專利名稱：單鏈抗體的基于序列的改造和優(yōu)化的制作方法
單鏈抗體的基于序列的改造和優(yōu)化
相關(guān)申請
本申請要求于2007年6月25日提交的美國臨時申請序列號 60/937,112的優(yōu)先權(quán)，所述美國臨時申請的名稱為"Sequence Based Engineering and Optimization of Single Chain Antibodies"。本中請還 要求于2008年3月12日提交的美國臨時申請序列號61/069,057的優(yōu) 先權(quán)，所述美國臨時申請的名稱為"S叫uence Based Engineering and Optimization of Single Chain Antibodies"。
背景技術(shù)：
已證明抗體在癌癥、自身免疫疾病和其他病癥的治療中是非常有 效和成功的治療劑。盡管一般已在臨床上使用全長抗體，但存在使用 抗體片段可以提供的許多優(yōu)點，例如增加組織穿透力、與增加其他效 應(yīng)子功能的能力結(jié)合的Fc效應(yīng)子功能的不存在、和由較短的全身體內(nèi) 半衰期導(dǎo)致的較少全身性副作用的可能性?？贵w片段的藥代動力學(xué)性 質(zhì)表明，它們可能特別良好地適合于局部治療方法。此外，抗體片段 在特定表達系統(tǒng)中可以比全長抗體更容易產(chǎn)生。
一個類型的抗體片段是單鏈抗體(scFv)，其由經(jīng)由接頭序列綴 合的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VJ與重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)組成。因此，scFv 缺乏所有抗體恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域，并且先前的可變/恒定結(jié)構(gòu)域界面的氨基 酸殘基(界面殘基)變成溶劑暴露的。scFv可以通過已建立的重組改 造技術(shù)由全長抗體(例如IgG分子)制備。然而，全長抗體轉(zhuǎn)變成scFv 通常導(dǎo)致蛋白質(zhì)的弱穩(wěn)定性和溶解性、低產(chǎn)量和高聚集趨勢，這增加 免疫原性危險。
因此，已嘗試改善scFv的性質(zhì)例如溶解性和穩(wěn)定性。例如，Nieba， L.等人(Prot. Eng. ( 1997) 10: 435-444)選擇已知為界面殘基的3
6個氨基酸殘基且使其突變。他們觀察到突變的scFv在細菌中周質(zhì)表達 增加，以及熱誘導(dǎo)聚集速率減小，盡管熱力學(xué)穩(wěn)定性和溶解性未顯著 改變。其中對scFv內(nèi)的特定氨基酸殘基進行定點誘變的其他研究也已 得到報告(參見例如，Tan， P.H.等人(1988 )5Zo/i/^s. J. 2^: 1473-1482; W6rn， A.和Pltickthun, A. ( 1998 )5/oc/^附.^Z: 13120-13127; W6rn， A.和PHickthun， A. ( 1999 ) 5,W&附.8739-8750)。在這些各種 研究中，選擇用于誘變的氨基酸殘基基于其在scFv結(jié)構(gòu)內(nèi)的已知位置 (例如，來自分子建模研究)進行選擇。
在另一種方法中，將來自表達極弱的scFv的互補決定區(qū)(CDR) 移植到已證實具有有利性質(zhì)的scFv的構(gòu)架區(qū)內(nèi)(Jung， S.和 Pltickthun, A. ( 1997)1￡: 959-966)。所得到的scFv顯 示改善的可溶性表達和熱力學(xué)穩(wěn)定性。
改造scFv以改善功能性質(zhì)中的進展在例如W(irn， A.和 Plttckthun, A. ( 2001 )/. Afo/.必iV /.巡989-1010中綜述。然而，仍 需要允許合理設(shè)計具有優(yōu)良功能性質(zhì)的scFv的新方法，特別是幫助技 術(shù)人員選擇潛在有問題的氨基酸殘基用于改造的方法。
發(fā)明概述
本發(fā)明提供了允許使用基于序列的分析鑒定scFv序列中對于穩(wěn) 定性和/或溶解性潛在有問題的氨基酸殘基的方法。此外，可選擇根據(jù) 本發(fā)明的方法鑒定的氨基酸殘基進行突變，可制備已進行突變的經(jīng)改 造的scFv并且就提高的功能性質(zhì)(例如穩(wěn)定性和/或溶解性)對其進 行篩選。在特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了其中將功能性選擇 的(functionally-selected) scFv的數(shù)據(jù)庫用于鑒定氨基酸殘基位置的 方法，所述氨基酸殘基位置比種系和/或成熟抗體免疫球蛋白序列中相 應(yīng)的位置更加耐受或更不耐受變異性，從而表明此類鑒定的殘基位置 可適合用于改造以提高scFv功能性例如穩(wěn)定性和/或溶解性。因此， 本發(fā)明提供了基于功能性選擇的scFv序列的數(shù)據(jù)庫的使用的"功能共 有區(qū)(functional consensus )，，方法并證明了其優(yōu)點。
7在其他優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供了用于鑒定免疫結(jié)合劑
(immunobinder )中目的氨基酸位置(例如，通過將具有至少一個期 望的性質(zhì)的scFv序列(如使用QC測定法選擇的)的數(shù)據(jù)庫與成熟抗 體序列的數(shù)據(jù)庫例如Kabat數(shù)據(jù)庫比較而鑒定的氨基酸位置)上要置 換的優(yōu)選氨基酸殘基(或備選地，要排除的氨基酸殘基)的方法。因 此本發(fā)明還提供了用于選擇特定氨基酸殘基的"富集/排除"法。此夕卜， 本發(fā)明提供了通過突變使用本文中描述的"功能共有區(qū)"方法鑒定的 特定構(gòu)架氨基酸位置來對免疫結(jié)合劑(例如，scFv、全長免疫球蛋白、 Fab片段、單結(jié)構(gòu)域抗體(例如，Dab)和納米抗體)進行改造的方法。 在優(yōu)選實施方案中，通過用使用本文中描述的"富集/排除"分析法發(fā) 現(xiàn)為"富集的"殘基的殘基置換現(xiàn)有的氨基酸殘基來突變構(gòu)架氨基酸
在一個方面，本發(fā)明提供了鑒定單鏈抗體(scFv)中用于突變的氨 基酸位置的方法，所述scFv具有Vh和Vl氛基酸序列，該方法包括
a) 將scFv VH、 Vl或Vh和Vt氨基酸序列輸入數(shù)據(jù)庫(所述數(shù)據(jù) 庫包含大量抗體VH、 Vl或Vh和VL氨基酸序列)以使scFv VH、 Vl 或VH和VL氨基酸序列與數(shù)據(jù)庫的抗體VH、 VL或VH和VL氨基酸序 列進行比對；
b) 將scFv Vh或Vt氨基酸序列中的氨基酸位置與數(shù)據(jù)庫的抗體 Vh或Vt氨基酸序列中相應(yīng)的位置相比較；
c) 確定scFv Vh或V^氨基酸序列中的氨基酸位置是否被在數(shù)據(jù)庫 的抗體Vh或Vt氨基酸序列中的相應(yīng)位置上保守的氨基酸殘基占據(jù)； 和
d) 當(dāng)氨基酸位置被在數(shù)據(jù)庫的抗體Vh或VL氨基酸序列中的相應(yīng) 位置上不保守的氨基酸殘基占據(jù)時，將scFv Vh或Vi^氨基酸序列中的 該氨基酸位置鑒定為用于突變的氨基酸位置。
該方法還可包括突變scFv Vh或Vt氨基酸序列中經(jīng)鑒定用于突變 的氨基酸位置。例如，可用在數(shù)據(jù)庫的抗體Vh或Vt氨基酸序列中的 相應(yīng)位置上保守的氨基酸殘基置換經(jīng)鑒定用于突變的氨基酸位置。另夕卜或備選地，可通過隨才幾i秀變或通過偏好性i秀變(biased mutagenesis) 突變經(jīng)鑒定用于突變的氨基酸位置以產(chǎn)生突變的scFv的文庫，然后篩 選突變的scFv的文庫，選擇具有至少一個提高的功能性質(zhì)的scFv(例 如，通過使用酵母質(zhì)量控制系統(tǒng)(QC-系統(tǒng))篩選文庫)。
