甲基細(xì)菌屬；曱基暖菌屬；曱基球菌屬；曱基微菌屬；曱基單胞菌屬；曱基八疊球菌屬；曱基球形菌屬；氮單胞菌屬；嗜氮根瘤菌屬；固氮菌屬；纖維弧菌屬；寡源桿菌屬；假單胞菌屬；Teredinibacter;弗朗西絲氏菌屬；寡養(yǎng)單胞菌屬；黃單胞菌屬；和海洋單胞菌屬。宿主細(xì)胞可選自"革蘭氏陰性變形菌門亞組6"。"革蘭氏陰性變形菌門亞組6"定義為下列屬的變形菌門組短波單胞菌屬；芽單胞菌屬；鞘氨醇單胞菌屬；伯克霍爾德氏菌屬；羅爾斯通氏菌屬；食酸菌屬；氫噬胞菌屬；氮單胞菌屬；嗜氮根瘤菌屬；固氮菌屬；纖維弧菌屬；寡源桿菌屬；假單胞菌屬；Teredinibacter;寡養(yǎng)單胞菌屬；黃單胞菌屬；和海洋單胞菌屬。宿主細(xì)胞可選自"革蘭氏陰性變形菌門亞組7"。"革蘭氏陰性變形菌門亞組7"定義為下列屬的變形菌門組氮單胞菌屬；嗜氮根瘤菌屬；固氮菌屬；纖維弧菌屬；寡源桿菌屬；假單胞菌屬；Teredinibacter;寡養(yǎng)單胞菌屬；黃單胞菌屬；和海洋單胞菌屬。宿主細(xì)胞可選自"革蘭氏陰性變形菌門亞組8"。"革蘭氏陰性變形菌門亞組8"定義為下列屬的變形菌門組短波單胞菌屬；芽單胞菌屬；鞘氨醇單胞菌屬；伯克霍爾德氏菌屬；羅爾斯通氏菌屬；食酸菌屬；氫噬胞菌屬；假單胞菌屬；寡養(yǎng)單胞菌屬；黃單胞菌屬；和海洋單胞菌屬。宿主細(xì)胞可選自"革蘭氏陰性變形菌門亞組9"。"革蘭氏陰性變形菌門亞組9"定義為下列屬的變形菌門組短波單胞菌屬；伯克霍爾德氏菌屬；羅爾斯通氏菌屬；食酸菌屬；氫噬胞菌屬；假單胞菌屬；寡養(yǎng)單胞菌屬；和海洋單胞菌屬。宿主細(xì)胞可選自"革蘭氏陰性變形菌門亞組10"。"革蘭氏陰性變形菌門亞組10"定義為下列屬的變形菌門組伯克霍爾德氏菌屬；羅爾斯通氏菌屬；假單胞菌屬；寡養(yǎng)單胞菌屬；和黃單胞菌屬。宿主細(xì)胞可選自"革蘭氏陰性變形菌門亞組ll"。"革蘭氏陰性變形菌門亞組ll"定義為下列屬的變形菌門組假單胞菌屬；寡養(yǎng)單胞菌屬；和黃單胞菌屬。宿主細(xì)胞可選自"革蘭氏陰性變形菌門亞組12"。"革蘭氏陰性變形63菌門亞組12"定義為下列屬的變形菌門組'.伯克霍爾德氏菌屬；羅爾斯通氏菌屬；假單胞菌屬。宿主細(xì)胞可選自"革蘭氏陰性變形菌門亞組13"。"革蘭氏陰性變形菌門亞組13"定義為下列屬的變形菌門組伯克霍爾德氏菌屬；羅爾斯通氏菌屬；假單胞菌屬；和黃單胞菌屬。宿主細(xì)胞可選自"革蘭氏陰性變形菌門亞組14"。"革蘭氏陰性變形菌門亞組14"定義為下列屬的變形菌門組假單胞菌屬和黃單胞菌屬。宿主細(xì)胞可選自"革蘭氏陰性變形菌門亞組15"。"革蘭氏陰性變形菌門亞組15"定義為假單胞菌屬的變形菌門組。宿主細(xì)胞可選自"革蘭氏陰性變形菌門亞組16"。"革蘭氏陰性變形菌門亞組16"定義為下列假單胞菌物種的變形菌門組(在圓括號中顯示了例示性菌抹的ATCC或其它保藏號)i^ewdomowasaZ^tom>/z//a(ATCC700689);銅綠假單胞菌(i^eM^wcww^n^/"osa)(ATCC10145);產(chǎn)堿假單胞菌(ATCC14909);病鱔々I單月包菌(戶化"(icw70"ayawgwz'〃^e/^cfl)(ATCC33660);香茅醇々支單月包菌(尸化M(icw7wzayc"ra"e〃ofc)(ATCC13674);變黃假單胞菌(尸化Mcfowo"as/7m^ce"力(ATCC51555);門多薩假單胞菌(尸^^/o"w"^mem/oc/"")(ATCC25411);硝基還原假單胞菌(/^ez^/omo"(Zs(ATCC33634);食油<叚單月包菌(/^ewdomowoso/eovoram1)(ATCC8062);類產(chǎn)石咸葉叚單月包菌(尸"W(iomowa/wewdoa/cfir/Zgewas1)(ATCC17440);食樹脂假單胞菌(尸^w6fomo"osm^'"ovorara)(ATCC14235);稻草假單胞菌(尸化wt/omo腦sWra服'"ea)(ATCC33636);傘菌假單月包菌(尸A，(io附ow(a^aga廠/('0(ATCC25941);/^ewdomowosa/ca/一z,/a;尸化M(io附o腦so/g/wovora;尸seM(io"7(9was1aw<iersom'/;4失角蕨"f艮單月包菌(尸sew(iomowfls<3wp/em7)(ATCC23835);壬二酸假單月包菌(尸wwdowo"ay"ze/a/ca)(ATCC27162);拜氏々i單月包菌(尸^M(iomowas6e_yen>ch7)(ATCC19372);Zwreafc;北i成々I單月包菌(i^ewcfowowas(ATCC33662);Z尸owz,caceflra附；食丁酉臾1^單月包菌CPjeM(icww7asZwto"ovora)(ATCC43655);T^ewcfomowasce〃w/osa(ATCC55703);桔黃^l單月包菌(i^ei/(iomowasawra"riaca)(ATCC33663);綠針假單胞菌CPsew^ww"wc/z/orarap/z/力(ATCC9446,ATCC13985，ATCC17418,ATCC17461);莓實假單胞菌OP化Mcfowo"w/rag0(ATCC49");隆德假單胞菌(i^ew^mo"os/m"&"m》(ATCC4"68);腐臭假單胞菌(尸化W(io附o/7as1taefra/ms)(ATCC4683);青紫葛假單胞菌(/^ew<iomcwas"M/co/a)(ATCC33616);暈斑假單胞菌(尸"Mt/omo"cwcorawq/^f".ms);64尸sew(icw(9"asci/te^pemj^/n'/a;4申長布支單月包菌(尸seM(iomow(xye/o"gata)(ATCC10144);彎曲假單胞菌(尸w"^mo"osy/e"ms)(ATCC12775);產(chǎn)氮假單胞菌(尸化M(iowo""sazc^q/^，(3ra);/^Womo"oy6re""g〃'；i^ewc/o附o"oyce<ire〃"；鈹纟丈布I單月包菌(/^ewt/cwo"oco;rwg(3e)(ATCC29736);尸化wflbm(9"as熒光布支單月包菌(/^ew(iomowwyZwomscera)(ATCC35858);尸化z^cwo"agrasaW/;/z'Z)""e腦、；尸化wcfowo"as1wa"cfe/〃(ATCC700871);