各種類型的數(shù)據(jù)庫可用于本發(fā)明的方法。例如，在一個實施方案 中，數(shù)據(jù)庫的抗體VH、 Vl或Vh和V^氨基酸序列是種系抗體VH、 Vl或Vh和V^氨基酸序列。在另一個實施方案中，數(shù)據(jù)庠的抗體Vh、 Vl或Vh和Vi^氨基酸序列是重排的親和力成熟的抗體VH、 Vl或Vh 和V^氨基酸序列。在另一個特別優(yōu)選的實施方案中，數(shù)據(jù)庫的抗體 VH、 Vl或Vh和VL氨基酸序列是因具有至少一個期望的功能性質(zhì)(例 如scFv的穩(wěn)、定性或scFv的溶解性)而被選擇的scFv抗體VH、 Vl或 Va和V^氨基酸序列。在另一個實施方案中，多于一個數(shù)據(jù)庫可用于 比較目的。例如，在特別優(yōu)選的實施方案中，使用因具有至少一個期 望的功能性質(zhì)而被選擇的scFv的數(shù)據(jù)庫以及一個或多個種系數(shù)據(jù)庫 或重排的親和力成熟的抗體數(shù)據(jù)庫，其中將來自scFv數(shù)據(jù)庫的序列比 較結(jié)果與來自其他數(shù)據(jù)庫的結(jié)果相比較。
本發(fā)明的方法可用于分析例如scFv的Vh區(qū)、scFv的Vl區(qū)或丙者。
雖然本發(fā)明的方法可用于分析目的scFv內(nèi)的單個目的氨基酸位 置，但更優(yōu)選該方法用于分析沿著scFv序列的多個氨基酸位置。因此， 在優(yōu)選實施方案中，在該方法的步驟b)中，將scFvVh或Vt氨基酸序 列中的多個氨基酸位置與數(shù)據(jù)庫的抗體Vh或Vt氨基酸序列中的相應(yīng) 位置相比較。例如，在優(yōu)選實施方案中，將scFvVh、 Vl或Vh和Vl 氨基酸序列中的各構(gòu)架位置(framework position)與數(shù)據(jù)庫的抗體 VH、 Vl或Vh和Vr^氨基酸序列中的各相應(yīng)構(gòu)架位置相比較。另外地 或備選地，可分析scFv的一個或多個CDR中的一個或多個位置。在 另一個實施方案中，將scFvVh、 V^或Vh和Vt氨基酸序列中的各氨 基酸位置與數(shù)據(jù)庫的抗體VH、 Vl或Vh和Vt氨基酸序列中的各相應(yīng) 的氨基酸位置相比較。
9在數(shù)據(jù)庫的序列之間"保守"的氨基酸位置可被一種或多種特定 類型的氨基酸殘基占據(jù)。例如，在一個實施方案中，"保守的"位置 被在該位置以極高頻率出現(xiàn)的一個特定氨基酸殘基占據(jù)。即，在該方
法的步驟c)中，在數(shù)據(jù)庫的抗體Vh或Vt氨基酸序列中的相應(yīng)位置上 保守的氨基酸殘基是在數(shù)據(jù)庫的抗體Vh或V^氨基酸序列中在該位置 上出現(xiàn)頻率最高或最顯著富集的氨基酸殘基。在該情況下，為了產(chǎn)生 經(jīng)改造的scFv，經(jīng)鑒定用于突變的氨基酸位置可用在數(shù)據(jù)庫的抗體
Vh或VL氨基酸序列中的相應(yīng)位置上最頻繁觀察到或最顯著富集的氨
基酸殘基進行置換。在另一個實施方案中，在數(shù)據(jù)庫的序列之間"保 守的"氨基酸位置可被例如(i)疏水氨基酸殘基，(ii)親水氨基酸殘基， (iii)能夠形成氫鍵的氨基酸殘基或(iv)具有形成P折疊傾向的氨基酸殘 基占據(jù)。即，在該方法的步驟c)中，數(shù)據(jù)庫的抗體Vh或V^氨基酸序 列中的相應(yīng)位置對于(i)疏水氨基酸殘基，(ii)親水氨基酸殘基，(iii) 能夠形成氫鍵的氨基酸殘基或(iv)具有形成P折疊傾向的氨基酸殘基 是保守的。
因此，為了產(chǎn)生經(jīng)改造的scFv，當(dāng)數(shù)據(jù)庫的抗體Vh或Vt氨基酸 序列中的相應(yīng)位置對于疏水氨基酸殘基是保守的時候，scFv中經(jīng)鑒定 用于突變的氨基酸位置可用在數(shù)據(jù)庫的抗體Vh或Vt氨基酸序列中的 相應(yīng)位置上出現(xiàn)頻率最高的疏水氨基酸殘基進行置換，此外或備選地， scFv中經(jīng)鑒定用于突變的氨基酸位置可用因在scFv中的該位置上為 最適合的而被選擇的疏水氨基酸殘基(例如，基于分子建模研究，最可 能保持scFv的結(jié)構(gòu)和功能的疏水殘基)置換。此外或備選地，scFv中 經(jīng)鑒定用于突變的氨基酸位置可通過定點誘變用一組疏水氨基酸殘基 進行置換，從而產(chǎn)生經(jīng)改造的scFv的文庫，并且最優(yōu)選的置換可通過 就期望的功能性質(zhì)篩選文庫來選擇(例如，在酵母QC-系統(tǒng)中)。
此外，為了產(chǎn)生經(jīng)改造的scFv，當(dāng)數(shù)據(jù)庫的抗體Vh或Vt氨基酸 序列中的相應(yīng)位置對于親水氨基酸殘基是保守的時候，scFv中經(jīng)鑒定 用于突變的氨基酸位置可用在數(shù)據(jù)庫的抗體Vh或VL氨基酸序列中的 相應(yīng)位置上出現(xiàn)頻率最高的親水氨基酸殘基進行置換。另外或備選地，
10scFv中經(jīng)鑒定用于突變的氨基酸位置可用因在scFv中的該位置上是 最合適的而被選擇的親水氨基酸殘基(例如，基于分子建模研究，最可 能保持scFv的結(jié)構(gòu)和功能的親水殘基)置換。另外或備選地，scFv中 經(jīng)鑒定用于突變的氨基酸位置可通過定點誘變用一組親水氨基酸殘基 來置換，從而產(chǎn)生經(jīng)改造的scFv文庫，并且最優(yōu)選的置換可通過就期 望的功能性質(zhì)篩選文庫來選擇(例如，在酵母QC-系統(tǒng)中)。
此外，為產(chǎn)生經(jīng)改造的scFv，當(dāng)數(shù)據(jù)庫的抗體Vh或Vt氨基酸序 列中的相應(yīng)位置對于能夠形成氬鍵的氨基酸殘基是保守的時候，scFv 中經(jīng)鑒定用于突變的氨基酸位置可用在數(shù)據(jù)庫的抗體Vh或Vt氨基酸 序列中的相應(yīng)位置上出現(xiàn)頻率最高的能夠形成氫鍵的氨基酸殘基進行 置換。另外或備選地，scFv中經(jīng)鑒定用于突變的氨基酸位置可用因在 scFv中的該位置上是最合適的而被選擇的能夠形成氫鍵的氨基酸殘 基(例如，基于分子建模研究，最可能保持scFv的結(jié)構(gòu)和功能的殘基) 置換。另外或備選地，scFv中經(jīng)鑒定用于突變的氨基酸位置可通過定 點誘變用一組能夠形成氫鍵的氨基酸殘基進行置換，從而產(chǎn)生經(jīng)改造 的scFv的文庫，并且最優(yōu)選的置換可通過就期望的功能性質(zhì)篩選文庫 來選擇(例如，在酵母QC-系統(tǒng)中)。
此外，為產(chǎn)生經(jīng)改造的scFv，當(dāng)數(shù)據(jù)庫的抗體Vh或Vt氨基酸序 列中的相應(yīng)位置對于具有形成P折疊的傾向的氨基酸殘基是保守的時 候，scFv中的經(jīng)鑒定用于突變的氨基酸位置可用在數(shù)據(jù)庫的抗體VH 或Vl氨基酸序列中的相應(yīng)位置上出現(xiàn)頻率最高的具有形成P折疊的 傾向的氨基酸殘基進行置換。另外或備選地，scFv中經(jīng)鑒定用于突變 的氨基酸位置可用因在scFv中的該位置上是最合適的而被選擇的具 有形成P折疊的傾向的氨基酸殘基(例如，基于分子建模研究，最可能 保持scFv的結(jié)構(gòu)和功能的殘基)置換。另外或備選地，scFv中經(jīng)鑒定 用于突變的氨基酸位置可通過定點誘變用 一組具有形成|3折疊的傾向 的氨基酸殘基進行置換，從而產(chǎn)生經(jīng)改造的scFv的文庫，并且最優(yōu)選 的置換可通過就期望的功能性質(zhì)篩選文庫來選擇(例如，在酵母QC-系統(tǒng)中)。在另 一個實施方案中，可使用數(shù)據(jù)庫進行用于鑒定scFv中用于突 變的氨基酸位置的本發(fā)明的方法，所述數(shù)據(jù)庫是其中只有與scFv抗體 VH、 Vl或Vh和Vt氨基酸序列具有高度相似性的抗體VH、 Vi^或Vh 和VL氨基酸序列包括在該數(shù)據(jù)庫中的受限制的數(shù)據(jù)庫。
在優(yōu)選實施方案中，為了定量分析的氨基酸位置(即，數(shù)據(jù)庫的 抗體Vh或V^氨基酸序列中的"相應(yīng)位置")的保守性，使用辛普森 指數(shù)(Simpson's Index )給氨基酸位置的保守程度賦值。
本發(fā)明的方法還可用于檢查scFv序列中的成對的氨基酸位置，以 鑒定彼此共變的氨基酸位置，這樣此類共變對位置的一個或兩個位置 可被鑒定用于突變。因此，在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了這樣 的方法，其包括
a) 對數(shù)據(jù)庫的抗體VH或VL氨基酸序列進行協(xié)方差分析 (covariance analysis )以鑒定氨基酸位置的共變對；
b) 將氨基酸位置的共變對與scFv Vh或Vt氨基酸序列中的相應(yīng)位 置相比較；
c) 確定scFv Vh或Vt氨基酸序列中的相應(yīng)位置是否被在數(shù)據(jù)庫的 抗體Vh或Vt氨基酸序列中的氨基酸位置的共變對上保守的氨基酸殘 基占據(jù)；和
d) 當(dāng)scFv中的相應(yīng)位置中的一個或兩個位置被在數(shù)據(jù)庫的抗體
Vh或VL氨基酸序列中的氨基酸位置的共變對上不保守的氨基酸殘基
占據(jù)時，將scFvVh或V^氨基酸序列中的相應(yīng)位置中的一個或兩個位 置鑒定為用于突變的氨基酸位置。
該協(xié)方差分析還可與單個氨基酸位置的分析組合，這樣具有步驟 a) - d)的上述鑒定scFv中用于突變的氨基酸位置的方法可進一步包括 步驟
e) 對數(shù)據(jù)庫的抗體Vh或Vt氨基酸序列進行協(xié)方差分析以鑒定氨 基酸位置的共變對；
f) 將氨基酸位置的共變對與scFv Vh或VL氨基酸序列中的相應(yīng)位 置相比較；g) 確定scFv Vh或V^氨基酸序列中的相應(yīng)位置是否被在數(shù)據(jù)庫的 抗體VH或Vl氨基酸序列中的氨基酸位置的共變對上保守的氨基酸殘 基占據(jù)；和
h) 當(dāng)scFv中的相應(yīng)位置中的一個或兩個位置被在數(shù)據(jù)庫的抗體 Vh或V^氨基酸序列中的氨基酸位置的共變對上不保守的氨基酸殘基 占據(jù)時，將scFv Vh或V!^氨基酸序列中的相應(yīng)位置中的一個或兩個位 置鑒定為用于突變的氨基酸位置。
可將協(xié)方差分析法用于單個共變對或，備選地，可在數(shù)據(jù)庫的抗 體Vh或Vt氨基酸序列中鑒定多個氨基酸位置共變對并且將其與scFv Vh或V^氨基酸序列中的相應(yīng)位置相比較。
該方法還可包括突變scFv中的相應(yīng)位置中的一個或兩個位置，所 述位置被在數(shù)據(jù)庫的抗體Vh或Vt氨基酸序列中的氨基酸位置的共變 對上不保守的氨基酸殘基占據(jù)。例如，在一個實施方案中，scFv中的 相應(yīng)位置中的一個位置(所述位置被在氨基酸位置的共變對上不保守 的氨基酸殘基占據(jù))用在共變對氨基酸位置上出現(xiàn)頻率最高的氨基酸 殘基進行置換。在另一個實施方案中，scFv中的兩個相應(yīng)位置(所述 位置都被在氨基酸位置的共變對上不保守的氨基酸殘基占據(jù))用在共 變對氨基酸位置上出現(xiàn)頻率最高的氨基酸殘基進行置換。
可將用于鑒定scFv序列中用于突變的氨基酸位置的本發(fā)明的基 于序列的方法與允許進行scFv的結(jié)構(gòu)分析的其他方法組合。例如，在 一個實施方案中，可將基于序列的方法與分子建模法組合來進一步分 析scFv的結(jié)構(gòu)。因此，在一個實施方案中，具有步驟a)-d)的上述方 法還可包括例如步驟
e) 使scFvVH、 Vl或Vh和VL氨基酸序列經(jīng)歷分子建模；和
f) 在scFv VH、 Vl或Vh和VL氨基酸序列中鑒定至少一個另外的 氨基酸位置用于突變。
該方法還可包括突變scFv VH、 Vl或Vh和V^氨基酸序列中的該 至少一個通過分子建模鑒定用于突變的另外的氨基酸位置。
在另一個方面，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的方法制備的scFv組合
13物，其中在經(jīng)鑒定用于突變的一個或多個氨基酸位置上進行了一個或
多個突變。還提供了藥物制劑，該制劑通常包含scFv組合物和藥學(xué)上可接受的載體。
在另一個方面，本發(fā)明提供了在單鏈抗體(scFv)中鑒定一個或多個用于突變的構(gòu)架氨基酸位置的方法，所述scFv具有Vh和V^氨基酸序列，該方法包括
a) 提供Vh、 Vl或Vh和V^氨基酸序列的第一數(shù)據(jù)庫；
b) 提供因具有至少一個期望的功能性質(zhì)而被選擇的scFv抗體VH、 Vl或Vh和V]L氨基酸序列的第二數(shù)據(jù)庫；
c) 確定第一數(shù)據(jù)庫的各構(gòu)架位置和第二數(shù)據(jù)庫的各構(gòu)架位置上的氨基酸變異性(variability);
d) 鑒定在其上氨基酸變異性的程度在第一數(shù)據(jù)庫和第二數(shù)據(jù)庫之間不同的一個或多個構(gòu)架位置，從而鑒定單鏈抗體(scFv)中用于突變的一個或多個構(gòu)架氨基酸位置。
優(yōu)選，各構(gòu)架位置上的氨基酸變異性通過使用辛普森指數(shù)給保守程度賦值來測定。在一個實施方案中，基于與第一數(shù)據(jù)庫相比在第二數(shù)據(jù)庫中具有更低的辛普森指數(shù)(SI)值的一個或多個構(gòu)架氨基酸位置鑒定用于突變的一個或多個構(gòu)架氨基酸位置。在另一個實施方案中，基于與第一數(shù)據(jù)庫(例如，種系數(shù)據(jù)庫)相比在第二數(shù)據(jù)庫中具有更高的辛普森指數(shù)值的一個或多個構(gòu)架氨基酸位置鑒定用于突變的一個或多個構(gòu)架氨基酸位置。在一個優(yōu)選實施方案中，第二數(shù)據(jù)庫(例如，QC數(shù)據(jù)庫)的氨基酸位置具有比第一數(shù)據(jù)庫(例如，Kabat數(shù)據(jù)庫)中的相應(yīng)的氨基酸位置的SI值低至少0.01，和更優(yōu)選低至少0.05(例如，0.06、 0.07、 0.08、 0.09或O.l)的SI值。在更優(yōu)選實施方案中，第二數(shù)據(jù)庫的氨基酸位置具有比第一數(shù)據(jù)庫中的相應(yīng)的氨基酸位置的SI值低至少O.l(例如，低O.l、 0.15、 0.2、 0.25、 0.3、 0.35、 0.4、 0.45或0.5)的SI值。
在另一個方面，本發(fā)明提供了鑒定用于免疫結(jié)合劑中的置換的優(yōu)選氨基酸殘基的方法，該方法包括a) 提供已分組的Vh或Vt氨基酸序列(例如按照Kabat家族亞型分組的種系和/或成熟抗體序列)的第一數(shù)據(jù)庫；
b) 提供因具有至少一個期望的功能性質(zhì)而被選擇(例如，根據(jù)QC測定)的已分組的scFv抗體Vh或V^氨基酸序列的第二數(shù)據(jù)庫；
c) 測定第一數(shù)據(jù)庫的構(gòu)架位置和第二數(shù)據(jù)庫的相應(yīng)構(gòu)架位置上的氨基酸殘基的氨基酸頻率；