邊緣假單胞菌(/^ew^mo"osma^/"a"力(ATCC10844);/^ewt/omowas1m/gw/ae;霉口未々支單月包菌(i^ewcfomowaywwczWo/era)(ATCC4685);東方"f叚單月包菌(尸化M^ifomo;7as:on'ewto/Z力；尸sewc/owowosr/zocfes/ae;類黃々支單月包菌(尸化M(i細(xì)(9way，xa涵")(ATCC9890);托拉氏假單胞菌(尸化W(io膨wayto/aos7./)(ATCC33618);尸5eM^fomowosveram7(ATCC700474);i^eMt/owo"os1^^/en'fe^e/^em^;彎曲々支單月包菌(i^ewdomowoygem'cw/ato)(ATCC19374);尸化wtfowo"os1g/"gen';i^ewcfomo/^gra加'm's;格氏假單胞菌(/^ewc/cwcwaygr/mcw"z');鹽脫氮1"艮單月包菌(/^ei^fow(9"as1/za/cxiew"nyC(3ra);口耆鹽作￡單月包菌(As'eM(io附o/7as1Zza/op/zZ/a);才西木沖堇布支單月包菌(7^ew(i(9momw/z/Z^c/co/a)(ATCC19867);哈特假單胞菌(尸化w^wo"似/wm'emz'力(ATCC14670);噬氫假單胞菌(尸sew(:/o附(9way/zj^ragewovora);/^ez^/。wcwoyy'es^em7.(ATCC700870);/^ewt/ow(9wash7o/7e"s&;/^ew^iowowas"/awceo/ato;(ATCC14669);Z^eM(iomo"a5//"/;劃界假單胞菌(/^e^owowomarg/腦to)(ATCC25417);臭味假單胞菌"7e//7//7'ca)(ATCC33665);脫氮々I單月包菌(尸化wt/om(9"ast/emYr折cara)(ATCC19244);百日咳々支單月包菌(尸"iAiomowaypeWwc/"ogewa)(ATCC190);皮克特假單胞菌CP化Mcfowo"asp/ctoram)(ATCC23328);尸5ew(iomowos1/^syc/zrap/w'/a;黃凈曷，支單月包菌//va)(ATCC31418);蒙氏1支單月包菌(尸5e^/o附6wosmo"fe〃")(ATCC700476);/^ewcsfowcwawas^e///;才西稻々支單月包菌(/^ewcfomcwayo/3^z7za6/tom)(ATCC43272);變形，支單胞菌(尸wwt/owo"asp/ecog/o^z'c/^)(ATCC700383);惡臭假單胞菌(尸sew(iomcwas1/M〃(i(2)(ATCC12633);i^ew/omowosreactara;多刺4,支單月包菌(尸sewfifomow(35s//"o9a)(ATCC14606);Za/ean'ca;》'戔黃々支單月包菌(7^ewfifomowas/wteo/a)(ATCC43273);施氏々支單月包菌(/^eMctomo"asWwteen')(ATCC17588);扁桃假單胞菌CP化w^wo"wam_Kgt/a//)(ATCC33614);尸sew(iowo"ayave〃朋ae(ATCC700331);番木瓜假單胞菌(/^ewofcw70"as65can'cflpa/a_yae)(ATCC33615);菊苣,支單月包菌(/^e"(iowowas1c/c/zon.z')(ATCC10857);天仙果假單胞菌OP化wfifomomw,cwectoe)(ATCC35104);褐鞘假單月包菌(T^ew(icwo"a5/"scovag/"ae);苦才束々i單月包菌(ATCC33050);丁香假單胞菌CP化^fowo"os矽n'"goe)(ATCC19310);綠黃假單胞菌(ftew^mo"osWn^yara)(ATCC13223);熱食碳酸假單胞菌(尸5^M(iomo"as1^2emoc(3T6oxy(iovorara)(ATCC35961);耐熱々支單月包菌(尸jgM(^o附o"o/2er附c^o/^73"s);//2/verva/e"j7.j;;J顯哥華^艮單刀包菌(尸化m^wo"wva"cowe^"^)(ATCC700688);威斯康辛假單胞菌(尸sew(iomo"as1w/sco"w."em7、)；禾口廈門^支單月包菌(/^ew(iomoway:d(2me"ews/s)。宿主細(xì)胞可選自"革蘭氏陰性變形菌門亞組17"。"革蘭氏陰性變形菌門亞組17"定義為本領(lǐng)域中已知"發(fā)熒光的假單胞菌"的變形菌門組，所述發(fā)焚光的假單胞菌包括那些屬于例如下列假單胞菌物種的產(chǎn)氮假單胞菌；尸seMcfo附0was1ex^ewon'ewto//s;熒光，支單月包菌；i^ewciowowfiwge^ara//;f^e〃c/omowas1//6twem，/s;jPsewdomwzas1邊纟彖"(叚單月包菌；尸化M(icw70W(5wm/gw/"e;霉味假單月包菌；東方假單胞菌；尸化"(iomowasr/z<9<ias7'ae;類黃布支單胞菌；托拉氏假單月包菌；和尸wMt/owo"氾其它合適的宿主包括那些分類在參考文獻(xiàn)的其它部分中的，諸如革蘭氏(+)變形菌門。在一個實施方案中，宿主細(xì)胞是大腸桿菌。已經(jīng)為大腸桿菌MG1655建立了大腸桿菌的基因組序列(Blattner等(1997)ThecompletegenomesequenceofEscherichiacoliK-12,Science277(5331):1453-74),而且對于大腸桿菌K12，DNA微陣列是商品化的(MWGInc,HighPoint,N.C.)。大腸桿菌可在豐富培養(yǎng)基諸如Luria-Bertani(LB)(10g/L胰蛋白胨、5g/LNaCl、5g/L酵母提取物)或具有合適的碳源(諸如1%葡萄糖)的限定基本培養(yǎng)基諸如M9(6g/LNa2HP04、3g/LKH2P04、lg/LNH4Cl、0.5g/LNaCl、pH7.4)中培養(yǎng)。常規(guī)的是，將大腸桿菌細(xì)胞的過夜培養(yǎng)物稀釋，并接種入搖瓶或發(fā)酵罐中的新鮮的豐富培養(yǎng)基或基本培養(yǎng)基中，并于37。C培養(yǎng)。宿主細(xì)胞也可以是哺乳動物起源的，諸如自包括任何人或非人哺乳動物的哺乳動物衍生的細(xì)胞。哺乳動物可以包括但不限于靈長類、猴、豬(porcine)、綿羊(ovine)、牛、嚙齒類、有蹄類、豬(pig)、豬(swine)、綿羊(sheep)、羔羊、山羊、牛、鹿、騾、馬、猴、猿、犬、貓、大鼠、和小鼠。宿主細(xì)胞也可以是植物起源的。可以選擇來自任何植物的細(xì)胞以在其中篩選感興趣異源蛋白質(zhì)的生成。合適的植物的例子包括但不限于苜蓿(alfalfa)、蘋果(apple)、杏(apricot)、擬南芥(Arabidopsis)、朝鮮薊(artichoke)、芝麻菜(arugula)、,夢(asparagus)、金f梨(avocado)、香蕉(banana)、大麥(barley)、豆類(beans)、甜菜(beet)、黑莓(blackberry)、藍(lán)莓(blueberry)、花椰菜(broccoli)、4包子甘藍(lán)(brusselssprouts)、甘藍(lán)(cabbage)、蕓苔(canola)、網(wǎng)纟丈瓜(cantaloupe)、胡蘿卜(carrot)、木薯(cassaya)、蓖麻(castorbean)、花椰菜(cauliflower)、芽菜(celery)、櫻桃(cheny)、菊苣(chicory)、芫荽(cilantro)、柑橘(citrus)、克萊門氏小柑橘(Clementines)、車軸草(clover)、椰子(coconut)、咖啡(coffee)、玉米(corn)、棉(cotton)、酸果蔓(cranberry)、黃瓜(cucumber)、黃杉(Douglasfir)、癡子(eggplant)、苣荬菜(endive)、菊苣(escarole)、按(eucalyptus)、茴香(fennel)、無花果(figs)、蒜(garlic)、葫蘆(gourd)、葡萄(grape)、葡萄柚(grapefruit)、蜜瓜(honeydew)、豆薯(jicama)、獼猴桃(kiwifruit)、萵苣(lettuce)、蔥(leeks)、檸檬(lemon)、來檬(lime)、火炬松(Loblollypine)、亞麻(linseed)、芒果(mango)、《計瓜(mdon)、蘑恭(mushroom)、油沖兆(nectarine)、堅果(nut)、燕麥(oat)、油4樂(oilpalm)、油菜(oilseedrape)、牙火葵(okra)、扭t才覽(olive)、蔥(onion)、#計橘(orange)、觀賞植物、棕櫚(palm)、番木瓜(papaya)、歐芹(parsley)、歐防風(fēng)(parsnip)、豌豆(pea)、桃(peach)、花生(peanut)、梨(pear)、胡椒(pepper)、柿子(persimmon)、4公(pine)、鳳梨(pineapple)、車前(plantain)、4每(plum)、石才留(pomegranate)、楊(poplar)、馬鈴薯(potato)、南瓜(p腿pkin)、榲梓(quince)、輻射沖公(radiatapine)、菊苣(radiscchio)、蘿卜(radish)、油菜沖予(rapeseed)、懸鉤子(raspberry)、稻(rice)、黑麥(rye)、高粱(sorghum)、南方^^(Southempine)、大豆(soybean)、蔆菜(spinach)、西葫蘆(squash)、草莓(strawberry)、甜菜(sugarbeet)、甘蔗(sugarcane)、向曰葵(sunflower)、甘薯(sweetpotato)、才風(fēng)香樹(sweetgum)、橘(tangerine)、茶(tea)、煙草(tobacco)、番癡(tomato)、黑小麥(1xiticale)、草皮(turf)、芫箐(turnip)、藤(vine)、西瓜(watermelon)、小麥(wheat)、薯蕷(yam)、和綠皮西葫蘆(zucchini)。在一些實施方案中，所述方法中有用的植物是擬南芥、玉米、小麥、大豆、和棉。試劑盒本發(fā)明還提供了對于鑒定如下宿主菌抹(例如熒光假單胞菌宿主菌抹)67有用的試劑盒，所述宿主菌抹對于生成感興趣的異源蛋白質(zhì)或多肽是最佳的。試劑盒包含多種表型獨特的宿主細(xì)胞，其中每個群體已經(jīng)進(jìn)行過遺傳修飾以提高一種或多種牽涉蛋白質(zhì)生成的靶基因的表達(dá)和/或降低一種或多種牽涉蛋白質(zhì)降解的靶基因的表達(dá)。陣列可以進(jìn)一步包含一個或多個如下細(xì)胞群體，其沒有進(jìn)行過遺傳修飾以調(diào)控牽涉蛋白質(zhì)生成的基因或牽涉蛋白質(zhì)降試劑以及供感興趣的異源蛋白質(zhì)或多肽表達(dá)用的試劑和/或構(gòu)建體。試劑盒中可以以任何適合于細(xì)胞群體貯存、轉(zhuǎn)運、和重建的方式提供宿主細(xì)胞群體?？梢栽诠苤?、在板上、或者在斜面上提供活著的細(xì)胞群體，或者可以在管或管形瓶中保存冷凍干燥的或冷凍的細(xì)胞群體。細(xì)胞群體可以包含貯存培養(yǎng)基中的別的成分，諸如甘油、蔗糖、清蛋白、或其它合適的保護(hù)劑或貯存劑。為了例示而非為了限制，^是供了以下實施例。實施例總論異源蛋白質(zhì)生成經(jīng)常導(dǎo)致不溶性或不正確折疊的蛋白質(zhì)的形成，所述不溶性或不正確折疊的蛋白質(zhì)難以恢復(fù)，而且可能是沒有活性的。此外，特定宿主細(xì)胞蛋白酶的存在可以降解感興趣的蛋白質(zhì)，如此降低最終的產(chǎn)量。沒有會改善所有異源蛋白質(zhì)生成的單一因素。如此，尋找一種方法來從可能的候選物庫鑒定對特定異源蛋白質(zhì)特異性的因素。使用SystemsBiology工具，挖掘熒光假單胞菌基因組來鑒定宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)折疊調(diào)控物和蛋白酶基因。然后，實施整體基因表達(dá)分析來以優(yōu)先順序排列上調(diào)的靶物，此后，構(gòu)建新的蛋白質(zhì)生產(chǎn)菌抹。結(jié)果，裝配"Pfenex菌抹陣列"，其由多種表型獨特的熒光假單胞菌宿主菌抹組成，所述表型獨特的熒光假單胞菌宿主菌抹是宿主細(xì)胞蛋白酶缺陷的或者容許蛋白質(zhì)折疊調(diào)控物的共過表達(dá)?？