d) 當(dāng)相對于第一數(shù)據(jù)庫，氨基酸殘基以更高的頻率在第二數(shù)據(jù)庫中發(fā)生(即，富集的殘基)時，將該氨基酸殘基鑒定為用于免疫結(jié)合劑的相應(yīng)氨基酸位置上的置換的優(yōu)選氨基酸殘基。
在另一個方面，本發(fā)明提供了鑒定待從免疫結(jié)合劑排除的氨基酸殘基的方法，該方法包括
a) 提供已分組的Vh或VL氨基酸序列(例如按照Kabat家族亞型分組的種系和/或成熟抗體序列)的第一數(shù)據(jù)庫；
b) 提供因具有至少一個期望的功能性質(zhì)而被選擇(例如，根據(jù)QC測定)的已分組的scFv抗體Vh或Vt氨基酸序列的第二數(shù)據(jù)庫；
c) 測定第一數(shù)據(jù)庫的構(gòu)架位置和第二數(shù)據(jù)庫的相應(yīng)構(gòu)架位置上的氨基酸殘基的氨基酸頻率；
d) 當(dāng)相對于第一數(shù)據(jù)庫，氨基酸殘基以更低的頻率在第二數(shù)據(jù)庫中發(fā)生時，將該氨基酸殘基鑒定為用于免疫結(jié)合劑的相應(yīng)氨基酸位置上的置換的不利氨基酸殘基，其中所述氨基酸殘基的類型是不利氨基酸殘基(即，被排除的殘基)。在某些優(yōu)選實施方案中，如果富集因子(EF)小于l，則鑒定了不利的氨基酸殘基。
在某些實施方案中，第一數(shù)據(jù)庫包含種系VH、 VL或VH和Vi^氨
基酸序列。在其他實施方案中，第一數(shù)據(jù)庫由種系VH、 Vl或Vh和Vt氨基酸序列組成。在另一個實施方案中，第一數(shù)據(jù)庫包含成熟VH、Vl或Vh和V^氨基酸序列。在另一個實施方案中，第一數(shù)據(jù)庫由成熟VH、 Vl或Vh和Vt氨基酸序列組成。在示例性實施方案中，成熟VH、VL或VH和VL氨基酸序列來自Kabat數(shù)據(jù)庫(KDB)。
在某些實施方案中，第二數(shù)據(jù)庫包含根據(jù)QC測定選擇的scFv抗
15體Vh、 Vl或Vh和Vt氨基酸序列。在另一個實施方案中，第二數(shù)據(jù)庫由根據(jù)QC測定選擇的scFv抗體VH、 Vl或Vh和Vl氛基酸序列組成。
在一個實施方案中，期望的功能性質(zhì)是提高的穩(wěn)定性。在另一個實施方案中，期望的功能性質(zhì)是提高的溶解性。在另一個實施方案中，期望的功能性質(zhì)是非聚集性(non-aggregation)。在另一個實施方案中，期望的功能性質(zhì)是表達的提高(例如，在原核細胞中)。在另一個實施方案中，功能性質(zhì)是在內(nèi)含體純化方法后重折疊產(chǎn)量的提高。在某些實施方案中，期望的功能性質(zhì)不是抗原結(jié)合親和力的提高。在另一個實施方案中，獲得一種或多種期望的功能的組合。
在另一個方面，本發(fā)明提供了改造免疫結(jié)合劑的方法，該方法包
括
a) 在免疫結(jié)合劑內(nèi)選擇一個或多個氨基酸位置用于突變；和
b) 使選擇用于突變的一個或多個氨基酸位置突變，
其中如果選擇用于突變的一個或多個氨基酸位置是重鏈氨基酸位置，那么所述氨基酸位置選自使用AHo編號的位置l、 6、 7、 10、 12、13、 14、 19、 20、 21、 45、 47、 50、 55、 77、 78、 82、 86、 87、 89、卯、92、 95、 98、 103和107 (使用Kabat編號的氨基酸位置1、 6、 7、
9、 11、 12、 13、 18、 19、 20、 38、 40、 43、 48、 66、 67、 71、 75、 76、78、 79、 81、 82b、 84、 89和93),和
其中如果選擇用于突變的 一個或多個氨基酸位置是輕鏈氨基酸位置，那么所述氨基酸位置選自使用AHo編號的位置l、 2、 3、 4、 7、
10、 11、 12、 14、 18、 20、 24、 46、 47、 50、 53、 56、 57、 74、 82、91、 92、 94、 101和103 (使用Kabat編號的氨基酸位置1、 2、 3、 4、7、 10、 11、 12、 14、 18、 20、 24、 38、 39、 42、 45、 48、 49、 58、 66、73、 74、 76、 83和85)。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供了改造免疫結(jié)合劑的方法，所迷方法包括
a)在免疫結(jié)合劑內(nèi)選擇一個或多個氨基酸位置用于突變；和b)使選擇用于突變的一個或多個氨基酸位置突變，其中選擇用于
突變的一個或多個氨基酸位置選自
(i) 使用AHo編號的VH3的氨基酸位置1、 6、 7、 89和103(使用Kabat編號的氨基酸位置1、 6、 7、 78和89);
(ii) 使用AHo編號的VHla的氨基酸位置1、 6、 12、 13、 14、 19、21、 90、 92、 95和98"吏用Kabat編號的氨基酸位置1、 6、 11、 12、13、 18、 20、 79、 81、 82b和84);
(iii) 使用AHo編號的VHlb的氨基酸位置1、 10、 12、 13、 14、20、 21、 45、 47、 50、 55、 77、 78、 82、 86、 87和107(使用Kabat編號的氨基酸位置l、 9、 11、 12、 13、 19、 20、 38、 40、 43、 48、 66、67、 71、 75、 76和93);
(iv) 使用AHo編號的Vk1的氨基酸位置1、 3、 4、 24、 47、 50、57、 91和103(使用Kabat編號的氨基酸位置1、 3、 4、 24、 39、 42、49、 73和85);
(v) 使用AHo編號的Vk3的氨基酸位置2、 3、 10、 12、 18、 20、56、 74、 94、 101和103(使用Kabat編號的氨基酸位置2、 3、 10、 12、18、 20、 48、 58、 76、 83和85);和
(vi) 使用AHo編號的V入l的氨基酸位置1、 2、 4、 7、 11、 14、46、 53、 82、 92和1030吏用Kabat編號的氨基酸位置1、 2、 4、 7、11、 14、 38、 45、 66、 74和85)。
在另一個實施方案中，突變進一步包括一個或多個(優(yōu)選所有)選自使用AHo編號的氨基酸位置12、 13和144 (使用Kabat編號的氨基酸位置12、 85和103)的重鏈氨基酸位置的鏈置換。
在某些優(yōu)選實施方案中，將選擇用于突變的一個或多個氨基酸位置突變成在因具有至少一個期望的功能性質(zhì)而被選擇(例如，在酵母QC-系統(tǒng)中)的抗體序列中的相應(yīng)氨基酸位置上發(fā)現(xiàn)的氨基酸殘基。在另一個實施方案中，將選擇用于突變的一個或多個氨基酸位置突變成按照本發(fā)明的富集/排除分析法鑒定的氨基酸殘基(例如，"富集的氨基酸殘基")。
17優(yōu)選，免疫結(jié)合劑是scFv，但其他免疫結(jié)合劑例如全長免疫球蛋
白和其他抗體片段(例如，F(xiàn)ab或Dab)也可按照該方法進行改造。本曰/
和藥學(xué)上可接受的載體的組合物。
附圖簡述
當(dāng)考慮本文的下列詳細描述時，本發(fā)明將得到更好地理解，并且除上文所述的那些外的目的將變得顯而易見。此種描述參考附圖，其中


圖1是概括根據(jù)本發(fā)明的方法的scFv的 一般的基于序列的分析的流程圖。
在第一個步驟中，提供了待在溶解性和穩(wěn)定性方面進行改善的scFv的序列(框1)，其隨后與抗體序列數(shù)據(jù)庫進行比較(框2),例如開放源種系序列數(shù)據(jù)庫(例如，Vbase, IMGT;框3)、開放源成熟抗體序列數(shù)據(jù)庫(例如，KDB;框4)或全長人穩(wěn)定和可溶scFv片段的數(shù)據(jù)庫(例如，QC;框5)。