梢允褂么司嚵衼砗Y選特異性增強(qiáng)某些異源蛋白質(zhì)產(chǎn)量或質(zhì)量的因素。提供多種表型獨特的宿主菌抹增加成功鑒定如下宿主菌林的機(jī)會，所述宿主菌株會提高任何個別的感興趣異源蛋白質(zhì)的生成。本發(fā)明提供了熒光假單胞菌中異源蛋白質(zhì)生成的改善。具有可用的相同遺傳背景中的宿主菌抹文庫容許快速篩選和鑒定提高異源表達(dá)的蛋白質(zhì)的產(chǎn)量和/或質(zhì)量的因素。已經(jīng)給熒光假單胞菌的基因組序列作注釋，并且已經(jīng)68鑒定出被靶定的宿主細(xì)胞折疊調(diào)控物和蛋白酶。折疊調(diào)控物幫助蛋白質(zhì)的正確折疊，并且包括伴侶蛋白、陪伴蛋白、肽基-脯氨酰異構(gòu)酶(PPI酶)、和二硫鍵形成蛋白。蛋白酶可以降解感興趣的蛋白質(zhì)，如此影響異源蛋白質(zhì)產(chǎn)量和質(zhì)量。使用來自文獻(xiàn)的背景知識和DNA^:陣列分析來鑒定可能的靶物，匯編了約80種靶基因的列表。在具有相同遺傳背景的宿主細(xì)胞中，將這些基因自基因組除去或克隆入質(zhì)粒中以能夠與異源蛋白質(zhì)一起共過表達(dá)。以96孔形式排列所得的菌林，并在轉(zhuǎn)化表達(dá)感興趣的異源蛋白質(zhì)的質(zhì)粒后，篩選改善的蛋白質(zhì)產(chǎn)量和/或質(zhì)量。實施例l:熒光假單胞菌菌林MB214基因組中折疊調(diào)控物基因的鑒定折疊調(diào)控物是一類存在于所有細(xì)胞中的蛋白質(zhì)，其幫助對新生的和異源的多肽的折疊、解折疊和降解。折疊調(diào)控物包括伴侶蛋白、陪伴蛋白、肽基-脯氨酰順反異構(gòu)酶、和牽涉蛋白質(zhì)二硫鍵形成的蛋白質(zhì)。作為構(gòu)建具有幫助折疊異源蛋白質(zhì)能力的新的生產(chǎn)菌抹的第一步，挖掘熒光假單胞菌基因組以鑒定宿主細(xì)胞折疊調(diào)控物基因。使用以下方法來對焚光假單胞菌MB214基因組中6,433種預(yù)測的ORF之每一種分析它們編碼折疊調(diào)控物的概率。Dow研究人員已經(jīng)通過對基因組注釋的分析鑒定出數(shù)種感興趣的折疊調(diào)控物(Ramseier等2001)。使用蛋白質(zhì)/蛋白質(zhì)BLAST來鑒定這些起始蛋白質(zhì)的同系物，其中起始蛋白質(zhì)作為詢問(query),而所有MB214翻譯的ORF的數(shù)據(jù)庫作為對象(subject)。將那些以顯著的同源性匹配詢問蛋白質(zhì)的翻譯ORF添加至列表以進(jìn)一步分析。顯著的同源性在這里定義為具有l(wèi)e-30或更小的e得分，其中允許基于比對長度和質(zhì)量進(jìn)行的人判斷。此研究的意圖是要非常廣泛，以使所有潛在的折疊調(diào)控物會得到鑒定的機(jī)會最大化?；谄鋪碜院嘘P(guān)鍵詞"伴侶蛋白"的先前注釋的安排功能，將更多種ORF添加至列表。最后，通過蛋白質(zhì)特征(signature)家族搜尋程序InterProScan(Quevillon等2005)針對InterPro數(shù)據(jù)庫第7.0版(Mulder等2005)分析所述ORF。由InterProScan軟件給ORF指定蛋白質(zhì)家族以及與那些家族有關(guān)的基因本體論(GeneOntology,GO)分類(GeneOntologyConsortium.2004)。4吏用這些自動GO指定，將所有已經(jīng)指定GO項"GO:0006457生物學(xué)過程蛋白質(zhì)折疊，，或"GO:0003754分子功能伴侶蛋白活性'，的ORF添加至列表以進(jìn)行進(jìn)一步分析。然后分析列表以除去具有低的編碼折疊調(diào)控物的概率的ORF。再一次，此研究的意圖是要非常廣泛的，但是通過這些半自動化方法而指定至列表的許多ORF基于有限的標(biāo)準(zhǔn)和人判斷可以被容易地鑒定為不編碼折疊調(diào)控物。排除某種ORF的最常見理由是此ORF實際上是折疊調(diào)控物的證據(jù)較弱，即如下的基于先前的注釋而已經(jīng)被指定至列表的ORF，其中用于將ORF注釋為折疊調(diào)控物的推理是不清楚的或矛盾的。InterProScan實際上是不同程序的集成，并且認(rèn)為這些程序中的一些比其它的更可靠。如果僅基于ScanRegExp或ProfileScan組件(component)的輸出將ORF指定至列表，那么將其除去。熒光假單胞菌折疊調(diào)控物的最終列表具有43位成員，并顯示于表l中。實施例2:熒光假單胞菌菌林MB214基因組中蛋白酶基因的鑒定蛋白酶是水解肽鍵且對所有活的生物的存活必需的酶。然而，它們在細(xì)胞中的作用意味著蛋白酶對任何異源蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)(其也包括Pfenex表達(dá)技術(shù)TM)中的重組蛋白質(zhì)產(chǎn)量和/或質(zhì)量可以是不利的。作為構(gòu)建自基因組除去蛋白酶基因的新的生產(chǎn)菌抹的第一步，挖掘熒光假單胞菌基因組以鑒定宿主細(xì)胞蛋白酶基因。使用以下方法來對熒光假單胞菌MB214基因組中6,433種預(yù)測的ORF之每一種分析它們編碼蛋白酶的概率。WellcomeTrustSanger研究所(Cambridge，UK)的研究人員手工安排了MEROPS數(shù)據(jù)庫(Rawlings等2006,http:〃merops.sanger.ac.uk)。它是經(jīng)由實驗室實驗以及通過與已知蛋白酶家族的同源性兩者而發(fā)現(xiàn)的蛋白酶的全面列表。該數(shù)據(jù)庫的強(qiáng)項之一在于MEROPS分級分類方案。在此系統(tǒng)中，將共享相同功能的同系物一起分組成家族(family)。基于進(jìn)化親緣關(guān)系將家族分組成異種集團(tuán)(clan),這再次基于相似的結(jié)構(gòu)特征。該方法極大地利用該數(shù)據(jù)庫來鑒定熒光假單胞菌基因組內(nèi)的蛋白酶同系物。使用蛋白質(zhì)/蛋白質(zhì)BLAST來鑒定MEROPS數(shù)據(jù)庫的同系物，其中每種MB214翻譯的ORF作為詢問，而所有MEROPS蛋白質(zhì)的數(shù)據(jù)庫作為對象。將那些以顯著的同源性匹配詢問蛋白質(zhì)的翻譯ORF添加至列表以進(jìn)一步分析。在此情況中顯著的同源性在這里定義為具有l(wèi)e^或更小的e得分，其中允許基于比對長度和質(zhì)量進(jìn)行的人判斷。此步驟為列表產(chǎn)生109種潛在的蛋白酶。70還通過蛋白質(zhì)特征家族搜尋程序InterProScan(Quevillon等2005)針對InterPro數(shù)據(jù)庫第7.0版(Mulder等2005)分析所述ORF。由InterProScan軟件給ORF指定蛋白質(zhì)家族以及與那些家族有關(guān)的基因本體論(GeneOntology,GO)分類(GeneOntologyConsortium.2004)。使用這些自動GO指定，將所有已經(jīng)指定含有字符串"肽酶"、"蛋白酶"或"蛋白水解"的GO名稱的ORF添加至列表以進(jìn)行進(jìn)一步分析。此步驟產(chǎn)生先前步驟中沒有鑒定出的另外的70種潛在的蛋白酶?；谄鋪碜院嘘P(guān)鍵詞"肽酶"或"蛋白酶"的先前注釋(Ramseier等2001)的安排功能，將更多種ORF添加至列表。此步驟產(chǎn)生先前步驟中又沒有鑒定出的32種潛在的蛋白酶。然后分析列表以除去具有低的編碼蛋白酶的概率的ORF。再一次，此研究的意圖是要非常廣泛的，但是通過這些半自動化方法而指定至列表的許多ORF基于有限的標(biāo)準(zhǔn)和人判斷可以被容易地鑒定為不編碼蛋白酶。排除基因的兩種最常見理由是某種ORF實際上是蛋白酶的證據(jù)較弱，或者特定基因與已知為蛋白酶同系物但自身不是蛋白酶的另一種蛋白質(zhì)顯示最大的同源性。熒光假單胞菌蛋白酶的最終列表具有90位成員，并顯示于表2中。實施例3:折疊調(diào)控物和蛋白酶蛋白質(zhì)的計算機(jī)(insilico)細(xì)胞位置預(yù)測Pfenex表達(dá)技術(shù)TM的強(qiáng)項之一在于其控制細(xì)胞區(qū)室的能力，所述細(xì)胞區(qū)室中可以隔離特定的異源蛋白質(zhì)。如此，預(yù)測其中定位鑒定出的宿主細(xì)胞折疊調(diào)控物和蛋白酶蛋白質(zhì)的細(xì)胞區(qū)室。為了進(jìn)行這些預(yù)測，選擇兩種程序。PsortB2.0組合12種分開的算法的結(jié)果，其預(yù)測給定肽的亞細(xì)胞位置。大多數(shù)算法依賴于檢測詢問蛋白質(zhì)和已知亞細(xì)胞定位的蛋白質(zhì)之間的同源性。PsortB還包括諸如HMMTOP和SignalP的算法，它們使用隱蔽馬爾科夫模型(HiddenMarkovModel,HMM)分別檢測跨膜折疊域或I型分泌信號序列的存在。在PsortB結(jié)果外，還使用SignalPHMM來預(yù)測I型分泌信號序列的存在。這是必須的，因為PsortB的輸出在檢測出信號序列但是沒有給出指明亞細(xì)胞位置的其它具體信息時是含糊的。在這些情況中，PsortB指明蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位是未知的，因為其確實能隔離至細(xì)胞質(zhì)膜、周質(zhì)、外膜或胞內(nèi)區(qū)室之任一項。然而，有足夠信息知曉的是，該蛋白質(zhì)可能不定位于胞質(zhì)中，使其值得在表中記錄那種蛋白質(zhì)。如此，除在那種結(jié)果未知的情況中外，表2列出了PsortB算法的結(jié)果。在這些情況中，給出單獨的SignalPHMM的結(jié)果，其中"信號肽"指明檢測出信號肽，而"非分泌的"指明沒有檢測出信號肽。實施例4:能夠共it^達(dá)折疊調(diào)控物的質(zhì)粒的構(gòu)建將折疊調(diào)控物基因克隆入pCN(Nieto等1990)的質(zhì)粒衍生物中，pCN與另一種常規(guī)用于表達(dá)感興趣的異源蛋白質(zhì)的質(zhì)粒是相容的(Squires等2004;Chew等2005)。例示了含有甘露醇誘導(dǎo)型w/^-^/""/C/的質(zhì)粒的構(gòu)建。與下文所概述的類似地克隆其它折疊調(diào)控物一一在操縱子中組織時為單基因或多基因。采用自熒光假單胞菌MB214分離的基因組DNA(DNeasy;Qiagen，Valencia,CA)作為模板和引物RC199(5-ATATACTAGTAGGAGGTAACTTATGGCTGACGAACAGACGCA陽3，)(SEQIDNO:1)和RC200(5，-ATATTCTAGATTACAGGTCGCCGAAGAAGC-3,)(SEQIDNO:2)，使用7yw7^Zw(Stratagene,LaJolla,CA)按照制造商的推薦來擴(kuò)增gr/^-d"a^/基因。用S/^i和;^gi(限制性位點在上文的引物中加下劃線)消化所得的4kbPCR產(chǎn)物，并連接入pDOW1306-6(Schneider等2005b)衍生物pDOW2236中以創(chuàng)建pDOW2240，其含有toc啟動子控制下的^7五-^aX7操縱子。然后用6)el和歷,7^in消化質(zhì)粒pDOW2240,并使用Qiaquick(Qiagen,Valencia,CA)對所得的含有g(shù)r/^-^o&7的4.0kbDNA片段進(jìn)行凝膠純化，并連接入也用S;eI和/7/^/in消化的pDOW2247中，所述pDOW2247是攜帶熒光假單胞菌甘露醇調(diào)控型啟動子的pCN的衍生物(Schneider等2005a)。所得的質(zhì)粒即pDOW3501含有甘露醇啟動子控制下的g/7五-^aX7操縱子。然后通過在補(bǔ)充有250ug/ml尿嘧啶的M9葡萄糖板上選擇，將質(zhì)粒pDOW3501轉(zhuǎn)化入DC388和其它尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌抹中。實施例5:具有蛋白酶基因的基因組刪除的焚光假單胞菌菌林的構(gòu)建如下構(gòu)建能夠創(chuàng)建基因組刪除的質(zhì)粒，即擴(kuò)增要刪除基因5，和3，兩端的500-1000bpDNA片段。所得的5，PCR產(chǎn)物通常以要刪除基因的翻譯起始密碼子(ATG或GTG或TGT)結(jié)束，而3，PCR產(chǎn)物通常以要刪除基因的終止密碼子(TAA或TGA或TAG)開始。