應(yīng)用例如框3中描述的開放源種系序列數(shù)據(jù)庫允許鑒定高度保守的位置，其在進化過程中進行選擇，并且因此被認為促成全長抗體背景中的可變結(jié)構(gòu)域的穩(wěn)定性(框3，)。針對開放源成熟抗體序列數(shù)據(jù)庫4的比較允許鑒定這樣的模式，其代表不依賴于各自的CDR的穩(wěn)定性、溶解性和/或結(jié)合的改善(框4，)。此外，針對全長人穩(wěn)定和可溶scFv片段的數(shù)據(jù)庫(框5 )的比較導(dǎo)致鑒定對于穩(wěn)定性和/或溶解性關(guān)鍵的殘基(特別是在scFv形式中)，以及鑒定這樣的模式，其代表特別是在scFv形式，例如VL和VH組合中不依賴于各自的CDR的穩(wěn)定性、溶解性和/或結(jié)合的改善(框5，)。
在下一個步驟中(框6)，用各個數(shù)據(jù)庫中鑒定的最頻繁的合適氨基酸置換關(guān)鍵殘基。
最后(框7)，可以在酵母QC系統(tǒng)中進行關(guān)鍵殘基的隨機或偏好性誘變并且隨后就改善的穩(wěn)定性和/或溶解性進行篩選。突變體可以再次經(jīng)歷上文描述的操作(至框2的箭頭)。
圖2是用于scFv的基于序列的分析的示例性多步驟方法的流程圖。
在第一個步驟中(框1),基于生物信息學(xué)工具提供的結(jié)果，通過比較每個位置處不同氨基酸的出現(xiàn)情況，測定每一個殘基在構(gòu)架中的頻率。在第二個步驟中，例如通過使用用式0 = 2:/1/(附'-/>)/^廣〃-7)計算的辛普森(Simpson's)指數(shù)，定義每個位置處的保守程度。在第三個步驟中，測定了使總體自由能降到最低的最佳置換(例如，通過應(yīng)用玻爾茲曼(Boltzmaim，s )定律AAGth =-RTln (/親本《共l足))。最后(步驟4)，測定潛在的穩(wěn)定性突變的作用。為了這個目的，可以考慮因素例如局部和非局部相互作用、規(guī)范殘基(canonical residue )、界面、暴露程度和p-轉(zhuǎn)角傾向。
圖3是用于在酵母中選擇穩(wěn)定和可溶scFv的示例性質(zhì)量控制(QC)系統(tǒng)的示意圖。利用這個系統(tǒng)，通過誘導(dǎo)型報告構(gòu)建體的存在(所述構(gòu)建體的表達依賴于穩(wěn)定和可溶scFv-AD-Gal llp融合蛋白的存在)選擇在還原環(huán)境中能夠表達穩(wěn)定和可溶scFv的宿主細胞。融合蛋白與Gal4 (1-100)的相互作用形成激活可選標(biāo)記的表達的功能轉(zhuǎn)錄因子(參見圖3A)。不穩(wěn)定和/或不溶性scFv無法形成功能轉(zhuǎn)錄因子并且誘導(dǎo)可選標(biāo)記的表達，并且因此從選擇中排除(圖3B)。即使在其中二硫鍵不折疊的還原條件下，所選擇的scFv也能夠獲得穩(wěn)定和可溶的蛋白質(zhì)折疊，而不穩(wěn)定和/或不溶性scFv趨于去折疊、聚集和/或降解。在氧化條件下，所選擇的scFv仍展現(xiàn)優(yōu)良的溶解性和穩(wěn)定性特征。
圖4是另一個示例性質(zhì)量控制(QC)系統(tǒng)的示意圖。用于選擇可溶和穩(wěn)定scFv的總體概念與圖3描述的相同，然而，在這個形式中，scFv與包含活化結(jié)構(gòu)域(AD)和DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DBD )的功能轉(zhuǎn)錄因子直接融合。圖4A描述了示例性可溶和穩(wěn)定scFv，其當(dāng)與功能轉(zhuǎn)錄因子融合時，不阻礙可選標(biāo)記的轉(zhuǎn)錄。相比之下，圖4B描述了其中不穩(wěn)定scFv與轉(zhuǎn)錄因子融合而產(chǎn)生無功能融合構(gòu)建體的情形，所述構(gòu)建體無法激活可選標(biāo)記的轉(zhuǎn)錄。
圖5是體細胞突變前在天然種系序列內(nèi)的特定構(gòu)架(FW)位置處(圖5A),和在QC系統(tǒng)中選擇的體細胞突變后在成熟抗體序列內(nèi)的相應(yīng)FW位置處(圖5B)的變異性分析的示意圖?？梢再x予種系和QC序列內(nèi)分別的FW位置(例如，高度可變構(gòu)架殘基("hvFR"))不同的變異性值(即，分別為"G"和"Q"值)。如果對于特定位置G>Q，那么在那個位置處存在有限數(shù)目的合適的穩(wěn)定FW殘基。如果對于特定位置G<Q,那么這可能表明該殘基已就最佳溶解性和穩(wěn)定性進行了天然選擇。
圖6描迷了在2S-95。C下的熱誘導(dǎo)脅迫后對于ESBA105變體觀察到的變性曲線圖。虛線表示具有至種系共有殘基的回復(fù)突變(V3Q、R47K或V103T)的ESBA-105變體。實線表示包含通過本發(fā)明的方法鑒定的優(yōu)選置換的變體(QC11.2、 QC15.2和QC23.2 )。
圖7描述了包含共有序列回復(fù)突變(S-2、 D-2、 D-3)、至丙氨酸(D-l)或QC殘基(QC7.1、 QC11.2、 QC15.2、 QC23.2)的突變的一組ESBA105變體的熱穩(wěn)定性的比較。提供了每種變體的熱穩(wěn)定性(以任意去折疊單位表示)。
圖8描述了在25-95'C下的熱誘導(dǎo)脅迫后對于ESBA212變體觀察到的變性曲線圖。虛線表示具有至種系共有殘基的回復(fù)突變(V3Q或R47K)的ESBA-212變體。實線表示親本ESBA212分子。
圖9描述了野生型ESBA105及其可溶性變體的PEG沉淀溶解度曲線。
圖10描述了如在廣泛溫度范圍(25-96°C)下的熱攻擊后測量的野生型ESBA105及其可溶性變體的熱變性曲線圖。
圖11描述了 SDS-PAGE凝膠，其顯示了在熱脅迫條件下溫育2周后各種ESBA105可溶性突變體的降解行為。
發(fā)明詳述
本發(fā)明涉及用于免疫結(jié)合劑性質(zhì)，特別地scFv性質(zhì)(包括但不限
20于穩(wěn)定性、溶解性和親和力)的基于序列的改造和優(yōu)化的方法。更具
體地，本發(fā)明公開了使用抗體序列分析鑒定scFv中待突變的氨基酸位 置來優(yōu)化scFv抗體，從而提高scFv的一個或多個物理性質(zhì)的方法。 本發(fā)明還涉及按照本發(fā)明的方法產(chǎn)生的經(jīng)改造的免疫結(jié)合劑例如 scFV。
本發(fā)明至少部分基于抗體序列的多個數(shù)據(jù)庫中的各重鏈和輕鏈構(gòu) 架位置上的氨基酸頻率的分析。特別地，已將種系和/或成熟抗體數(shù)據(jù) 庫的頻率分析與因具有期望的功能性質(zhì)而被選擇的scFv序列的數(shù)據(jù) 庫的頻率分析相比較。通過給各構(gòu)架位置的變異性程度賦值(例如， 通過使用辛普森指數(shù))和通過比較不同類型的抗體序列數(shù)據(jù)庫中的各 構(gòu)架位置上的變異性程度，現(xiàn)已能夠鑒定對于scFv的功能性質(zhì)(例如， 穩(wěn)定性、溶解性)是重要的構(gòu)架位置。這現(xiàn)允許對構(gòu)架氨基酸位置定 義"功能共有區(qū)"，其中已鑒定了比種系和/或成熟抗體免疫球蛋白序 列中的相應(yīng)位置更耐受變異性或更不耐受變異性的構(gòu)架位置。因此， 本發(fā)明提供基于功能性選擇的scFv序列的數(shù)據(jù)庫的使用的"功能共有 區(qū)"方法并證明了其優(yōu)點。此外，本發(fā)明提供了通過突變使用本文中 描述的"功能共有區(qū)"方法鑒定的特定構(gòu)架氨基酸位置來對免疫結(jié)合 劑(例如，scFv)進4亍改造的方法。
首先定義某些術(shù)語，這樣可使本發(fā)明更容易被理解。除非另外指 出，本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域內(nèi)的技 術(shù)人員通常理解的意義相同的意義。雖然與本文中描述的方法和材料 相似或等同的方法和材料可用于本發(fā)明的實踐或試驗中，但下面描述 了適當(dāng)?shù)姆椒ê筒牧?。本文中提及的所有公開物、專利申請、專利和 其他參考資料以它們的全文通過引用合并入本文。在矛盾的情況下， 以本說明書(包括定義)為準(zhǔn)。此外，材料、方法和實施例只是舉例 說明性的而非限定性的。