使用SOEPCR(Horton等1990),經(jīng)由另一個擴(kuò)增步驟將這兩種PCR產(chǎn)物融合在一起，然后克隆入pDOW1261(圖l)(Chew等722005)中。實施例6:對熒光假單胞菌菌林中異源蛋白質(zhì)表達(dá)的高通量培養(yǎng)和分析質(zhì)粒pDOW2787編碼單克隆抗體(單抗)gal2;重鏈與Pbp分泌前導(dǎo)一起表達(dá)，且在toc啟動子的控制下。輕鏈與OprF分泌前導(dǎo)一起表達(dá)，且在甘露醇啟動子的控制下。將質(zhì)粒電穿孔入63種攜帶定向基因刪除或pDOW2247的菌抹和5種含有野生型菌抹的對照菌抹的感受態(tài)細(xì)胞中，所述pDOW2247攜帶供共表達(dá)用的折疊調(diào)控物。通過以300rpm搖動將細(xì)胞一式多份地在裝有具有甘油的生長培養(yǎng)基的深孔塊中培養(yǎng)。在24時時用0.lmM異丙基-P-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)和l。/。甘露醇誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)。誘導(dǎo)后第24小時，裂解等分試樣，測量抗原的抗原結(jié)合以定量活性抗體量。用該數(shù)值除以O(shè)D6oo以測量纟田月包比活。菌才朱A;rc/、Afifeg尸2、ALa2、Ac/;尸、禾口Aprc2、Aprc2、gr/五c/waX7共表達(dá)菌抹A^g、Ac/pX、和A/w7均比對照菌抹高2.4倍或更多倍，其是統(tǒng)計學(xué)顯著的(p〈0.5)。自Apr7、Atfeg尸2、ALa2和gr;五^a^/共表達(dá)菌抹制備可溶性細(xì)胞級分，并進(jìn)行Western分析(圖2)。在4種測試菌抹中而不是在對照中檢測出大小與完全裝配的抗體一致的條帶。參考文獻(xiàn)Chew,L.C.，T.M.Ramseier,D.M.Retallack,J.C.Schneider,C.H.Squires和H.W.Talbot(2005).Pseudomonasfluorescens.ProductionofRecombinantProteins.NovelMicrobialandEucaryoticExpressionSystems.G.Gellissen.Weinheim,WILEY-VCH:45-66Dolinski，K,Heitman,J.1997.Peptidyl-prolylisomerases-anoverviewofthecyclophilin，F(xiàn)KBPandparvulinfamilies.于GuidebooktoMolecularChaperonesandProtein-FoldingCatalysts.GethingM-J編OxfordUniversityPressInc.,NewYork:359-369Gardy,J丄.，MR.Laird,F.Chen,S.Rey，C丄Walsh,M.Ester,和F.S丄.Brinkman2005PSORTbv.2.0:expandedpredictionofbacterialproteinsubcellularlocalizationandinsightsgainedfromcomparativeproteomeanalysis.Bioinformatics21(5):617-623.GeneOntologyConsortium.2004.TheGeneOntology(GO)databaseandinformaticsresource.NucleicAcidsResearch32:D258-D261.GethingM-J編1997.GuidebooktoMolecularChaperonesandProtein-FoldingCatalysts.OxfordUniversityPressInc.,NewYork.Horton,R.M.，Z.Cai,S.N.Ho和LR.Pease(1990)."Genesplicingbyoverlapextension:tailor-madegenesusingthepolymerasechainreaction,"BioTechniques8(5):528-30,532,534-5Lombardo,M-J，Thanassi，DG,Hultgren,SJ.1997.EscherichiacoliPapD.inGuidebooktoMolecularChaperonesandProtein-FoldingCatalysts.GethingM-J編OxfordUniversityPressInc.,NewYork:463-465MulderNJ,ApweilerR,AttwoodTK，BairochA，BatemanA,BinnsD,BradleyP，BorkP，BucherP，CeruttiL,CopleyR，CourcelleE,DasU,DurbinR，F(xiàn)leischmannW,GoughJ,HaftD，HarteN，HuloN,KahnD,KanapinA,KrestyaninovaM,LonsdaleD,LopezR，LetunicI,MaderaM，MaslenJ，McDowallJ,MitchellA,NikolskayaAN,OrchardS，PagniM，PontingCP，QuevillonE,SelengutJ,SigristCJ,SilventoinenV,StudholmeDJ,VaughanR，WuCH.2005.InterPro，ProgressandStatusin2005.NucleicAcidsRes.33，DatabaseIssue:D201-5.Nieto,C.,E.Femandez陽Tresguerres，N.Sanchez,M.Vicente,口R.Diaz(1990)."Cloningvectors,derivedfromanaturallyoccurringplasmidofPseudomonassavastanoi,specificallytailoredforgeneticmanipulationsinPseudomonas."Gene87(1):145-9.QuevillonE.,SilventoinenV"PillaiS.