本文中使用的術(shù)語"抗體"是免疫球蛋白的同義詞。根據(jù)本發(fā)明 的抗體可以是完整的免疫球蛋白或其片段，其包括免疫球蛋白的至少 一個可變結(jié)構(gòu)域，例如單個可變結(jié)構(gòu)域，F(xiàn)v(SkerraA.和Plttckthun，A. ( 1988) 5Wg歐240: 1038-41 ) 、 scFv (Bird, R.E.等人(1988) 242: 423-26; Huston, J.S.等人(1988; / 亂胸"ca"d. ^A^4 §1: 5879-83) , Fab、 ( Fab') 2、或本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其 他片段。
本文中使用的術(shù)語"抗體構(gòu)架(antibody framework)"是指可 變結(jié)構(gòu)域VL或VH的一部分，其用作該可變結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合環(huán)的 支架(Kabat， E.A.等人，(1991 )Sequences of proteins of immunological interest. NIH Publication 91-3242 )。
本文中使用的"抗體CDR"是指抗體的互補決定區(qū)，其如Kabat E.A.等人，(1991 )Sequences of proteins of immunological interest. NIH Publication 91-3242 )定義的由抗原結(jié)合環(huán)組成。抗體Fv片段的兩個 可變結(jié)構(gòu)域中的每一個包含例如3個CDR。
術(shù)語"單鏈抗體"或"scFv"意指包含通過接頭連接的抗體重鏈 可變區(qū)(VH)和抗體輕鏈可變區(qū)(Vj的分子。此類scFv分子可具 有一般結(jié)構(gòu)NH2-VL-接頭-VH-COOH或NHrVH-接頭-VL-COOH。
如本文中所使用的，"同一性"是指兩個多肽、分子之間或兩個 核酸之間匹配的序列。當(dāng)兩個進行比較的序列中的位置都被相同的堿 基或氨基酸單體亞單元占據(jù)(例如，如果兩個多肽的每一個中的位置 都被賴氨酸占據(jù))時，各個分子在該位置上是同一的。兩個序列之間 的"百分數(shù)同一性"是由這兩個序列共有的匹配位置數(shù)目除以進行比 較的位置數(shù)目再乘以100的函數(shù)。例如，如果兩個序列的IO個位置中 有6個匹配，那么這兩個序列具有60%的同一性。通常，在將兩個序 列比對以產(chǎn)生最大同一性時進行比較。這樣的比對可通過使用，例如， 通過計算機程序例如Align程序(DNAstar， Inc.)方便地進行的 Needleman等人(1970 ) / A^/.祝o/.處443-453的方法來提供。 "相似的"序列是當(dāng)比對時共有相同和相似氨基酸殘基的序列，
換。在這點上r參照序列中的殘:的"保守置換":用在:理或功能 上與相應(yīng)的參照殘基相似(例如具有相似大小、形狀、電荷、化學(xué)性
22質(zhì)，包括形成共價鍵或氫鍵的能力等)的殘基進行的置換。因此，"經(jīng) 保守置換修飾的"序列是與參照序列或野生型序列相異在于存在一個 或多個保守置換的序列。兩個序列之間的"百分數(shù)相似性"是包含由 兩個序列共有的匹配殘基或保守置換的位置數(shù)目除以進行比較的位置
數(shù)目再乘以100的函數(shù)。例如，如果兩個序列的IO個位置中有6個匹 配以及10個位置中有2個包含保守置換，那么這兩個序列具有80% 的正相似性。
本文中使用的"氨基酸共有序列"是指可使用至少兩個，優(yōu)選更 多的進行比對的氨基酸序列的矩陣產(chǎn)生的氨基酸序列(允許在比對中 出現(xiàn)缺口)，其使得可能確定各位置上出現(xiàn)頻率最高的氨基酸殘基。 共有序列是包含在各位置上出現(xiàn)頻率最高的氨基酸的序列。如果兩個 或更多個氨基酸等同地出現(xiàn)在單個位置上，那么共有序列包括兩個或 所有此類氨基酸。
可在不同水平上分析蛋白質(zhì)的氨基酸序列。例如，可在單個殘基 水平、多個殘基水平、具有缺口的多個殘基水平等上展示保守性或變 異性。殘基可展示相同殘基的保守性或可在種類水平上保守。氨基酸 種類的實例包括極性但不帶電荷的R組(絲氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺 和谷氨酰胺)；帶正電荷的R組(賴氨酸、精氨酸和組氨酸)；帶負電 荷的R組(谷氨酸和天冬氨酸)；疏水R組(丙氨酸、異亮氨酸、亮 氨酸、甲疏氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、纈氨酸和酪氨酸)；以及特殊 氨基酸(半胱氨酸、甘氨酸和脯氨酸)。其他種類對于本領(lǐng)域技術(shù)人 員來說是已知的并且可使用結(jié)構(gòu)測定法或其他數(shù)據(jù)來定義以估量可置 換性。在該意義上，可置換的氨基酸可以指可在該位置上進行置換并 且保持功能保守性的任何氨基酸。
如本文中所使用的，當(dāng)一個氨基酸序列(例如，第一Vh或Vl序 列)與一個或多個另外的氨基酸序列(例如，數(shù)據(jù)庫中的一個或多個 VH或VL序列)比對時，可將一個序列(例如，第一Vh或Vl序列) 中的氨基酸位置與一個或多個另外的氨基酸序列中的"相應(yīng)位置"相 比較。如本文中所使用的，"相應(yīng)位置"表示當(dāng)對序列進行最優(yōu)比對時，即當(dāng)序列進行比對以獲得最高百分數(shù)同 一 性或百分數(shù)相似性時進 行比較的序列中的等同位置。
如本文中所使用的，術(shù)語"抗體數(shù)據(jù)庫"是指兩個或更多個抗體 氨基酸序列("多個"序列)的集合，通常是指數(shù)十個、數(shù)百個或甚
至數(shù)千個抗體氨基酸序列的集合?？贵w數(shù)據(jù)庫可存儲例如抗體VH區(qū)、 抗體VL區(qū)或兩者的集合的氨基酸序列，或可存儲由Vh和Vl區(qū)域組 成的scFv序列的集合。優(yōu)選，可將數(shù)據(jù)庫存儲在可檢索的、固定的介 質(zhì)中，例如計算機上可檢索的計算機程序中。在一個實施方案中，抗 體數(shù)據(jù)庫是包含或由種系抗體序列組成的數(shù)據(jù)庫。在另一個實施方案 中，抗體數(shù)據(jù)庫是包含或由成熟(即，表達的)抗體序列組成的數(shù)據(jù) 庫(例如，成熟抗體序列的Kabat數(shù)據(jù)庫，例如KBD數(shù)據(jù)庫)。在 另一個實施方案中，抗體數(shù)據(jù)庫包含或由功能性選擇的序列(例如， 根據(jù)QC測定選擇的序列)組成。