，HarteN.,MulderN.，ApweilerR.,LopezR.(2005)InterProScan:proteindomainsidentifier.NucleicAcidsResearch33:W116-W120.RamseierTM，S.C.，PayneJ，ChewL，RothmanLD,SubramanianM.2001.ThePseudomonasfluorescensMB214GenomeSequence.CRICRI2001001442;BIOTECH01-007.TheDowChemicalCompany.Ranson,NA，White,HE，Saibil,HR.1998.ChaperoninsBiochem.J.333，233-242.Rawlings，N.D.,Morton,F.R.和Barrett，AJ.2006.MEWOPS:thepeptidasedatabase.NucleicAcidsRes34，D270-D272.74Schneider,J.C.，A.F.Jenings,D.M.Mun,P.M.McGovern和L.C.Chew(2005a)."AuxotrophicmarkerspyrFandproCcanreplaceantibioticmarkersonproteinproductionplasmidsinhigh-cell-densityPseudomonasfluorescensfermentation."BiotechnologyProgress21(2》343-348.Schneider,丄C.,B,Rosner和A.Rubio(2005b).MannitolInducedPromoterSystemsinBacterialHostCells.USA,TheDowChemicalCompany.Squires,C.H.,D.M.Retallack,L.C.Chew,T.M.Ramseier,J.C.Schneider和H.W.Talbot(2004)."HeterologousproteinproductioninP.fluorescens."BioProcessInternational2(11):54-56，58-5975<table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table>RXF05073.145RXF04495.288RXF02090137RXF04500.189RXF04567.190RXF04631.291RXF04653.292RXF04657.293RXF04663.194RXF04692.195RXF04693.196RXF04715.197RXF04802.198RXF04808.299RXF04920.1100RXF04923.1101RXF04960.202RXF04968.2103RXF04971.2104RXF05081.1105RXF05113.2106RXF05137.1107RXF05236.1108RXF05379.1109RXF05383.2110RXF05400.2111RXF05615.1112RXF05817.1113RXF05943.1114RXF06281.1115RXF06308.2116RXF06399.2117-RXF06451.1118RXF06564.1119RXF06586.1120RXF06755.2121RXF06993.2122RXF07170.1123RXF07210.1124RXF07879.1125RXF08136.2126RXF08517.1127RXF08627.2128RXF08653.1129RXF08773.1130RXF08978.1131RXFO麵.l132RXF09147.2133RXF09487.1134RXF09831.2135RXF04892.113677說明書中所提及的所有出版物和專利申請指明本發(fā)明所屬領(lǐng)域中技術(shù)人員的水平。本文通過提及而收錄所有出版物和專利申請，其程度就像明確且單獨指明通過提及而收錄每篇單獨的出版物或?qū)＠暾堃粯?。雖然出于理解清晰的目的，已經(jīng)通過例示和實施例較為詳細(xì)地描述了上述發(fā)明，但是顯而易見的是，可以在所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)實施某些變化和改良。78權(quán)利要求1.一種陣列，其至少包含熒光假單胞菌細(xì)胞的第一群體和第二群體，其中每個群體選自下組a)至少一個如下的熒光假單胞菌細(xì)胞群體，其已經(jīng)進(jìn)行過遺傳修飾以降低至少一種牽涉蛋白質(zhì)降解的靶基因的表達(dá)；b)至少一個如下的熒光假單胞菌細(xì)胞群體，其已經(jīng)進(jìn)行過遺傳修飾以提高至少一種牽涉蛋白質(zhì)生成的靶基因的表達(dá)；和c)至少一個如下的熒光假單胞菌細(xì)胞群體，其已經(jīng)依照(a)和(b)進(jìn)行過遺傳修飾；其中所述陣列中的每個群體是不相同的，且其中每個群體在物理上是彼此分開的。2.權(quán)利要求l的陣列，其中所述至少一種牽涉蛋白質(zhì)降解的靶基因是蛋白酶。3.權(quán)利要求2的陣列，其中所述至少一種蛋白酶選自表2中所列出的蛋白酶。4.權(quán)利要求l的陣列，其中所述至少一種牽涉蛋白質(zhì)生成的靶基因是牽涉異源蛋白質(zhì)的正確蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄、翻譯、加工、或轉(zhuǎn)運的基因。5.權(quán)利要求4的陣列，其中所述至少一種靶基因是蛋白質(zhì)折疊調(diào)控物。6.權(quán)利要求5的陣列，其中所述蛋白質(zhì)折疊調(diào)控物選自表l中所列出的蛋白質(zhì)折疊調(diào)控物。7.權(quán)利要求l-6任一項的陣列，其進(jìn)一步包含至少一個如下的熒光假單胞菌細(xì)胞群體，其尚未進(jìn)行遺傳修飾以提高牽涉蛋白質(zhì)生成的靶基因或牽涉蛋白質(zhì)降解的靶基因的表達(dá)。8.權(quán)利要求1-7任一項的陣列，其中至少一個群體已經(jīng)進(jìn)行過遺傳修飾以提高兩種或更多種牽涉蛋白質(zhì)生成的靶基因的表達(dá)。9.權(quán)利要求l-7任一項的陣列，其中至少一個群體已經(jīng)進(jìn)行過遺傳修飾以降低兩種或更多種牽涉蛋白質(zhì)降解的靶基因的表達(dá)。10.權(quán)利要求1-9任一項的陣列，其中所述陣列處于有益于高通量篩選所述陣列的形式。11.權(quán)利要求10的陣列，其中所述形式是96孔形式。12.權(quán)利要求l-ll任一項的陣列，其中至少一個群體在用包含編碼至少一種感興趣異源蛋白質(zhì)的至少一種基因的表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)化時能夠表達(dá)所述至少一種感興趣異源蛋白質(zhì)。13.—種試劑盒，其包含權(quán)利要求1-12任一項的陣列。14.一種用于鑒定對于表達(dá)至少一種感興趣異源蛋白質(zhì)最佳的熒光假單胞菌宿主細(xì)胞的方法，包括a)獲得至少包含熒光假單胞菌細(xì)胞的第一和第二群體的陣列，其中每個群體選自下組i)至少一個如下的焚光假單胞菌細(xì)胞群體，其已經(jīng)進(jìn)行過遺傳修飾以降低至少一種牽涉蛋白質(zhì)降解的靶基因的表達(dá)；ii)至少一個如下的熒光假單胞菌細(xì)胞群體，其已經(jīng)進(jìn)行過遺傳修飾以提高至少一種牽涉蛋白質(zhì)生成的靶基因的表達(dá)；和iii)至少一個如下的熒光假單胞菌細(xì)胞群體，其已經(jīng)依照(a)和(b)進(jìn)行過遺傳修飾；其中所述陣列中的每個群體是不相同的，且其中每個群體在物理上是彼此分開的；b)向每個群體的至少一個細(xì)胞中導(dǎo)入包含編碼所述至少一種感興趣異源蛋白質(zhì)的至少一種基因的表達(dá)盒；c)在足以在至少一個細(xì)胞群體中表達(dá)所述感興趣蛋白質(zhì)的條件下維持所述細(xì)胞；并d)選4奪所述感興.趣異源蛋白質(zhì)得以生成的最佳纟田月包群體；其中與所述陣列中的其它群體相比，所述感興趣異源蛋白質(zhì)在所述最佳的細(xì)胞群體中展現(xiàn)出改善的表達(dá)、改善的活性、改善的溶解度、改善的轉(zhuǎn)運、或降低的蛋白水解降解之一項或多項。15.權(quán)利要求14的方法，其中所述至少一種牽涉蛋白質(zhì)降解的靶基因是蛋白酶。16.權(quán)利要求15的方法，其中所述蛋白酶選自表2中所列出的蛋白酶。17.權(quán)利要求14的方法，其中所述至少一種牽涉蛋白質(zhì)生成的靶基因是牽涉異源蛋白質(zhì)的正確蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄、翻譯、加工、或轉(zhuǎn)運的基因。18.權(quán)利要求17的方法，其中所述至少一種靶基因是蛋白質(zhì)折疊調(diào)控物。19.權(quán)利要求18的方法，其中所述蛋白質(zhì)折疊調(diào)控物選自表l中所列出的蛋白質(zhì)折疊調(diào)控物。20.權(quán)利要求14-19任一項的方法，其中所述陣列進(jìn)一步包含至少一個如下的熒光假單胞菌細(xì)胞群體，其尚未進(jìn)行遺傳修飾以提高牽涉蛋白質(zhì)生成的靶基因或牽涉蛋白質(zhì)降解的靶基因的表達(dá)。21.權(quán)利要求14-20任一項的方法，其中至少一個群體已經(jīng)進(jìn)行過遺傳修飾以提高兩種或更多種牽涉蛋白質(zhì)生成的靶基因的表達(dá)。22.權(quán)利要求14-20任一項的方法，其中至少一個群體已經(jīng)進(jìn)行過遺傳修飾以降低兩種或更多種牽涉蛋白質(zhì)降解的靶基因的表達(dá)。23.權(quán)利要求14-22任一項的方法，其中所述陣列處于有益于高通量篩選所述陣列的形式。24.權(quán)利要求23的方法，其中所述形式是96孔形式。25.權(quán)利要求14的方法，其中所述表達(dá)盒進(jìn)一步包含與所述感興趣異源蛋白質(zhì)可操作連接的信號肽。26.權(quán)利要求19的方法，其中所述信號肽是分泌信號肽。27.權(quán)利要求19的方法，其中所述信號肽對于所述熒光假單胞菌宿主細(xì)胞而言是天然的。28.—種用于鑒定對于表達(dá)感興趣異源蛋白質(zhì)最佳的熒光假單胞菌宿主細(xì)胞的方法，包括a)獲得至少包含熒光假單胞菌細(xì)胞的第一和第二群體的陣列，其中每個群體已經(jīng)進(jìn)行過遺傳修飾以降低至少一種牽涉蛋白質(zhì)降解的蛋白質(zhì)的表達(dá)，其中所述陣列中的每個群體是不相同的，且其中每個群體在物理上是彼此分開的；b):容解所述細(xì)胞；c)使來自每個細(xì)胞群體的溶解物與所述感興趣異源蛋白質(zhì)接觸；并d)選擇最佳的細(xì)胞群體；其中所述最佳的細(xì)胞群體是如下的群體，其與所述陣列中的其它群體相比導(dǎo)致步驟(c)中對所述感興趣異源蛋白質(zhì)的降解水平降低。全文摘要本發(fā)明提供了一種陣列，其用于快速鑒定能夠以改善的產(chǎn)量和/或質(zhì)量生成異源蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞群體。該陣列包含一個或多個如下宿主細(xì)胞群體，所述宿主細(xì)胞群體已經(jīng)進(jìn)行過遺傳修飾以提高一種或多種牽涉蛋白質(zhì)生成的靶基因的表達(dá)和/或降低一種或多種牽涉蛋白質(zhì)降解的靶基因的表達(dá)。該陣列中的一種或多種菌株可以在周質(zhì)區(qū)室中表達(dá)感興趣的異源蛋白質(zhì)，或者可以穿過細(xì)胞外壁向胞外分泌異源蛋白質(zhì)。該菌株陣列對于篩選任何感興趣蛋白質(zhì)的表達(dá)改善是有用的，包括治療性蛋白質(zhì)、激素、生長因子、胞外受體或配體、蛋白酶、激酶、血液蛋白質(zhì)、趨化因子、細(xì)胞因子、抗體等。文檔編號C12N15/78GK101688213SQ200880022208公開日2010年3月31日申請日期2008年4月25日優(yōu)先權(quán)日2007年4月27日發(fā)明者托馬斯·M·拉姆塞爾,拉塞爾·J·科爾曼,查爾斯·D·赫什伯格,簡·C·施奈德申請人:陶氏環(huán)球技術(shù)公司