術(shù)語"免疫結(jié)合劑"是指分子，所述分子包含抗體的全部或部分 抗原結(jié)合位置，例如重鏈和/或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的全部或一部分，這樣 免疫結(jié)合劑能夠特異性識別靶抗原。免疫結(jié)合劑的非限定性實例包括 全長免疫球蛋白分子和scFv,以及抗體片段，包括但不限于(i)Fab片 段，由V。 Vh、 Cl和Ch1結(jié)構(gòu)域組成的單價片段；(ii)F(ab')2片段， 包含通過鉸鏈區(qū)上的二疏橋連接的兩個Fab片段的二價片段，(iii) Fab，片段，其基本上是具有鉸鏈區(qū)的 一部分的Fab (參見， FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY (Paul編輯，3,sup.rd ed. 1993 ); (iv)由Vh和Ch1結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；(vi)單結(jié)構(gòu)域抗體例如Dab 片段(Ward等人，(1989 ) A^"re Mi: 544-546 )，其由VH或VL結(jié) 構(gòu)域組成，Camelid (參見Hamers誦Casterman，等人,Nature 363: 446-448( 1993 )和Dumoulin等人，Protein Science 11: 500-515( 2002 )) 或Shark抗體(例如，shark Ig-NARs Nanobodies );和(vii)納米抗 體(Nanobody)，包含單個可變結(jié)構(gòu)域和兩個恒定結(jié)構(gòu)域的重鏈可變區(qū)。
如本文中所使用的，術(shù)語"功能性質(zhì)"是例如為了提高多肽的生 產(chǎn)性質(zhì)或治療功效，其提高(例如相對于常規(guī)多肽)對于本領(lǐng)域技術(shù)
24人員來說是期望的和/或有利的多肽(例如，免疫結(jié)合劑)的性質(zhì)。在 一個實施方案中，功能性質(zhì)是提高的穩(wěn)定性(例如，熱穩(wěn)定性)。在 另一個實施方案中，功能性質(zhì)是提高的溶解性(例如，在細胞條件下)。 在另一個實施方案中，功能性質(zhì)是非聚集性。在另一個實施方案中， 功能性質(zhì)是表達(例如，在原核細胞中)的提高。在另一個實施方案 中，功能性質(zhì)是在內(nèi)含體純化方法后重折疊產(chǎn)量的提高。在某些實施 方案中，功能性質(zhì)不是抗原結(jié)合親和力的提高。
scFv的基于序列的分析
本發(fā)明提供了用于分析scFv序列的方法，其允許鑒定scFv序列 中選擇用于突變的氨基酸位置。選擇用于突變的氨基酸位置是經(jīng)預(yù)測 影響scFv的功能性質(zhì)例如溶解性、穩(wěn)定性和/或抗原結(jié)合的氨基酸位 置，其中預(yù)測該位置上的突變提高scFv的性能。因此，本發(fā)明允許對 scFv進行比簡單隨機突變scFv序列中的氨基酸位置更集中的改造以 優(yōu)化性能。
在圖l的流程圖中示意性地圖解了 scFv序列的基于序列的分析的 某些方面。如該圖中所示的，將待優(yōu)化的scFv序列與一個或多個抗體 數(shù)據(jù)庫(包括由因穩(wěn)定和可溶而被選擇的scFv序列組成的抗體數(shù)據(jù) 庫)中的序列相比較。這可允許鑒定特別地scFv形式中對于穩(wěn)定性和 /或溶解性至關(guān)重要的殘基，以及鑒定特別地在scFv形式(例如， 和VH的組合)中顯示不依賴于各自CDR的穩(wěn)定性、溶解性和/或結(jié)合 的提高的模式。在鑒定了至關(guān)重要的殘基后，它們就可用例如在各自 數(shù)據(jù)庫中鑒定的出現(xiàn)頻率最高的適當(dāng)?shù)陌被徇M行置換，和/或通過隨 機或偏好性誘變進行置換。
因此，在一個方面，本發(fā)明涉及鑒定單鏈抗體(scFv)中用于突變 的氨基酸位置的方法，所述scFv具有Vh和Vt氨基酸序列，該方法 包括
a)將scFv VH、 Vl或Vh和V^氨基酸序列輸入包含許多抗體VH、 Vl或Vh和VL氨基酸序列的數(shù)據(jù)庫，以使scFv VH、 Vl或Vh和Vl氨基酸序列與數(shù)據(jù)庫的抗體VH、 Vl或Vh和V[氨基酸序列比對；
b) 將scFv Vh或Vt氨基酸序列中的氨基酸位置與數(shù)據(jù)庫的抗體 Vh或V^氨基酸序列中的相應(yīng)位置相比較；
c) 確定scFv Vh或Vr^氨基酸序列中的氨基酸位置是否被在數(shù)據(jù) 庫的抗體Vh或Vt氨基酸序列中的相應(yīng)位置上保守的氨基酸殘基占 據(jù)；和
d) 當(dāng)氨基酸位置被在數(shù)據(jù)庫的抗體Vh或V^氨基酸序列中的相 應(yīng)位置上不保守的氨基酸殘基占據(jù)時，將scFv VH或Vl氨基酸序列中 的氨基酸位置鑒定為用于突變的氨基酸位置。
因此，在本發(fā)明的方法中，將目的scFv的序列(即，VH、 Vl或雨 者的序列)與抗體數(shù)據(jù)庫的序列相比較，然后確定目的scFv中的氨基 酸位置是否被在數(shù)據(jù)庫中的序列的相應(yīng)位置上"保守的"氨基酸殘基 占據(jù)。如果scFv序列的氨基酸位置被在數(shù)據(jù)庫的序列中的相應(yīng)位置上 不"保守的，，氨基酸殘基占據(jù)，則scFv的該氨基酸位置選擇用于突變。 優(yōu)選，被分析的氨基酸位置是目的scFv中的構(gòu)架氨基酸位置。更優(yōu)選， 可分析目的scFv中的每一個構(gòu)架氨基酸位置。在備選的實施方案中， 可分析目的scFv的一個或多個CDR中的一個或多個氨基酸位置。在 另外的實施方案中，可分析目的scFv中的各氨基酸位置。
為了確定氨基酸殘基在抗體數(shù)據(jù)庫的序列中的特定氨基酸位置 (例如，構(gòu)架位置)上是否"保守"，可計算在特定位置上的保守程 度。存在許多不同的本領(lǐng)域內(nèi)已知的可定量給定的位置上的氨基酸多 樣性的方法，其全都可用于本發(fā)明的方法。優(yōu)選，使用辛普森多樣性 指數(shù)計算保守程度，該指數(shù)是多樣性的量度。其考慮到存在于各位置 上的氨基酸的數(shù)目，以及各氨基酸的相對豐度(abundance)。辛普 森指數(shù)(S.I.)代表兩個隨機選擇的抗體序列在某些位置包含相同的氨 基酸的概率。當(dāng)測量保守性時，辛普森指數(shù)考慮了兩個主要因素，豐 富度(richness)和均勻度(evenness)。如本文中所使用的，"豐富 度"是存在于特定位置上的氨基酸的不同種類的數(shù)目的量度(即，數(shù) 據(jù)庫中在該位置上顯示的不同氨基酸殘基的數(shù)目是豐富度的量度)。如本文中所使用的，"均勻度"是存在于特定位置上的氨基酸中的每 一個的豐度的量度(即，數(shù)據(jù)庫的序列中氨基酸殘基在該位置上發(fā)生 的頻率是均勻度的量度)。
雖然殘基豐富度獨自可用作檢查特定位置上的保守程度的量度， 但其沒有考慮存在于某些位置上的各氨基酸殘基的相對頻率。其對在 數(shù)據(jù)庫的序列中的特定位置上極少發(fā)生的氨基酸殘基與對在相同位置 以極高的頻率發(fā)生的殘基給予同樣的權(quán)重。均勻度是組成位置的豐富 度的不同氨基酸的相對豐度的量度。辛普森指數(shù)將兩者(豐富度和均 勻度)都考慮到了，從而是按照本發(fā)明定量保守程度的優(yōu)選方法。特 別地，在非常保守的位置上的低頻率殘基被認為是潛在有問題的，從 而其可選擇用于突變。
辛普森指數(shù)的公式為D-Siii(nrl)/N(N-1)，其中N是調(diào)查的序列 (例如，在數(shù)據(jù)庫中)的總數(shù)，ni是各氨基酸殘基在被分析的位置上 的頻率。氨基酸事件(i)在數(shù)據(jù)庫中的頻率是氨基酸在數(shù)據(jù)庫中發(fā)生的 次數(shù)(ni)。計數(shù)iM本身以相對頻率給出，其表示它們按照事件的總數(shù) 進行了標(biāo)準(zhǔn)化。當(dāng)最大多樣性發(fā)生時，S.I.值是O，當(dāng)最小多樣性發(fā)生 時，S.I.值是1。因此S.I.的范圍是O至1，多樣性和指數(shù)值呈負相關(guān)。
在圖2中更詳細地描述了概述用于分析數(shù)據(jù)庫的序列中的構(gòu)架氨 基酸位置的多個步驟的流程圖。
因此，在上述方法的優(yōu)選實施方案中，使用辛普森指數(shù)給數(shù)據(jù)庫 的抗體Vh或V^氨基酸序列中的相應(yīng)位置的保守程度賦值。該相應(yīng)位 置的S.I.值可用作該位置的保守性的指標(biāo)。
在其他實施方案中，將密切相關(guān)的抗體序列的可信比對(trusted alignment)(即，考慮蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)相似性的序列比對)，用于本發(fā)明 以產(chǎn)生氨基酸的相對豐度和確定的位置的保守程度的矩陣。這些矩陣 經(jīng)設(shè)計用于抗體-抗體數(shù)據(jù)庫比較。計算各殘基的觀察到的頻率，并且 將其與預(yù)期的頻率(其基本上是數(shù)據(jù)集中各殘基對于各位置的頻率) 相比較。
使用所述方法對給定的scFv抗體進行的分析提供了關(guān)于給定的
27scFv抗體中的某些位置上的生物學(xué)上允許的突變和罕見殘基的信息， 以及允許預(yù)測其構(gòu)架中的潛在弱點。可將常規(guī)技術(shù)用于對"最佳"擬 合一組氨基酸-頻率數(shù)據(jù)的氨基酸置換進行工程設(shè)計(使用S丄值和相 對頻率作為標(biāo)準(zhǔn))。
上述基于序列的分析可用于scFv的Vh區(qū)域，scFv的Vl區(qū)域或 兩者。因此，在一個實施方案中，將scFv VH氨基酸序列輸入數(shù)據(jù)庫 并且與數(shù)據(jù)庫的抗體VH氨基酸序列比對。在另一個實施方案中，將 scFv Vt氨基酸序列輸入數(shù)據(jù)庫并且與數(shù)據(jù)庫的抗體Vt氨基酸序列比 對。在另一個實施方案中，將scFvVh和V^氨基酸序列輸入數(shù)據(jù)庫并 且與數(shù)據(jù)庫的抗體VH和VL氨基酸序列比對。用于將一個序列與數(shù)據(jù) 庫中的其他序列的集合進行比對的算法在本領(lǐng)域內(nèi)已良好地建立。將 序列進行比對以獲得序列之間的最高百分數(shù)同 一 性或相似性。
本發(fā)明的方法可用于分析scFv序列中的一個目的氨基酸位置或 更優(yōu)選，可用于分析多個目的氨基酸位置。因此，在上迷方法的步驟 b)中，可將scFvVh或Vt氨基酸序列中的多個氨基酸位置與數(shù)據(jù)庫的 抗體Vh或VL氨基酸序列中的相應(yīng)位置相比較。待分析的優(yōu)選位置是 scFv的Vh和/或V^序列中的構(gòu)架位置(例如，可分析各VH和VL構(gòu) 架位置)。另外或備選地，可分析scFv的一個或多個CDR中的一個或 多個位置(雖然突變CDR中的氨基酸位置可能不是優(yōu)選的，因為CDR 中的突變比構(gòu)架區(qū)中的突變更可能影響抗原結(jié)合活性)。此外，本發(fā)明 的方法允許分析scFv VH、 Vl或Vh和V^氨基酸序列中的各氨基酸位 置。
在本發(fā)明的方法中，可將目的scFv的序列與多種不同類型的抗體 序列數(shù)據(jù)庫的一種或多種中的序列相比較。例如，在一個實施方案中， 數(shù)據(jù)庠的抗體Vh、 V^或Vh和Vt氨基酸序列是種系抗體Vh、 Vl或 Vh和V^氛基酸序列。在另一個實施方案中，數(shù)據(jù)庫的抗體VH、 Vl 或Vh和VL氨基酸序列是重排的親和力成熟的抗體VH、 Vl或Vh和 Vt氨基酸序列。在另一個優(yōu)選實施方案中，數(shù)據(jù)庫的抗體VH、 V^或 VH和氨基酸序列是因具有至少 一種期望的功能性質(zhì)例如scFv穩(wěn)定性或scFv溶解性而被選擇的scFv抗體VH、 Vl或Vh和Vl氛基酸序 列(下面進一步論述的)。
得、匯編和/或產(chǎn)生抗體序列信息。序列的來源可包括但不限于一種或 多種下列數(shù)據(jù)庫
Kabat數(shù)據(jù)庫(.immuno.bme.nwu.Edu(到2007年10月為止)； Johnson和Wu ( 2001) 7Vwc/"c ^"Vfo及仏205-206; Johnson和 Wu (2000) 7V"c/"'c爿"Vfe及仏！^: 214-218)。來自2000年的原始數(shù) 據(jù)可通過在美國的FTP和在英國的鏡像獲得。
Kabatman包含允許用戶就序列的罕見特征檢索Kabat序列和 使用戶能夠發(fā)現(xiàn)對于特定抗體序列中的CDR的正則分配(canonical assignment)的數(shù)據(jù)庫。
AAAAA網(wǎng)站(www.bioc.imizh.ch/antibodv/ (到2007年10月 為止))，由Aimemarie Honegger制作的提供關(guān)于抗體的序列信息 和結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)的抗體網(wǎng)頁。
ABG:抗體的3D結(jié)構(gòu)的目錄(directory )-由Antibody Group (ABG)產(chǎn)生的目錄允許用戶訪問匯編在Protein Data Bank (PDB)
中的抗體結(jié)構(gòu)。在該目錄中，各PDB條目(entry)具有至原始來源 的超鏈接，從而使重新獲得全部信息變得容易。
ABG:小鼠VH和VK種系區(qū)段的種系基因目錄，在Instituto de Biotecnologia, UN AM (National University of Mexico)的 Antibody Group的網(wǎng)頁的一部分。
IMGT ,國際免疫遺傳學(xué)信息系統(tǒng) ( international ImMunoGeneTics information system )-由 Marie-Paule Lefranc (Universi" Montpellier II， CNRS)于1989年創(chuàng)建，IMGT是專門于人 和其他脊推動物物種的免疫系統(tǒng)的免疫球蛋白、T細胞受體和相關(guān)蛋 白質(zhì)的集成知識資源。IMGT由序列數(shù)據(jù)庫(IMGT/LIGM-DB，來自 人和其他脊推動物的IG和TR的綜合數(shù)據(jù)庫，具有完全注釋的序列的 翻譯，IMGT/MHC-DB， IMGT/PRIMER-DB)、基因組數(shù)據(jù)庫(IMGT/GENE-DB)、結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(IMGT/3Dstructure-DB)、網(wǎng)絡(luò)資源 (IMGT Repertoire)組成(IMGT， the international ImMunoGeneTics information system ; imgt.cines.fr (到2007年10月為止)；Lefranc 等人(1999)7VMc/"c爿c,Vfe及d 2: 209-212; Ruiz等人(2000 )A7ic/e/c 219-221; Lefranc等人(2001) iVwc/""c油1￡: 207-209; Lefranc等人(2003 ) A^c/e/c ^"Vfc^i: 307-310)。
V BASE-從一千多個公開序列(包括目前從Genbank和EMBL 數(shù)據(jù)庫釋放的序列)匯編的所有人種系可變區(qū)序列的綜合目錄。
在優(yōu)選實施方案中，從scFv文庫獲得抗體序列信息，所述scFv 文庫具有已在還原性環(huán)境中就增強的穩(wěn)定性和溶解性進行選擇的確定 的構(gòu)架。更特別地，已描述了允許細胞內(nèi)選擇在還原性環(huán)境中具有增 強的穩(wěn)定性和溶解性的scFv構(gòu)架的酵母質(zhì)量控制(QC)-系統(tǒng)(參見例 如，PCT
發(fā)明者D·厄馳, L·博拉斯 申請人:艾斯巴技術(shù),愛爾康生物醫(yī)藥研究裝置有限責(zé)任公司